CN116063418A - 结核分枝杆菌抗原组合物epdpa015及其制备方法与应用 - Google Patents

结核分枝杆菌抗原组合物epdpa015及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体提供结核分枝杆菌抗原组合物EPDPA015及其制备方法与应用。本发明提供的抗原组合物EPDPA015由EsxH、nPPE18、nDnak、nPstS1和Ag85B组成。本发明提供由独立表达的五种抗原构成混合抗原EPDPA015m；以及通过基因工程手段，将表达五种抗原的基因片段经过剪接、优化后依次连接的融合表达抗原EPDPA015f。EPDPA015m和EPDPA015f组均表现出与BCG组相同的抑制分枝杆菌生长能力。因此，该抗原组合作为亚单位疫苗抗原成分能够刺激机体产生足够的保护性细胞免疫和体液免疫。

Description

结核分枝杆菌抗原组合物EPDPA015及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及结核分枝杆菌抗原组合物EPDPA015及其制备方法与应用。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌引起的，卡介苗(BCG)作为目前为止唯一获准用于预防结核病的疫苗，在反复传代和保存中一些保护性抗原不同程度丢失、导致其免疫保护效果减弱，且对成年人保护效果不佳，因此研制新型预防和治疗性结核疫苗势在必行。
机体的抗结核免疫反应主要为致敏T细胞介导的细胞免疫，抗原特异性CD4+、CD8+T细胞在机体抗结核感染中起着关键作用，因此寻找特异性抗原成分是新型亚单位疫苗设计的关键。目前在研疫苗中，亚单位蛋白疫苗仅需一种或几种保护性抗原即可刺激产生有效的免疫反应，避免产生许多无关抗原诱发的抗体，从而减少疫苗的副反应和疫苗引起的相关疾病，因此具有很好的应用开发前景。目前已发现多种免疫优势抗原，主要为分泌蛋白、细胞壁蛋白和菌体裂解释放出的胞浆蛋白，一些能够诱导细胞免疫或体液免疫的蛋白抗原被广泛应用于结核病诊断、治疗及新型疫苗的研制。
目前，进入临床试验阶段的结核病疫苗，包括重组卡介苗、全菌灭活疫苗、DNA疫苗、蛋白/多肽疫苗和病毒载体疫苗等。其中全菌灭活疫苗成分复杂，大剂量接种才可发挥有效的免疫应答，且易出现不良反应；减毒活疫苗不适用于儿童和免疫低下的人群；DNA疫苗和重组卡介苗安全性存在一定争议，而病毒载体疫苗缺点在于机体既存的免疫应答会阻止该免疫抗原发挥效应，从而减弱疫苗功效；另外，机体对活载体的免疫反应限制了再次免疫的效果。
发明内容
卡介苗(BCG)是目前世界上接种最为广泛的结核疫苗，能够有效预防新生儿脑膜结核以及全身粟粒性结核，但对成年人预防效果有限且不适用于免疫缺陷患者。而蛋白亚单位疫苗具有保护性抗原表位多，安全性高等优势。
本发明基于生物信息学分析，对Rv1196(PPE18)、Rv0350(DnaK)和Rv0934(PstS1)基因及其产物进行预测、设计和优化，构建可高效表达潜在T细胞表位聚集簇的基因片段，形成nRv1196、nRv0350和nRv0934，通过基因工程技术体外表达蛋白nPPE18、nDnaK和nPstS1。最后，本发明选用EsxH、nPPE18、nDnak、nPstS1以及Ag85B作为构建EPDPA015亚单位疫苗的潜在候选组分。
第一方面，本发明提供一种结核分枝杆菌抗原组合物，由EsxH、nPPE18、nDnak、nPstS1和Ag85B组成。
EsxH可诱导强的CD4+T细胞应答和高水平IFN-γ分泌。Ag85B可刺激机体产生Th1型细胞因子，诱导增强BCG疫苗的免疫保护效。PPE蛋白家族中的PPE18可介导病原体-宿主的相互作用，是分枝杆菌在细胞内存活的关键毒力因子。分子伴侣蛋白DnaK能诱导人外周血单个核细胞(PBMC)分泌TNF-α和IL-10等保护性细胞因子。而磷酸盐特异性运输底物结合蛋白-1(PstS1p)是Rv0934基因编码的一种参与无机磷酸盐跨膜转运的细胞壁蛋白，可诱导小鼠CD8+T细胞的激活并产生Th1和Th17免疫保护反应。
第二方面，本发明提供一种结核分枝杆菌混合蛋白抗原EPDPA015m，包含Rv0288、nRv1196、nRv0350、nRv0934以及Rv1886c五种基因片段的表达产物。
