CN103333251A - 基于重组融合抗原蛋白的γ-干扰素夹心ELISA检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于重组融合抗原蛋白的γ-干扰素夹心ELISA检测方法，同时本发明还涉及重组融合抗原蛋白的制备方法和γ-干扰素单克隆抗体制备方法，属于医学检验测定技术领域。本发明的重组融合抗原蛋白由分泌性抗原蛋白MPB70、抗原蛋白CFP10、抗原蛋白ESAT6通过肽键连接组成，γ-干扰素单克隆抗体通过动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选、克隆、纯化得到，利用重组融合抗原蛋白和γ-干扰素单克隆抗体建立夹心ELISA检测方法。由于重组融合抗原蛋白可快速刺激牛血样品分泌出γ-干扰素，γ-干扰素单抗能快速特异性识别牛γ-干扰素，具有较强的灵敏度和特异性，在水牛结核病诊断方面具有广泛的应用前景。

Description

基于重组融合抗原蛋白的γ-干扰素夹心ELISA检测方法

技术领域

本发明属于医学检验测定技术领域，特别是涉及基于重组融合抗原蛋白的γ-干扰素夹心ELISA检测方法。 

背景技术

牛结核病（tuberculosis,TB）是由牛结核分枝杆菌引起的慢性消耗性疾病，呈世界性分布。世界动物卫生组织（OIE）将牛结核病列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。一直以来，人们习惯认为牛结核病在水牛中很少发生，但1998~2000年南非克罗格国家公园爆发了以水牛为自然宿主的牛结核病，公园南部的水牛感染率达42%，中部地区的感染率为21%，给人们提示了水牛感染结核病的严重性。近年来我国南方奶水牛业的快速发展，尤其是广西、云南、贵州、四川等地掀起了饲养奶水牛的热潮。由于水牛奶干物质含量高达18.4%，比黑白花牛奶的含量高出1/3多；其中乳脂率含量为7.9%，高出黑白花牛奶一倍多，水牛奶在人们的日常生活中的地位越来越重要。随着水牛集约化养殖程度的提高，水牛养殖密度的增加，尤其是从国内外引种交易的频繁以及检疫的不严格，增加了水牛结核病发生的可能性，全国水牛结核病的流行具有上升与蔓延趋势。我国亦不断有水牛结核病发生的报道，但对水牛结核病的检测由于没有适合的方法而一直是沿用牛结核病的检测方法，均不适用于水牛结核病的检测。 

到目前为止，我国国标推荐的牛结核病诊断方法只有细菌学检查和结核菌素(PPD)皮内变态反应。细菌学检出率低，培养周期长，不适于大规模普查。皮内变态反应的应用最为广泛，该法技术要求不高，但工作量大，检出时间长，操作麻烦，许多因素都可以降低该方法的敏感性和特异性。γ-干扰素（IFN-γ）主要是由抗原、有丝分裂素等一些细胞因子活化T淋巴细胞和NK细胞产生，是免疫调节活性最强的一类干扰素。经结核杆菌抗原致敏的T淋巴细胞，在再次遇到相同抗原时，将在短时间内产生IFN-γ，因此高水平的IFN-γ即可表明有结核杆菌感染。国外Wood等首先将抗原特异性的IFN-γ试验用于牛结核病的检测，澳大利亚选用牛IFN-γ试验为牛结核病根除计划的大规模筛选试验，已于1997年12月宣布消灭了牛结核病；此外，爱尔兰、新西兰等国也批准牛IFN-γ试验为正式试验。 

经过对检索有关于牛结核病检测试剂的研究报道，国内牛结核病检测的现有技术情况如下：（1）华中农业大学、中国农业大学对抗牛IFN-γ试验单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立进行了研究；扬州大学建立了牛γ-干扰素抗原捕获ELISA检测方法，建立了竞争抑制ELISA方法和胶体金试纸条检测牛γ-干扰素。但扬州大学建立的方法采用牛分支杆菌抗原PPD作为刺激物，临床诊断中难以与禽分支杆菌等环境分支杆菌感染区分开，特异性较差。（2）中国农业大学申请的专利（申请号201110034194.3）牛分支杆菌检测试剂使用单个重组蛋白MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的混合物，中国农科院北京畜牧兽医研究所申请的专利（申请号201210147678.3）牛结核病检测试剂亦使用单个重组蛋白CFP-10、ESAT-6和TB10.4，单个抗原混合使用在抗原表达与纯化、相互配比及方法的标准化等方面均存在明显不足；中国农科院哈尔滨兽医研究所申请的专利(申请号200510005002.0)使用牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83和ESAT6融合蛋白用于牛结核病的检测，忽视了CFP-10和ESAT-6是紧密异二聚体结构的特点，在检测灵敏度方面略有欠缺。γ-干扰素水平成为了牛结核病的判断标准，而国内对γ-干扰素检测方面的研究存在一定的局限性，例如灵敏度和特异性差、检测周期长、检测方法仅限用于黑白花奶牛、不适于大规模普查等问题。 

本发明人通过对1500余头奶水牛进行PPD皮内变态反应临床试验，其结果显示，2岁以下的水牛术前皮厚平均值在20mm左右，3~5岁的水牛术前皮厚平均值在17.5mm左右，5岁以上水牛的平均值在18.5mm左右。用PPD作为抗原进行水牛皮内变态反应，皮厚差大于2mm的水牛占到20%左右，其中皮厚差大于4mm的水牛占到10%左右，按照国标（GB/T18645-2002.动物结核病诊断技术）其检出的阳性率异常高。然而，PPD检测阳性水牛用IFN-γELISA试验复检，其阳性率通常不足5%。该检测结果让我们认为直接参照现行国标用PPD进行水牛结核病检测，以2mm皮厚差以下判断阴性的标准是不适用于水牛结核病检测的。有关报道显示，奶水牛以及水牛群已经处于结核病感染的状态，急需开发出一种可用于快速检测牛全血中γ-干扰素分泌水平的方法，实现水牛结核病的防控。 

