CN106755107A - 一种car新分子及其在肿瘤治疗中的应用 - Google Patents

一种car新分子及其在肿瘤治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种CAR新分子及其在肿瘤治疗中的应用。具体的，本发明公开了在T细胞或NK细胞中同时表达CAR和IL‑15、和/或IL‑15受体，能够显著提高修饰细胞的抗肿瘤活性。

Description

一种CAR新分子及其在肿瘤治疗中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种CAR新分子及其在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养，导入特定的外源基因，并扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。本领域技术人员一直致力于开发新的细胞免疫疗法，以提高细胞免疫疗法的效果，并降低其副作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CAR新分子及其在肿瘤治疗中的应用。
本发明的第一方面，提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物具有下式所示的结构：
car-(IRES)-f
其中，car表示嵌合抗原受体编码多核苷酸序列；IRES表示内部核糖体进入位点序列(Internal ribosome entry site,IRES)；f表示功能性融合蛋白编码序列，所述功能性融合蛋白包括细胞因子或其活性片段，和/或所述细胞因子的受体或其活性片段。
在另一优选例中，所述细胞因子为IL15。
在另一优选例中，所述功能性融合蛋白由IL15受体sushi片段和IL15融合形成。
在另一优选例中，所述核酸构建物具有下式所示的结构：
嵌合抗原受体编码多核苷酸序列-(IRES)-IL15受体sushi片段编码多核苷酸序列-L–IL15多核苷酸编码序列，其中“-”表示连接相邻核苷酸的磷酯键或任选地接头肽编码多核苷酸序列，“L”表示任选地接头肽编码序列。
在另一优选例中，所述IRES序列为SEQ ID NO.31中的第21位-605位。
在另一优选例中，f为编码SEQ ID NO.22、33、35所示多肽的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述核酸构建物为DNA或RNA。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域特异性靶向肿瘤细胞表明抗原，优选地包括各种实体瘤和固体肿瘤的细胞表面抗原，例如c-Met、HER2、CD19等。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域特异性靶向c-Met抗原。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域，其中所述抗原结合结构域为特异性靶向c-Met抗原的单链抗体(scFV)。
在另一优选例中，所述抗原结合结构域为特异性靶向c-Met抗原的抗体,其亲和力为0.1-20nM，0.64-12.5nM,更加优选地1-2nM。
在另一优选例中，所述单链抗体(scFV)的重链可变区如SEQ ID NO.6所示。
在另一优选例中，所述单链抗体(scFV)的轻链可变区如SEQ ID NO.7所示。
在另一优选例中，所述单链抗体(scFV)的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的结构如下式所示：
scFV－H-TM－S－CD3ζ
其中，
scFV为特异性靶向c-Met抗原的单链抗体；
H为绞链区；
TM为跨膜结构域；
S为共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包括源自CD28的共刺激分子，和/或源自4-1BB的共刺激分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
在另一优选例中，H的序列如SEQ ID NO.9所示。
在另一优选例中，TM的序列如SEQ ID NO.11所示。
在另一优选例中，所述源自CD28的共刺激分子的序列如SEQ ID NO.17所示。
在另一优选例中，所述源自4-1BB的共刺激分子的序列如SEQ ID NO.13所示。
在另一优选例中，CD3ζ的序列如SEQ ID NO.15所示。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域如SEQ ID NO.8所示。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的序列如SEQ ID NO.1、或3所示。
在另一优选例中，car中包含选自下组的编码所述CD8α的铰链区核酸序列：
(A)编码如SEQ ID NO.9所示的多核苷酸；
(C)核苷酸序列与SEQ ID NO.10所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQ ID NO.9所示氨基酸序列的多核苷酸；
(D)与(A)-(C)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，car中包含选自下组的编码所述CD8α的跨膜区的核酸序列：
(A)编码如SEQ ID NO.11所示多肽的多核苷酸；
(B)序列如SEQ ID NO.12所示的多核苷酸；
(C)核苷酸序列与SEQ ID NO.12所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQ ID NO.11所示氨基酸序列的多核苷酸；
(D)与(A)-(C)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，car中包含选自下组的编码所述4-1BB(CD137)共刺激分子的核酸序列：
(A)编码如SEQ ID NO.13所示多肽的多核苷酸；
(B)序列如SEQ ID NO.14所示的多核苷酸；
(C)核苷酸序列与SEQ ID NO.14所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQ ID NO.13所示氨基酸序列的多核苷酸；
(D)与(A)-(C)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，car中包含选自下组的编码所述CD28共刺激分子的核酸序列：
(A)编码如SEQ ID NO.17所示多肽的多核苷酸；
(B)序列如SEQ ID NO.18所示的多核苷酸；
(C)核苷酸序列与SEQ ID NO.18所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQ ID NO.17所示氨基酸序列的多核苷酸；
(D)与(A)-(C)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，car中包含选自下组的编码所述CD3ζ的胞内信号结构域的核酸序列：
(A)编码如SEQ ID NO.15所示多肽的多核苷酸；
(B)序列如SEQ ID NO.16所示的多核苷酸；
(C)核苷酸序列与SEQ ID NO.16所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQ ID NO.15所示氨基酸序列的多核苷酸；
(D)与(A)-(C)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，car中包含选自下组的核酸序列：
(A)编码如SEQ ID NO.1、或3所示多肽的多核苷酸；
(B)序列如SEQ ID NO.2、或4所示的多核苷酸；
(C)核苷酸序列与SEQ ID NO.2、或4所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥98％)，并且编码SEQ ID NO.1、或3任一所示氨基酸序列的多核苷酸；
(D)与(A)-(C)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，car中包含选自下组的核酸序列：
(A)编码如SEQ ID NO.1、或3所示多肽的多核苷酸；
(B)序列如SEQ ID NO.29、或30所示的多核苷酸；
(C)核苷酸序列与SEQ ID NO.29、或30所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥98％)，并且编码SEQ ID NO.1、或3任一所示氨基酸序列的多核苷酸；
(D)与(A)-(C)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述核酸构建物为分离的。
在另一优选例中，car中还包括编码前导序列(引导序列，信号肽)的多核苷酸。
在另一优选例中，car的序列如SEQ ID NO.2、或4所示。
在另一优选例中，所述IL15包括野生型的IL15和突变型的IL15，或其活性片段。
在另一优选例中，所述IL15受体包括野生型的IL15受体和突变型的IL15受体，或其活性片段(如野生型或突变型的IL15受体α亚基)。
在另一优选例中，car的序列和所述IL15或所述IL15受体和IL15融合蛋白之间通过IRES序列连接。
在另一优选例中，所述IRES序列为序列如SEQ ID NO.31、32、34中的第21-605位多核苷酸。
在另一优选例中，car-(IRES)-f中包含选自下组的核酸序列：
(A)编码如SEQ ID NO.1和22所示多肽的多核苷酸；
(B)序列如SEQ ID NO.29和31所示的多核苷酸；
(C)核苷酸序列与SEQ ID NO.29或31所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥98％)，并且编码SEQ ID NO.1或22所示氨基酸序列的多核苷酸；
(D)与(A)-(C)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，car-(IRES)-f中包含选自下组的核酸序列：
(A)编码如SEQ ID NO.1和33所示多肽的多核苷酸；
(B)序列如SEQ ID NO.29和32所示的多核苷酸；
(C)核苷酸序列与SEQ ID NO.29或32所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥98％)，并且编码SEQ ID NO.1或33所示氨基酸序列的多核苷酸；
(D)与(A)-(C)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，car-(IRES)-f中包含选自下组的核酸序列：
(A)编码如SEQ ID NO.1和35所示多肽的多核苷酸；
(B)序列如SEQ ID NO.29和34所示的多核苷酸；
(C)核苷酸序列与SEQ ID NO.29或和34所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥98％)，并且编码SEQ ID NO.1或34所示氨基酸序列的多核苷酸；
(D)与(A)-(C)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
本发明的第二方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第一方面所述的核酸构建物。
在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。
本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第二方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第一方面所述的核酸构建物。
在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。
在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。
在另一优选例中，所述细胞为T细胞或NK细胞。
本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及本发明本发明第一方面所述的核酸构建物、本发明第二方面所述的载体、或本发明第三方面所述的细胞。
本发明的第五方面，提供了本发明本发明第一方面所述的核酸构建物、本发明第二方面所述的载体、或本发明第三方面所述的细胞的用途，用于制备治疗肿瘤的药物或制剂。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括c-Met阳性肿瘤。
本发明的第六方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明本发明第一方面所述的核酸构建物、本发明第二方面所述的载体、或本发明第三方面所述的细胞、或本发明第四方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述疾病为肿瘤。
本发明的第七方面，提供了一种制备CAR修饰的细胞(如CAR-修饰的T细胞或NK细胞)的方法，
所述方法包括步骤：将本发明第一方面所述的核酸构建物、本发明第二方面所述的载体导入待修饰的细胞内，从而获得所述CAR修饰的细胞。
在另一优选例中，所述细胞为T细胞或NK细胞。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了质粒JX005(实施例3)和JX006(实施例4)酶切鉴定。实施例3挑选5个克隆(lanes 1-5)，实施例4挑选3个克隆(lanes 6-8)分别用BamH1和EcoRI双酶切后，琼脂糖凝胶电泳。结果表明实施例3和实施例4分别得到了正确的克隆。M：DNA分子量标记。
图2显示了质粒JX007(实施例5)和JX008(实施例6)酶切鉴定。实施例5挑选3个克隆(lanes 1-3)，实施例6挑选3个克隆(lanes 4-6)分别用EcoRI和SalI双酶切后，琼脂糖凝胶电泳。结果表明实施例5和实施例6分别得到了正确的克隆。M：DNA分子量标记。
图3显示了本发明CAR分子结构示意图(JX007和JX008)。左，表达JX007的T,NK细胞，带有细胞内4-1BB信号，特异结合c-Met阳性肿瘤细胞，表达细胞因子IL15，能显著杀伤肿瘤细胞，对c-Met阴性或低表达细胞也没有毒性。右，表达JX008的T,NK细胞，带有细胞内4-1BB信号，特异结合c-Met阳性肿瘤细胞，表达细胞因子IL15受体sushi片段和IL15的融合分子(IL15Ra shushi-L-IL15),该融合分子增强了IL15因子的活性(受体和细胞因子反式激活作用)，能极显著杀伤肿瘤细胞，对c-Met阴性或低表达细胞也没有毒性。这两个CAR的活性结果表明，本发明CAR新分子通过结合c-Met靶向肿瘤细胞，通过特异的细胞因子、细胞因子和受体在肿瘤细胞周围微环境聚集杀死肿瘤细胞，而不杀伤正常(非c-Met阳性，或c-Met低表达)细胞。
图4显示了本发明CAR分子对肿瘤细胞的杀伤活性。图4a，转染空载体(不表达CAR)的T细胞和表达本发明CAR分子JX005,JX006,JX007,JX008的T细胞和肿瘤细胞按3：1比例时对肿瘤细胞的杀伤作用。图4b，同样条件下，对c-Met非阳性的细胞HepG2没有杀伤作用。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，意外地发现在T细胞或NK细胞中同时表达CAR和IL-15、和/或IL-15受体，能够显著提高抗肿瘤活性。在本发明的一个优选的实施方式中，本发明提供了一种表达嵌合抗原受体(CAR)的核酸构建物及其在CAR-T和/或者CAR-NK细胞治疗肿瘤中的运用。该CAR核酸构建物由抗人c-Met单克隆抗体轻链、重链可变区组成的单链可变区(single chain Fv，scFv)表达序列,人CD8α铰链区、跨膜区表达序列,人4-1BB胞内区和/或人CD28胞内区表达序列、人CD3ζ胞内区表达序列、人IL-15Ra表达序列、人IL-15表达序列结构串联构成。该嵌合抗原受体(CAR)表达核酸构建物可用于修饰T淋巴细胞，NK细胞，修饰后的T细胞(CAR-T细胞),NK细胞(CAR-NK细胞)能用于c-Met阳性的肿瘤患者的治疗，包括消化道癌症、如胃癌、肠道癌症，肺癌，肝癌，黑色素瘤、胆囊癌、前列腺癌，膀胱癌、肾癌、卵巢癌等癌症的治疗。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。因本发明的公开，相关的内容为本领域的技术人员显而易见的。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种优化的c-Met靶向性的嵌合抗原受体及其制法和应用，所述嵌合抗原受体的细胞外抗原结合结构域N端到C端依次为抗体轻链可变区和抗体重链可变区。实验结果表明，本发明还提供的嵌合抗原受体，其特定的轻链可变区-重链可变区顺序的排布，膜外绞链区长度的调节，和信号传导结构域的调整能够显著提高抗原结合受体的活性，极大的提高了对肿瘤细胞的杀伤能力。
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
嵌合抗原受体
本发明提供了包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域的嵌合抗原受体(CAR)。胞外结构域包括靶向特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供了经过基因工程改造以表达CAR的细胞(例如，T细胞)，其显示显著的抗肿瘤性质。本发明的CAR还可以包括胞外结构域，所述胞外结构域具有融合至T细胞抗原受体复合物ζ链(例如，CD3ζ)的细胞内信号传导结构域的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性改变抗原识别。示例性抗原为c-Met。然而，本发明不限于靶向c-Met。相反地，本发明包括任何抗原结合结构域，当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1BB(CD137)信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。
在一个实施方式中，本发明的c-Met靶向性CAR包括包含本发明特定信号传导结构域(CD8的跨膜区、4-1BB和CD3ζ的胞内信号结构域串联而成)。与其他方式的c-Met靶向性CAR相比，本发明的信号传导结构域显著增加了抗肿瘤活性和CAR-T细胞的体内持久性。
在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体(CAR)的氨基酸序列如下：
JX005:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO.1)
其中，第1‐238位为结合c‐Met的scFv编码序列；第239‐285位为人CD8α铰链区编码序列；第286‐307位为人CD8α跨膜区编码序列；第308‐349位为4‐1BB胞内区编码序列；第350‐461位为CD3zeta(ζ)胞内信号区编码序列；
其编码多核苷酸序列如下：
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACCGGGTGACCATCACCTGCTCCGTGTCCTCCTCCGTGTCCTCCATCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTCCACCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCCGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGGTGTACTCCGGCTACCCCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCCGGGTGAACCCCAACCGGCGGGGCACCACCTACAACCAGAAGTTCGAGGGCCGGGTGACCATGACCACCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGCGGTCCCTGCGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGGCCAACTGGCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCAGTACTACCACCCCCGCCCCCCGGCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCTCCCAGCCCCTGTCCCTGCGGCCCGAGGCCTGCCGGCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGTCCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGCGGGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCTCCTGCCGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGCGGGTGAAGTTCTCCCGGTCCGCCGACGCCCCCGCCTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGGCGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGCGGGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGGCGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGCGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGG(SEQ ID NO.2)，
