CN102747092A

CN102747092A - 表达o型口蹄疫病毒空衣壳的重组缺损腺病毒及其应用

Info

Publication number: CN102747092A
Application number: CN2012100301156A
Authority: CN
Inventors: 于力; 周国辉; 杨德成
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2012-02-10
Filing date: 2012-02-10
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2032-02-10
Also published as: CN102747092B

Abstract

本发明公开了表达O型口蹄疫病毒空衣壳的重组缺损腺病毒及其应用。本发明首先精确构建了编码O型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组或其突变体，其核苷酸序列分别为SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示；将其与腺病毒表达载体可操作性连接得到重组腺病毒穿梭表达载体，进而与腺病毒骨架载体质粒共转化大肠杆菌，获得了克隆化重组腺病毒基因组；将其线性化后转染细胞，获得两株重组复制缺损型腺病毒。本发明的重组缺损腺病毒滴度高，在复制过程中能够形成口蹄疫病毒空衣壳，并在病毒传代过程中稳定、高效地表达口蹄疫病毒空衣壳，所表达的空衣壳在小鼠体内可持续诱导高水平的中和抗体并可抵抗病毒的攻击，可作为预防或治疗口蹄疫的疫苗。

Description

表达O型口蹄疫病毒空衣壳的重组缺损腺病毒及其应用

技术领域

本发明涉及重组腺病毒，尤其涉及表达O型口蹄疫病毒空衣壳的重组缺损型腺病毒及其构建方法，本发明进一步涉及该重组缺损腺病毒在制备预防或治疗口蹄疫疫苗中的应用，属于口蹄疫的防治领域。

背景技术

口蹄疫是猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种。口蹄疫的临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水泡。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大经济损失。鉴于此，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病之首。目前，有三分之二的OIE成员国流行FMD，时刻威胁着无FMD国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV)属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属，其直径为23纳米。目前已知口蹄疫病毒在全世界有七个血清型C、A、O、C、南非1、南非2、南非3和亚洲1型，以及65个以上亚型。O型口蹄疫为全世界流行最广的一个血清型，中国流行的口蹄疫主要为O、A、C三个血清型及ZB型(云南保山型)。口蹄疫病毒各血清之间没有交叉保护，即使是同一血清型内的不同亚型之间抗原差异程度也较大，以至于一种亚型的疫苗可能不完全保护同一血清型中其它亚型FMDV的感染，给口蹄疫的防治带来了极大的困难。疫苗接种是成功预防、控制乃至最终消灭口蹄疫的最有效手段。目前用于防治口蹄疫的疫苗主要有合成肽疫苗和灭活疫苗两种。

合成肽疫苗是基于病毒的主要抗原位点，利用病毒的主要抗原位点的一部分氨基酸序列合成的具有一定结构的多肽，用于免疫动物诱导中和抗体而达到保护的目的。但是，如果在病毒的主要抗原位点上发生关键氨基酸的突变，就会导致合成肽疫苗免疫保护效力的丧失。

口蹄疫灭活疫苗在消灭欧洲的口蹄疫以及控制世界其他国家的口蹄疫过程中发挥了重要作用。但是，灭活疫苗的生产中需要密闭设施来繁殖活病毒，存在活病毒逃逸的潜在风险，世界上一些地区FMD的暴发似乎与灭活疫苗中残存的活病毒有关。此外，制备FMD灭活疫苗的抗原未经提纯，含有病毒非结构蛋白，难于进行感染动物和免疫动物的鉴别诊断。鉴于FMD灭活疫苗的上述缺点，国内外研究者都在寻求一种更加安全有效的口蹄疫疫苗。理想的口蹄疫疫苗具有病毒的完整抗原谱，其免疫原性类似与天然的病毒颗粒，并且没有病毒的核酸，不能自主复制等特点。如今成为研究热点的口蹄疫候选疫苗包括蛋白质亚单位疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗和重组病毒等。到目前为止，证明最有效的FMD新型疫苗是人5型复制缺损型腺病毒(Ad5)表达的口蹄疫病毒空衣壳。Ad5作为一个理想的载体的重要原因是因为其免疫动物后不产生针对Ad5的中和抗体，排除了二次免疫的干扰。研制出安全、高效、免疫保护期更长的以腺病毒为载体的口蹄疫病毒空衣壳疫苗，对于口蹄疫的有效预防将具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供编码O型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组P1-2A-3C以及该亚基因组P1-2A-3C的突变体；

本发明的目的之二是提供携带亚基因组P1-2A-3C或该亚基因组P1-2A-3C的突变体并能够稳定表达O型口蹄疫病毒空衣壳的重组缺损型腺病毒；

本发明的目的之三是提供一种构建上述重组缺损型腺病毒的方法；

本发明目的之四是将所构建的重组缺损型腺病毒应用于制备成预防或治疗口蹄疫病毒空衣壳疫苗或试剂。

为了实现上述目的，本发明首先提供了编码O型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组P1-2A-3C，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。此外，本发明还提供了该亚基因组P1-2A-3C的突变体，其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

构建口蹄疫病毒空衣壳必须保证在完整正确的FMDV基因组结构基础上精确拼接FMDV的P1-2A和3C基因以形成完全正确的亚基因组，否则将对口蹄疫病毒空衣壳的形成造成严重的影响。只有口蹄疫病毒P1-2A-3C亚基因组序列得到正确拼接，3C蛋白酶才能充分裂解口蹄疫前体蛋白并完成病毒空衣壳的组装，这对后期的动物免疫试验的效果会产生重要甚至决定性影响。Mayr等(Mayr，G.A.，Chinsangaram，J.，Grubman，M.J.，1999，Development of replication-defective adenovirus serotype 5 containing thecapsid and 3C protease coding regions of foot-and-mouth disease virus as a vaccinecandidate.Virology 263，496-506.)构建了含A型FMDV亚基因组P1-2A-3C的重组腺病毒，并对一株重组腺病毒的3C蛋白酶基因进行了突变，从而使3C蛋白酶不能发挥裂解蛋白的作用，在后期的动物免疫试验中此株重组腺病毒就不能够诱导动物产生中和抗体。本发明将所拼接的编码口蹄疫病毒空衣壳的P1-2A-3C亚基因组序列或其突变体导入到腺病毒中筛选获到两株稳定、高效表达FMD病毒空衣壳的重组腺病毒，这两株重组腺病毒免疫的小鼠产生了高水平的口蹄疫病毒中和抗体，同时在C57BL/6鼠体内能够诱导产生完全的保护性免疫，这也验证了本发明在体外正确地拼接了O型口蹄疫病毒的亚基因组P1-2A-3C或其突变体，因此在腺病毒感染的293细胞中FMDV空衣壳蛋白得到正确表达、裂解和组装，因而在动物体内诱导坚强而持久的保护性免疫。

筛选到稳定、高效表达口蹄疫病毒空衣壳的重组腺病毒是本发明的另一重要之目的，为此，本发明提供了两株稳定、高效表达口蹄疫病毒空衣壳的重组腺病毒。其中一株是携带有SEQ ID No.1所示的编码O型口蹄疫病毒空衣壳亚基因组的重组缺损型腺病毒(rAdV-O-P12A3C)，另外一株是携带SEQ ID No.2所示的编码O型口蹄疫病毒突变株空衣壳的亚基因组的重组复制缺损型腺病毒(rAdV-Om-P12A3C)。