发明内容

本发明的目的是针对现有牛牛全血中γ-干扰素检测技术存在检测周期长、不适于大规模普查、工作量大、检测操作麻烦、敏感性和特异性差等不足，以及专门针对水牛中的γ-干扰素的有效检测技术处于空白状态，提供一种基于重组融合抗原蛋白（CFP10，ESAT6，MPB70）和γ-干扰素特异单克隆抗体的γ-干扰素夹心ELISA检测方法。 

本发明实现的技术方案为：一种重组融合抗原蛋白，其特征在于，该重组融合抗原蛋白由分泌性抗原蛋白MPB70、抗原蛋白CFP10、抗原蛋白ESAT6通过肽键依次连接组成；所述重组融合抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。 

本发明的技术原理为：一种用于牛血中γ-干扰素检测，由三个牛分支杆菌特异性抗原连接而成的重组融合抗原蛋白（CFP10，ESAT6，MPB70），其中CFP10和ESAT6抗原蛋白对牛的血液中免疫类细胞产生刺激，导致异常免疫细胞在γ-干扰素方面的分泌情况发生变化；而MPB70蛋白能使异常免疫细胞持续性分泌γ-干扰素。异常细胞受重组融合抗原蛋白（CFP10，ESAT6，MPB70）的刺激影响，γ-干扰素分泌水平上升；正常的免疫类细胞不受重组融合抗原蛋白（CFP10，ESAT6，MPB70）的刺激影响，γ-干扰素分泌水平变化不大。所以将三个抗原以一个蛋白的形式表达，不但能刺激机体产生细胞免疫反应，而且引发体液免疫，具有免疫原性和免疫保护，该重组抗原蛋白能够有效刺激细胞产生DTH反应及刺激动物外周血淋巴细胞释放γ-干扰素。通过以γ-干扰素单克隆抗体为基础的夹心ELISA方法，检测动物机体受重组融合抗原蛋白（CFP10，ESAT6，MPB70）刺激后的γ-干扰素分泌水平，即可区分出异常细胞和正常细胞。 

作为本发明的进一步改进，所述抗原蛋白MPB70位于该重组融合抗原蛋白的氨基端，抗原蛋白ESAT6位于该重组融合抗原蛋白的羧基端。 

作为本发明的进一步改进，所述抗原蛋白MPB70和抗原蛋白CFP10之间具有连接肽序列；所述CFP10抗原蛋白和ESAT6抗原蛋白之间具有连接肽序列。 

制备以上所述重组融合抗原蛋白的方法，该制备方法包括PCR扩增重组基因、构建重组基因表达载体、诱导表达重组基因、色谱纯化获得重组融合抗原蛋白，其特征在于，所述PCR扩增重组基因为利用5对引物对抗原蛋白MPB70基因、抗原蛋白CFP10基因、抗原蛋白ESAT6基因进行扩增得到重组融合抗原蛋白MPB70-CFP10-ESAT6基因；所述的引物包括：第一对引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，第二对引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，第三对引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，第四对引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，第五对引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7。以上所述的构建重组基因表达载体、诱导表达重组基因、色谱纯化获得重组融合抗原蛋白方法步骤，按照实验室常规现有方法即可实现。 

作为本发明的进一步改进，所述PCR扩增重组基因的步骤如下： 

步骤A：以牛结核分支杆菌基因组DNA为模板，利用序列表SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的第一对引物扩增得到MPB70基因，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的第二对引物扩增得到CFP10基因，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的第三对引物扩增得到ESAT6基因。

步骤B：以步骤A扩增得到的CFP10基因和ESAT6基因为模板，利用序列表SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7 所示的第五对引物扩增得到CFP10-ESAT6基因。 

步骤C：以步骤A扩增得到的MPB70基因和步骤B扩增得到的CFP10-ESAT6基因为模板，利用序列表SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的第四对引物扩增得到MPB70-CFP10-ESAT6基因。 

以上所述的PCR扩增重组基因的实现方法依靠现有的PCR技术，通过多次PCR扩增，以及基因工程双酶切技术，实现抗原蛋白MPB70基因、抗原蛋白CFP10基因、抗原蛋白ESAT6基因三段基因的衔接合并。 

基于重组融合抗原蛋白的γ-干扰素夹心ELISA检测方法，其特征在于，该夹心ELISA检测方法步骤包括： 

步骤1）样品预处理：将重组融合抗原蛋白和牛全血样品按体积比为100ul：1000~2000ul混合，置于37℃温育16~24小时，取400ul温育后牛全血上清液为待测样品。

步骤2）包被：用γ-干扰素单克隆抗体包被酶标板，每孔中γ-干扰素单克隆抗体添加量为5~7×10^-2ug，添加完后酶标板置于37℃保温1.5~3h，得到包被后的酶标板。 

步骤3）封闭：用BSA/PBST溶液封闭步骤2）包被后的酶标板，BSA/PBST溶液添加量为200μL/孔，酶标板在37℃下温育1~3h，温育后甩去溶液并洗涤，得到封闭后的酶标板。 

步骤4）加样：分别将50~100μL对照样品和步骤1）得到的待测样品加入至步骤3）得到的封闭后的酶标板相应孔中，添加完后酶标板置于37℃温育1~2h，温育后甩去溶液并洗涤，得到加样完成酶标板。 

步骤5）加酶标记单抗：在步骤4）得到的加样完成酶标板中每孔加入50~100μL经马血清PBST新鲜稀释的酶标结合物，振荡混匀后在37℃下温育1~3h，温育后甩去溶液并洗涤，得到加酶标记单抗完成酶标板。 

步骤6）显色与终止：在步骤5）得到的加酶标记单抗完成酶标板中每孔加入50~100μL新鲜配制的底物溶液，振荡混合后室温避光孵育10~20min进行显色，再每孔加入50~100μL终止液，混匀孵育5~10min终止反应，得到可进行测定的溶液。 

步骤7）测值：测定步骤6）得到的可进行测定的溶液在OD_450nm处的吸光值A_450nm。 

步骤8）数据处理：利用步骤7）测定的吸光值A_450nm计算出待测样品S/P值，所述待测样品S/P值=（待测样品A_450nm－阴性对照样品平均值NCx）÷（阳性对照样品平均值PCx－阴性对照样品平均值NCx）。 

