CN104313127B - 一种用于快速特异检测结核杆菌感染的试剂盒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于快速特异检测结核杆菌感染的试剂盒，包括三对分别用于结核杆菌游离小RNA的特异性引物。本发明通过设计针对结核杆菌游离小RNA的特异性引物，从人外周血中提取和检测结核杆菌游离小RNA，合成cDNA后，建立了含梯度稀释的cDNA实时定量扩增体系，从而建立快速特异的结核菌感染检测的试剂盒及方法，最终解决了结核患者实验室诊断耗时长、敏感性低和操作复杂等问题。实验证明本发明的试剂盒可用于临床实验室检测结核杆菌感染，还可用于临床治疗效果的评价。使用本发明的试剂盒进行结核杆菌的检测具有敏感性高、特异性好、成本低、操作方便等优点，能够满足临床及实验室快速诊断的需要。

Description

一种用于快速特异检测结核杆菌感染的试剂盒及其用途
技术领域
本发明涉及一种用于检测结核杆菌感染的试剂盒，特别涉及一种能够快速而且特异地从人外周血中检测结核菌感染的试剂盒，本发明属于结核杆菌的临床诊断领域。
背景技术
结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。估计世界人口中1/3感染结核分枝杆菌。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。
20世纪80年代后，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及人口流动等因素，全球范围内结核病的疫情骤然恶化。据WHO统计，全世界约每3个人中就有1个人感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成人中结核分枝杆菌携带率高达80％，其中约5％～10％携带者可发展为活动性结核病。近二十年由于艾滋病的流行，感染了HIV的结核分枝杆菌携带者，由于病毒破坏了机体的免疫功能，发展为活动性结核病的可能性比未感染HIV者高30～50倍，且结核的病程发展更快。此外，在HIV感染的发展进程中，结核是最早发生的一种机会性感染，结核病加重了HIV感染者或艾滋病人的疾病负担，使其更易死亡。目前全球每年约出现800万结核新病例，并导致约300万万人死亡。中国每年死于结核病的人约25万之多，是各类传染病死亡人数总和的两倍多。因此，结核病又成为了威胁人类健康的全球性卫生问题，并成为某些发展中国家和地区，特别是艾滋病高发区人群的首要死因。
在本发明的前期工作中已经明确了人结核杆菌H37Rv株染色体为4,411,532bp，通过分析细菌中提取的小分子RNA，或者用基于生物信息学的方法，目前在该株细菌中共确认和验证了100余种小RNA(sRNA)，它们不仅调控结核菌的基因表达，而且参与细菌的应激调节，同时也可能参与感染和致病。本发明的前期试验表明，这些小RNA还可以释放到菌体外，在人体循环中发挥作用。在外周血中，小RNA与microRNA一样有很好的抗RNA酶降解的作用。提示它们可用于结核杆菌感染的外周血检测诊断中。
在本发明的前期试验中，发明人选取了已明确存在结核杆菌中的若干种sRNA用实时荧光定量PCR的方法在人外周血中进行了检测。通过对结核患者外周血样本离心分离的血浆进行结核菌sRNA的检测，结果发现患者外周血浆中存在结核菌sRNA。提示结核菌sRNA可能具有分泌功能。
细菌sRNA具有复杂的二级结构，对PCR反应体系及条件要求高，易出现非特异反应，即假阳性，给实验室诊断带来一定困难。所以建立一个敏感度高、特异性好的实验室诊断方法在结核杆菌快速诊断中是至关重要的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有结核杆菌感染检测技术中耗时长、阳性率低和操作复杂等缺点，提供了一种方便的、高敏感性和特异性、可广泛应用的sRNA检测的试剂盒。利用本发明的试剂盒可以实现快速，高效，准确地从人外周血中检测结核菌感染的目的。
为了达到上述目的本发明采用了以下技术手段：
1.根据实验室前期研究结果，自主设计了三对分别用于人外周血中结核杆菌游离小RNA的检测引物，并建立检测和疾病诊断的具体应用方法；
2.基于实时荧光定量PCR标准曲线的绘制原理，在实时荧光定量PCR样本体系中加入浓度倍比稀释的模板，进一步通过反应中测得的CT值是否成线性关系来确定sRNA在外周血中的有无。
具体的，本发明的一种用于快速特异检测结核杆菌感染的试剂盒，其特征在于包括三对分别用于结核杆菌游离小RNA的特异性引物，第一对引物的核苷酸序列分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，第二对引物的核苷酸序列分别为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示，以及第三对引物的核苷酸序列分别为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。