本发明用间接免疫荧光试验和Western blot检测重组腺病毒rAdV-O-P12A3C中的SEQ ID No.1所示的亚基因组在293细胞中的表达，同时测定其一步生长曲线；然后用rAdV-O-P12A3C免疫BALB/c小鼠，研究该重组腺病毒在鼠体内诱导的体液免疫应答；最后，在C57BL/6小鼠体内评价其攻毒保护效果。试验结果显示：该重组缺损型腺病毒的滴度达7.2×10⁸PFU/ml，重组腺病毒rAdV-O-P12A3C在病毒传代过程中稳定表达并能够形成FMD病毒空衣壳；rAdV-O-P12A3C接种BALB/c小鼠后9周(二免后3周)中和抗体达到峰值；rAdV-O-P12A3C接种C57BL/6小鼠后的3、5、7和14天用同型口蹄疫病毒攻击，均产生完全的免疫保护。这些结果表明，本发明所制备的用缺损腺病毒5型表达的O型口蹄疫病毒空衣壳在小鼠体内可持续诱导高水平的中和抗体并可抵抗病毒的攻击，作为预防或治疗O型口蹄疫的候选疫苗。

本发明人研究发现，近年来中国流行的O型FMDV毒株产生了2个氨基酸位点的变异(site 1)，造成了一个优势FMDV中和表位的部分改变，为了研制能够更好地覆盖O型FMDV抗原谱的疫苗，本发明在构建的O型质粒pShuttle-O-P12A3C的基础上，设计突变引物进行定点诱变，构建了O型FMDV突变株P1-2A-3C亚基因组的重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C。为此，本发明提供了另一株能够稳定表达口蹄疫病毒空衣壳的重组复制缺损型腺病毒(rAdV-Om-P12A3C)，该O型突变体重组腺病毒(rAdV-Om-P12A3C)与O型重组腺病毒(rAdV-O-P12A3C)相比较，只是在于上述的2个氨基酸的变化，其余的基因及其氨基酸序列均未发生任何变化。同时，O型突变体重组腺病毒的构建及鉴定也同于O型重组腺病毒。该O型突变体重组复制缺损型腺病毒携带有SEQ ID No.2所示的编码O型口蹄疫病毒突变株的亚基因组，毒价达7.4×10⁸PFU/ml，能够在各种表达系统中稳定表达O型口蹄疫病毒突变株的空衣壳。用FMDV共享表位单克隆抗体进行免疫荧光检测呈阳性，用Western blot检测呈现中等强度的阳性反应，表明其口蹄疫病毒空衣壳在293细胞中实现了高效表达。本发明绘制一步生长曲线测定重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C在293细胞中的复制能力。同时，在C57BL/6小鼠体内评价了其攻毒保护效果。试验结果表明，当重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C传至第8代、在接种后60h，病毒的复制水平达到高峰。病毒在复制过程中能够形成FMDV病毒空衣壳，并在病毒传代过程中稳定地表达。rAdV-Om-P12A3C接种C57BL/6小鼠后的3天、5天、7天和14天用同型口蹄疫病毒攻击，均产生完全的免疫保护。

本发明将所筛选到的稳定、高效的表达口蹄疫病毒空衣壳、病毒滴度为7.2×10⁸PFU/ml的第8代重组复制缺损型腺病毒(rAdV-O-P12A3C)提交专利认可的微生物保藏机构进行保藏，其微生物保藏号是：CGMCC No.5719；分类命名是：人血清5型复制缺损型腺病毒；保藏时间是：2012年1月16日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明将所筛选到的另一株稳定、高效的表达口蹄疫病毒空衣壳、病毒滴度为7.4×10⁸PFU/ml的第8代重组复制缺损型腺病毒(rAdV-Om-P12A3C)提交专利认可的微生物保藏机构进行保藏，其微生物保藏号是：CGMCC No.5717；分类命名是：人血清5型复制缺损型腺病毒；保藏时间是：2012年1月16日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明还提供了一种构建所述重组缺损型腺病毒rAdV-O-P12A3C的方法，该方法包括以下步骤：将SEQ ID No.1所示的亚基因组和腺病毒穿梭质粒可操作性的连接，得到重组腺病毒穿梭表达载体；将重组腺病毒穿梭表达载体与腺病毒骨架载体质粒共转化大肠杆菌，通过细菌内同源重组获得了以质粒形式存在的克隆化重组腺病毒基因组；将克隆化重组腺病毒基因组线型化后转染细胞，获得重组缺损型腺病毒rAdV-O-P12A3C。

本发明还提供了一种构建所述重组缺损型腺病毒rAdV-Om-P12A3C的方法，该方法包括以下步骤：将SEQ ID No.2所示的亚基因组的突变体和腺病毒穿梭质粒可操作的连接，得到重组腺病毒穿梭表达载体；将重组腺病毒穿梭表达载体与腺病毒骨架载体质粒共转化大肠杆菌，通过细菌内同源重组获得了以质粒形式存在的克隆化重组腺病毒基因组；将克隆化重组腺病毒基因组线性化后转染细胞，获得重组的缺损型腺病毒rAdV-Om-P12A3C。其中，所述的腺病毒穿梭质粒选自p-Shuttle，p-Shuttle-CMV，pAdTrack或pAdTrack-CMV；所述的病毒骨架载体质粒选自pAdEasy-1或pAdEasy-2。

本发明所筛选到的两株重组缺损腺病毒滴度高，在复制过程中能够形成口蹄疫病毒空衣壳，并在病毒传代过程中稳定地表达，所表达的口蹄疫病毒空衣壳在小鼠体内可持续诱导高水平的中和抗体并可抵抗病毒的攻击，可作为预防或治疗O型口蹄疫的疫苗。用本发明重组缺损腺病毒所制备的疫苗不含有口蹄疫病毒遗传物质，因此不具有感染性，安全性更高；该疫苗不必加佐剂，副作用更小；该疫苗接种后可获得更持久的免疫反应和较长的免疫保护期；该疫苗以复制缺损型腺病毒作为载体，其在体内不复制，再次接种时不干扰疫苗的免疫效果。

附图说明

图1重组腺病毒rAdV-O-P12A3C感染293细胞引起的细胞病变；(A)正常293细胞；(B)感染rAdV-O-P12A3C的293细胞。

图2重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C感染293细胞引起的细胞病变；(A)正常293细胞；(B)感染rAdV-Om-P12A3C的293细胞。

图3重组腺病毒rAdV-O-P12A3C的PCR鉴定；L：DL 15000 DNA Ladder；1～3：在293细胞中传至第4代、6代和8代rAdV-O-P12A3C；4：wtAdV作为阴性对照。

图4重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C的PCR鉴定；1：wtAdV；2～5：在293细胞中传至第2代、4代、6代和8代rAdV-Om-P12A3C；L：DL 15000 DNA Ladder。

图5用间接免疫荧光试验检测重组腺病毒rAdV-O-P12A3C感染的293细胞；(A)rAdV-O-P12A3C感染的293细胞；(B)wtAdV感染的293细胞作为阴性对照。

图6用间接免疫荧光试验检测重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C感染的293细胞；(A)rAdV-Om-P12A3C感染的293细胞；(B)wtAdV感染的293细胞作为阴性对照。

图7Western blot分析FMDV空衣壳在重组腺病毒rAdV-O-P12A3C感染细胞中的表达；1.野生型腺病毒感染的293细胞；2.FMDV 146S蛋白；3预染的蛋白Marker；4～7.第2代、4代，6代和8代rAdV-O-P12A3C感染的293细胞。