作为本发明的进一步限定，所述酶标结合物为辣根过氧化物酶与γ-干扰素单克隆抗体分子数按照1:1结合得到。 

以上所述的一种基于重组融合抗原蛋白的γ-干扰素夹心ELISA检测方法，以识别牛全血中γ-干扰素抗原表位不同的γ-干扰素单克隆抗体分别作为包被抗体和酶标记抗体，包被液、洗涤液、酶标抗体稀释液、底物显色液、终止液的配备为ELISA现有方法的常规技术。 

为使本发明的技术方案完整，本发明技术实现方案设计思路中还涉及到了γ-干扰素单克隆抗体制备，所述γ-干扰素单克隆抗体其制备过程为： 

步骤a动物免疫：以γ-干扰素重组蛋白为免疫抗原注射小鼠3~6次，每次注射量为100ul，每次注射间隔时间7~21天，最后一次免疫注射3天后，获取 P/N值≥2.5的免疫小鼠脾细胞。

步骤b细胞融合：将骨髓瘤细胞和步骤a得到P/N值≥2.5的免疫小鼠脾细胞进行细胞融合得到杂交瘤细胞。 

步骤c杂交瘤细胞筛选：获取步骤b得到的杂交瘤细胞，筛选出 P/N值≥2.5的杂交瘤细胞，转入培养瓶中扩大培养，得到大量P/N值≥2.5的杂交瘤细胞。 

步骤d杂交瘤细胞克隆：在小鼠腹腔内接种步骤c得到的大量P/N值≥2.5的杂交瘤细胞1~5×10⁶个，使其在小鼠腹腔内增2~3周后，注射器采集得到小鼠腹水。 

步骤e纯化：等体积PBS稀释步骤d得到的小鼠腹水后，搅拌加入等体积饱和硫酸铵溶液，继续搅拌20~30min，高速离心弃上清液；沉淀溶于饱和硫酸铵溶液中，搅拌20~30min，高速离心弃上清液；将沉淀溶于原腹水体积1/10的PBS溶液中，于4℃透析过夜，得到纯化的γ-干扰素单克隆抗体。 

作为本发明的进一步限定，所述γ-干扰素重组蛋白为以水牛基因组为克隆模版，利用基因重组表达方法获得；所述注射为腹腔注射或皮下注射；所述P/N值为按照间接ELISA方法测定待测样品复孔的OD_450nm和阴性复孔的OD_450nm，再计算P/N值=待测样品复孔的OD_450nm÷阴性复孔的OD_450nm。 

为使本发明公开充分，作为本发明的进一步改进，在γ-干扰素单克隆抗体制备过程，建立了间接ELISA用于杂交瘤细胞筛选中P/N值的测定，所述间接ELISA方法的步骤如下： 

 (1)包被：以纯化的重组γ-干扰素裂解上清分别作为抗原用包被稀释液稀释，使浓度分别为：25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL，3.12μg/mL每孔包被酶标板，37℃过夜，烘干。

 (2)洗涤：甩干包被液，用pH7.4的PBST洗涤三次，每次3min。 

 (3)封闭：加入封闭液100μL/孔，37℃温育30min。甩干，洗涤同上。 

 (4)加样：小鼠阳性及阴性血清用血清稀释液作1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600稀释，100μL/孔，37℃温育60min，甩干，洗涤同上。 

 (5)加酶标二抗：加1:2000稀释的羊抗小鼠IgG酶标二抗，每孔100μL，37℃温育60min。甩干，洗涤同上。 

 (6)加底物：加入TMB单组分可溶性底物溶液100μL/孔，室温作用15min左右。 

 (7)终止：滴加100μL/孔终止液。 

 (8)测值：酶联检测仪测定OD_450nm值。 

 (9)判断方法：依次测得各反应孔OD_450nm值，P是待测样品复孔的OD_450nm，N是阴性复孔的OD_450nm，计算同一条件下各P/N值。 

以上所述的基于重组融合抗原蛋白的γ-干扰素夹心ELISA检测方法，该方法用于检测牛全血中的γ-干扰素，所述的牛包括普通水牛、奶水牛、普通黄牛、黑白花奶牛。该检测方法尤其适用于普通水牛和奶水牛中γ-干扰素水平的检测。 

本发明的实质性特点和显著进步是： 

（1）本发明所述的重组融合抗原蛋白（CFP10，ESAT6，MPB70）作为刺激免疫类细胞产生γ-干扰素抗原时，其稳定性和准确性高于单一的重组抗原蛋白。

（2）本发明所述的重组融合抗原蛋白（CFP10，ESAT6，MPB70）能特异性地刺激受结核分支杆菌感染的机体分泌γ-干扰素，且能在机体处于各种状态均能稳定地分泌γ-干扰素；而未受结核分枝杆菌感染的机体不受其刺激，γ-干扰素分泌水平较低；通过夹心ELISA方法，检测出样品中γ-干扰素浓度，即可应用于牛免疫情况测定中。 

（3）本发明所述的γ-干扰素单克隆抗体可以特异性的识别样品中的γ-干扰素，其识别水平高，使夹心ELISA检测方法的灵敏度提高，且该单克隆抗体实现了大量克隆，降低了检测试剂的成本。 

（4）本发明夹心ELISA检测方法检测过程缩短为20~36小时，相对于传统方法需要2~5天，提高了检测效率，本方法利用酶标板一次性可以实现24~96个样品的检测，使得该方法适于大规模普查、工作量减小、检测操作简便。 

附图说明

图1为MPB70、CFP10、ESAT6基因的PCR扩增，其中M为DNA marker DL2000，1为MPB70基因的PCR扩增，2为CFP10基因的PCR扩增、3为ESAT6基因的PCR扩增。 

图2为MPB70、CFP10、ESAT6融合基因的PCR扩增，其中M为DNA marker DL2000，1为MPB70基因的PCR扩增，2为CFP10-ESAT6基因的PCR扩增、3为MPB70- CFP10-ESAT6基因的PCR扩增。 