其中，第1‐714位为结合c-Met的scFv编码序列；第715‐855位为人CD8α铰链区编码序列；第856‐921位为人CD8α跨膜区编码序列；第922‐1047位为4‐1BB胞内区编码序列；第1048‐1383位为CD3zeta(ζ)胞内信号区编码序列。
在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体(CAR)的氨基酸序列如下：
JX006:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO.3)
该序列第1‐238位为结合c-Met的scFv编码序列；第239‐285位为人CD8α铰链区编码序列；第286‐307位为人CD8α跨膜区编码序列；第308‐348位为CD28胞内区编码序列；第349‐390位为4‐1BB胞内区编码序列；第391‐502位为CD3zeta(ζ)胞内信号区编码序列；
其编码多核苷酸序列如下：
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACCGGGTGACCATCACCTGCTCCGTGTCCTCCTCCGTGTCCTCCATCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTCCACCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCCGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGGTGTACTCCGGCTACCCCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCCGGGTGAACCCCAACCGGCGGGGCACCACCTACAACCAGAAGTTCGAGGGCCGGGTGACCATGACCACCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGCGGTCCCTGCGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGGCCAACTGGCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCAGTACTACCACCCCCGCCCCCCGGCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCTCCCAGCCCCTGTCCCTGCGGCCCGAGGCCTGCCGGCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGTCCCTGGTGATCACCCTGTACTGCCGGTCCAAGCGGTCCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCCCGGCGGCCCGGCCCCACCCGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCCCCGGGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAAGCGGGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCTCCTGCCGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGCGGGTGAAGTTCTCCCGGTCCGCCGACGCCCCCGCCTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGGCGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGCGGGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGGCGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGCGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGG(SEQ ID NO.4)
第1‐714位为结合c-Met的scFv编码序列；第715‐855位为人CD8α铰链区编码序列；第856‐921位为人CD8α跨膜区编码序列；第922‐1044位为CD28胞内区编码序列(无色)；第1045‐1170位为4‐1BB胞内区编码序列；第1171‐1506位为CD3zeta(ζ)胞内信号区编码序列。
抗原及抗原结合结构域
c-Met抗原
间质上皮转换(MET)基因编码受体酪氨酸激酶c-Met(或称为Met)。c-Met与其配体肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)结合，引起受体酪氨酸磷酸化并通过激活下游信号通路PI3K和AKT、STAT3或者RAS和MAPK等发挥功能。Met在部分晚期恶性肿瘤中过度活化，扩增，突变等，导致细胞增殖、分裂、迁移和侵润。研究表明c-Met基因扩增,过表达，活性改变等可能是这部分恶性肿瘤的驱动癌基因。这些肿瘤包括消化道癌症、如胃癌、肠道癌症，肺癌，肝癌，黑色素瘤、胆囊癌、前列腺癌，膀胱癌、肾癌、卵巢癌等。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述c-Met抗原的氨基酸序列如下：
>NP_001120972.1(hepatocyte growth factor receptor isoform apreproprotein[Homo sapiens])
MKAPAVLAPGILVLLFTLVQRSNGECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISTWWKEPLNIVSFLFCFASGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFTGLIAGVVSISTALLLLLGFFLWLKKRKQIKDLGSELVRYDARVHTPHLDRLVSARSVSPTTEMVSNESVDYRATFPEDQFPNSSQNGSCRQVQYPLTDMSPILTSGDSDISSPLLQNTVHIDLSALNPELVQAVQHVVIGPSSLIVHFNEVIGRGHFGCVYHGTLLDNDGKKIHCAVKSLNRITDIGEVSQFLTEGIIMKDFSHPNVLSLLGICLRSEGSPLVVLPYMKHGDLRNFIRNETHNPTVKDLIGFGLQVAKGMKYLASKKFVHRDLAARNCMLDEKFTVKVADFGLARDMYDKEYYSVHNKTGAKLPVKWMALESLQTQKFTTKSDVWSFGVLLWELMTRGAPPYPDVNTFDITVYLLQGRRLLQPEYCPDPLYEVMLKCWHPKAEMRPSFSELVSRISAIFSTFIGEHYVHVNATYVNVKCVAPYPSLLSSEDNADDEVDTRPASFWETS(SEQ ID NO.5)
在一个实施方式中，本发明的CAR包括被称为抗原结合结构域的靶-特异性结合元件。在本发明优选的实施方式中，所述抗原为c-Met。
在本发明优选的实施方式中，本发明的CAR的抗原结合结构域靶向c-Met。优选地，本发明的CAR中的抗原结合结构域为靶向c-Met的抗体，优选为靶向c-Met的scFV。
在另一优选例中，所述抗体重链可变区的氨基酸序列如下：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.6)。
在另一优选例中，所述抗体氢链可变区的氨基酸序列如下：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO.7)。
在本发明的CAR中，可以使用0-20个(优选为2-15个)氨基酸的肽接头连接在抗体重链可变区和轻链可变区之间，从而形成作为抗原结合结构域的单链抗体。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明的CAR中的抗原结合结构域(scFv)氨基酸序列如下：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.8)。
绞链区和跨膜区
对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
跨膜结构域可源于天然来源或合成来源。在天然来源中，该结构域可源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。优选地，本发明的CAR中的绞链区和跨膜区为CD8a的绞链区和跨膜区。
在本发明的一个优选的实施方式中，CD8a的绞链区包括以下氨基酸序列：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY(SEQ ID NO.9)；其编码多核苷酸序列如下：
ACTACCACCCCCGCCCCCCGGCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCTCCCAGCCCCTGTCCCTGCGGCCCGAGGCCTGCCGGCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTAC(SEQ IDNO.10)。
在本发明的一个优选的实施方式中，CD8a的跨膜区包括以下氨基酸序列
IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO.11),
其编码多核苷酸序列如下:
ATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGTCCCTGGTGATCACCCTGTACTGC(SEQ ID NO.12)
胞内结构域
本发明的CAR的胞内结构域或另外的细胞内信号传导结构域是造成其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的活化的原因。术语“效应子功能”指的是细胞的专有功能。例如，T细胞的效应子功能可为包括细胞因子分泌的细胞溶解活性或辅助活性。因此术语“细胞内信号传导结构域”指的是转导效应子功能信号并指导细胞实施专有功能的蛋白部分。尽管通常可使用整个细胞内信号传导结构域，但在很多例子中，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可用于代替完整的链，只要它转导效应子功能信号。术语细胞内信号传导结构域因此指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本发明的CAR的细胞内信号传导结构域的优选例子包括T细胞受体(TCR)的胞浆序列和协同行动以在抗原受体结合后开始信号转导的共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同的功能能力的任何合成序列。
在优选的实施方式中，CAR的胞浆结构域可被设计以本身包括CD3-ζ信号传导结构域，或可与在本发明的CAR的内容中有用的任何其他期望的胞浆结构域(一个或多个)联合。例如，CAR的胞浆结构域可包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。优选地，包括CD28、和/或4-1BB(CD137)等。
本发明的CAR的胞浆信号传导部分内的胞浆信号传导序列可以随机或以规定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸，可形成该连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。
在一个实施方式中，本发明的CAR中的胞浆结构域被设计以包括CD28、和/或4-1BB的信号传导结构域(共刺激分子)以及CD3ζ的信号传导结构域。
优选地，4-1BB的胞内信号结构域(共刺激分子)包含如下氨基酸序列：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO.13)；
其编码核苷酸序列如下：
AAGCGGGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCTCCTGCCGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTG(SEQ ID NO.14)。
优选地，CD3ζ的胞内信号结构域包含如下氨基酸序列：
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO.15)；
其编码核苷酸序列如下：
CGGGTGAAGTTCTCCCGGTCCGCCGACGCCCCCGCCTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGGCGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGCGGGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGGCGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGCGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGG(SEQ ID NO.16)
在本发明的另一个优选地实施方式中，CD28的胞内信号结构域(共刺激分子)包含如下氨基酸序列:
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO.17)；
其编码核苷酸序列如下
CGGTCCAAGCGGTCCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCCCGGCGGCCCGGCCCCACCCGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCCCCGGGACTTCGCCGCCTACCGGTCC(SEQ ID NO.18)
当本发明的CAR同时包含CD28的胞内信号结构域和4-1BB的胞内信号结构域时，两者之间可通过0-20个(优选为2-15个)氨基酸的肽接头连接。
载体和细胞修饰
本发明包括包含CAR序列的DNA构建体，其中该序列包括可操作地连接至信号传导结构域的核酸序列的抗原结合结构域的核酸序列。可用于本发明的CAR的示例性的信号传导结构域包括抗c-Met scFv、CD8铰链和跨膜区、CD28和/或4-1BB以及CD3ζ胞内信号传导结构域。在一个实施方式中，本发明的CAR包括SEQ ID NO:2、4中提出的核酸序列。
编码期望分子的核酸序列可通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明也提供了其中插入本发明的DNA的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
简单概括，通常通过可操作地连接编码CAR多肽或其部分的核酸至启动子，并将构建体并入表达载体，实现编码CAR的天然或合成核酸的表达。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册，产品说明书中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如puromycin等。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是慢病毒载体，比如通过慢病毒感染动物细胞将外援基因带入细胞，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自逆转录病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。优选地，所述载体中还包括信号肽编码序列。优选地，所述信号肽序列连接在所述抗原结核结构域核酸序列的上游。优选地所述信号肽为CD8α信号肽MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO.19)。
在本发明的一个优选地实施方式中，将编码本发明CAR的载体导入T细胞或NK细胞中从而构建出了本发明CAR修饰的T细胞或NK细胞。
在本发明的一个优选地实施方式中，经本发明CAR修饰的T细胞或NK细胞还表达外源的IL15和/或IL15受体(如IL15受体-接头肽-IL15融合分子)，或它们的活性片段。
白细胞介素interleukin 15(IL15)是一种细胞因子，与其受体结合发挥其生物学功能。IL15受体有三个亚基，分别为IL15受体α(IL15Rα)、IL15Rβ(CD122)和γ(也称CD132)。IL15Rα细胞外区域为结合IL15的部分，其中的区域Sushi结构域与IL15结合可发挥IL15的生物学功能。由于IL15Rα与IL2受体α不同,因而导致IL15可能在免疫治疗中有不同IL2的作用效果。IL15和IL15Rα结合，除自身细胞被激活外，因为IL15Rα的介导，还可以将信号传递到另一个细胞激活细胞活性。这些活性包括选择性地扩增CD8+T细胞，NK细胞等，而且不像IL2那样活化调节T细胞，从而在抗肿瘤免疫反应中可能发挥不同的功能。
在本发明的一个优选地实施方式中，向导入本发明的CAR基因序列的T细胞或NK细胞中，导入外源的IL15基因和/或IL15受体基因能够显著提高修饰细胞的肿瘤杀伤活性。所述外源的IL15基因编码野生型的IL15、突变型的IL15或其活性片段；所述IL15受体基因编码野生型的IL15受体、突变型的IL15受体或其活性片段(如野生型或突变型的IL15受体α亚基)，其中所述IL15受体的活性片段至少包括IL15受体α亚基的Sushi结构域的一部分(优选地，77个氨基酸的sushi片段)。
细胞因子，细胞因子受体/细胞因子融合蛋白：
本发明CAR分子表达细胞因子IL15,或细胞因子IL15R sushi片段和IL15融合蛋白分子,两者之间以G4S序列连接。特别地，细胞因子IL15R sushi片段和IL15融合蛋白分子可以模拟IL15分子和表达IL15R的细胞结合所产生的反式激活作用。本发明意外发现，表达IL15R sushi片段和IL15融合蛋白的CAR能更加特异的杀伤CAR抗原阳性的肿瘤细胞。本实施例中选取表达c-Met阳性的肿瘤细胞MNK45。而对c-Met非表达细胞HepG2没有杀伤毒性。
可以使用0-20个氨基酸的肽接头连接,例如(G4S)n(n＝1-5),连接IL15R sushi片段和IL15分子。IL15,IL15R-(G4S)n-IL15的编码区通过IRES序列和CAR分子中的CD3zeta(ζ)连接。
在本发明的一个优选地实施方式中，外源的IL15基因和/或IL15受体基因以及本发明的CAR编码基因构建在同一个载体中，并被导入T或NK细胞内。或者外源的IL15基因和/或IL15受体基因以及本发明的CAR编码基因各自独立的包含在不同的载体内，并被独立地以任意顺序导入T或NK细胞内。当外源的IL15基因和IL15受体基因同时出现时，外源的IL15基因和IL15受体基因可以分别构建独立的载体，或者外源的IL15基因和IL15受体基因构建在同一载体中，或者外源的IL15基因和IL15受体基因以及本发明的CAR基因一起构建在同一载体中。
在本发明的一个优选地实施方式中，IL-15的氨基酸序列如下：
P40933.1|IL15_HUMAN
MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO.20)
其编码核苷酸序列如下(NCBI，CR542007.1人IL15核苷酸序列)：
ACAGAAGCCAACTGGGTGAATGTAATAAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCCAGTTGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGAGATGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCCTAGCAAACAACAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGAACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCATCAACACTTCT(SEQ ID NO.21)；