在本发明提供的结核分枝杆菌混合蛋白抗原EPDPA015m中，所述Rv0288的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述nRv1196的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述nRv0350的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述nRv0934的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，所述Rv1886c的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明提供的结核分枝杆菌混合蛋白抗原EPDPA015m，由独立表达的抗原EsxH、nPPE18、nDnak、nPstS1和Ag85B构成混合抗原EPDPA015m；以摩尔比计，含有相同摩尔量的抗原EsxH、nPPE18、nDnak、nPstS1和Ag85B。
本发明提供的结核分枝杆菌混合蛋白抗原EPDPA015m，所述EsxH的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述nPPE18的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述nDnak的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述nPstS1的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述Ag85B的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
第三方面，本发明请求保护一种DNA片段，所述DNA片段为编码抗原nPPE18的nRv1196，所述nRv1196的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
或，所述DNA片段为编码抗原nDnak的nRv0350，所述nRv0350的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；
或DNA片段为编码抗原nPstS1的nRv0934，所述nRv0934的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。
本发明对现有技术中，编码结核分枝杆菌PPE家族蛋白nPPE18、分子伴侣蛋白nDnak、的基因片段进行选择和优化。最终得到核苷酸序列如SEQ ID NO.2和3所示，比起已有的DNA片段，本发明提供的SEQ ID NO.2和3优势在于：本发明利用生物信息学软件对蛋白抗原进行表位分析和预测，根据分析预测结果，选择能与MHC分子结合，又能与TCR结合的表位多肽，经过剪接，删除免疫原性相对较弱的冗余片段，形成抗原表位集中区，增强抗原免疫原性。
结核亚单位疫苗抗原选择的最佳策略是联合结核分枝杆菌不同感染阶段的优势抗原以期提高疫苗保护效力。目前尚有许多未被应用于结核疫苗开发但已被证明免疫原性良好的抗原，如PstS1、Dnak等具有成为疫苗候选抗原的潜力。因此，基于多阶段抗原联合效果优于单一抗原的疫苗制备思路，本发明选用EsxH、PPE18和Ag85B等生长期抗原、Dnak等潜伏期抗原以及各时期稳定表达的PstS1等五种抗原制备多阶段疫苗。
此外，机体免疫细胞发挥免疫效应是通过识别并结合抗原表位而非整个抗原分子，而上述M72、H4、H56:IC31、AEC/BC02等候选疫苗均采用完整抗原分子作为组分，但本发明在选择具有良好免疫原性的完整优势抗原分子基础上，依据生物信息学软件预测抗原表位，剪切冗余片段，提高了免疫针对性。
第四方面，本发明提供一种融合蛋白抗原EPDPA015f，所述融合蛋白抗原EPDPA015f的核苷酸序列从N端到C端按照Rv0288、nRv1196、nRv0350、nRv0934以及Rv1886c，通过linker连接得到联合基因。
本发明所提供的融合蛋白抗原EPDPA015f，所述联合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，所述联合基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
第五方面，本发明提供上述的结核分枝杆菌抗原组合物或上述的结核分枝杆菌混合蛋白抗原EPDPA015m或上述的融合蛋白抗原EPDPA015f在以下任一方面的应用：
(1)制备诊断结核分枝杆菌感染或结核分枝杆菌感染引起疾病的试剂；
(2)制备预防结核分枝杆菌感染疫苗；