图3为重组质粒PET-32a-MPB70的酶切鉴定，其中M为DNA marker DL2000，1为PET-32a-MPB70的双酶切鉴定。 

图4为重组质粒PET-32a-CFP10-ESAT6的酶切鉴定，其中M为DNA marker DL2000，1为PET-32a-CFP10-ESAT6的双酶切鉴定。 

图5为重组质粒PET-32a-MPB70-CFP10-ESAT6的酶切鉴定，其中M为DNA marker DL2000，1为PET-32a-MPB70-CFP10-ESAT6的双酶切鉴定。 

图6为重组蛋白MPB70、CFP10-ESAT6、MPB70-CFP10-ESAT-6的SDS-PAGE分析，所有为诱导5小时后的基因工程菌菌体蛋白，M为标准蛋白质分子量，1为诱导pET-32a-MPB70/BL21、2为诱导pET-32a-CFP10-ESAT6/BL21、3为诱导pET-32a-MPB70-CFP10-ESAT6/BL21，4为诱导pET-32a /BL21， 5为未诱导pET-32a-MPB70/BL21、6为未诱导pET-32a-CFP10-ESAT6/BL21、7为未诱导pET-32a-MPB70-CFP10-ESAT-6/BL21。 

图7为重组蛋白MPB70、CFP10-ESAT6、MPB70-CFP10-ESAT-6 Western-blotting鉴定结果， 1为诱导pET-32a-MPB70-CFP10-ESAT6/BL21、2为诱导pET-32a-CFP10-ESAT6/BL21、3为诱导pET-32a-MPB70/BL21，4为诱导pET-32a /BL21， 5为未诱导pET-32a-MPB70-CFP10-ESAT-6/BL21，M为标准蛋白质分子量。 

图8为重组蛋白MPB70-CFP10-ESAT-6蛋白纯化色谱图。 

图9为单抗的纯化效果分析，M为标准蛋白质分子量，1、2分别为两只不同小鼠腹水单抗的纯化SDS-PAGE分析图。 

具体实施方式

以下结合说明书附图和实施例描述本发明一种基于重组融合抗原蛋白的γ-干扰素夹心ELISA检测方法，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定，以下实施例中所用到的所有试剂均可通过商业手段购买。 

实施例1重组融合抗原蛋白MPB70-CFP10-ESAT6的表达 

（1）引物设计

根据GenBank中（登录号：NC_002945）的牛结核分枝杆菌AF2122/97中的三个类似基因序列设计8条引物：其中MPB70、CFP10均删除终止密码子，引入linker (Gly4Ser1)3、YAPQDP，分别共45bp和18bp个碱基（划线标识）。引物由大连宝生物工程公司合成，引物序列如表1中的SEQ ID NO:3~10所示。

表1扩增重组抗原基因MPB70-CFP10-ESAT-6的引物核苷酸序列 

（2）PCR扩增重组基因

以牛结核分支杆菌基因组DNA为模板，用表1中的引物对分别扩增CFP10、ESAT6、MPB70基因，具体反应体系如下： 

10×EX Taq Buffer                  2.5μL

d NTP (2.5M each)                  2μL

MgCl₂(25μM)                      2μL

EX-Taq                           0.3μL            

25 pmol/L上游引物 (M1/C1/E1 )     0.5μL

25 pmol/L下游引物 (M2/C2/E2)     0.5μL

ddH₂O                          16.5μL

三个基因扩增和反应条件相同：95℃预变性5 min，进入循环：95℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃ 延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物电泳检测，结果见图1，其中牛结核分枝杆菌MPB70、CFP10、ESAT-6基因产物分别约为504bp、314bp、300bp，与预期大小一致。

参照DNA回收试剂盒说明书进行操作（购自Takata（大连）生物工程公司），分别回收MPB70、CFP10、ESAT-6目的基因PCR产物。 

CFP10-ESAT-6基因的融合扩增：以CFP10和ESAT-6的PCR回收产物为模板，用表1中的引物对 C1\E2进行PCR扩增，具体反应体系如下： 

   2.5 mmol/L dNTPs                2.0 μL

   10×PCR buffer                   2.5 μL

   MgCl₂                          2.0μL

   25 pmol/L的上游引物（C1）      0.5μL  

   25 pmol/L的下游引物 (E2)        0.5μL  

   CFP10 PCR回收产物              2.5 μL

   ESAT6 PCR回收产物              2.5 μL

   Taq DNA聚合酶（5μ/μL）        0.25 μL

   ddH₂O                           12.5μL

按以下程序进行反应：95℃预变性5 min，进入循环：95℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃ 延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物电泳检测，结果见图2，其中牛结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6融合基因产物扩增片断与预期的646bp大小一致。

参照DNA回收试剂盒说明书进行操作（购自Takata（大连）生物工程公司），回收CFP10-ESAT-6目的基因PCR产物。 

MPB70-CFP10-ESAT-6基因的融合扩增：以MPB70和CFP10-ESAT-6的PCR回收产物为模板，用表1中的引物对 MCE1\MCE2进行PCR扩增，具体反应体系如下： 

   2.5 mmol/L dNTPs              2.0 μL

   10×PCR buffer                 2.5 μL

   MgCl₂                         2.0μL

   25 pmol/L的上游引物（MCE1）    各0.5μL  

   25 pmol/L的下游引物 (MCE2)      各0.5μL  

   CFP10 PCR回收产物              2.5 μL

   ESAT6 PCR回收产物              2.5 μL

   Taq DNA聚合酶（5μ/μL）       0.25 μL

   ddH₂O                         12.5μL

按以下程序进行反应：95℃预变性5 min，进入循环：95℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃ 延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物电泳检测，结果见图2，其中牛结核分枝杆菌MPB70-CFP10-ESAT-6融合基因产物扩增片断与预期的1158bp大小一致。

参照DNA回收试剂盒说明书进行操作（购自Takata（大连）生物工程公司），回收MPB70-CFP10-ESAT-6目的基因PCR产物。 

（3）构建重组基因表达载体 

将MPB70、CFP10-ESAT-6、MPB70-CFP10-ESAT-6PCR产物分别经双酶切后，定向克隆到PET-32a表达载体中，构建重组表达质粒，并将重组表达质粒转化到BL21中。获得的重组质粒经双酶切（见图3、图4、图5）和测序鉴定正确后，筛选得到阳性重组菌，分别命名为pET-32a-MPB70/BL21、pET-32a-CFP10-ESAT6/BL21、pET-32a-MPB70-CFP10-ESAT6/BL21。