IL-15分子活性片段的一个优选地例子如下：
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO.22)。
在本发明的一个优选地实施方式中，IL-15受体的氨基酸序列如下(NCBI数据库序列)：
MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVL NKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL(SEQ ID NO.23)
其中，IL15Rα结构域sushi区域为第66-142位氨基酸；
其编码核苷酸序列如下：
ATGGCCCCGCGGCGGGCGCGCGGCTGCCGGACCCTCGGTCTCCCGGCGCTGCTACTGCTGCTGCTGCTCCGGCCGCCGGCGACGCGGGGCATCACGTGCCCTCCCCCCATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCAGGGAGCGGTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACGTCCAGCCTGACGGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACGAATGTCGCCCACTGGACAACCCCCAGTCTCAAATGCATTAGAGACCCTGCCCTGGTTCACCAAAGGCCAGCGCCACCCTCCACAGTAACGACGGCAGGGGTGACCCCACAGCCAGAGAGCCTCTCCCCTTCTGGAAAAGAGCCCGCAGCTTCATCTCCCAGCTCAAACAACACAGCGGCCACAACAGCAGCTATTGTCCCGGGCTCCCAGCTGATGCCTTCAAAATCACCTTCCACAGGAACCACAGAGATAAGCAGTCATGAGTCCTCCCACGGCACCCCCTCTCAGACAACAGCCAAGAACTGGGAACTCACAGCATCCGCCTCCCACCAGCCGCCAGGTGTGTATCCACAGGGCCACAGCGACACCACTGTGGCTATCTCCACGTCCACTGTCCTGCTGTGTGGGCTGAGCGCTGTGTCTCTCCTGGCATGCTACCTCAAGTCAAGGCAAACTCCCCCGCTGGCCAGCGTTGAAATGGAAGCCATGGAGGCTCTGCCGGTGACTTGGGGGACCAGCAGCAGAGATGAAGACTTGGAAAACTGCTCTCACCACCTA(SEQ ID NO.24)
治疗性应用
本发明包括用慢病毒载体(Lentivirus,LV)转导的细胞(例如，T细胞、NK细胞)。例如，LV编码将特异性抗体的抗原结合结构域与4-1BB和/或CD28、以及CD3-ζ组合的细胞内结构域联合的CAR。因此，在一些例子中，转导的T细胞或NK细胞可引起CAR-介导的T-细胞应答。
因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：施用给哺乳动物表达CAR的T细胞、NK细胞，其中CAR包括特异性地与预定标靶相互作用的结合部分，包括例如人CD3ζ的细胞内结构域的ζ链部分，和共刺激信号传导区。优选地，在CAR修饰的细胞中同时导入细胞因子IL15、或IL15R片段和IL15的融合分子，以产生反式激活作用。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中T细胞或NK细胞被基因修饰以表达本发明的CAR，和将修饰的细胞注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。
在一个实施方式中，本发明的CAR-T或NK细胞可经历稳固的体内细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T或NK细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗c-Met的CAR-T或NK细胞引起抗表达c-Met的肿瘤细胞的特异性免疫应答。
尽管本文公开的数据具体公开了包括抗-c-Met scFv、CD8铰链和跨膜区、CD28和/或4-1BB以及CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。
可治疗的癌症包括CAR抗原表达阳性肿瘤，本发明优选c-Met阳性的肿瘤，包括c-Met阳性的，如消化道癌症、如胃癌、肠道癌症，肺癌，肝癌等。本发明的CAR-修饰T或NK细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
通常地，如本文所述活化和扩展的细胞可用于治疗和预防无免疫应答的个体中产生的疾病。
本发明的CAR-修饰的T细胞或NK细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2或其他细胞因子或细胞群结合施用。本发明的CAR-修饰的T细胞或NK细胞可和其它肿瘤治疗方法，特别是免疫疗法，免疫检查点抗体PD-L1,PD-1抗体联合应用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×106个至1×1010个本发明经修饰的T或NK细胞，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
本发明的主要优点在于：
(1)首次提供了一种以c-Met抗原为靶点的嵌合抗原受体，且显示出了显著的肿瘤抑制效果；且对c-Met抗原阴性或表达低的细胞没有杀伤作用。
(2)首次发现在CAR修饰的T细胞或NK细胞内，随CAR一起表达外源的IL15和/或IL15受体能够显著提高肿瘤抑制活性。
(3)用抗c-Met抗体轻、重链构建scFV，在此基础上，成功构建了具有显著肿瘤抑制活性的CAR。
(4)本发明意外发现，表达IL15、或IL15R sushi片段和IL15融合蛋白的CAR能更加特异的杀伤CAR抗原阳性的肿瘤细胞。对抗原阴性或表达低的细胞没有杀伤作用。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。其中，293T购自ProCell,MKN45购自Biovec质粒载体细胞菌种基因保藏中心，pBabe-puro载体，病毒载体购自优宝生物。
实施例1用于本发明CAR分子中的scFv序列来源
本发明CAR分子中的scFv序列源于抗人c-Met抗体。可通过免疫小鼠，脾细胞融合、杂交瘤筛选得到。该方法为本领域熟知。即通过免疫小鼠，得到小鼠来源抗人c-Met单克隆细胞株，将结合活性(和人c-Met的亲和力KD)从0.1nM到10uM不同的细胞株分别提取cDNA，得到结合活性不同的抗人c-Met单克隆抗体，包括抗c-Met抗体轻、重链可变区和恒定区。
从抗人c-Met单克隆细胞株得到鼠源抗c-Met单克隆抗体轻、重链序列，分别用抗体数据库(例如v-base；NCBI IgBlast；IMGT等)进行同源性分析，选择人抗体种序列(germline),并避免序列中存在糖基化，脱酰胺化，氧化等敏感位点。构建人源化抗体模型，筛选和人c-Met的亲和力KD可以从0.1nM到10uM不等的人源化抗c-Met抗体分子(参见表1)。KD用抗c-Met抗体在GE公司Biacore 3000仪器检测来评估。详细操作方法参考Biocaore仪器和GE公司提供的CM5芯片(GE Life Sciences catalog#BR-1000-12)和配套试剂使用说明进行。即固定Anti-IgG抗体的芯片捕获待检测的抗体，PBS缓冲液稀释his标记抗原作为流动相。数据用BiaEvaluation 4.0软件拟合分析，得到抗原抗体结合力KD。
表1可用于本发明CAR分子的抗c-Met抗体
检测分子(抗体) KD(nM)
X001 1.62
X002 0.64
X003 1.2
X004 2.0
X005 12.5
通过免疫得到的鼠源，后人源化的抗人c-Met抗体分子的轻、重链序列通过设计linker连接轻、重链的可变区；或来源于已经在临床的人抗c-Met抗体分子包括LY2875358(专利WO2010059654A1)，阳性对照分子X001；Onartuzumab(MetMab；RG-3638；RO-5490258)等的部分序列，设计成scFv序列，均可设计成用于本发明CAR分子中的肿瘤细胞结合部分，例如以下序列，通过GGGGS(SEQ ID NO.25)等接头(linker)，比如GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO.26)连接得到本发明scFv区域。
用于本发明的X1scFv(X001)的序列信息如下：
轻链序列：
XL1:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO.7)；
其编码核苷酸序列为：
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACCGGGTGACCATCACCTGCTCCGTGTCCTCCTCCGTGTCCTCCATCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTCCACCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCCGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGGTGTACTCCGGCTACCCCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG(SEQ ID NO.27)
重链序列：
XH1:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.6)
其编码核苷酸序列为：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCCGGGTGAACCCCAACCGGCGGGGCACCACCTACAACCAGAAGTTCGAGGGCCGGGTGACCATGACCACCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGCGGTCCCTGCGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGGCCAACTGGCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCAGT(SEQ ID NO.28)
实施例2：本发明其它序列选定
除scFc序列外，其它序列可以从美国国立医学图书馆网站http://www.pubmed.comGenBank数据库中搜索得到。人CD8α信号肽、人CD8α铰链区、CD8α跨膜区、人CD28胞内区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、内部核糖体进入元件(IRES elements)、人IL15,人IL15受体alpha(IL15Ra)野生型和突变/sushi部分(US2014/01314；WO2007/046006)等蛋白序列。所有序列均根据蛋白质序列进行密码子优化后得到氨基酸序列，以保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。
实施例3：JX005表达质粒的构建
JX005表达质粒
全基因合成完整以下DNA序列如下：
tctaggcgccggccggatccGGCGCCGGCCGGATCCGCCACCATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCCGGCCCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACCGGGTGACCATCACCTGCTCCGTGTCCTCCTCCGTGTCCTCCATCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTCCACCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCCGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGGTGTACTCCGGCTACCCCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCCGGGTGAACCCCAACCGGCGGGGCACCACCTACAACCAGAAGTTCGAGGGCCGGGTGACCATGACCACCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGCGGTCCCTGCGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGGCCAACTGGCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCAGTACTACCACCCCCGCCCCCCGGCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCTCCCAGCCCCTGTCCCTGCGGCCCGAGGCCTGCCGGCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGTCCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGCGGGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCTCCTGCCGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGCGGGTGAAGTTCTCCCGGTCCGCCGACGCCCCCGCCTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGGCGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGCGGGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGGCGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGCGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGGTGAGATCCCAGTGTGGTGaattcgccagcacag，SEQ ID NO.29
其中，第106-819位为结合c-Met的scFv编码序列；第820-960位为人CD8α铰链区编码序列；第961-1026位为人CD8α跨膜区编码序列；第1027-1152位为4-1BB胞内区编码序列；第1153-1488位为CD3zeta(ζ)胞内信号区编码序列。
上述序列编码的氨基酸序列如下：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO.1)
该序列第1-238位为结合c-Met的scFv编码序列；第239-285位为人CD8α铰链区编码序列；第286-307位为人CD8α跨膜区编码序列；第308-349位为4-1BB胞内区编码序列；第350-461位为CD3zeta(ζ)胞内信号区编码序列。
将pBABEpuro质粒用BamHI和EcoRI双酶切线性化，纯化备用。
重组转化用Clontech Laboratories,Inc.的In-Fusion HD cloning试剂盒，按操作说明书进行，具体如下：
2ul 5x In-Fusion HD Enzyme Premix
5ng pBABEpuro线性化质粒
15ng上述合成的JX005基因
用dH2O补齐终体积10ul
50℃反应15min后置于冰上。取5ul反应物转化DH5α感受态细胞，挑选5个克隆分别用BamHI和EcoRI双酶切鉴定(见图1，泳道1-5,为代表结果pJX005)。克隆鉴定正确后，挑选正确的克隆提取质粒备用。质粒所表达的蛋白分子为人源化抗人c-Met抗体(实施例1)scFv序列、人CD8α铰链区、跨膜区、4-1BB胞内区、CD3zeta(ζ)胞内信号区的组合。
实施例4：JX006表达质粒构建
JX006表达质粒
全基因合成完整DNA序列如下：
tctaggcgccggccggatccGGCGCCGGCCGGATCCGCCACCATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCCGGCCCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACCGGGTGACCATCACCTGCTCCGTGTCCTCCTCCGTGTCCTCCATCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTCCACCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCCGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGGTGTACTCCGGCTACCCCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCCGGGTGAACCCCAACCGGCGGGGCACCACCTACAACCAGAAGTTCGAGGGCCGGGTGACCATGACCACCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGCGGTCCCTGCGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGGCCAACTGGCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCAGTACTACCACCCCCGCCCCCCGGCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCTCCCAGCCCCTGTCCCTGCGGCCCGAGGCCTGCCGGCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGTCCCTGGTGATCACCCTGTACTGCCGGTCCAAGCGGTCCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCCCGGCGGCCCGGCCCCACCCGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCCCCGGGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAAGCGGGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCTCCTGCCGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGCGGGTGAAGTTCTCCCGGTCCGCCGACGCCCCCGCCTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGGCGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGCGGGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGGCGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGCGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGGTGAGATCCCAGTGTGGTGgaattcgccagcacag,SEQ ID NO.30
第106-819位为结合c-Met的scFv编码序列；第820-960位为人CD8α铰链区编码序列；第961-1026位为人CD8α跨膜区编码序列；第1027-1149位为CD28胞内区编码序列；第1150-1275位为4-1BB胞内区编码序列；第1276-1611位为CD3zeta(ζ)胞内信号区编码序列。
上述序列编码的氨基酸序列如下：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO.3)
该序列第1-238位为scFv编码序列；第239-285位为人CD8α铰链区编码序列；第286-307位为人CD8α跨膜区编码序列；第308-348位为CD28胞内区编码序列；第349-390位为4-1BB胞内区编码序列；第391-502位为CD3zeta(ζ)胞内信号区编码序列。