图8Western blot分析FMDV空衣壳在重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C感染细胞中的表达；1.野生型腺病毒感染的293细胞；2～3.第6代、8代rAdV-Om-P12A3C感染的293细胞；4.FMDV 146S蛋白；5预染的蛋白Marker。

图9重组腺病毒rAdV-O-P12A3C的一步生长曲线。

图10重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C的一步生长曲线。

图11重组腺病毒rAdV-O-P12A3C免疫BALB/c鼠的IgG抗体动态变化；A：重组腺病毒rAdV-O-P12A3C免疫组；B：O型口蹄疫BEI灭活病毒免疫组；C：Asia1和O型口蹄疫双价灭活商品苗免疫组；D：Ad5野生型腺病毒免疫对照组；A和D组在第一次免疫后第6周以相同剂量加强免疫；B和C组在第一次免疫后第4周以相同剂量加强免疫。

图12重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C免疫BALB/c鼠的IgG抗体动态变化；A：重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C免疫组；B：O型口蹄疫BEI灭活病毒免疫组；C：Asia1和O型口蹄疫双价灭活商品苗免疫组；D：Ad5野生型腺病毒免疫对照组；A和D组在第一次免疫后第6周以相同剂量加强免疫；B和C组在第一次免疫后第4周以相同剂量加强免疫。

图13重组腺病毒rAdV-O-P12A3C免疫BALB/c鼠的中和抗体动态变化；A：重组腺病毒rAdV-O-P12A3C免疫组；B：O型口蹄疫BEI灭活病毒免疫组；C：Asia1和O型口蹄疫双价灭活商品苗免疫组；D：Ad5野生型腺病毒免疫对照组；A和D组在第一次免疫后第6周以相同剂量加强免疫；B和C组在第一次免疫后第4周以相同剂量加强免疫。

图14重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C免疫BALB/c鼠的中和抗体动态变化；A：重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C免疫组；B：O型口蹄疫BEI灭活病毒免疫组；C：Asia1和O型口蹄疫双价灭活商品苗免疫组；D：Ad5野生型腺病毒免疫对照组；A和D组在第一次免疫后第6周以相同剂量加强免疫；B和C组在第一次免疫后第4周以相同剂量加强免疫。

图15重组腺病毒rAdV-O-P12A3C免疫C57BL/6鼠不同时间对同源FMDV攻毒的保护；A：重组腺病毒rAdV-O-P12A3C免疫组；B：Asia1和O型口蹄疫双价灭活商品苗免疫组；C：Ad5野生型腺病毒免疫对照组；D：PBS空白对照组；各试验组的鼠分别在在接种后3天、5天、7天和14天用同型口蹄疫病毒攻击，每只400LD₅₀。

图16重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C免疫C57BL/6鼠不同时间对同源FMDV攻毒的保护；A：重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C免疫组；B：Asia1和O型口蹄疫双价灭活商品苗免疫组；C：Ad5野生型腺病毒免疫对照组；D：PBS空白对照组；各试验组的鼠分别在在接种后3天、5天、7天和14天用同型口蹄疫病毒攻击，每只80LD₅₀。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。

实验材料

腺病毒骨架载体pAdEasy-1、腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV、大肠杆菌BJ5183感受态菌以及AD-293细胞均购自Stratagene公司。大肠杆菌JM109、DH5α感受态细胞和pOK质粒由本发明人试验室保存。Pme I和Pac I均为NEB BioLabs产品。转染试剂Effectene Transfection Reagent购自QIAGEN公司。口蹄疫病毒VP2单克隆抗体4B2(于力等，抗口蹄疫病毒血清型共享单克隆抗体及其识别的抗原表位，中国发明专利申请号200910161346.9)由本实验室制备和保存。无外源基因表达的野生型腺病毒(wtAd)由本发明人实验室构建并保存。商品化的Asia1和O型口蹄疫双价灭活苗购自新疆天康公司(生产批号：2010025)。

1、重组复制缺损型腺病毒(rAdV-O-P12A3C)和重组复制缺损型腺病毒(rAdV-Om-P12A3C)的构建和鉴定

1.1O型FMDV亚基因组组P1、2A和3C基因的拼接

根据O型FMDV O/YS/CHA/05株全长基因组，分别设计上下游引物(表1)，采用PCR方法分别扩增P1-2A和3C基因，将pOK和P1-2A的PCR扩增产物分别进行HindIII和BamHI酶切，连接后转化并且筛选阳性克隆，酶切鉴定正确的重组质粒命名为pOK-P12A。将pOK与3C基因的PCR产物分别进行XhoI和EcoRV酶切，连接后转化并且筛选阳性克隆，进行酶切和测序鉴定，测序正确的重组质粒命名为pOK-3C。将pOK-P12A和pOK-3C分别进行XhoI和EcoRV酶切，连接后转化并且筛选阳性克隆，进行酶切和测序鉴定，测序正确的重组质粒命名为pOK-O-P12A3C。

表1 用于O型FMDV的P1、2A和3C亚基因组拼接的引物

1.2重组腺病毒穿梭载体的构建

引物名称	引物序列	酶切位点
			UP12A	5`CTTAAGCTTCCACCATGGGTGCCGGGCAATCCAGCCCGGCGAC 3`	HindIII
LP12A	5`TATGGATCCCTCGAGACCGGTGTCAGCCAG 3`	BamHI
			U3C	5`CCACTCGAGCGTCAAAAACCTCTG 3`	XhoI
L3C	5`CTCGATATCTTACTCGTGGTGTGGTTCGGGATC 3`	EcoRV

根据质粒pOK-O-P12A3C和腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV，进行HindIII和EcoRV双酶切，胶回收纯化酶切后的产物与穿梭载体连接，并转化至JM109感受态菌，经卡那霉素抗性筛选，挑取菌落接种至5mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，培养过夜，提取质粒，进行PCR、酶切和测序鉴定。测序正确的质粒命名pShuttle-O-P12A3C。

根据质粒pShuttle-O-P12A3C(O型)的亚基因组序列设计突变引物P1和P2(表2)，用于扩增pShuttle-O-P12A3C(O型)质粒上的P12A3C亚基因组，并转化至JM109感受态菌，经卡那霉素抗性筛选，挑取菌落接种至5mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，培养过夜，提取质粒，进行PCR、酶切和测序鉴定。测序正确的质粒命名为pShuttle-Om-P12A3C，用于构建重组腺病毒并在293细胞中表达O型突变株的空衣壳。pShuttle-Om-P12A3C后续的转染、重组腺病毒的鉴定、增殖滴度的测定等试验与pShuttle-O-P12A3C相同。

表2 用于O型突变株FMDV的P1、2A和3C亚基因组拼接的引物

引物名称	引物序列
		P1	5′TGACCTGCAAGTGTTGGCCCAGAAGGCGGCAAGAACGCTG 3′
P2	5′CAGCGTTCTTGCCGCCTCTGGGCCAACACTTGCAGGTCA 3′

1.3重组腺病毒质粒的获得

将pShuttle-O-P12A3C或pShuttle-Om-P12A3C用限制性内切酶Pme I线性化，电转化至含有腺病毒骨架载体AdEasy-1的BJ5183感受态菌(AdEasy-1-BJ5183)中。经卡那霉素抗性筛选，提取质粒，用Pac I酶切鉴定，将阳性重组腺病毒质粒进行测序，验证正确的命名为pAdV-O-P12A3C或pAdV-Om-P12A3C。