(3)制备治疗结核分枝杆菌感染引起疾病的药物。
本发明的有益效果：
本发明构建EPDPA015m和EPDPA015f联合氢氧化铝佐剂的两种新型亚单位疫苗免疫BALB/c小鼠，以BCG作为阳性对照，以PBS与佐剂作为阴性对照，评价和分析EPDPA015m和EPDPA015f的免疫学效果。EPDPA015m组和EPDPA015f组的体液免疫特异性抗体IgG水平均显著高于BCG组，表明与BCG相比，EPDPA015m和EPDPA015f用于制备亚单位疫苗均可产生较强的体液免疫，且IgG2a/IgG1结果显示两种蛋白均倾向诱导Th2型免疫反应。EPDPA015f/佐剂诱导产生的IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-10和IL-17四种抗原特异性细胞因子显著高于BCG对照组，其中IL-12可促进Th0向Th1分化，增加IFN-γ、TNF-α分泌从而扩大Th1应答效应；而由CD4+Th2细胞分泌产生的IL-10可辅助体液免疫，IL-17可募集、活化中性粒细胞和单核细胞，诱导局部炎症反应，提示EPDPA015f/佐剂可刺激多种细胞参与机体免疫应答。EPDPA015m/佐剂诱导产生的IL-12水平高于BCG对照组，表明EPDPA015m蛋白作为亚单位疫苗也可诱导产生比BCG更全面的免疫保护反应。体外分枝杆菌抑制实验表明，亚单位疫苗EPDPA015m/佐剂和EPDPA015f/佐剂均表现出比BCG更强的抑制分枝杆菌生长能力。因此，本发明的抗原组合物EPDPA015整体上表现出较优的免疫原性和保护效应，能引起机体产生较强的抗原特异性细胞免疫应答和体液免疫应答，具有作为独立疫苗或卡介苗加强型疫苗的潜力。
本发明选择多组分蛋白构建亚单位疫苗，克服了单一抗原组分有效抗原表位不足的问题；同时选择表位聚集区的序列nPPE18、nDnak、nPstS1而非抗原全长作为多组分抗原成分，有效提高了免疫针对性，能够刺激机体产生与全抗原相当甚至更强的免疫反应。本发明不仅选择结核生长期抗原EsxH、Ag85B作为组分，还选择结核潜伏期优势抗原Dnak和分枝杆菌细胞壁优势抗原PstS1的表位聚集区作为抗原组分，克服了抗原类型单一的问题，也为后续抗结核疫苗的研制提供了新的思路。
总的来说，本发明提供的结核分枝杆菌抗原组合物EPDPA015作为结核病新型疫苗候选抗原兼备了制备方法简单易行，适合大规模生产，且成本较低等优势。因此，基于本发明的抗原组合物EPDPA015制成的亚单位疫苗有望成为新型结核疫苗候选。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是纯化得到EPDPA015m各组分抗原和融合蛋白EPDPA015f的SDS-PAGE结果图，其中，1为组合15融合蛋白、2为EsxH、3为nPPE18、4为nDnak、5为nPstS1、6为Ag85B，其理论分子量分别为88.4kD、31.07kD、31.4kD、33.82kD、40.75kD、56.26kD。
图2是EPDPA015f、EPDPA015m和BCG血清抗体滴度的检测结果；图中，ns代表P＞0.05，结果无统计学差异，*代表P≤0.05，结果有统计学差异，**代表P≤0.01，结果有统计学差异，***代表P≤0.001，结果有统计学差异，****代表P≤0.0001，结果有统计学差异。
图3是EPDPA015f、EPDPA015m和BCG的IgG2a和IgG1比值，图中，ns代表P＞0.05，结果无统计学差异，*代表P≤0.05，结果有统计学差异，**代表P≤0.01，结果有统计学差异。
图4a是ELISPOT的IFN-γ结果图，图中，ns代表P＞0.05，结果无统计学差异，***代表P≤0.001，结果有统计学差异，****代表P≤0.0001，结果有统计学差异。
图4b是ELISPOT的IL-4结果图，图中，ns代表P＞0.05，结果无统计学差异，*代表P≤0.05，结果有统计学差异，***代表P≤0.001，结果有统计学差异，****代表P≤0.0001，结果有统计学差异。
图5是EPDPA015f组TNF-α、IL-12、IL-17和IL-10四种细胞因子分泌水平，图中，ns代表P＞0.05，结果无统计学差异，*代表P≤0.05，结果有统计学差异，**代表P≤0.01，结果有统计学差异，***代表P≤0.001，结果有统计学差异。
图6是EPDPA015f、EPDPA015m的体外保护效应评价，图中ns代表P＞0.05，结果无统计学差异。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1T细胞表位预测及富含T细胞表位序列的选择