重组转化用Clontech Laboratories,Inc.的In-Fusion HD cloning试剂盒，按操作说明书进行，具体如下：
2ul 5x In-Fusion HD Enzyme Premix
5ng pBABEpuro线性化质粒(同实施JX005)
15ng上述合成的JX006基因
用dH2O补齐终体积10ul
50℃反应15min后置于冰上。取5ul反应物转化DH5α感受态细胞，挑选3个克隆分别用BamHI和EcoRI双酶切鉴定(图1，泳道6-8，为代表JX006的结果)。3个克隆均为正确，挑选正确克隆提取质粒。质粒表达的蛋白由人源化抗人c-Met抗体scFv序列、人CD8α铰链区、跨膜区、CD28胞内区、4-1BB胞内区、CD3zeta(ζ)胞内信号区组合构成。
实施例5：JX007表达质粒构建
全基因合成完整如下DNA序列如下：
GATCCCAGTGTGGTGaattcGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCC GGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCT GTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGA AGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTG GCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTT GTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAA GGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTACACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAAC GTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAGCCACCATGAGGATCTCCAAGCCCCACCTGCGGTCCATCTCCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACTCCCACTTCCTGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCTCCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGTCCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGTCCGACGTGCACCCCTCCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTCCTGCTGGAGCTGCAGGTGATCTCCCTGGAGTCCGGCGACGCCTCCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACTCCCTGTCCTCCAACGGCAACGTGACCGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAGGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTCCTGCAGTCCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCTCCTGAgtcgaccctgtggaat(SEQ ID NO.31)
其中，第21-605位为IRES序列(下划线部分)，第699-1040位为人IL15编码序列；
上述序列编码的IL15氨基酸序列(野生型)为：
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO.22)
将表达JX005质粒pJX005用EcoRI和SalI双酶切线性化，纯化备用。
重组转化用Clontech Laboratories,Inc.的In-Fusion HD cloning试剂盒，按操作说明书进行，具体如下：
2ul 5x In-Fusion HD Enzyme Premix
8ng pJX005线性化质粒
15ng上述合成的基因
用dH2O补齐终体积10ul
50℃反应15min后置于冰上。取5ul反应物转化DH5α感受态细胞，挑选三个克隆分别用EcoRI和SalI双酶切鉴定(图2，泳道1-3代表结果为pJX007)。克隆鉴定正确后，挑选正确克隆提取质粒。质粒表达的区域包括JX005的全部序列(人源化抗人c-Met抗体scFv、人CD8α铰链区、跨膜区、4-1BB胞内区、CD3zeta(ζ)胞内信号区)、IRES和野生型IL-15分子编码区。
表达产物蛋白序列如下：
JX007
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO.1)
和
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO.22)
实施例6：JX008表达质粒构建
JX008.1表达质粒
全基因合成如下DNA序列：
GATCCCAGTGTGGTGaattcGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCC GGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCT GTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGA AGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTG GCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTT GTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAA GGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTACACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAAC GTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAGCCACCATGGCCCCCCGGCGGGCCCGGGGCTGCCGGACCCTGGGCCTGCCCGCCCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCGGCCCCCCGCCACCCGGGGCGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCGAGGGCCGGATCACCTGCCCCCCCCCCATGTCCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGTCCTACTCCCTGTACTCCCGGGAGCGGTACATCTGCAACTCCGGCTTCAAGCGGAAGGCCGGCACCTCCTCCCTGACCGAGTGCGTGCTGAACAAGGCCACCAACGTGGCCCACTGGACCACCCCCTCCCTGAAGTGCATCCGGGACCCCGCCCTGGTGCACCAGCGACCAGCTCCACCTTCAGGTGGATCAGGTGGAGGAGGTTCTGGAGGTGGATCAGGAGGAGGTGGTTCTCTGCAGAACTGGGTGAACGTGATCTCCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGTCCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGTCCGACGTGCACCCCTCCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTCCTGCTGGAGCTGCAGGTGATCTCCCTGGAGTCCGGCGACGCCTCCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACTCCCTGTCCTCCAACGGCAACGTGACCGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAGGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTCCTGCAGTCCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCTCCTGAgtcgaccctgtggaat(SEQ ID NO.32)
其中，第21-605位为IRES序列(下划线部分)；第738-1370位为人IL15Rαsushi片段和IL15(野生型)编码序列。
上述序列编码的人IL15Rαsushi片段(野生型)和IL15(野生型)氨基酸序列为：
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO.33)
JX008表达质粒
全基因合成以下DNA序列：
GATCCCAGTGTGGTGaattcGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCC GGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCT GTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGA AGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTG GCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTT GTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAA GGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTACACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAAC GTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAGCCACCATGGCCCCCCGGCGGGCCCGGGGCTGCCGGACCCTGGGCCTGCCCGCCCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCGGCCCCCCGCCACCCGGGGCGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCGAGGGCCGGATCACCTGCCCCCCCCCCATGTCCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGTCCTACTCCCTGTACTCCCGGGAGCGGTACATCTGCAACTCCGGCTTCAAGCGGAAGGCCGGCACCTCCTCCCTGACCGAGTGCGTGCTGAACAAGGCCACCAACGTGGCCCACTGGACCACCCCCTCCCTGAAGTGCATCCGGGACCCCGCCCTGGTGCACCAGCGACCAGCTCCACCTTCAGGTGGATCAGGTGGAGGAGGTTCTGGAGGTGGATCAGGAGGAGGTGGTTCTCTGCAGAACTGGGTGAACGTGATCTCCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGTCCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGTCCGACGTGCACCCCTCCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTCCTGCTGGAGCTGCAGGTGATCTCCCTGGAGTCCGGCGACGCCTCCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACGACTCCCTGTCCTCCAACGGCAACGTGACCGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAGGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTCCTGCAGTCCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCTCCTGAgtcgaccctgtggaat(SEQ ID NO.34)
其中，第21-605位为IRES序列(下划线部分)；738-1370位为人IL15Rα(sushi片段)和IL15(突变型)编码序列；
上述序列编码的人IL15Rα(sushi片段)和IL15(突变型)氨基酸序列为：
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO.35)
将表达JX005的质粒pJX005用EcoRI和SalI双酶切线性化，纯化备用。
重组转化用Clontech Laboratories,Inc.的In-Fusion HD cloning试剂盒，按操作说明书进行，具体如下：
2ul 5x In-Fusion HD Enzyme Premix
8ng pJX005线性化质粒
15ng上述合成的pJX008或JX008.1基因
用dH2O补齐终体积10ul
50℃反应15min后置于冰上。取5ul反应物转化DH5α感受态细胞，挑选三个克隆用分别EcoRI和SalI双酶切鉴定(图2，泳道4-6为pJX008的代表结果)。克隆鉴定均为正确后，挑选正确的克隆提取质粒。质粒表达的序列为JX005(即人源化抗人c-Met抗体scFv序列、人CD8α铰链区、跨膜区、4-1BB胞内区、CD3zeta(ζ)胞内信号区)、IRES,和IL-15Rαsushi部分以及野生型IL-15或突变型IL-15分子组合构成。
具体序列为：
JX008
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQID NO.1)
和
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO.35)
JX008.1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO.1)
和
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO.33)
实施例7：人PBMC的分离
人抗凝浓缩白细胞，50ml/袋转移到有150ml PBS的无菌瓶中。取6个50ml离心管，每管加入15毫升人淋巴细胞分离液(StemCell,Cat#:7851)，再加入稀释后的血液35ml轻轻加到淋巴细胞分离液表面。常温离心，2000RPM/500g，20分钟。由于升速降速都很慢，大概共需要40-50分钟。小心吸除废液至交界面上方1厘米左右，再用10ml一次性移液管吸出交界面细胞，转移至新离心管中，加入无菌PBS至50毫升。常温离心，200g，10分钟。弃上清，弹散细胞，将同一个供者来源的PBMC混在一起，加入50ml PBS,500g离心10分钟。弃上清，用含2ug/ml DNAse I的1640培养基重悬细胞，计数。20％DMSO，80％FBS，1x107/管液氮冻存或用于实验。
实施例8：从人PBMC中分别分离T细胞和NK细胞
实施例7中得到的PBMC用StemCell提供的T细胞，NK细胞分离试剂盒分别提取T细胞和NK细胞。操作步骤按照StemCell试剂盒提供的手册进行。
用StemCellEasySep Kit,Cat:18051提取CD3+T细胞。将上述实施例中得到的PBMC离心，重悬于1x108细胞/ml,按100ul/ml的量加入cocktail,混匀，RT 15min；混匀磁珠，按50ul/ml的量加入上述细胞/cocktail,RT10min；加入1640培养基至总体积2.5ml,用pipet混打几次后置于磁铁，RT5min.弃上清，余下的为CD3+T细胞。
用StemCellEasySep Kit,Cat:19055从上述PBMC中分离NK细胞用于本发明CAR活性检测。将上述实施例中得到的PBMC离心，重悬于5x107细胞/ml,按50ul/ml的量加入cocktail,混匀，RT 10min；混匀磁珠30sec，按100ul/ml的量加入上述细胞/cocktail,RT5min；加入1640培养基至总体积2.5ml,置于磁铁，RT2.5min.收集上清为NK细胞。
实施例9：表达本发明CAR分子JX005；JX006；JX007；JX008,JX008.1的人T细胞和NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性检测
表达本发明的CAR分子的人T细胞，NK细胞能够特异杀伤肿瘤细胞。下面以T细胞为例子进行说明。表达本发明CAR分子的NK细胞杀伤肿瘤细胞操作只需将T细胞置换为上述分离的NK细胞。
T细胞增值：取上述实施例中分离的T细胞，1x106/ml在100mm培养皿中培养，培养基为RPMI 1640(InvitrogenCat.No.12633-012,添加2mL L-glutamin,10％FBS,100U/mlpenicillin/streptomycin)加入Dynabeads人T-细胞激活因子CD3/CD28按1：1比例添加，同时加入30u/ml的人IL-2因子。5％CO2,37℃.每周2次计数细胞，待到细胞密度到2.5x106/ml的时候，传代扩培，继续添加30u/ml的人IL-2因子。培养好的T细胞可以用5％DMSO冻存，或直接进行下面的实验。
反转录病毒制备：293T细胞(购自ProCell)培养在100mm培养皿中，DMEM培养基加10％FBS，到培养皿面积40％覆盖时候开始转染质粒。取5个100mm培养皿培养好的293T,移除原培养基，分别加入10ml新鲜的培养基，和1)6ug pBABEpuro(空载体，购自优宝生物)、6ug pENV(购自优宝生物),6ug pGSVG(购自优宝生物),6ug pGP质粒(购自优宝生物)和Fugene6混合物(购自Invitrogen)；2)6ug pJX005(实施例3)、6ug pENV,6ug pGSVG,6ugpGP质粒和Fugene6混合物；3)6ug pJX006(实施例4)、6ug pENV,6ug pGSVG,6ug pGP质粒和Fugene6混合物；4)6ug pJX007(实施例5)、6ug pENV,6ug pGSVG,6ug pGP质粒和Fugene6混合物；5)6ug pJX008或pJX008.1(实施例6)、6ug pENV,6ug pGSVG,6ug pGP质粒和Fugene6混合物。24小时后，移除培养基，换成6ml T细胞培养基(RPMI 1640)，继续培养24小时后，收集上清，过滤备用。
表达本发明CAR分子的T细胞制备：取上述培养增值中的T细胞，离心，按1x107/孔转到6-well细胞培养板上，分别加入上述制备好的6ml病毒:空载体、pJX005、pJX006、pJX007、pJX008、pJX008.1。24小时后，更换成正常的T细胞培养基(RPMI 1640)，继续培养72小时后，收集表达JX005、JX006、JX007、JX008、JX008.1和对照(空载体)的T细胞，准备肿瘤细胞杀伤实验。
表达本发明CAR分子的T细胞杀伤肿瘤细胞：肿瘤细胞杀伤实验前一天，将肿瘤细胞，即目标细胞(本实验MKN45为表达本发明CAR结合抗原的肿瘤细胞),和对照细胞(没有本发明CAR结合抗原表达的HepG2肝细胞系)按5000个每孔，铺在96-well板上。实验开始，取上述准备好的表达JX005、JX006、JX007、JX008、JX008.1和对照(空载体)的T细胞，按照T细胞：目标细胞比例为1：1、3：1、10：1加入混合、检测。实验中，每个处理设3个重复，并设只有目标细胞，只有T细胞，没有任何细胞的对照孔。
表达本发明分子的T细胞杀伤肿瘤细胞活性检测：用CCK8试剂盒(上海同仁化学提供)检测T细胞杀伤目标细胞活性。每孔加入10％体积的CCK8试剂(参考产品说明书)，孵育4小时后，读取OD450值。
表达本发明分子的T细胞杀伤肿瘤细胞活性结果：
表2表达本发明分子的CAR-T细胞对抗原特异表达的肿瘤细胞和非抗原表达的细胞的杀伤活性
#：空载体，即转染了没有CAR表达的T细胞。将该细胞用于对照，其读值减除背景值后为100，表达本发明CAR的T细胞读值同样减除背景值后，相对于100，数值减少即代表本发明CAR-T分子对c-Met阳性肿瘤细胞(MKN45)和c-Met阴性细胞(HepG2)的杀伤效果。T检验:Student T检验。NA:不适用。