1.4转染

将质粒pAdV-P12A3C或pAdV-Om-P12A3C转化DH5α感受态菌，大量增殖重组质粒。用中量质粒提取试剂盒提取重组腺病毒质粒，用Pac I酶切，乙醇沉淀灭菌，超净工作台无菌吹干，用无菌超纯水溶解沉淀，使质粒的终浓度为1-2mg/uL。用QIAGEN公司转染试剂Effectene Transfection Reagent进行转染，具体操作按说明书进行。转染后7天细胞开始出现病变，细胞变圆、变大、脱落。第9天收获病毒进行传代，传至第5代时，细胞于接种病毒后24-48h完全出现CPE(图1、图2)。所获得稳定的重组腺病毒分别命名为rAdV-O-P12A3C和rAdV-Om-P12A3C。

1.5重组腺病毒的纯化与鉴定

用质粒pAdV-O-P12A3C或pShuttle-Om-P12A3C转染后获得的初代重组腺病毒分别反复冻融后，离心取上清，接种293细胞，连续传8代，观察细胞病变情况；取第4代、6代和8代重组腺病毒，用DNA提取试剂盒提取重组病毒DNA，PCR均能检出3.5kb的目的基因(图3和图4)。

同时取2代、4代、6代和8代重组腺病毒感染的293细胞，用口蹄疫病毒VP2的单克隆抗体4B2进行间接免疫荧光试验及Western blot分析，以检测目的基因的表达情况。

间接免疫荧光试验：将293细胞种入96孔板，当长到90％单层时，接种15MOI(Multiplicities of infection)rAdV-O-P12A3C，24h后弃去培养基，用PBS洗涤细胞3次，将rAdV-O-P12A3C感染的293细胞用预冷的无水乙醇固定15min，加入单抗4B2，37℃作用1h，用PBST洗涤后，加入荧光标记羊抗鼠IgG(Sigma)于37℃作用40min，PBST洗涤后自然干燥，加入缓冲甘油，于荧光显微镜下观察。

用针对FMDV VP2蛋白的单克隆抗体4B2进行IFA检测，结果发现重组腺病毒感染的细胞均出现明显的荧光，而对照组则检测不到荧光(图5和图6)，表明rAdV-O-P12A3C和rAdV-Om-P12A3C能正确地表达FMDV-VP2蛋白。

Western blot：对第2代、4代、6代、8代的重组腺病毒rAdV-O-P12A3C和第6代、8代的重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C进行Western blot分析，具体如下：将感染rAdV-O-P12A3C或rAdV-Om-P12A3C的293细胞进行SDS-PAGE分析，同时设立口蹄疫全病毒蛋白作为阳性对照，野生型腺病毒感染的293细胞作为阴性对照，之后转印到硝酸纤维素膜上，用脱脂牛奶封闭后，加入抗VP2的单抗4B2(1∶1000稀释)37℃作用1h，用PBST洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG(Sigma，1∶10000稀释)，37℃作用1h，洗涤后加入DAB溶液显色。

试验结果表明，重组腺病毒rAdV-O-P12A3C和rAdV-Om-P12A3C在感染的293细胞中复制、产生病毒空衣壳、并且稳定地进行表达(图7和8)。与单克隆抗体4B2发生免疫反应的条带与FMDV衣壳蛋白VP0、VP3的分子量大小相当，表明rAdV-O-P12A3C感染293细胞后形成FMDV多聚蛋白，并组装成FMD病毒空衣壳。

试验例1 重组腺病毒增殖滴度的测定试验

分别用10MOI剂量的第8代重组腺病毒rAdV-O-P12A3C和第8代rAdV-Om-P12A3C、野生型腺病毒wtAdV接种293细胞，在接种后12h、24h、36h、48h、60h和72h收取病毒并进行毒价测定，建立重组腺病毒与野生型腺病毒的一步生长曲线。

经病毒滴度测定，绘制出第8代重组腺病毒rAdV-O-P12A3C、第8代rAdV-Om-P12A3C和野生型腺病毒的一步生长曲线，即病毒增殖滴度与生长时间的相关性曲线，反映病毒生长繁殖的规律，结果见图9和图10。结果表明，随着重组腺病毒感染293细胞时间的延长，病毒滴度逐渐升高，在60h时，病毒的滴度达到峰值，随后开始下降。

试验例2 BALB/c鼠的免疫接种

7周龄BALB/c鼠20只，购自于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心，用免疫荧光方法检测人腺病毒5型抗体为阴性。实验动物随机分成4组，每组5只。A组接种5×10⁷PFU第8代重组腺病毒(rAdV-O-P12A3C)，在第一次免疫后第6周以相同剂量加强免疫；B组接种O型口蹄疫BEI灭活病毒200ul剂量，在第一次免疫后第4周以相同剂量加强免疫；C组接种新疆天康公司的Asia1和O型口蹄疫双价灭活苗，在第一次免疫后第4周以相同剂量加强免疫，每只鼠200ul剂量；D组接种Ad5野生型腺病毒。重组腺病毒用PBS稀释，免疫途径均为后腿肌肉注射。上述各组均在接种后17周内采集血清，分别用ELISA和微量中和试验检测血清抗体的动态水平。

7周龄BALB/c鼠20只，购自于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心，用免疫荧光方法检测人腺病毒5型抗体为阴性。实验动物随机分成4组，每组5只。A组接种5×10⁷PFU第8代的重组腺病毒(rAdV-Om-P12A3C)，在第一次免疫后第6周以相同剂量加强免疫；B组接种O型口蹄疫BEI灭活病毒200ul剂量，在第一次免疫后第4周以相同剂量加强免疫；C组接种新疆天康公司的Asia1和O型口蹄疫双价灭活苗，在第一次免疫后第4周以相同剂量加强免疫，每只鼠200ul剂量；D组接种Ad5野生型腺病毒。重组腺病毒用PBS稀释，免疫途径均为后腿肌肉注射。上述各组均在接种后17周内采集血清，分别用ELISA和微量中和试验检测血清抗体的动态水平。

1.1间接ELISA检测

用包被液将FMDV 146S抗原稀释至20μg/mL，每孔100μL，加入酶标板，4℃过夜包被。用PBS洗3次，5％脱脂乳封闭，37℃孵育1h。PBS洗3次，加入待检小鼠血清，同时设立鼠阳性和鼠阴性血清为对照。37℃孵育1h。洗涤后加入1∶5000稀释的HRP标记羊抗鼠二抗，OPD显色后于492nm处读取OD值。

1.2微量细胞中和试验

(1)病毒毒价的测定：将病毒接种于单层细胞，37℃吸附1h后加入维持液，置温箱培养；逐日观察，待细胞病变(CPE)达75％以上，收获病毒悬液冻融3次，以3000r/min离心10min，取上清液，定量分装成1ml小瓶置-70℃保存备用，选用的病毒对细胞有较稳定的致病力。从-70℃冰箱取出病毒一安瓶，将病毒在96孔培养板上作10倍递进稀释，每孔病毒悬液量为50μl，每个稀释度作8孔，每孔加入100μl细胞悬液，每块板的最后一行设8孔细胞对照，制备细胞悬液的浓度以使细胞在24h内长满单层为度。把培养板置5％CO2温箱于37℃培养，从48至72h逐日观察细胞病变，记录结果。按Reed和Muench方法计算TCID50(殷震，刘景华，动物病毒学[M].第2版，北京：科学出版社，1997，336～340.)。举例说明见表3。

表3 TCID₅₀计算(接种剂量50μl)