检索美国国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，简称NCBI)数据库中结核分枝杆菌Rv1196(PPE18)、Rv0350(DnaK)和Rv0934(PstS1)基因序列及其表达产物的氨基酸序列。利用NetMHCⅡpan3.2 Server、SYFPEITHI、TEpredict和IEDB等在线生物信息学分析工具预测PPE18、Dnak、PstS1的CD4+、CD8+T细胞表位，选取HLA-Ⅱ类分子(HLA-DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0802、DRB1*0901、DRB1*1101、DRB1*1302、DRB1*1501)、MHC类型选择HLA-Ⅰ类分子HLA-A*0201、*0202、*0203、*0206作为预测限定条件，筛选与HLA-Ⅰ类分子和HLA-Ⅱ类分子结合性较好的表位肽段，得到优势抗原表位肽集中区。以PPE18的第201-300位氨基酸序列、以Dnak蛋白的第260-381位氨基酸序列、PstS1的第57-135位氨基酸序列以及第268-373位氨基酸序列，经过生物信息学分析，选择抗原表位集中区，剪切冗余片段，连接表位集中区，经过这样的剪接、优化后，构建表位富集区基因片段nPPE18、nDnak和nPstS1，所获得抗原免疫原性更强。
实施例2结核分枝杆菌EsxH、nPPE18、nDnak、nPstS1、Ag85B以及融合蛋白EPDPA015f重组质粒构建
1、引物设计
根据NCBI上传的结核分枝杆菌H37Rv的Rv0288、Rv1886c基因序列以及抗原表位肽nPPE18、nDnak、nPstS1的基因序列，利用Primer primer5.0软件设计引物，引物信息如表1所示。
表1
Figure BDA0003989135800000071
2、重组质粒的构建与鉴定
(1)Rv0288、Rv1886c基因获得：利用CTAB法提取结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA，以该DNA为模板，利用PCR技术扩增Rv0288、Rv1886c基因，反应体系如表2所示。
表2
Figure BDA0003989135800000072
PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性1min，61℃退火1min，72℃延伸70s，30个循环，72℃延伸10min。然后利用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，条带与预期目的片段一致，用于重组表达质粒构建。
(2)nRv1196、nRv0350、nRv0934基因获得：将实例1中经剪接、优化后构建表位富集区基因片段nRv1196、nRv0350、nRv0934上下游分别加上EcoRⅠ和HindIII，利用基因工程技术合成，构建重组质粒19T-nRv1196、19T-nRv0350、19T-nRv0934。
(3)双酶切：将上述Rv0288、Rv1886c基因的PCR产物、重组质粒19T-nRv1196、19T-nRv0350、19T-nRv0934以及表达载体pET32a分别利用限制性内切酶EcoRⅠ和HindIII双酶切，酶切体系如表3所示。
表3酶切体系
Figure BDA0003989135800000081
(4)回收目的片段：将酶切体系置于37℃水浴1h，1％琼脂糖凝胶电泳，然后利用Promega切胶回收试剂盒切胶回收，具体步骤如下：
①将带有目的片段的胶块切好后放入干净的1.5ml的离心管中，并将胶块质量称量记录；
②按照10mg胶块加入10μL Membrance Binding溶液的比例加入适量的该溶液，56℃水浴溶解，期间可以震荡；
③将溶解后的液体加入SV柱子中，室温放置1min，12000rpm离心1min，将液体倾倒；
④加入700μL Membrance Wash溶液，12000rpm离心1min，液体弃掉；
⑤重复上一步；
⑥12000rpm空转2min，将SV柱子取出，室温放置5min；
⑦将SV柱子放入洁净的1.5ml离心管中，加入50μL无核酸酶水，室温放置2min，12000rpm离心1min；
⑧将离心后液体吸取后再次加入SV柱子中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