表2结果表明，表达本发明CAR新分子的T细胞(JX005，JX006，JX007，JX008)和表达抗原的肿瘤细胞MKN45以1：1，3：1，10：1的不同比例混合后，JX005，JX006，JX007，JX008均能杀伤肿瘤细胞。杀伤效果随CAR-T细胞比例加大，杀伤作用明显。特别是，JX007，JX008在和肿瘤细胞比例1：1，3：1时候，已经能显著(P<0.05)杀伤肿瘤细胞；在10：1的比例下，JX006,JX007能显著杀死肿瘤细胞(P<0.05)，而JX008杀死作用极为显著(P<0.01)。同样的条件下，表达本发明CAR-T分子不杀伤没有抗原表达的肝细胞系HepG2(差异不显著)，表明本发明的CAR表达T细胞的杀伤作用是靶向特异的。
表达本发明CAR新分子JX008.1(实施例6)的T细胞和表达c-Met抗原的肿瘤细胞MKN45以不同比例混合(实施例9)，意外发现以10：1的比例混合后，JX008.1能极显著杀死肿瘤细胞(P<0.01)。同样的条件下，不杀伤没有抗原表达的肝细胞系HepG2(无显著差异)，表明表达本发明的CAR新分子JX008.1表达T细胞的杀伤作用是靶向特异的。
此外，将实施例9中JX005,JX006,JX007,JX008中的scFV换成实施例1中X005的轻、重链构建的scFV同样能杀死c-Met阳性MKN45细胞。当T细胞和MKN45以10：1的比例时，杀伤细胞效率为14.8％，13.4％,27.7％和32％.同样的条件下，对肿瘤抗原c-Met阴性，低表达肝细胞系HepG2无杀伤作用(均无显著差异)，表明本发明的CAR新分子表达T细胞的杀伤作用是靶向特异的。
综合上述结果，本发明意外发现CAR新分子针对c-Met特异抗原的抗体/抗原结合分子，亲和力在1.62-12.5nM范围内，用4-1BB,和/或CD28作为共刺激因子，都能对靶细胞有特异的杀伤作用，但杀伤作用不足够显著，对非c-Met细胞没有毒性。意外发现，本发明新分子设计带有细胞因子IL15,或IL15R sushi-L-IL15后，特别是带有IL15R sushi-L-IL15(野生型或突变型)后(JX008，JX008.1)对靶细胞的特异杀伤作用极为显著，且对非靶向细胞没有毒性。因此，这些新的CAR分子可用于c-Met阳性的肿瘤病人细胞治疗，能提高疗效，降低脱靶带来的非特异杀伤副作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海健信生物医药科技有限公司
<120> 一种CAR新分子及其在肿瘤治疗中的应用
<130> P2016-1725
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Val Ser Ser Ile
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Tyr Ser Gly Tyr Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val
115 120 125
Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser
130 135 140
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met His Trp Val
145 150 155 160
Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Val Asn Pro
165 170 175
Asn Arg Arg Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Glu Gly Arg Val Thr
180 185 190
Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser
195 200 205
Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Trp
210 215 220
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr
225 230 235 240
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
245 250 255
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
260 265 270
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
275 280 285
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
290 295 300
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
305 310 315 320
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
325 330 335
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
340 345 350
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln
355 360 365
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
370 375 380
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
385 390 395 400
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
405 410 415
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
420 425 430
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
435 440 445
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455 460
<210> 2
<211> 1383
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gacatccaga tgacccagtc cccctcctcc ctgtccgcct ccgtgggcga ccgggtgacc 60
atcacctgct ccgtgtcctc ctccgtgtcc tccatctacc tgcactggta ccagcagaag 120
cccggcaagg cccccaagct gctgatctac tccacctcca acctggcctc cggcgtgccc 180
tcccggttct ccggctccgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatctc ctccctgcag 240
cccgaggact tcgccaccta ctactgccag gtgtactccg gctaccccct gaccttcggc 300
ggcggcacca aggtggagat caagggcggc ggcggctccg gcggcggcgg ctccggcggc 360
ggcggctccc aggtgcagct ggtgcagtcc ggcgccgagg tgaagaagcc cggcgcctcc 420
gtgaaggtgt cctgcaaggc ctccggctac accttcaccg actactacat gcactgggtg 480
cggcaggccc ccggccaggg cctggagtgg atgggccggg tgaaccccaa ccggcggggc 540
accacctaca accagaagtt cgagggccgg gtgaccatga ccaccgacac ctccacctcc 600
accgcctaca tggagctgcg gtccctgcgg tccgacgaca ccgccgtgta ctactgcgcc 660
cgggccaact ggctggacta ctggggccag ggcaccaccg tgaccgtgtc cagtactacc 720
acccccgccc cccggccccc cacccccgcc cccaccatcg cctcccagcc cctgtccctg 780
cggcccgagg cctgccggcc cgccgccggc ggcgccgtgc acacccgggg cctggacttc 840
gcctgcgaca tctacatctg ggcccccctg gccggcacct gcggcgtgct gctgctgtcc 900
ctggtgatca ccctgtactg caagcggggc cggaagaagc tgctgtacat cttcaagcag 960
cccttcatgc ggcccgtgca gaccacccag gaggaggacg gctgctcctg ccggttcccc 1020
gaggaggagg agggcggctg cgagctgcgg gtgaagttct cccggtccgc cgacgccccc 1080
gcctacaagc agggccagaa ccagctgtac aacgagctga acctgggccg gcgggaggag 1140
tacgacgtgc tggacaagcg gcggggccgg gaccccgaga tgggcggcaa gccccggcgg 1200
aagaaccccc aggagggcct gtacaacgag ctgcagaagg acaagatggc cgaggcctac 1260
tccgagatcg gcatgaaggg cgagcggcgg cggggcaagg gccacgacgg cctgtaccag 1320
ggcctgtcca ccgccaccaa ggacacctac gacgccctgc acatgcaggc cctgcccccc 1380
cgg 1383
<210> 3
<211> 502
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Val Ser Ser Ile
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Tyr Ser Gly Tyr Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val
115 120 125
Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser
130 135 140
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met His Trp Val
145 150 155 160
Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Val Asn Pro
165 170 175
Asn Arg Arg Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Glu Gly Arg Val Thr
180 185 190
Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser
195 200 205
Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Trp
210 215 220
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr
225 230 235 240
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
245 250 255
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
260 265 270
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
275 280 285
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
290 295 300
Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
305 310 315 320
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
325 330 335
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg
340 345 350
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
355 360 365
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
370 375 380
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
385 390 395 400
Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
405 410 415
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
420 425 430
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
435 440 445
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
450 455 460
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
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Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
485 490 495
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500
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<211> 1506
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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cccgaggact tcgccaccta ctactgccag gtgtactccg gctaccccct gaccttcggc 300
ggcggcacca aggtggagat caagggcggc ggcggctccg gcggcggcgg ctccggcggc 360
ggcggctccc aggtgcagct ggtgcagtcc ggcgccgagg tgaagaagcc cggcgcctcc 420
gtgaaggtgt cctgcaaggc ctccggctac accttcaccg actactacat gcactgggtg 480
cggcaggccc ccggccaggg cctggagtgg atgggccggg tgaaccccaa ccggcggggc 540
accacctaca accagaagtt cgagggccgg gtgaccatga ccaccgacac ctccacctcc 600
accgcctaca tggagctgcg gtccctgcgg tccgacgaca ccgccgtgta ctactgcgcc 660
cgggccaact ggctggacta ctggggccag ggcaccaccg tgaccgtgtc cagtactacc 720
acccccgccc cccggccccc cacccccgcc cccaccatcg cctcccagcc cctgtccctg 780
cggcccgagg cctgccggcc cgccgccggc ggcgccgtgc acacccgggg cctggacttc 840
gcctgcgaca tctacatctg ggcccccctg gccggcacct gcggcgtgct gctgctgtcc 900
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tactccgaga tcggcatgaa gggcgagcgg cggcggggca agggccacga cggcctgtac 1440
cagggcctgt ccaccgccac caaggacacc tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc 1500
ccccgg 1506
<210> 5
<211> 1408
<212> PRT
<213> 人
<400> 5
Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe
1 5 10 15
Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys
20 25 30
Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala
35 40 45
Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu
50 55 60
Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys
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Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe
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Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His
130 135 140
Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys
145 150 155 160
Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val
165 170 175
Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe
180 185 190
Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp
195 200 205
His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp
210 215 220
Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu
225 230 235 240
Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn
245 250 255
Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln
260 265 270
Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu
275 280 285
His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg
290 295 300
Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala
305 310 315 320
Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser
325 330 335
Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp
340 345 350
Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys
355 360 365
Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg
370 375 380
Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg
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Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr
405 410 415
Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly
420 425 430
Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly
435 440 445
Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln
450 455 460
Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu
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Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu
485 490 495
Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys
500 505 510
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515 520 525
Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys
530 535 540
Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile
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Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu
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Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg
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Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu
595 600 605
Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys
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Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp
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Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly
660 665 670
Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg
675 680 685
His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn
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Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe
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Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe
725 730 735
Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser
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Phe Ile Ser Thr Trp Trp Lys Glu Pro Leu Asn Ile Val Ser Phe Leu
755 760 765
Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn
770 775 780
Leu Asn Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala
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Gly Arg Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile
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Ile Cys Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro
820 825 830
Leu Lys Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr
835 840 845
Phe Asp Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys
850 855 860
Pro Val Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly
865 870 875 880
Asn Asp Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly
885 890 895
Asn Lys Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys
900 905 910
Thr Val Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu
915 920 925
Trp Lys Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln
930 935 940
Pro Asp Gln Asn Phe Thr Gly Leu Ile Ala Gly Val Val Ser Ile Ser
945 950 955 960
Thr Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly Phe Phe Leu Trp Leu Lys Lys Arg
965 970 975
Lys Gln Ile Lys Asp Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg
980 985 990
Val His Thr Pro His Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser
995 1000 1005
Pro Thr Thr Glu Met Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg Ala
1010 1015 1020
Thr Phe Pro Glu Asp Gln Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ser
1025 1030 1035
Cys Arg Gln Val Gln Tyr Pro Leu Thr Asp Met Ser Pro Ile Leu
1040 1045 1050
Thr Ser Gly Asp Ser Asp Ile Ser Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr
1055 1060 1065
Val His Ile Asp Leu Ser Ala Leu Asn Pro Glu Leu Val Gln Ala
1070 1075 1080
Val Gln His Val Val Ile Gly Pro Ser Ser Leu Ile Val His Phe
1085 1090 1095
Asn Glu Val Ile Gly Arg Gly His Phe Gly Cys Val Tyr His Gly
1100 1105 1110
Thr Leu Leu Asp Asn Asp Gly Lys Lys Ile His Cys Ala Val Lys
1115 1120 1125
Ser Leu Asn Arg Ile Thr Asp Ile Gly Glu Val Ser Gln Phe Leu
1130 1135 1140
Thr Glu Gly Ile Ile Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val Leu
1145 1150 1155
Ser Leu Leu Gly Ile Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser Pro Leu Val
1160 1165 1170
Val Leu Pro Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe Ile Arg
1175 1180 1185
Asn Glu Thr His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe Gly
1190 1195 1200
Leu Gln Val Ala Lys Gly Met Lys Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Phe
1205 1210 1215
Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp Glu Lys
1220 1225 1230
Phe Thr Val Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr
1235 1240 1245
Asp Lys Glu Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala Lys Leu
1250 1255 1260
Pro Val Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Leu Gln Thr Gln Lys Phe
1265 1270 1275
Thr Thr Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu
1280 1285 1290
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1295 1300 1305
Asp Ile Thr Val Tyr Leu Leu Gln Gly Arg Arg Leu Leu Gln Pro
1310 1315 1320
Glu Tyr Cys Pro Asp Pro Leu Tyr Glu Val Met Leu Lys Cys Trp
1325 1330 1335
His Pro Lys Ala Glu Met Arg Pro Ser Phe Ser Glu Leu Val Ser
1340 1345 1350
Arg Ile Ser Ala Ile Phe Ser Thr Phe Ile Gly Glu His Tyr Val
1355 1360 1365
His Val Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys Cys Val Ala Pro Tyr
1370 1375 1380
Pro Ser Leu Leu Ser Ser Glu Asp Asn Ala Asp Asp Glu Val Asp
1385 1390 1395
Thr Arg Pro Ala Ser Phe Trp Glu Thr Ser
1400 1405
<210> 6
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Val Asn Pro Asn Arg Arg Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Asn Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Val Ser Ser Ile
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Tyr Ser Gly Tyr Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Val Ser Ser Ile
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Tyr Ser Gly Tyr Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val
115 120 125
Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser
130 135 140
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met His Trp Val
145 150 155 160
Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Val Asn Pro
165 170 175
Asn Arg Arg Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Glu Gly Arg Val Thr
180 185 190
Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser
195 200 205
Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Trp
210 215 220
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
225 230 235
<210> 9
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
35 40 45
<210> 10
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
actaccaccc ccgccccccg gccccccacc cccgccccca ccatcgcctc ccagcccctg 60
tccctgcggc ccgaggcctg ccggcccgcc gccggcggcg ccgtgcacac ccggggcctg 120
gacttcgcct gcgacatcta c 141
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<211> 22
<212> PRT
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<400> 11
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
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20
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<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
atctgggccc ccctggccgg cacctgcggc gtgctgctgc tgtccctggt gatcaccctg 60
tactgc 66
<210> 13
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 14
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aagcggggcc ggaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 60
accacccagg aggaggacgg ctgctcctgc cggttccccg aggaggagga gggcggctgc 120
gagctg 126
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cgggtgaagt tctcccggtc cgccgacgcc cccgcctaca agcagggcca gaaccagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg ccggcgggag gagtacgacg tgctggacaa gcggcggggc 120
cgggaccccg agatgggcgg caagccccgg cggaagaacc cccaggaggg cctgtacaac 180
gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tactccgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240
cggcggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctgt ccaccgccac caaggacacc 300
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccccgg 336
<210> 17
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 18
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cggtccaagc ggtcccggct gctgcactcc gactacatga acatgacccc ccggcggccc 60
ggccccaccc ggaagcacta ccagccctac gccccccccc gggacttcgc cgcctaccgg 120
tcc 123
<210> 19
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 20
<211> 162
<212> PRT
<213> 人
<400> 20
Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr
1 5 10 15
Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His
20 25 30
Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala
35 40 45
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
50 55 60
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
65 70 75 80
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
85 90 95
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
100 105 110
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
115 120 125
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
130 135 140
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
145 150 155 160
Thr Ser
<210> 21
<211> 351
<212> DNA
<213> 人
<400> 21
acagaagcca actgggtgaa tgtaataagt gatttgaaaa aaattgaaga tcttattcaa 60
tctatgcata ttgatgctac tttatatacg gaaagtgatg ttcaccccag ttgcaaagta 120
acagcaatga agtgctttct cttggagtta caagttattt cacttgagtc cggagatgca 180
agtattcatg atacagtaga aaatctgatc atcctagcaa acaacagttt gtcttctaat 240
gggaatgtaa cagaatctgg atgcaaagaa tgtgaggaac tggaggaaaa aaatattaaa 300