Ig TCID₅₀＝高于50％病毒稀释度的对数-距离比例×稀释系数的对数高于50％病毒稀释度的对数为-6，距离比例为0.26，稀释系数的对数为-1。

IgTCID₅₀＝-6+0.26×(-1)

＝-6.3

则TCID₅₀＝10^-6.3，50即病毒作10^-6.3稀释，每孔接种50μl，可使半数组织细胞管发生病变。

(2)中和试验：动物血清中含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用，如补体、免疫球蛋白和抗补体抗体等。为排除这些不耐热的非特异性反应因素，用于中和试验的血清或腹水须经56℃加热30min灭活处理。取已灭活处理的血清，在96孔微量细胞培养板上，用不含血清的DMEM作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为原血清的1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64等等，每孔含量为50μl，每个稀释度作4孔。取-70℃冰箱保存的病毒液，按经测定的毒价作200TCID50稀释(与等量血清混合，其毒价为100TCID50)。如病毒价为10^-6.3，50μl。所以应将病毒作2×10^-4.3稀释。每孔加入50μl病毒液，封好盖，置于37℃温箱中和1h。在制备细胞悬液时，其浓度以在24h内长满单层为度：血清病毒中和1h后取出，每孔加入100μl细胞悬液。置5％CO2于37℃温箱培养，自培养48h开始逐日观察记录，120h终判。为保证试验结果的准确性，每次试验都必须设置下列对照。阳性和阴性(sp2/0)腹水与待检腹水进行平行试验，阳性腹水对照应不出现细胞病变，而阴性腹水对照应出现细胞病变。每次试验每一块板上都设立病毒对照，先将病毒作0.1、1、10、100、1000TCID₅₀稀释，每个稀释度作4孔，每孔加50μl。然后每孔100μl细胞悬液。0.1TCID₅₀应不引起细胞病变，而且100TCID₅₀必须引起细胞病变，否则该试验不能成立。为检查被检腹水本身对细胞有无任何毒性作用，设立被检腹水毒性对照是必要的。即在组织细胞中加入低倍稀释的待检腹水(相当于中和试验中被检腹水的最低稀释度)。即不接种病毒和待检腹水的细胞悬液孔。正常细胞对照应在整个中和试验中一直保持良好的形态和生活特征，为避免培养板本身引起试验误差，应在每块板上都设立这一对照。当病毒回归试验，阳性、阴性、正常细胞对照相，赋税毒性对照全部成立时，才能进行判定，被检腹水孔出现100％CPE判为阴性，50％以上细胞出现保护者为阳性；固定病毒稀释腹水中和试验的结果计算，是计算出能保护50％细胞孔不产生细胞病变的腹水稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。用Reed和Muench两氏法(或Karber法)计算结果。举例说明见表4。

表4 固定病毒稀释血清法中和抗体效价计算

用Reed和Muench两氏法(或Karber法)计算结果

IgPD₅₀＝高于50％血清稀释度的对数-距离比例×稀释系数的对数

IgPD₅₀＝-1.5-0.5×(-0.3)＝-1.35

则PD₅₀＝10^-1.36，50μl

因10^-1.35＝1/22，即1∶22的血清可保护50％细胞不产生病变，1∶22就是该份血清的中和抗体效价。

从图11可见，接种后的BALB/c鼠，重组腺病毒rAdV-O-P12A3C(第8代)免疫组(A组)，O型口蹄疫BEI灭活病毒组(B组)和商品化O型口蹄疫灭活苗组(C组)均在接种后3周出现口蹄疫病毒特异的IgG抗体，随后抗体水平逐渐升高。其中，重组腺病毒rAdV-O-P12A3C免疫组(A组)的鼠在二免后3周(一免后9周)IgG抗体达到高峰，之后抗体水平逐渐下降，到第17周接种鼠的抗体仍然维持在一定的水平；O型口蹄疫BEI灭活病毒组(B组)和商品化O型口蹄疫灭活苗组(C组)的鼠在二免后3周(一免后7周)IgG抗体达到高峰，之后抗体水平逐渐下降，到第17周接种鼠的抗体仍然维持在一定的水平；Ad5野生型腺病毒组(E组)没有产生任何针对FMDV的IgG抗体。概括起来，免疫鼠诱导产生的IgG抗体水平有如下特征：1)A和B组鼠，加强免疫明显提高了抗体的应答水平，C组鼠在一免后3周IgG抗体就达到较高的水平(OD值为1.12)，之后IgG抗体滴度基本维持在此水平，在加强免疫后抗体水平升高不明显；2)从整个免疫期分析A、B和C组接种鼠的IgG抗体水平，其从高到低的顺序为：C组、A组、B组。

从图12可见，接种后的BALB/c鼠，重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C(第8代)免疫组(A组)，O型口蹄疫BEI灭活病毒组(B组)和商品化O型口蹄疫灭活苗组(C组)均在接种后3周出现口蹄疫病毒特异的IgG抗体，随后抗体水平逐渐升高。其中，重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C免疫组(A组)的鼠在二免后1周(一免后7周)IgG抗体达到高峰，之后抗体水平逐渐下降，到第17周接种鼠的抗体仍然维持在一定的水平；O型口蹄疫BEI灭活病毒组(B组)和商品化O型口蹄疫灭活苗组(C组)的鼠在二免后3周(一免后7周)IgG抗体达到高峰，之后抗体水平逐渐下降，到第17周接种鼠的抗体仍然维持在一定的水平；Ad5野生型腺病毒组(D组)没有产生任何针对FMDV的IgG抗体。概括起来，免疫鼠诱导产生的IgG抗体水平有如下特征：1)A和B组鼠，加强免疫明显提高了抗体的应答水平，C组鼠在一免后3周IgG抗体就达到较高的水平(OD值为1.12)，之后IgG抗体滴度基本维持在此水平，在加强免疫后抗体水平升高不明显；2)从整个免疫期分析A、B和C组接种鼠的IgG抗体水平，其从高到低的顺序为：C组、A组、B组。

用ELISA检测IgG抗体可以反映rAdV-O-P12A3C在免疫接种鼠体内诱导免疫应答的整体水平，而最直观的保护性免疫指标是所诱导的中和抗体水平。因此，在检测血清IgG抗体的同时，本发明也测定了上述各实验组小鼠的中和抗体水平及其动态变化，结果见图13。rAdV-O-P12A3C免疫组(A组)在加强免疫后1周(一免后7周)出现中和抗体(1.94log10)，随后抗体水平逐渐升高，在加强免疫后的3周和5周(一免后9周和11周)中和抗体达到高峰(2.11log10)，之后抗体水平逐渐下降，到第17周接种鼠的中和抗体水平接近阴性；O型口蹄疫病毒BEI灭活病毒组(B组)在加强免疫后1周(一免后5周)出现中和抗体(1.20log10)，随后抗体水平逐渐升高，在加强免疫后的7周和9周(一免后11周和13周)中和抗体达到高峰(1.51log10)，之后抗体水平逐渐下降，到第17周接种鼠的中和抗体水平分别接近阴性；商品化O型口蹄疫灭活苗组(C组)小鼠在加强免疫后3周(一免后7周)出现中和抗体(1.34log10)，可是本组接种鼠的中和抗体维持在此水平仅维持2周，未见升高，之后抗体水平逐渐下降，到第13周接种鼠的中和抗体水平接近阴性；Ad5野生型腺病毒组(D组)没有产生任何针对口蹄疫病毒的特异性中和抗体。总之，免疫小鼠诱导中和抗体具有如下明显特征：其一，加强免疫能够明显诱导接种鼠产生口蹄疫特异性中和抗体，A、B和C组接种鼠分别在加强免疫后的1周、1周和3周开始产生中和抗体；其二，中和抗体的应答水平与鼠免疫的疫苗种类有关。从总体趋势看，不同种类疫苗，按诱导鼠产生中和抗体的水平的高低和持续时间的长短排序顺序为：A组、B组、C组。