(5)连接：利用1％琼脂糖电泳检测回收样品是否成功，成功后进行重组表达载体构建。将上述基因片段分别与pET32a载体在16℃连接1h，连接体系如表4所示。
表4重组表达载体连接体系
Figure BDA0003989135800000091
(6)转化：将连接产物加入DH5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入900μL LB液体培养基，37℃振荡培养1h，4000rpm离心1min，弃掉600μL上清，然后重悬菌体，取200μL菌液涂布在含有氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养16h。挑取单菌落于5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养12h后测序验证。
(7)融合蛋白EPDPA015f重组质粒构建：将基因片段以Rv0288-[linker]-nRv1196-[linker]-nRv0350-[linker]-nRv0934-[linker]-Rv1886c依次串联合成后克隆于pET43.1a载体，序列两端连接的酶切位点为NdeⅠ和XhoⅠ，Linker由GGTGGTTCTGGCGGT(SEQID NO.23)基因序列组成，对应氨基酸为GGSGG。
实施例3结核分枝杆菌抗原EsxH、nPPE18、nDnak、nPstS1、Ag85B以及融合蛋白EPDPA015f的表达纯化及复性
(1)转化：将实施例2中构建成功的六种重组质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，具体方式为：将重组质粒与感受态细胞混合后冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入800μl LB液体培养基，37℃振荡培养1h，4000rpm离心1min，弃600μl上清，重悬剩余培养基，取200μl菌液涂布在含有氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养16h。
(2)诱导表达：挑取单菌落接种至含氨卞青霉素的LB液体培养基中37℃、180rpm增菌培养，加入1mM终浓度的异丙基β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)在适宜温度条件下培养一定时间诱导目的蛋白表达。(各蛋白诱导表达条件见表5)
表5各组分蛋白诱导表达条件
Figure BDA0003989135800000092
Figure BDA0003989135800000101
(3)超声破碎：诱导结束后4℃、4000rpm离心10min收集菌体，20mmol/LTris-HCl重悬菌体后使用超声破碎菌体(超声参数为220W，工作15s间隔20s，共15min)，超声结束后12000rpm离心10min分离上清和沉淀，利用15％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定重组蛋白的表达水平和表达形式(各蛋白表达形式见表6)。若为可溶性蛋白，将上清转移至50mL离心管中再次离心收集上清；若为包涵体，则再加入20mMTris-HCl裂解液震荡混匀，再次冰浴超声10min后4℃、12000rpm离心5min弃上清，先加入去离子水重悬沉淀，再加入8mol/L尿素，于4℃条件下12000rpm离心5min，收集上清。
(4)纯化：根据重组蛋白的表达形式选择不同的纯化方法，在安装His柱水洗柱材后，使用20mmol/LTris-HCl以5倍柱体积清洗柱材。1％ NiSO4过柱，使Ni2+充分与亲和层析柱材充分耦合。其中可溶性蛋白使用可溶性结合缓冲液(10mM咪唑、0.5MNaCl、20mMTris-HCl)，包涵体重组蛋白使用包涵体结合缓冲液(8mol/L尿素，0.5MNaCl，20mMTris-HCl)。调节样品的pH至8.0后泵入样品，收集流穿液。依次使用含不同浓度咪唑，梯度洗脱目的蛋白，其中可溶性蛋白使用可溶性蛋白洗脱缓冲液(15mmol/L、30mmol/L、60mmol/L、150mmol/L咪唑，0.5MNaCl，20mMTris-HCl)，包涵体蛋白使用包涵体蛋白洗脱缓冲液(15mmol/L、30mmol/L、60mmol/L、150mmol/L咪唑，8mol/L尿素，20mMTris-HCl)，蛋白检测仪280nm波长处的吸光度变化时收集洗脱液，对收集的不同咪唑浓度的洗脱液进行SDS-PAGE鉴定纯化效果。