（4）诱导表达重组基因 

制备的阳性重组菌pET-32a-MPB70/BL21、pET-32a-CFP10-ESAT6/BL21、pET-32a-MPB70-CFP10-ESAT6/BL21       过夜培养后，以1:50转接种含Ampicillin (100mg/mL)的LB液体培养基中，37℃ 200r/min振荡培养4h，使其OD600nm值达到0.4~0.6，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG 37℃诱导5h，同时设不含插入片段的PET-32a转化菌诱导对照。分别取1mL菌液12000r/min离心5min，去上清，用0.01mol/L PBS (pH7.2)洗涤2次后，悬浮于40μL PBS，加10μL 5× SDS-PAGE上样缓冲液经煮沸5min后，取处理好的样品(包括IPTG诱导的PET-32a /BL21转化菌、pET-32a-MPB70/BL21、pET-32a-CFP10-ESAT6/BL21、pET-32a-MPB70-CFP10-ESAT6/BL21   重组菌及未经IPTG诱导的pET-32a-MPB70/BL21、pET-32a-CFP10-ESAT6/BL21、pET-32a-MPB70-CFP10-ESAT6/BL21    转化菌) 20μL进行SDS-PAGE分析（图6）。

（5）色谱纯化获得重组融合抗原蛋白 

诱导表达的菌体经超声裂解后，取上清用于HIS琼脂糖凝胶FF纯化，所用仪器为AKTA Purifier；经蛋白质定量，1L大肠杆菌菌体裂解上清纯化可得到MPB70-CFP10-ESAT6融合蛋白2.8mg（见图8）。

实施例2 γ-干扰素单克隆抗体的制备 

本发明γ-干扰素重组蛋白为以水牛基因组为克隆模版，利用基因重组表达方法获得， γ-干扰素重组蛋白的克隆其步骤为：

（1）水牛外周血淋巴细胞培养17小时后，离心收取淋巴细胞及其培养物悬液，按RNA抽提试剂盒说明书进行RNA提取（购自上海生物工程公司）。

（2）对上述得到的RNA进行逆转录，RT反应体系如下：取抽提好的RNA样品16μL于PCR管中，加入IFN-γ2（25pmol/μL）1.0μL，5×Buffer 5.0μL，dNTPs(2.5mmoL)2.0μL，RNasin(40U/μL) 0.5μL，M-MLVRTase(200U/μL)0.5μL，置PCR仪中，42℃ 60min，94℃ 5min，反应结束后得到cDNA。 

以上述得到的cDNA为模板，按顺序加入以下试剂， PCR反应体系如下： 

2.5 mmol/L dNTPs              2.0 μL

10×PCR buffer                 2.5 μL

MgCl₂                         2.0μL

25 pmol/L的 IFN-γ1            0.5 μL

25 pmol/L的 IFN-γ2            0.5 μL

cDNA模板                     5 μL

Taq DNA聚合酶（5μ/μL）    0.25 μL

ddH₂O                       12.5μL

按以下程序进行反应：95℃预变性5 min，进入循环：95℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃ 延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物电泳检测，结果见图9，其中水牛IFN-γ含信号肽基因产物约为544bp，与预期大小一致。

参照DNA回收试剂盒说明书进行操作（购自Takata（大连）生物工程公司），回收目的基因PCR产物，并与PMD18-T载体的连接，4℃连接过夜，转化至DH5α感受态细胞，提取重组质粒进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，将酶切和测序正确的阳性重组质粒命名为PMD18-T-WBIFN-γ。 

水牛γ-干扰素基因（成熟肽段）的扩增，以阳性重组质粒PMD18-T-IFN-γ为模板，利用设计的引物，PCR扩增含有EcoRⅠ和XholⅠ酶切位点的水牛γ-干扰素基因。按顺序加入以下试剂，建立25 μL PCR反应体系： 

2.5 mmol/L dNTPs              2 μL

  10×PCR buffer                 2.5 μL

  MgCl₂                         2.0μL

  25 pmol/L的上下游引物      各0.5 μL  

  阳性克隆质粒                   5 μL

Taq DNA聚合酶（5U/μL）    0.25 μL

  ddH₂O                        12.5 μL

  按以下程序进行反应：95℃预变性5 min，进入循环：95℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。PCR扩增产物电泳检测，其中水牛IFN-γ成熟肽段基因产物约为463bp，与预期大小一致。

  参照DNA回收试剂盒说明书进行操作（购自Takata（大连）生物工程公司），回收目的基因PCR产物，用限制性内切酶EcoRⅠ和XholⅠ分别对目的基因PCR产物和表达载体质粒pGEX-6P-1、PET -32a 酶切，37℃水浴作用2 h。 

将纯化回收后的PCR产物与表达载体pGEX-6P-1和PET -32a连接，4℃连接过夜后转化入DH5α感受态细胞，连接体系如下： 

10×T₄ DNA连接酶buffer                2.5 μL

  表达载体DNA                        0.03pmol 

PCR产物                             0.3pmol

  T₄  DNA连接酶                       1.0 μL

  取上述转化后的基因工程阳性菌提取质粒，对pGEX-WBIFN-γ重组质粒用PstⅠ单酶切鉴定，对PET-WBIFN-γ重组质粒用EcoRⅠ和XholⅠ双酶切重组质粒，酶切和测序鉴定正确后，筛选得到阳性重组菌，分别命名为pGEX-WBIFN-γ/BL21、PET-WBIFN-γ/BL21。

制备的阳性重组菌pGEX-WBIFN-γ/BL21、PET-WBIFN-γ/BL21      过夜培养后，以1:50转接种含Ampicillin (100mg/mL)的LB液体培养基中，37℃ 200r/min振荡培养4h，使其OD600nm值达到0.4~0.6，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG 37℃诱导3h，同时设不含插入片段的PET-32a转化菌诱导对照。 