在本发明中，优选的，所述的试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒。
在本发明中，优选的，所述的试剂盒中还包括SYBRGreen染料。
在本发明中，优选的，所述的试剂盒用于快速特异检测结核杆菌感染，按照以下步骤进行：
(1)从患者的外周血中分离血浆，并提取其中的总RNA；
(2)利用随机引物将提取得到的总RNA逆转录成cDNA；
(3)分别应用权利要求1中的三对特异性引物对上述cDNA进行体外核酸扩增；
(4)根据扩增结果判断是否感染。
其中，优选的，所述的体外核酸扩增是指采用实时荧光定量PCR方法进行扩增。
其中，优选的，以原液、4倍稀释、16倍稀释的模板分别进行实时荧光定量PCR扩增，通过荧光检测分别得到模板原液CT值、4倍稀释的CT值及16倍稀释的CT值，如果稀释倍数与CT值成线性关系则说明血液样本中存在结核菌sRNA，即感染了结核杆菌。
进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备快速特异检测结核杆菌感染的试剂中的应用。
相较于现有技术，本发明的优点是：
1、本发明所涉及检测的结核杆菌小RNA为游离存在于患者外周血中，标本容易获得。
2、本发明所涉及的结核杆菌小RNA可以抵抗RNA酶的降解作用，在外周血中稳定存在。
3、本发明所涉及的核酸扩增方法可以高灵敏度的检测血中低水平的结合小RNA，且本发明的三对引物只在结核杆菌(BCG)中呈特异性扩增反应，而对于常见的感染性细菌大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌无扩增，说明本发明设计的引物具有良好的特异性。
4、本发明涉及到的倍比稀释基于实时定量PCR标准曲线的绘制，具有强大的理论基础。
5、本发明所涉及的检测方法无需结核菌培养，因此使用更安全、更快速。
6、本发明所涉及的引物根据细菌小RNA特点设计，序列更加优化。
7、结核菌感染率高，是当今感染的局势和特点，本发明所涉及的检测方法便于大规模筛查检测，能够满足当前对于结核菌感染检测的需要。
附图说明
图1为正常人与患者血清中sRNA荧光定量PCR检测的CT值结果；
其中患者CT值相对正常人小且具有线性关系，正常人CT值较高且无线性关系；
图2为患者cDNA梯度稀释后定量PCR荧光累积曲线；
图3为正常人cDNA梯度稀释后定量PCR荧光累积曲线；
图4为qPCR的反应条件设定；
图5为使用发明的引物的特异性PCR检测结果；
图5A为第一对引物的特异性PCR检测结果，图5B为第二对引物的特异性PCR检测结果，图5C为第三对引物的特异性PCR检测结果；
图6为不同拷贝数小RNA用对应引物对(第一对引物)做定量PCR的荧光图及CT检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来和附图进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚"但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制"本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1引物的设计与合成
根据实验室前期研究结果，自主设计并合成了三对分别用于结核杆菌游离小RNA的特异性引物，第一对引物的核苷酸序列分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，第二对引物的核苷酸序列分别为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示，以及第三对引物的核苷酸序列分别为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示(表1)。
表1多重PCR检测引物组
SEQ ID No.1 CCACCTACTCGATGGCGTTG
SEQ ID No.2 ACTTACGGGGATTGGGAGGT
SEQ ID No.3 ATAGAGGACGGAGTCGATGA
SEQ ID No.4 AGAAACTTCGGATCGAGGTA
SEQ ID No.5 AACTCCGACAGGGCTGGAAG
SEQ ID No.6 CGTGGCTATACCAAGGTCCA
实施例2本发明的多重PCR引物组在检测结核杆菌感染中的应用
方法：
1、血浆中总RNA的提取
(1)获取血浆：
采集患者或正常个体外周血3-5毫升，1000g/分，水平离心10分钟。小心吸取上层血浆200微升至无菌1.5毫升离心管中。
(2)总RNA提取：