从图14可见，rAdV-Om-P12A3C免疫组(A组)在加强免疫后1周(一免后7周)出现中和抗体(1.94log10)，随后抗体水平逐渐升高，在加强免疫后的5周(一免后11周)中和抗体达到高峰(2.25log10)，之后抗体水平逐渐下降，到第17周接种鼠的中和抗体水平接近阴性；O型口蹄疫病毒BEI灭活病毒组(B组)在加强免疫后1周(一免后5周)出现中和抗体(1.20log10)，随后抗体水平逐渐升高，在加强免疫后的7周和9周(一免后11周和13周)中和抗体达到高峰(1.51log10)，之后抗体水平逐渐下降，到第17周接种鼠的中和抗体水平分别接近阴性；商品化O型口蹄疫灭活苗组(C组)小鼠在加强免疫后3周(一免后7周)出现中和抗体(1.34log10)，可是本组接种鼠的中和抗体维持在此水平仅维持2周，未见升高，之后抗体水平逐渐下降，到第13周接种鼠的中和抗体水平接近阴性；Ad5野生型腺病毒组(D组)没有产生任何针对口蹄疫病毒的特异性中和抗体。总之，免疫小鼠诱导中和抗体具有如下明显特征：其一，加强免疫能够明显诱导接种鼠产生口蹄疫特异性中和抗体，A、B和C组接种鼠分别在加强免疫后的1周、1周和3周开始产生中和抗体；其二，中和抗体的应答水平与鼠免疫的疫苗种类有关。从总体趋势看，不同种类疫苗，按诱导鼠产生中和抗体的水平的高低和持续时间的长短排序顺序为：A组、B组、C组。

试验例3 C57BL/6小鼠攻毒保护试验

1)6周龄C57BL/6SPF级小鼠共80只，分为2个免疫组和2个对照组，每个试验组又分为4个攻毒组，分别为免疫后3天、5天、7天和14天攻毒组。A组接种第8代的重组腺病毒rAdV-O-P12A3C，剂量为5×10⁷PFU/鼠；B组接种新疆天康公司的Asia1和O型口蹄疫双价灭活疫苗，每只鼠200ul剂量；C组接种Ad5野生型腺病毒，剂量为5×10⁷PFU/鼠；D组为PBS空白对照。各试验组的鼠分别在在接种后3天、5天、7天和14天用同型口蹄疫病毒攻击，每只400LD₅₀。攻毒后每日3次观察鼠死亡情况，结果见图15。

从图15可见，重组腺病毒(A组)、O型口蹄疫灭活疫苗(B组)、野生型腺病毒(C组)和PBS(D组)接种C57BL/6鼠后3天，用400LD₅₀的O型FMDV攻毒。病毒攻击后96小时，重组腺病毒免疫组的小鼠全部存活(存活率100％)，而O型口蹄疫灭活疫苗组、野生型腺病毒组和PBS空白对照组的小鼠全部死亡(存活率0％)。重组腺病毒(A组)、O型口蹄疫灭活苗(B组)、野生型腺病毒(C组)和PBS(D组)接种C57BL/6鼠后5、7和14天，用400LD₅₀的O型FMDV攻毒。结果与上述的免疫后3天攻毒组一致，鼠在病毒攻击后96小时，重组腺病毒组小鼠的存活率为100％，O型口蹄疫灭活苗组、野生型腺病毒组和PBS空白对照组鼠全部死亡(存活率0％)。

2)4周龄C57BL/6SPF级小鼠共80只，分为2个免疫组和2个对照组，每个试验组又分为4个攻毒组，分别为免疫后3天、5天、7天和14天攻毒组。A组接种第8代的重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C，剂量为5×10⁷PFU/鼠；B组接种中农威特公司的Asia1和O型口蹄疫双价灭活疫苗，每只鼠200ul剂量；C组接种Ad5野生型腺病毒，剂量为5×10₇PFU/鼠；D组为PBS空白对照。各试验组的鼠分别在在接种后3天、5天、7天和14天用同型口蹄疫病毒攻击，每只80LD₅₀。攻毒后每日3次观察鼠死亡情况，结果见图16。

从图16可见，重组腺病毒(A组)、O型口蹄疫灭活疫苗(B组)、野生型腺病毒(C组)和PBS(D组)接种C57BL/6鼠后3天，用80LD₅₀的Om型FMDV攻毒。病毒攻击后96小时，重组腺病毒免疫组的小鼠存活4只(存活率80％)，而O型口蹄疫灭活疫苗组、野生型腺病毒组和PBS空白对照组的小鼠全部死亡(存活率0％)。重组腺病毒(A组)、O型口蹄疫灭活苗(B组)、野生型腺病毒(C组)和PBS(D组)接种C57BL/6鼠后5、7和14天，用80LD₅₀的Om型FMDV攻毒。病毒攻击后96小时，重组腺病毒免疫组的小鼠全部存活(存活率100％)，而O型口蹄疫灭活疫苗组、野生型腺病毒组和PBS空白对照组的小鼠全部死亡(存活率0％)。

C57BL/6鼠是研究口蹄疫病毒感染、发病机理以及评价疫苗免疫保护效果的良好模型动物(Salguero FJ，Sanchez-Martin MA，Diaz-San Segundo F，de Avila A，SevillaN(2005)Foot-and-mouth disease virus(FMDV)causes an acute disease that can be lethalfor adult laboratory mice.Virology 332：384-396；Sanz-Ramos M，Diaz-San Segundo F，Escarmis C，Domingo E，Sevilla N(2008)Hidden virulence determinants in a viralquasispecies in vivo.J Virol 82：10465-10476.)。本发明人前期的研究表明O型和Om FMDV在成年C57BL/6鼠上的LD₅₀分别为10^4.1和10^2.9，因此，确定C57BL/6鼠免疫后的O型和Om FMDV攻毒剂量分别为400LD₅₀和80LD₅₀。上述试验结果也证明这一攻毒剂量是合适的，野生型腺病毒组和PBS空白对照免疫组小鼠均全部死亡。同时，重组腺病毒rAdV-O-P12A3C(A组)接种C57BL/6鼠后3、5、7和14天，用400LD₅₀的O型FMDV攻毒，小鼠全部存活(存活率100％)；重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C(A组)接种C57BL/6鼠后3天、5天、7天和14天，分别用80LD₅₀的Om FMDV攻毒，小鼠的存活率分别为80％、100％、100％和100％。而相对应的O型口蹄疫灭活苗组(B组)的鼠则全部死亡。这表明，C57BL/6鼠在免疫本发明重组腺病毒后3～14天，均能够坚强地抵抗O型和Om FMDV的攻击。国外的研究已表明，重组腺病毒接种动物7天时，中和抗体的产生有限或者还没有诱导机体产生中和抗体(Moraes M P，Mayr G A，Mason P W，et al.2002.Early protection against homologous challenge after a single dose ofreplication-defective human adenovirus type 5 expressing capsid proteins offoot-and-mouth disease virus(FMDV)strain A24[J].Vaccine.20：1631-1639.)时就已经存在保护性免疫；而本发明的重组腺病毒免疫小鼠后攻毒即可诱导完全的保护性免疫，这正说明有细胞介导免疫、粘膜免疫、天然免疫等其它免疫因素的参与。因此，本发明重组腺病毒在C57BL/6鼠体内能够诱导产生体液免疫及细胞免疫等免疫应答，达到良好的免疫保护效果。