诱导表达的pGEX-WBIFN-γ/BL21及PET-WBIFN-γ/BL21菌体经超声裂解后，取上清用于GST和HIS琼脂糖凝胶FF纯化，所用仪器为AKTA Purifier，得到纯化好的γ-干扰素重组蛋白，进入以下γ-干扰素单克隆抗体制备。 

（1）动物免疫：以γ-干扰素重组蛋白为免疫抗原注射小鼠3~6次，每次注射量为100~500ul，每次注射间隔时间7~21天，最后一次免疫注射3天后，获取 P/N值≥2.5的免疫小鼠脾细胞。γ-干扰素重组蛋白可通过基因工程手段获得，实施过程中，免疫注射方式为免疫抗原注射小鼠5次，每次注射量为100ul，每次注射间隔时间14天。 

（2）细胞融合：将免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合。免疫小鼠鼠脾细胞的制备：将已经免疫的Balb/c小鼠，摘除眼球采血并分离血清作为抗体检测时的阳性对照，处死小鼠后无菌手术取脾，放入盛有清理液无菌平皿内，轻轻洗涤后用灭菌玻璃注射器内芯于200目铜网碾压脾脏，使脾细胞释放到平皿中的清理液中，用吸管吹打数次，制成单细胞悬液，计数备用。骨髓瘤细胞的准备：将骨髓瘤细胞(SP2/0)融合前36小时扩大培养，融合当天取对数生长期的细胞用融合试剂盒配备的清理液轻吹下，1000r/min离心10min，重悬于清理液中，计数备用。细胞融合使用上海杰美公司生产的融合试剂盒进行。 

（3）杂交瘤细胞筛选：获取 P/N值≥2.5的杂交瘤细胞，转入培养瓶中扩大培养。 

（4）杂交瘤细胞克隆：在小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞1~5×10⁶个，使其在小鼠腹腔内增2~3周，注射器采集小鼠腹水。实施过程中接种杂交瘤细胞2×10⁶个。 

（5）纯化：等体积PBS稀释步骤4）得到的腹水后，搅拌加入等体积饱和硫酸铵溶液，继续搅拌20~30min，高速离心弃上清液；沉淀溶于饱和硫酸铵溶液中，搅拌20~30min，高速离心弃上清液；将沉淀溶于原腹水体积1/10的PBS溶液中，于4℃透析过夜，得到纯化的γ-干扰素单克隆抗体，结果见图9。 

以上P/N值为按照间接ELISA方法测定待测样品复孔的OD_450nm和阴性复孔的OD_450nm，再计算P/N值=待测样品复孔的OD_450nm÷阴性复孔的OD_450nm。 

以上P/N值测定所用到的间接ELISA方法的步骤如下： 

 1)包被：以纯化的重组γ-干扰素裂解上清分别作为抗原用包被稀释液稀释，使浓度分别为：25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL，3.12μg/mL每孔包被酶标板，37℃过夜，烘干。

 2)洗涤：甩干包被液，用pH7.4的PBST洗涤三次，每次3min。 

 3)封闭：加入封闭液100μL/孔，37℃温育30min。甩干，洗涤同上。 

 4)加样：小鼠阳性及阴性血清用血清稀释液作1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600稀释，100μL/孔，37℃温育60min，甩干，洗涤同上。 

 5)加酶标二抗：加1:2000稀释的羊抗小鼠IgG酶标二抗，每孔100μL，37℃温育60min。甩干，洗涤同上。 

 6)加底物：加入TMB单组分可溶性底物溶液100μL/孔，室温作用15min左右。 

 7)终止：滴加100μL/孔终止液。 

 8)测值：酶联检测仪测定OD_450nm值。 

 9)判断方法：依次测得各反应孔OD_450nm值，P是待测样品复孔的OD_450nm，N是阴性复孔的OD_450nm，计算同一条件下各P/N值。 

实施例3利用重组融合抗原蛋白和γ-干扰素单克隆抗体检测牛血清中的γ-干扰素 

本检测方法依据夹心ELISA方法原理，以随机抽取的普通黄牛全血为样品，样品数量为6，检测方法如下：

（1）样品预处理：高速离心牛血清样品获得上清液，将重组融合抗原蛋白与牛血上清液按体积比为100ul：1000ul进行混合，在37℃温育混合液20小时，离心收集上清液。

（2）包被：用γ-干扰素单克隆抗体包被酶标板，每孔中γ-干扰素单克隆抗体添加量为5~7×10^-2ug，添加完后酶标板置于37℃保温1.5h。 

（3）封闭：用BSA/PBST溶液封闭包被后的酶标板，BSA/PBST溶液添加量为200μL/孔，酶标板在37℃下温育1.5h，温育后甩去溶液并洗涤。 

（4）加样：分别将50μL待测样品和对照样品加入至相应孔中，添加完后酶标板置于37℃温育1h，温育后甩去溶液并洗涤。 

（5）加酶标记单抗：每孔加入100μL经马血清PBST新鲜稀释的酶标结合物，振荡混匀后在37℃下温育1h，温育后甩去溶液并洗涤。酶标结合物为辣根过氧化物酶与γ-干扰素单克隆抗体分子数按照1:1结合得到。 

（6）显色与终止：每孔加入50μL新鲜配制的底物溶液，振荡混合后室温避光孵育10min，再每孔加入80μL终止液，混匀孵育5~10min。 

（7）测值：测定步骤6）得到的溶液在OD_450nm处的吸光值A_450nm。 

（8）数据处理：对步骤7）测定的吸光值A_450nm结果判定计算出待测样品S/P值，待测样品S/P值＜0.3和待测样品S/P值≥0.3判定结果。待测样品S/P值=（待测样品A_450nm－阴性对照样品平均值NCx）÷（阳性对照样品平均值PCx－阴性对照样品平均值NCx）。检测结果见表2。 

重组融合抗原蛋白和水牛γ-干扰素单克隆抗体，以识别抗原表位不同的γ-干扰素单克隆抗体分别作为包被抗体和酶标记抗体，包被液、洗涤液、酶标抗体稀释液、底物显色液、终止液的配备为ELISA现有方法的常规技术。 