对于镍亲和层析纯化产物纯度不够的两种蛋白EsxH和Ag85B，采用截留分子量为10kDa的透析袋透析除盐后进行离子交换层析，EsxH采用20mmol/LTris-HC1平衡柱材，Ag85B采用8M尿素平衡柱材后，采用不同浓度NaCl进行梯度洗脱，其中可溶性蛋白使用可溶性蛋白洗脱缓冲液(100mM、200mM、400mMNaCl，20mMTris-HCl)，包涵体蛋白使用包涵体蛋白洗脱缓冲液(100mM、200mM、400mMNaCl，8mol/L尿素，20mMTris-HCl)，收集各阶段样品进行SDS-PAGE电泳鉴定纯化效果。(各蛋白表达形式和洗脱条件见表6)
表6蛋白表达形式及纯化条件
Figure BDA0003989135800000111
(5)复性：纯化结束后将目的蛋白装入透析袋中梯度透析去除尿素、咪唑及其他小分子杂质，蛋白透析液中尿素浓度逐步降低，即6mol/L、4mol/L、2mol/L、1mol/L、0.5mol/L和不含尿素的透析液。最后使用pH为8.0的20mMTris-HCl在14℃条件下透析14～16h，透析结束后超滤浓缩并用0.22μm滤器滤过除菌，分装后于-70℃保存。纯化得到EPDPA015m各组分抗原和融合蛋白EPDPA015f的SDS-PAGE结果见图1。
实施例4混合物EPDPA015m和融合蛋白EPDPA015f免疫原性评价
1、实验动物选择和免疫方式
选用SPF级6周龄的BABL/c雌性小鼠，将30只小鼠随机分成5组，分别为PBS组、氢氧化铝佐剂组、BCG组、EPDPA015f组、EPDPA015m组，每组6只。
免疫方式：BCG组免疫1×106CFU活菌，共免疫一次；PBS组、佐剂组按200μl/只的量免疫PBS和佐剂，EPDPA015m抗原按照各组分蛋白等摩尔比混合，EPDPA015f组免疫融合蛋白EPDPA015f，剂量为50μg/只，将融合蛋白抗原EPDPA015f与混合抗原EPDPA015m分别与氢氧化铝佐剂按照体积比3:1混匀后，每只老鼠经皮下多点免疫3次，间隔周期为10天。
2、血液样本采集
通过眼眶采血法采集初次免疫前以及小鼠处死前血液，37℃静置2h，4000rpm离心10min，分离血清，分装后存放于-20℃。
3、血清抗体滴度检测
检测小鼠血清中特异性IgG、IgG1以及IgG2a的滴度，具体方法为：分别用EPDPA015f与EPDPA015m抗原包被酶标板，将抗原稀释到2μg/ml每孔加入100μL，4℃包被过夜；PBST洗板5次后每孔加入100μL封闭液(PBST+0.5％脱脂奶粉)，37℃孵育2h；弃除封闭液，PBST洗板5次后拍干；每孔加入100μL稀释后的血清(血清进行2倍梯度稀释)，37℃孵育2h；PBST洗板6次并且将残余液体去除干净候每孔加入100μLHRP标记的羊抗鼠IgG、IgG1以及IgG2a抗体(1：5000稀释)，37℃孵育1h；PBST洗板6次后每孔中加入TMB显色液100μL，37℃孵育15min；显色结束后每孔加入100μL2MH2SO4终止反应；最后，酶标仪检测450nm吸光值A450。
各组血清抗体滴度的检测结果见图2。结果显示EPDPA015f与EPDPA015m免疫后小鼠血清IgG、IgG1和IgG2a抗体效价均显著高于BCG组小鼠血清抗体效价，其中EPDPA015f免疫组小鼠血清抗体效价最高，表明EPDPA015f与EPDPA015m均可刺激机体产生较强体液免疫反应且EPDPA015f刺激体液免疫能力更强。IgG2a/IgG1比值见图3。通过计算IgG2a和IgG1比值可知EPDPA015f与EPDPA015m刺激后产生免疫效应均偏向于Th2型体液免疫。
4、细胞免疫检测
(1)小鼠脾脏淋巴细胞的分离(最后一次免疫后一周处死小鼠后取脾脏)
①颈椎脱臼处死小鼠，用75％医用酒精浸泡小鼠消毒，将小鼠解剖取出脾脏，放入RPMI1640中，1h之内分离淋巴细胞；
②利用小鼠淋巴细胞分离液分离淋巴细胞；
③分离淋巴细胞后测定淋巴细胞浓度，并调整至浓度为1×106cells/ml用于后续实验。
(2)ELISPOT检测IFN-γ与IL-4释放
①预包被板的活化：加入200μL/well的RPMI-1640培养基，室温静置5-10分钟后将其扣出。
②加入细胞悬液及刺激物：将调整好浓度的细胞悬液按100μL/well加入各实验孔，随后加入刺激物。
正对照孔：加入阳性刺激物ConA(伴刀豆蛋白)1μg/well；