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120> 表达O型口蹄疫病毒空衣壳的重组缺损腺病毒及其应用

<130> DQXL-0012

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3378

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 1

atgggtgccg ggcaatccag cccggcgact gggtcgcaga accagtcagg taacactgga 60

agcattatca acaattacta catgcagcag taccagaact ccatggacac acaacttggt 120

gacaacgcta ttagtggagg ctccaacgag gggtccacgg acaccacctc cacccacaca 180

accaacaccc aaaacaacga ctggttttca aagctagcca gttctgcttt tagcggtctt 240

ttcggcgctc ttctcgctga caagaaaacc gaggagacca ctcttcttga ggaccgcatc 300

ctcactaccc gcaacgggca cacgacctcg acaacccagt caagcgttgg agtcacttac 360

gggtacgcga cagctgagga ctttgtgagc ggaccgaaca cgtctgggct tgagaccagg 420

gttgtgcagg cagagcggtt cttcaaaacc cacttgttcg actgggtcac cagtgacccg 480

ttcggacggt gctacctgct ggaactccca actgaccaca aaggtgtcta cggtagccta 540

actgactctt atgcttacat gagaaacggt tgggatgtag aggttactgc agtggggaat 600

cagttcaacg gaggatgtct gttggtggct atggtaccag aactttgctc tattgacaag 660

agagggcttt accaactcac gctcttcccc caccagttca tcaacccccg gacgaacatg 720

acggcgcaca tcactgtgcc ttttgttggc gtcaaccgct acgaccagta caaggtacac 780

agaccttgga ctctcgtggt catggttgtg gccccgctga ctgtcaacac tgaaggtgcc 840

ccacagatca aggtttacgc caacatcgcc cctactaacg tgcacgtcgc gggtgagctc 900

ccttctaagg aagggatctt ccccgtggca tgtagcgacg gttacggtgg cctggtgacc 960

actgacccaa agacggctga ccccgcctac gggaaagtgt tcaatccacc tcgcaacatg 1020

ttgccggggc ggttcaccaa cttccttgat gtggctgagg cgtgtcctac gtttctgcat 1080

tttgagggtg acgtaccgta cgtgaccaca aagacggact cagacagggt gctcgcccag 1140

tttgacttgt ctctggcagc aaaacacatg tcaaacacct tcctggcagg tctcgcccag 1200

tattacacac agtacagcgg caccatcaac ctgcacttca tgttcactgg acccactgac 1260

gcgaaagcgc gttacatgat tgcatacgcc ccccctggca tggagccgcc caaaacaccc 1320

gaggcggccg ctcactgcat tcatgcggag tgggacacag ggttgaactc aaaattcaca 1380

ttttcaatcc cttacctttc ggcggctgac tacgcgtaca ccgcgtctga ctccgcggag 1440

accacaaacg tgcagggatg ggtttgcctg tttcaaatca cacacgggaa ggctgacggc 1500

gacgcgctgg tcgttctagc tagtgccggt aaggactttg aactgcgttt gccagttgat 1560

gctcgcacgc agaccacctc tacaggtgag tcggctgacc ccgtaactgc caccgttgag 1620

aactacggtg gtgagacaca ggtccagaga cgccagcaca cggatgtctc gttcatacta 1680

gacagatttg tgaaagtaac accaaaagac caaatcaatg tgttggacct gatgcaaacc 1740

cctgcacaca ctttggtagg cgcgctcctc cgtactgcca cttactactt tgcagattta 1800

gaagtggcag tgaaacacga ggggaacctt acctgggtcc cgaatggggc gcccgaggca 1860

gcattggaca acaccaccaa tccaacggcc taccacaagg cgccgctcac ccggcttgca 1920

ctgccttaca cggcaccaca ccgtgtcttg gctactgttt acaacgggaa ctgtaagtac 1980

ggcaagagcc ccgtggccaa cgcgagaggt gacctgcaag tgttgacccc gaaggcggca 2040

agaacgctgc ctacctcctt caattacggc gccatcaaag ccactcgggt gactgaactg 2100

ctttaccgca tgaagagggc cgaaacgtac tgcccccggc ctcttttggc tattcacccg 2160

agcgaaacta gacacaaaca aaagattgtg gcgcctgtga agcagctttt gaattttgat 2220

ctgctcaagc tggcaggaga cgttgagtcc aaccctggac ccttcttctt cgctgacgtc 2280

aggtcaaatt tttccaagct ggttgagacc atcaaccaaa tgcaggagga catgtcaaca 2340

aaacacggac ccgactttaa ccggttggtg tctgcgtttg aggaactggc cgctggagtg 2400

agggctatca ggactggtct cgacgaggcc aaaccctggt acaagctcat caagctactg 2460

agccgcctgt catgcatggc cgctgtagca gcacggtcaa aggacccagt ccttgtggcc 2520

atcatgctgg ctgacaccgg tctcgagcgt caaaaacctc tgaaagtgag agccaggctc 2580

ccacagcagg aggggcccta cgctggcccg atggagagac agaaaccgct gaaagtgaaa 2640

gtgaaagccc cggtcgttaa ggaaggacct tacgaaggac cggtgaagaa acctgtcgct 2700

ctgaaagtga aagcaaagaa cttgattgtc actgagagtg gtgctccccc gactgacttg 2760

caaaagatgg tcatgggcaa caccaagcct gttgagctca tcctcgacgg gaagacggtg 2820

gccatctgct gcgccaccgg agtgtttggt accgcctacc ttgttcctcg ccatcttttc 2880

gcagagaagt acgacaagat catgttggac ggcagagcca tgacagacag tgactacaga 2940

gtgtttgagt ttgagattaa agtgaaaggg caggacatgc tctcggacgc cgcgctcatg 3000

gtgctccacc gtgggaatcg cgtgcgggac atcacgaagc acttccgtga tgtggcaaga 3060

atgaagaaag gcacccccgt cgtcggcgtg gtcaacaacg ctgatgttgg gagactgatc 3120

ttctctggtg aggcccttac ctacaaggac attgtagtgt gcatggacgg agacaccatg 3180

cccggtctct tcgcctacaa agccgccacc aaggcgggtt actgtggagg agccgttctt 3240

gcaaaggacg gagccgagac tttcatcgtc ggcactcact ccgcaggcgg caacggagtt 3300

ggctactgct cgtgcgtttc caggtctatg ctgctaaaaa tgaaggcaca catcgatccc 3360

gaaccacacc acgagtaa 3378

<210> 2

<211> 3378

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 2

atgggtgccg ggcaatccag cccggcgact gggtcgcaga accagtcagg taacactgga 60

agcattatca acaattacta catgcagcag taccagaact ccatggacac acaacttggt 120

gacaacgcta ttagtggagg ctccaacgag gggtccacgg acaccacctc cacccacaca 180

accaacaccc aaaacaacga ctggttttca aagctagcca gttctgcttt tagcggtctt 240

ttcggcgctc ttctcgctga caagaaaacc gaggagacca ctcttcttga ggaccgcatc 300