200微升血浆中，加入500微升酚胍RNA提取液，充分混匀，室温静置5分钟。加入300微升氯仿，混匀后12000转/分离心10分钟。小心吸取上层澄清液体至一无菌2毫升离心管中。加入900微升丙酮，混匀后用硅胶膜吸附。蛋白洗液冲洗一次，100％乙醇和80％乙醇依次冲洗一次，待乙醇挥发后，用TE或去离子水洗脱RNA，收集与无菌1.5毫升离心管中，即为血浆中总RNA。
2、总RNA逆转录成cDNA
(1)反应体系：
总RNA取10微升，9碱基随机引物1微升，dNTP1微升，逆转录酶100单位，5倍浓缩反应缓冲液4微升，0.1M二硫苏糖醇1微升，去离子水补充体积到20微升。
(2)反应条件：
50℃一小时，75℃15分钟后，低温保存，即为cDNA。
3、利用小RNA引物及梯度模板PCR检测结核菌感染情况
(1)PCR体系：
SYBRGreen10微升，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示引物各0.4微升，cDNA模板1微升(原液、4倍稀释、16倍稀释)，加去离子水补充体积至20微升。
(2)PCR反应条件：如图4所示。
按照相同方法，使用其余两对引物进行PCR检测。
结果：
不同梯度模板DNA扩增的产物所产生的荧光量被检测到以Ct值得形式呈现出来，通过比较Ct值梯度变化来确定是否扩增出目的片段。
正常人与患者血清中sRNA荧光定量PCR检测的CT值结果如图1所示，其中患者CT值相对正常个体小且具有线性关系，正常个体CT值较高且无线性关系。图2为患者cDNA梯度稀释后定量PCR荧光累积曲线，图3为正常个体cDNA梯度稀释后定量PCR荧光累积曲线。
从该结果可以看出，检测患者外周血时，稀释倍数与CT值成线性关系，说明血液样本中存在结核菌sRNA，即感染了结核杆菌。而检测正常个体外周血时，稀释倍数与CT值无线性关系，说明血液样本中不存在结核菌sRNA，即没有感染结核杆菌。
实施例3特异性实验
用本发明所设计的引物对两种结核杆菌感染的主要细胞(THP-1和A549)和常见的感染性细菌大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌进行PCR反应，结果如图5所示。
从图5结果可以看出，本发明的三对引物只在结核杆菌(BCG)中呈特异性扩增反应，而对于THP-1和A549和常见的感染性细菌大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌无扩增，说明本发明设计的引物具有良好的特异性。
实施例4灵敏度实验
图6为不同拷贝数小RNA用对应引物(第一对引物)对做定量PCR的荧光图及CT检测结果，小RNA模板为本发明前期研究中构建的质粒，模板拷贝数从左至右依次为6*105copies、6*104copies、6*103copies、6*102copies、6*101copies、6copies。
结果表明，本发明的引物(SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示)在样本中游离小RNA拷贝数小于10copies的时候也可以检测出，说明灵敏度高。

Claims (6)

1.一种用于快速特异检测结核杆菌感染的试剂盒，其特征在于包括三对分别用于结核杆菌游离小RNA的特异性引物，第一对引物的核苷酸序列分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，第二对引物的核苷酸序列分别为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示，以及第三对引物的核苷酸序列分别为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还包括SYBRGreen染料。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于用于快速特异检测结核杆菌感染，按照以下步骤进行：
(1)从患者的外周血中分离血浆，并提取其中的总RNA；
(2)利用随机引物将提取得到的总RNA逆转录成cDNA；
(3)分别应用权利要求1中的三对特异性引物对上述cDNA进行体外核酸扩增；
(4)根据扩增结果判断是否感染。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述的体外核酸扩增是指采用实时荧光定量PCR方法进行扩增。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于以原液、4倍稀释、16倍稀释的模板分别进行实时荧光定量PCR扩增，通过荧光检测分别得到模板原液CT值、4倍稀释的CT值及16倍稀释的CT值，如果稀释倍数与CT值成线性关系则说明血液样本中存在结核菌sRNA，即感染了结核杆菌。
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