实施例4检测黑白花奶牛全血中的γ-干扰素 

本实施例中检测的血样品为随机抽取的黑白花奶牛全血，样品数量为6，在样品预处理步骤中重组融合抗原蛋白与牛血上清液按体积比为100ul：1500ul进行混合，在37℃温育混合液16小时；包被步骤中保温时间为2.0h；封闭步骤中温育2.0h；加样步骤中待测样品和对照样品添加量为100μL，温育2h；加酶标记单抗步骤中酶标结合物添加量为80μL，温育2.0h；显色与终止中新鲜配制的底物溶液加入量为70ul，振荡混合后室温避光孵育15min，再每孔加入100μL终止液；其余操作步骤同实施例3，检测结果见表2。

实施例5检测普通水牛全血中的γ-干扰素 

本实施例中检测的血样品为随机抽取的普通水牛全血，样品数量为6，在样品预处理步骤中重组融合抗原蛋白与牛血上清液按体积比为100ul：2000ul进行混合，在37℃温育混合液24小时；包被步骤中保温时间为2.5h；封闭步骤中温育1.0h；加样步骤中待测样品和对照样品添加量为60μL，温育2h；加酶标记单抗步骤中酶标结合物添加量为60μL，温育3h；显色与终止中新鲜配制的底物溶液加入量为80ul，振荡混合后室温避光孵育20min，再每孔加入60μL终止液；其余操作步骤同实施例3，检测结果见表2。

实施例6检测奶水牛全血中的γ-干扰素 

本实施例中检测的血清样品为随机抽取的奶水牛全血，样品数量为6，在样品预处理步骤中重组融合抗原蛋白与牛血上清液按体积比为100ul：1800ul进行混合，在37℃温育混合液18小时；包被步骤中保温时间为3.0h；封闭步骤中温育3.0h；加样步骤中待测样品和对照样品添加量为80μL，温育1.0h；加酶标记单抗步骤中酶标结合物添加量为50μL，温育2.0h；显色与终止中新鲜配制的底物溶液加入量为100ul，振荡混合后室温避光孵育15min，再每孔加入70μL终止液；其余操作步骤同实施例3，检测结果见表2。

本发明上述实施例方案仅是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书中指出了本发明的范围，而上述的具体实施例说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应当认为是包括在权利要求书的范围内。 

本发明是经过水牛疾病长期工作经验积累，并通过创造性劳动创作而出，其在实际试验检测和水牛疾病检测实际应用程中，该方法检测结果可靠，检测准确率高。 

表2牛血清中的γ-干扰素夹心ELISA检测结果 

注：“+”代表待测样品S/P值≥0.3，“-”代表待测样品S/P值＜0.3。 

  

序列表

<110>  广西壮族自治区动物疫病预防控制中心

<120>  基于重组融合抗原蛋白的γ-干扰素夹心ELISA检测方法

<130>  2013

<160>  10     

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  380

<212>  PRT

<213>  牛分枝杆菌（mycobacterium bovis）

<400>  1

MET Gly Asp Leu Val Gly Pro Gly Cys Ala Glu Tyr Ala Ala Ala Asn Pro Thr Gly Pro 

                 5                   10                  15                  20

Ala Ser Val Gln Gly MET Ser Gln Asp Pro Val Ala Val Ala Ala Ser Asn Asn Pro Glu 

                 25                  30                  35                  40

Leu Thr Thr Leu Thr Ala Ala Leu Ser Gly Gln Leu Asn Pro Gln Val Asn Leu Val Asp 

                 45                  50                  55                  60

Thr Leu Asn Ser Gly Gln Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Ala Ala Phe Ser Lys Leu 

                 65                  70                  75                  80 

Ser Ala Ser Thr Ile Asp Glu Leu Lys Thr Asn Ser Ser Leu Leu Thr Ser Ile Leu Thr 

                 85                  90                  95                 100

Tyr His Val Val Ala Gly Gln Thr Ser Pro Ala Asn Val Val Gly Thr Arg Gln Thr Leu 

                105                 110                 115                 120

Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Thr Gly Gln Gly Asn Ser Leu Lys Val Gly Asn Ala Asp 

                125                 130                 135                 140 

Val Val Cys Gly Gly Val Ser Thr Ala Asn Ala Thr Val Tyr MET Ile Asp Ser Val Leu 

                145                 150                 155                  160

MET Pro Pro Ala Tyr Ala Pro Gln Asp Pro MET Ala Glu MET Lys Thr Asp Ala Ala Thr 

                165                 170                 175                  180

Leu Ala Gln Glu Ala Gly Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp 

                185                 190                 195                  200

Gln Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly Thr Ala 

                205                 210                 215                  220

Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys Gln Lys Gln Glu Leu Asp 

                225                 230                 235                  240

Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln 

                245                 250                 255                  260

Gln Gln Ala Leu Ser Ser Gln MET Gly Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 

                265                 270                 275                  280

Gly Gly Gly Gly Ser MET Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala 

                285                 290                 295                  300

Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser 

                305                 310                 315                  320

Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln 

                325                 330                 335                  340

Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr 

                345                 350                 355                  360

Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala MET Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly MET Phe Ala