负对照孔：加入PBS组、佐剂组、BCG组、EPDPA015f组、EPDPA015m组免疫后的小鼠脾细胞，不加对应刺激物分别作为各组负对照；
背景负对照：加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，不加细胞悬液；
实验孔：a.EPDPA015f组加入2μg/well的融合蛋白EPDPA015f。
b.EPDPA015m组加入2μg/well，即各组分蛋白等摩尔比混合制备混合蛋白EPDPA015m。
③孵育：将预包被板放入37℃，5％CO2培养箱静置培养20-24小时。
④裂解细胞：倾倒孔内细胞及培养基。加入200μL/well去离子水，4℃冰箱放置10分钟低渗裂解细胞。
⑤洗板：甩出孔内液体，加入200μL/well的1×Washing Buffer洗板六次后拍干。
⑥抗体孵育：加入100μL/well的1×Biotinylated Antibody工作液至各实验孔，37℃孵育1小时。
⑦洗板：重复步骤5。
⑧酶联亲和素孵育：加入100μL/well的1×Streptavidin-HRP工作液至各实验孔，37℃孵育1小时。
⑨洗板：甩出孔内液体，加入200μL/well的1×Washing Buffer工作液洗板五次后扣干，洗涤完成后揭开板底座，用去离子水/自来水洗涤膜底面及底座，用吸水纸小心吸干底座及膜底残留的水迹，合上底座。
⑩显色：将100μL/well的现配的AEC显色液加入各实验孔。37℃孵箱避光静置5-30分钟。
Figure BDA0003989135800000131
终止显色：倾倒孔内液体，揭开板底座，用去离子水/自来水洗涤各实验孔正反面及底座3-5遍，终止显色。将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座。
Figure BDA0003989135800000132
ELISPOT板斑点计数，进行结果分析。
实验结果：ELISPOT的IFN-γ结果如图4a所示，IL-4结果如图4b所示。IFN-γ、IL-4结果显示，EPDPA015m组诱导产生的IL-4水平与BCG相当，提示EPDPA015m能诱导产生Th2型免疫反应。此外，EPDPA015f组的IFN-γ释放量显著高于BCG组和EPDPA015m组，并产生不低于BCG组的IL-4，提示EPDPA015f组能诱导产生比BCG更强的Th1型以及Th2型免疫反应。
(3)Lumminex法检测胞外细胞因子
小鼠脾淋巴细胞分离同ELIPOT实验。
每组取100μL上述调整好浓度的脾细胞置于24孔培养板中，加入10μg/well特异性抗原，将脾细胞与相应的刺激物在37℃，5％CO2培养箱中孵育72小时后，收集细胞上清，通过Luminex多因子检测技术检测TNF-α、IL-12、IL-17和IL-10四种细胞因子水平。
结果如图5所示，EPDPA015f组TNF-α、IL-12、IL-17和IL-10四种细胞因子水平均显著高于BCG组，提示EPDPA015f/佐剂能够诱导比BCG更为全面的免疫保护效应；EPDPA015m组TNF-α、IL-17和IL-10三种细胞因子分泌水平与BCG组相当，IL-12分泌水平显著高于BCG组和EPDPA015f，提示EPDPA015m/佐剂也可产生相较于BCG更强的免疫保护效应。
实施例5体外保护效应评价
1、小鼠脾淋巴细胞分离：分离步骤同上述实例4操作步骤，分离淋巴细胞后测定淋巴细胞浓度并调整至浓度为1×106cells/ml。
2、结核分枝杆菌体外感染
取1ml上述调整好浓度的脾淋巴细胞于24孔板中，接种100μL/well倍比稀释后的结核分枝杆菌H37Rv混悬液(即每个样品孔接种50CFU分枝杆菌)得到脾细胞-结核分枝杆菌共培养物(约1ml)，37℃孵育96h。
分枝杆菌悬液制备方法：调整分枝杆菌吸光度为1OD后四次10倍比稀释，具体稀释方式为取1ml的1OD菌液1ml加入9mL PBS，进行三次10倍稀释后，第四次稀释为取第三次稀释的菌液1mL加入9ml完全1640培养基。结核分枝杆菌混悬液需在制备后1小时内接种于含脾细胞的培养基中。
2、培养：37℃孵育96h后将培养物在24孔板的孔中上下吹打3次，将脾细胞-分枝杆菌共培养物转移到2ml离心管中，12000rpm离心10分钟。用500μL无菌组织培养级水重悬细胞并室温孵育15min以裂解细胞，涡旋混匀，取50μl涂布于7H10平板后37℃培养2周，对各组平板进行菌落计数。
4、数据处理：实验数据以每管样品的log10CFU表示，用样品的生长比值(CFU样品(96小时)/CFU第0天对照)。