gaatttttgc agagttttgt acatattgtc caaatgttca tcaacacttc t 351
<210> 22
<211> 114
<212> PRT
<213> 人
<400> 22
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 23
<211> 267
<212> PRT
<213> 人
<400> 23
Met Ala Pro Arg Arg Ala Arg Gly Cys Arg Thr Leu Gly Leu Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Pro Ala Thr Arg Gly Ile Thr
20 25 30
Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser
35 40 45
Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys
50 55 60
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala
65 70 75 80
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
85 90 95
Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val Thr Thr
100 105 110
Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly Lys Glu
115 120 125
Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr Thr Ala
130 135 140
Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro Ser Thr
145 150 155 160
Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr Pro Ser
165 170 175
Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser His Gln
180 185 190
Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Val Ala Ile
195 200 205
Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser Leu Leu
210 215 220
Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser Val Glu
225 230 235 240
Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser Ser Arg
245 250 255
Asp Glu Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu
260 265
<210> 24
<211> 801
<212> DNA
<213> 人
<400> 24
atggccccgc ggcgggcgcg cggctgccgg accctcggtc tcccggcgct gctactgctg 60
ctgctgctcc ggccgccggc gacgcggggc atcacgtgcc ctccccccat gtccgtggaa 120
cacgcagaca tctgggtcaa gagctacagc ttgtactcca gggagcggta catttgtaac 180
tctggtttca agcgtaaagc cggcacgtcc agcctgacgg agtgcgtgtt gaacaaggcc 240
acgaatgtcg cccactggac aacccccagt ctcaaatgca ttagagaccc tgccctggtt 300
caccaaaggc cagcgccacc ctccacagta acgacggcag gggtgacccc acagccagag 360
agcctctccc cttctggaaa agagcccgca gcttcatctc ccagctcaaa caacacagcg 420
gccacaacag cagctattgt cccgggctcc cagctgatgc cttcaaaatc accttccaca 480
ggaaccacag agataagcag tcatgagtcc tcccacggca ccccctctca gacaacagcc 540
aagaactggg aactcacagc atccgcctcc caccagccgc caggtgtgta tccacagggc 600
cacagcgaca ccactgtggc tatctccacg tccactgtcc tgctgtgtgg gctgagcgct 660
gtgtctctcc tggcatgcta cctcaagtca aggcaaactc ccccgctggc cagcgttgaa 720
atggaagcca tggaggctct gccggtgact tgggggacca gcagcagaga tgaagacttg 780
gaaaactgct ctcaccacct a 801
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 26
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 27
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gacatccaga tgacccagtc cccctcctcc ctgtccgcct ccgtgggcga ccgggtgacc 60
atcacctgct ccgtgtcctc ctccgtgtcc tccatctacc tgcactggta ccagcagaag 120
cccggcaagg cccccaagct gctgatctac tccacctcca acctggcctc cggcgtgccc 180
tcccggttct ccggctccgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatctc ctccctgcag 240
cccgaggact tcgccaccta ctactgccag gtgtactccg gctaccccct gaccttcggc 300
ggcggcacca aggtggagat caag 324
<210> 28
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
caggtgcagc tggtgcagtc cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgcctc cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactactaca tgcactgggt gcggcaggcc 120
cccggccagg gcctggagtg gatgggccgg gtgaacccca accggcgggg caccacctac 180
aaccagaagt tcgagggccg ggtgaccatg accaccgaca cctccacctc caccgcctac 240
atggagctgc ggtccctgcg gtccgacgac accgccgtgt actactgcgc ccgggccaac 300
tggctggact actggggcca gggcaccacc gtgaccgtgt ccagt 345
<210> 29
<211> 1521
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
tctaggcgcc ggccggatcc ggcgccggcc ggatccgcca ccatggccct gcccgtgacc 60
gccctgctgc tgcccctggc cctgctgctg cacgccgccc ggcccgacat ccagatgacc 120
cagtccccct cctccctgtc cgcctccgtg ggcgaccggg tgaccatcac ctgctccgtg 180
tcctcctccg tgtcctccat ctacctgcac tggtaccagc agaagcccgg caaggccccc 240
aagctgctga tctactccac ctccaacctg gcctccggcg tgccctcccg gttctccggc 300
tccggctccg gcaccgactt caccctgacc atctcctccc tgcagcccga ggacttcgcc 360
acctactact gccaggtgta ctccggctac cccctgacct tcggcggcgg caccaaggtg 420
gagatcaagg gcggcggcgg ctccggcggc ggcggctccg gcggcggcgg ctcccaggtg 480
cagctggtgc agtccggcgc cgaggtgaag aagcccggcg cctccgtgaa ggtgtcctgc 540
aaggcctccg gctacacctt caccgactac tacatgcact gggtgcggca ggcccccggc 600
cagggcctgg agtggatggg ccgggtgaac cccaaccggc ggggcaccac ctacaaccag 660
aagttcgagg gccgggtgac catgaccacc gacacctcca cctccaccgc ctacatggag 720
ctgcggtccc tgcggtccga cgacaccgcc gtgtactact gcgcccgggc caactggctg 780
gactactggg gccagggcac caccgtgacc gtgtccagta ctaccacccc cgccccccgg 840
ccccccaccc ccgcccccac catcgcctcc cagcccctgt ccctgcggcc cgaggcctgc 900
cggcccgccg ccggcggcgc cgtgcacacc cggggcctgg acttcgcctg cgacatctac 960
atctgggccc ccctggccgg cacctgcggc gtgctgctgc tgtccctggt gatcaccctg 1020
tactgcaagc ggggccggaa gaagctgctg tacatcttca agcagccctt catgcggccc 1080
gtgcagacca cccaggagga ggacggctgc tcctgccggt tccccgagga ggaggagggc 1140
ggctgcgagc tgcgggtgaa gttctcccgg tccgccgacg cccccgccta caagcagggc 1200
cagaaccagc tgtacaacga gctgaacctg ggccggcggg aggagtacga cgtgctggac 1260
aagcggcggg gccgggaccc cgagatgggc ggcaagcccc ggcggaagaa cccccaggag 1320
ggcctgtaca acgagctgca gaaggacaag atggccgagg cctactccga gatcggcatg 1380
aagggcgagc ggcggcgggg caagggccac gacggcctgt accagggcct gtccaccgcc 1440
accaaggaca cctacgacgc cctgcacatg caggccctgc ccccccggtg agatcccagt 1500
gtggtgaatt cgccagcaca g 1521
<210> 30
<211> 1645
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
tctaggcgcc ggccggatcc ggcgccggcc ggatccgcca ccatggccct gcccgtgacc 60
gccctgctgc tgcccctggc cctgctgctg cacgccgccc ggcccgacat ccagatgacc 120
cagtccccct cctccctgtc cgcctccgtg ggcgaccggg tgaccatcac ctgctccgtg 180
tcctcctccg tgtcctccat ctacctgcac tggtaccagc agaagcccgg caaggccccc 240
aagctgctga tctactccac ctccaacctg gcctccggcg tgccctcccg gttctccggc 300
tccggctccg gcaccgactt caccctgacc atctcctccc tgcagcccga ggacttcgcc 360
acctactact gccaggtgta ctccggctac cccctgacct tcggcggcgg caccaaggtg 420
gagatcaagg gcggcggcgg ctccggcggc ggcggctccg gcggcggcgg ctcccaggtg 480
cagctggtgc agtccggcgc cgaggtgaag aagcccggcg cctccgtgaa ggtgtcctgc 540
aaggcctccg gctacacctt caccgactac tacatgcact gggtgcggca ggcccccggc 600
cagggcctgg agtggatggg ccgggtgaac cccaaccggc ggggcaccac ctacaaccag 660
aagttcgagg gccgggtgac catgaccacc gacacctcca cctccaccgc ctacatggag 720
ctgcggtccc tgcggtccga cgacaccgcc gtgtactact gcgcccgggc caactggctg 780
gactactggg gccagggcac caccgtgacc gtgtccagta ctaccacccc cgccccccgg 840
ccccccaccc ccgcccccac catcgcctcc cagcccctgt ccctgcggcc cgaggcctgc 900
cggcccgccg ccggcggcgc cgtgcacacc cggggcctgg acttcgcctg cgacatctac 960
atctgggccc ccctggccgg cacctgcggc gtgctgctgc tgtccctggt gatcaccctg 1020
tactgccggt ccaagcggtc ccggctgctg cactccgact acatgaacat gaccccccgg 1080
cggcccggcc ccacccggaa gcactaccag ccctacgccc ccccccggga cttcgccgcc 1140
taccggtcca agcggggccg gaagaagctg ctgtacatct tcaagcagcc cttcatgcgg 1200
cccgtgcaga ccacccagga ggaggacggc tgctcctgcc ggttccccga ggaggaggag 1260
ggcggctgcg agctgcgggt gaagttctcc cggtccgccg acgcccccgc ctacaagcag 1320
ggccagaacc agctgtacaa cgagctgaac ctgggccggc gggaggagta cgacgtgctg 1380
gacaagcggc ggggccggga ccccgagatg ggcggcaagc cccggcggaa gaacccccag 1440
gagggcctgt acaacgagct gcagaaggac aagatggccg aggcctactc cgagatcggc 1500
atgaagggcg agcggcggcg gggcaagggc cacgacggcc tgtaccaggg cctgtccacc 1560
gccaccaagg acacctacga cgccctgcac atgcaggccc tgcccccccg gtgagatccc 1620
agtgtggtgg aattcgccag cacag 1645
<210> 31
<211> 1059
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gatcccagtg tggtgaattc gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag 60
ccgcttggaa taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc 120
ttttggcaat gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg 180
tctttcccct ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc 240
tctggaagct tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc 300
cccacctggc gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa 360
ggcggcacaa ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct 420
ctcctcaagc gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg 480
atctgatctg gggcctcggt acacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg 540
tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg 600
ccacagccac catgaggatc tccaagcccc acctgcggtc catctccatc cagtgctacc 660
tgtgcctgct gctgaactcc cacttcctga ccgaggccaa ctgggtgaac gtgatctccg 720
acctgaagaa gatcgaggac ctgatccagt ccatgcacat cgacgccacc ctgtacaccg 780
agtccgacgt gcacccctcc tgcaaggtga ccgccatgaa gtgcttcctg ctggagctgc 840
aggtgatctc cctggagtcc ggcgacgcct ccatccacga caccgtggag aacctgatca 900
tcctggccaa caactccctg tcctccaacg gcaacgtgac cgagtccggc tgcaaggagt 960
gcgaggagct ggaggagaag aacatcaagg agttcctgca gtccttcgtg cacatcgtgc 1020
agatgttcat caacacctcc tgagtcgacc ctgtggaat 1059
<210> 32
<211> 1389
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gatcccagtg tggtgaattc gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag 60
ccgcttggaa taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc 120
ttttggcaat gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg 180
tctttcccct ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc 240
tctggaagct tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc 300
cccacctggc gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa 360
ggcggcacaa ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct 420