ctcactaccc gcaacgggca cacgacctcg acaacccagt caagcgttgg agtcacttac 360

gggtacgcga cagctgagga ctttgtgagc ggaccgaaca cgtctgggct tgagaccagg 420

gttgtgcagg cagagcggtt cttcaaaacc cacttgttcg actgggtcac cagtgacccg 480

ttcggacggt gctacctgct ggaactccca actgaccaca aaggtgtcta cggtagccta 540

actgactctt atgcttacat gagaaacggt tgggatgtag aggttactgc agtggggaat 600

cagttcaacg gaggatgtct gttggtggct atggtaccag aactttgctc tattgacaag 660

agagggcttt accaactcac gctcttcccc caccagttca tcaacccccg gacgaacatg 720

acggcgcaca tcactgtgcc ttttgttggc gtcaaccgct acgaccagta caaggtacac 780

agaccttgga ctctcgtggt catggttgtg gccccgctga ctgtcaacac tgaaggtgcc 840

ccacagatca aggtttacgc caacatcgcc cctactaacg tgcacgtcgc gggtgagctc 900

ccttctaagg aagggatctt ccccgtggca tgtagcgacg gttacggtgg cctggtgacc 960

actgacccaa agacggctga ccccgcctac gggaaagtgt tcaatccacc tcgcaacatg 1020

ttgccggggc ggttcaccaa cttccttgat gtggctgagg cgtgtcctac gtttctgcat 1080

tttgagggtg acgtaccgta cgtgaccaca aagacggact cagacagggt gctcgcccag 1140

tttgacttgt ctctggcagc aaaacacatg tcaaacacct tcctggcagg tctcgcccag 1200

tattacacac agtacagcgg caccatcaac ctgcacttca tgttcactgg acccactgac 1260

gcgaaagcgc gttacatgat tgcatacgcc ccccctggca tggagccgcc caaaacaccc 1320

gaggcggccg ctcactgcat tcatgcggag tgggacacag ggttgaactc aaaattcaca 1380

ttttcaatcc cttacctttc ggcggctgac tacgcgtaca ccgcgtctga ctccgcggag 1440

accacaaacg tgcagggatg ggtttgcctg tttcaaatca cacacgggaa ggctgacggc 1500

gacgcgctgg tcgttctagc tagtgccggt aaggactttg aactgcgttt gccagttgat 1560

gctcgcacgc agaccacctc tacaggtgag tcggctgacc ccgtaactgc caccgttgag 1620

aactacggtg gtgagacaca ggtccagaga cgccagcaca cggatgtctc gttcatacta 1680

gacagatttg tgaaagtaac accaaaagac caaatcaatg tgttggacct gatgcaaacc 1740

cctgcacaca ctttggtagg cgcgctcctc cgtactgcca cttactactt tgcagattta 1800

gaagtggcag tgaaacacga ggggaacctt acctgggtcc cgaatggggc gcccgaggca 1860

gcattggaca acaccaccaa tccaacggcc taccacaagg cgccgctcac ccggcttgca 1920

ctgccttaca cggcaccaca ccgtgtcttg gctactgttt acaacgggaa ctgtaagtac 1980

ggcaagagcc ccgtggccaa cgcgagaggt gacctgcaag tgttggccca gaaggcggca 2040

agaacgctgc ctacctcctt caattacggc gccatcaaag ccactcgggt gactgaactg 2100

ctttaccgca tgaagagggc cgaaacgtac tgcccccggc ctcttttggc tattcacccg 2160

agcgaaacta gacacaaaca aaagattgtg gcgcctgtga agcagctttt gaattttgat 2220

ctgctcaagc tggcaggaga cgttgagtcc aaccctggac ccttcttctt cgctgacgtc 2280

aggtcaaatt tttccaagct ggttgagacc atcaaccaaa tgcaggagga catgtcaaca 2340

aaacacggac ccgactttaa ccggttggtg tctgcgtttg aggaactggc cgctggagtg 2400

agggctatca ggactggtct cgacgaggcc aaaccctggt acaagctcat caagctactg 2460

agccgcctgt catgcatggc cgctgtagca gcacggtcaa aggacccagt ccttgtggcc 2520

atcatgctgg ctgacaccgg tctcgagcgt caaaaacctc tgaaagtgag agccaggctc 2580

ccacagcagg aggggcccta cgctggcccg atggagagac agaaaccgct gaaagtgaaa 2640

gtgaaagccc cggtcgttaa ggaaggacct tacgaaggac cggtgaagaa acctgtcgct 2700

ctgaaagtga aagcaaagaa cttgattgtc actgagagtg gtgctccccc gactgacttg 2760

caaaagatgg tcatgggcaa caccaagcct gttgagctca tcctcgacgg gaagacggtg 2820

gccatctgct gcgccaccgg agtgtttggt accgcctacc ttgttcctcg ccatcttttc 2880

gcagagaagt acgacaagat catgttggac ggcagagcca tgacagacag tgactacaga 2940

gtgtttgagt ttgagattaa agtgaaaggg caggacatgc tctcggacgc cgcgctcatg 3000

gtgctccacc gtgggaatcg cgtgcgggac atcacgaagc acttccgtga tgtggcaaga 3060

atgaagaaag gcacccccgt cgtcggcgtg gtcaacaacg ctgatgttgg gagactgatc 3120

ttctctggtg aggcccttac ctacaaggac attgtagtgt gcatggacgg agacaccatg 3180

cccggtctct tcgcctacaa agccgccacc aaggcgggtt actgtggagg agccgttctt 3240

gcaaaggacg gagccgagac tttcatcgtc ggcactcact ccgcaggcgg caacggagtt 3300

ggctactgct cgtgcgtttc caggtctatg ctgctaaaaa tgaaggcaca catcgatccc 3360

gaaccacacc acgagtaa 3378

Claims

1.编码O型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组P1-2A-3C，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.编码O型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组P1-2A-3C的突变体，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

3.携带有权利要求1所述亚基因组的重组腺病毒。

4.携带有权利要求2所述亚基因组的突变体的重组腺病毒。

5.按照权利要求3所述的重组腺病毒，其特征在于，其微生物保藏号是：CGMCC No.5719。

6.按照权利要求4所述的重组腺病毒，其特征在于，其微生物保藏号是：CGMCC No.5717。

7.一种构建权利要求3或5所述的重组腺病毒的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将SEQ ID No.1所示的亚基因组和腺病毒穿梭质粒可操作的连接，得到重组腺病毒穿梭表达载体；将重组腺病毒穿梭表达载体与腺病毒骨架载体质粒共转化大肠杆菌，通过细菌内同源重组获得了以质粒形式存在的克隆化重组腺病毒基因组；将克隆化重组腺病毒基因组线型化后转染细胞，获得重组缺损型腺病毒。

8.一种构建权利要求4或6所述的重组腺病毒的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将SEQ ID No.2所示的亚基因组的突变体和腺病毒穿梭质粒可操作的连接，得到重组腺病毒穿梭表达载体；将重组腺病毒穿梭表达载体与腺病毒骨架载体质粒共转化大肠杆菌，通过细菌内同源重组获得了以质粒形式存在的克隆化重组腺病毒基因组；将克隆化重组腺病毒基因组线性化后转染细胞，获得重组的缺损型腺病毒。

9.权利要求1所述的亚基因组或权利要求2所述的的亚基因组突变体在制备预防或治疗口蹄疫的药物或试剂中的应用。

10. 权利要求3-6任何一项所述的重组腺病毒在制备预防或治疗口蹄疫的药物或试剂中的应用。