结果如图6所示，EPDPA015f组和EPDPA015m组菌落数明显少于BCG组，其中EPDPA015f菌落数减少0.54log10CFU/ml，EPDPA015m菌落数减少0.39log10CFU/ml，提示以EPDPA015f和EPDPA015m为基础构建的亚单位疫苗具有强于BCG的体外保护效应。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种结核分枝杆菌抗原组合物，其特征在于，由EsxH、nPPE18、nDnak、nPstS1和Ag85B组成。
2.一种结核分枝杆菌混合蛋白抗原EPDPA015m，其特征在于，包含Rv0288、nRv1196、nRv0350、nRv0934以及Rv1886c五种基因片段的表达产物。
3.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌混合蛋白抗原EPDPA015m，其特征在于，所述Rv0288的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述nRv1196的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述nRv0350的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述nRv0934的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述Rv1886c的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌混合蛋白抗原EPDPA015m，其特征在于，由独立表达的抗原EsxH、nPPE18、nDnak、nPstS1和Ag85B构成混合抗原EPDPA015m；以摩尔比计，含有相同摩尔量的抗原EsxH、nPPE18、nDnak、nPstS1和Ag85B。
5.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌混合蛋白抗原EPDPA015m，其特征在于，所述EsxH的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述nPPE18的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述nDnak的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述nPstS1的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述Ag85B的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
6.一种DNA片段，其特征在于，所述DNA片段为编码抗原nDnak的nRv0350，所述nRv0350的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；或DNA片段为编码抗原nPstS1的nRv0934，所述nRv0934的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
7.一种融合蛋白抗原EPDPA015f，其特征在于，所述融合蛋白抗原EPDPA015f的核苷酸序列从N端到C端按照Rv0288、nRv1196、nRv0350、nRv0934以及Rv1886c，通过linker连接得到联合基因。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白抗原EPDPA015f，其特征在于，所述联合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述联合基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
9.权利要求1所述的结核分枝杆菌抗原组合物或权利要求2-5任一项所述的结核分枝杆菌混合蛋白抗原EPDPA015m或权利要求7-8任一项所述的融合蛋白抗原EPDPA015f在以下任一方面的应用：
(1)制备诊断结核分枝杆菌感染或结核分枝杆菌感染引起疾病的试剂；
(2)制备预防结核分枝杆菌感染疫苗；
(3)制备治疗结核分枝杆菌感染引起疾病的药物。
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