ctcctcaagc gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg 480
atctgatctg gggcctcggt acacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg 540
tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg 600
ccacagccac catggccccc cggcgggccc ggggctgccg gaccctgggc ctgcccgccc 660
tgctgctgct gctgctgctg cggccccccg ccacccgggg cgactacaag gacgacgacg 720
acaagatcga gggccggatc acctgccccc cccccatgtc cgtggagcac gccgacatct 780
gggtgaagtc ctactccctg tactcccggg agcggtacat ctgcaactcc ggcttcaagc 840
ggaaggccgg cacctcctcc ctgaccgagt gcgtgctgaa caaggccacc aacgtggccc 900
actggaccac cccctccctg aagtgcatcc gggaccccgc cctggtgcac cagcgaccag 960
ctccaccttc aggtggatca ggtggaggag gttctggagg tggatcagga ggaggtggtt 1020
ctctgcagaa ctgggtgaac gtgatctccg acctgaagaa gatcgaggac ctgatccagt 1080
ccatgcacat cgacgccacc ctgtacaccg agtccgacgt gcacccctcc tgcaaggtga 1140
ccgccatgaa gtgcttcctg ctggagctgc aggtgatctc cctggagtcc ggcgacgcct 1200
ccatccacga caccgtggag aacctgatca tcctggccaa caactccctg tcctccaacg 1260
gcaacgtgac cgagtccggc tgcaaggagt gcgaggagct ggaggagaag aacatcaagg 1320
agttcctgca gtccttcgtg cacatcgtgc agatgttcat caacacctcc tgagtcgacc 1380
ctgtggaat 1389
<210> 33
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 33
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu
85 90 95
Gln Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu
100 105 110
Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
115 120 125
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
130 135 140
Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
145 150 155 160
Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn
165 170 175
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
180 185 190
Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile
195 200 205
Asn Thr Ser
210
<210> 34
<211> 1389
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gatcccagtg tggtgaattc gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag 60
ccgcttggaa taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc 120
ttttggcaat gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg 180
tctttcccct ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc 240
tctggaagct tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc 300
cccacctggc gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa 360
ggcggcacaa ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct 420
ctcctcaagc gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg 480
atctgatctg gggcctcggt acacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg 540
tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg 600
ccacagccac catggccccc cggcgggccc ggggctgccg gaccctgggc ctgcccgccc 660
tgctgctgct gctgctgctg cggccccccg ccacccgggg cgactacaag gacgacgacg 720
acaagatcga gggccggatc acctgccccc cccccatgtc cgtggagcac gccgacatct 780
gggtgaagtc ctactccctg tactcccggg agcggtacat ctgcaactcc ggcttcaagc 840
ggaaggccgg cacctcctcc ctgaccgagt gcgtgctgaa caaggccacc aacgtggccc 900
actggaccac cccctccctg aagtgcatcc gggaccccgc cctggtgcac cagcgaccag 960
ctccaccttc aggtggatca ggtggaggag gttctggagg tggatcagga ggaggtggtt 1020
ctctgcagaa ctgggtgaac gtgatctccg acctgaagaa gatcgaggac ctgatccagt 1080
ccatgcacat cgacgccacc ctgtacaccg agtccgacgt gcacccctcc tgcaaggtga 1140
ccgccatgaa gtgcttcctg ctggagctgc aggtgatctc cctggagtcc ggcgacgcct 1200
ccatccacga caccgtggag aacctgatca tcctggccaa cgactccctg tcctccaacg 1260
gcaacgtgac cgagtccggc tgcaaggagt gcgaggagct ggaggagaag aacatcaagg 1320
agttcctgca gtccttcgtg cacatcgtgc agatgttcat caacacctcc tgagtcgacc 1380
ctgtggaat 1389
<210> 35
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 35
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu
85 90 95
Gln Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu
100 105 110
Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
115 120 125
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
130 135 140
Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
145 150 155 160
Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn
165 170 175
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
180 185 190
Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile
195 200 205
Asn Thr Ser
210

Claims (10)

1.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物具有下式所示的结构：
car-(IRES)-f
其中，car表示嵌合抗原受体编码多核苷酸序列；IRES表示内部核糖体进入位点序列(Internal ribosome entry site,IRES)；f表示功能性融合蛋白编码序列，所述功能性融合蛋白包括细胞因子或其活性片段，和/或所述细胞因子的受体或其活性片段。
2.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述细胞因子为IL15。
3.如权利要求2所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物具有下式所示的结构：
嵌合抗原受体编码多核苷酸序列-(IRES)-IL15受体sushi片段编码多核苷酸序列-L–IL15多核苷酸编码序列，其中“-”表示连接相邻核苷酸的磷酯键或任选地接头肽编码多核苷酸序列，“L”表示任选地接头肽编码序列。
4.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域特异性靶向肿瘤抗原，优选地所述肿瘤抗原为c-Met抗原。
5.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，f为编码SEQ ID NO.22、33、35所示多肽的多核苷酸序列。
6.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1所述的核酸构建物。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求6所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求1所述的核酸构建物。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有药学上可接受的载体以及权利要求1所述的核酸构建物、权利要求6所述的载体、或权利要求7所述的细胞。
9.权利要求1所述的核酸构建物、权利要求6所述的载体、或权利要求7所述的细胞的用途，用于制备治疗肿瘤的药物或制剂。
10.一种制备CAR修饰的细胞(如CAR-修饰的T细胞或NK细胞)的方法，其特征在于，
所述方法包括步骤：将权利要求1所述的核酸构建物、或权利要求6所述的载体导入待修饰的细胞内，从而获得所述CAR修饰的细胞。
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Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109320615A (zh) * 2018-09-25 2019-02-12 上海恒润达生生物科技有限公司 靶向新型bcma的嵌合抗原受体及其用途
WO2019047932A1 (zh) * 2017-09-08 2019-03-14 科济生物医药（上海）有限公司 基因工程化的t细胞及应用
CN109609465A (zh) * 2018-12-29 2019-04-12 武汉波睿达生物科技有限公司 一种利用脐血来源的γδT细胞制备CAR-T细胞的方法及该CAR-T细胞和应用
CN109939127A (zh) * 2018-06-13 2019-06-28 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 Nk细胞的应用及包括该nk细胞的药物组合物及其应用
WO2019160956A1 (en) * 2018-02-13 2019-08-22 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
WO2019242505A1 (zh) 2018-06-17 2019-12-26 上海健信生物医药科技有限公司 靶向cldn18.2的抗体、双特异性抗体、adc和car及其应用
CN112105723A (zh) * 2018-03-08 2020-12-18 鲁比厄斯治疗法股份有限公司 用于治疗癌症和传染病的治疗性细胞系统和方法
WO2021244626A1 (zh) * 2020-06-05 2021-12-09 上海交通大学 靶向cldn18.2的嵌合抗原受体及其用途
CN114106176A (zh) * 2020-09-01 2022-03-01 深圳市菲鹏生物治疗股份有限公司 Cd22抗体及其应用
CN114249834A (zh) * 2021-12-23 2022-03-29 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体、其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
WO2023056915A1 (en) * 2021-10-08 2023-04-13 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Polynucleotides encoding interleukin-12 (il-12) and related composition and methods thereof
CN116814553A (zh) * 2023-03-30 2023-09-29 广州百吉生物制药有限公司 杀伤和存续能力增强型car-t细胞及其制备和应用
WO2023213280A1 (zh) * 2022-05-06 2023-11-09 上海先博生物科技有限公司 靶向cldn18.2的嵌合抗原t细胞受体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101376891B (zh) * 2007-08-27 2012-05-23 上海生物制品研究所有限责任公司 新型结核病疫苗的制备及其应用
WO2015066551A2 (en) * 2013-10-31 2015-05-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified hematopoietic stem/progenitor and non-t effector cells, and uses thereof
CN105734080A (zh) * 2016-01-30 2016-07-06 山西大学 一种靶向抗癌基因-质粒及其构建方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101376891B (zh) * 2007-08-27 2012-05-23 上海生物制品研究所有限责任公司 新型结核病疫苗的制备及其应用
WO2015066551A2 (en) * 2013-10-31 2015-05-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified hematopoietic stem/progenitor and non-t effector cells, and uses thereof
CN105734080A (zh) * 2016-01-30 2016-07-06 山西大学 一种靶向抗癌基因-质粒及其构建方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JENSEN等: "Designing chimeric antigen receptors to effectively and safely target tumors", 《CURR. OPIN.IMMUNOL.》 *

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019047932A1 (zh) * 2017-09-08 2019-03-14 科济生物医药（上海）有限公司 基因工程化的t细胞及应用
WO2019160956A1 (en) * 2018-02-13 2019-08-22 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
CN112105723A (zh) * 2018-03-08 2020-12-18 鲁比厄斯治疗法股份有限公司 用于治疗癌症和传染病的治疗性细胞系统和方法
CN109939127A (zh) * 2018-06-13 2019-06-28 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 Nk细胞的应用及包括该nk细胞的药物组合物及其应用
US11912763B2 (en) 2018-06-17 2024-02-27 L & L Biopharma Co., Ltd. Antibody targeting CLDN18.2, bispecific antibody, ADC, and CAR, and applications thereof
WO2019242505A1 (zh) 2018-06-17 2019-12-26 上海健信生物医药科技有限公司 靶向cldn18.2的抗体、双特异性抗体、adc和car及其应用
CN109320615A (zh) * 2018-09-25 2019-02-12 上海恒润达生生物科技有限公司 靶向新型bcma的嵌合抗原受体及其用途
CN109609465A (zh) * 2018-12-29 2019-04-12 武汉波睿达生物科技有限公司 一种利用脐血来源的γδT细胞制备CAR-T细胞的方法及该CAR-T细胞和应用
WO2021244626A1 (zh) * 2020-06-05 2021-12-09 上海交通大学 靶向cldn18.2的嵌合抗原受体及其用途
CN114106176A (zh) * 2020-09-01 2022-03-01 深圳市菲鹏生物治疗股份有限公司 Cd22抗体及其应用
CN114106176B (zh) * 2020-09-01 2024-04-09 深圳市菲鹏生物治疗股份有限公司 Cd22抗体及其应用
WO2023056915A1 (en) * 2021-10-08 2023-04-13 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Polynucleotides encoding interleukin-12 (il-12) and related composition and methods thereof
CN116829578A (zh) * 2021-10-08 2023-09-29 苏州艾博生物科技有限公司 编码白细胞介素-12(il-12)的多核苷酸以及其相关组合物和方法
CN114249834B (zh) * 2021-12-23 2023-06-23 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体、其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
CN114249834A (zh) * 2021-12-23 2022-03-29 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体、其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
WO2023213280A1 (zh) * 2022-05-06 2023-11-09 上海先博生物科技有限公司 靶向cldn18.2的嵌合抗原t细胞受体及其应用
CN116814553A (zh) * 2023-03-30 2023-09-29 广州百吉生物制药有限公司 杀伤和存续能力增强型car-t细胞及其制备和应用

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