                365                 370                 375                  380

<210>  2

<211>  1140

<212>  DNA

<213>  牛分枝杆菌（mycobacterium bovis）

<400>  2

atgggcgatc tggtgggccc gggctgcgcg gaatacgcgg cagccaatcc cactgggccg      60

gcctcggtgc agggaatgtc gcaggacccg gtcgcggtgg cggcctcgaa caatccggag     120

ttgacaacgc tgacggctgc actgtcgggc cagctcaatc cgcaagtaaa cctggtggac     180

accctcaaca gcggtcagta cacggtgttc gcaccgacca acgcggcatt tagcaagctg     240

tcggcatcca cgatcgacga gctcaagacc aattcgtcac tgctgaccag catcctgacc     300

taccacgtag tggccggcca aaccagcccg gccaacgtcg tcggcacccg tcagaccctc     360

cagggcgcca gcgtgacggt gaccggtcag ggtaacagcc tcaaggtcgg taacgccgac     420

gtcgtctgtg gtggggtgtc taccgccaac gcgacggtgt acatgattga cagcgtgcta     480

atgcctccgg cgtacgcacc acaggacccg atggcagaga tgaagaccga tgccgctacc     540

ctcgcgcagg aggcaggtaa tttcgagcgg atctccggcg acctgaaaac ccagatcgac     600

caggtggagt cgacggcagg ttcgttgcag ggccagtggc gtggcgcggc ggggacggcc     660

gcccaggccg cggtggtgcg cttccaagaa gcagccaata agcagaagca ggaactcgac     720

gagatctcga cgaatattcg tcaggccggc gtccaatact cgagggccga cgaggagcag     780

cagcaggcgc tgtcctcgca aatgggcttc ggtggcggtg gaagcggcgg tggcggaagc     840

ggcggtggcg gcagcatgac agagcagcag tggaatttcg cgggtatcga ggccgcggca     900

agcgcaatcc agggaaatgt cacgtccatt cattccctcc ttgacgaggg gaagcagtcc     960

ctgaccaagc tcgcagcggc ctggggcggt agcggttcgg aggcgtacca gggtgtccag    1020

caaaaatggg acgccacggc taccgagctg aacaacgcgc tgcagaacct ggcgcggacg    1080

atcagcgaag ccggtcaggc aatggcttcg accgaaggca acgtcactgg gatgttcgca    1140

<210>  3

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

cgggatccat gggcgatctg gtgg                                            24

<210>  4

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

cccaagcttc taatgcctcc ggcg                                            24

<210>  5

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

ccggatccat ggcagagatg aagac                                           25

<210>  6

<211>  71

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  6

gctgccgcca ccgccgcttc cgccaccgcc gcttccaccg ccaccgaagc ccatttgcga     60

ggacagcgcc t                                                          71

<210>  7

<211>  73

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  7

ggtggcggtg gaagcggcgg tggcggaagc ggcggtggcg gcagcatgac agagcagcag     60

tggaatttcg cgg                                                        73

<210>  8

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  8

ccaagctttg cgaacatccc agtga                                           25

<210>  9

<211>  33

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  9

cgggtcctgt ggtgcgtacg ccggaggcat tag                                  33

<210>  10

<211>  35

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  10

tacgcaccac aggacccgat ggcagagatg aagac                                35

Claims (8)

1.一种重组融合抗原蛋白，其特征在于，该重组融合抗原蛋白由分泌性抗原蛋白MPB70、抗原蛋白CFP10、抗原蛋白ESAT6通过肽键依次连接组成；所述重组融合抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组融合抗原蛋白，其特征在于，所述抗原蛋白MPB70位于该重组融合抗原蛋白的氨基端，抗原蛋白ESAT6位于该重组融合抗原蛋白的羧基端。

3.一种制备权利要求1~2任一所述的重组融合抗原蛋白的方法，该制备方法包括PCR扩增重组基因、构建重组基因表达载体、诱导表达重组基因、色谱纯化获得重组融合抗原蛋白，其特征在于，所述PCR扩增重组基因为利用5对引物对抗原蛋白MPB70基因、抗原蛋白CFP10基因、抗原蛋白ESAT6基因进行扩增得到重组融合抗原蛋白MPB70-CFP10-ESAT6基因；所述的引物包括：第一对引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，第二对引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，第三对引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，第四对引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，第五对引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7。

4.根据权利要求3所述的制备重组融合抗原蛋白的方法，其特征在于，所述PCR扩增重组基因的步骤如下：

步骤A：以牛结核分支杆菌基因组DNA为模板，利用序列表SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的第一对引物扩增得到MPB70基因，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的第二对引物扩增得到CFP10基因，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的第三对引物扩增得到ESAT6基因；

步骤B：以步骤A扩增得到的CFP10基因和ESAT6基因为模板，利用序列表SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7 所示的第五对引物扩增得到CFP10-ESAT6基因；

步骤C：以步骤A扩增得到的MPB70基因和步骤B扩增得到的CFP10-ESAT6基因为模板，利用序列表SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的第四对引物扩增得到MPB70-CFP10-ESAT6基因。

5.一种基于权利要求3~4任一制备得到的重组融合抗原蛋白的γ-干扰素夹心ELISA检测方法，其特征在于，该夹心ELISA检测方法步骤包括：

步骤1）样品预处理：将重组融合抗原蛋白和牛全血样品按体积比为100ul：1000~2000ul混合，置于37℃温育16~24小时，取400ul温育后牛全血上清液为待测样品；

步骤2）包被：用γ-干扰素单克隆抗体包被酶标板，每孔中γ-干扰素单克隆抗体添加量为5~7×10^-2ug，添加完后酶标板置于37℃保温1.5~3h，得到包被后的酶标板；

步骤3）封闭：用BSA/PBST溶液封闭步骤2）包被后的酶标板，BSA/PBST溶液添加量为200μL/孔，酶标板在37℃下温育1~3h，温育后甩去溶液并洗涤，得到封闭后的酶标板；

步骤4）加样：分别将50~100μL对照样品和步骤1）得到的待测样品加入至步骤3）得到的封闭后的酶标板相应孔中，添加完后酶标板置于37℃温育1~2h，温育后甩去溶液并洗涤，得到加样完成酶标板；

步骤5）加酶标记单抗：在步骤4）得到的加样完成酶标板中每孔加入50~100μL经马血清PBST新鲜稀释的酶标结合物，振荡混匀后在37℃下温育1~3h，温育后甩去溶液并洗涤，得到加酶标记单抗完成酶标板；

步骤6）显色与终止：在步骤5）得到的加酶标记单抗完成酶标板中每孔加入50~100μL新鲜配制的底物溶液，振荡混合后室温避光孵育10~20min进行显色，再每孔加入50~100μL终止液，混匀孵育5~10min终止反应，得到可进行测定的溶液；

步骤7）测值：测定步骤6）得到的可进行测定的溶液在OD_450nm处的吸光值A_450nm；

步骤8）数据处理：利用步骤7）测定的吸光值A_450nm计算出待测样品S/P值，所述待测样品S/P值=（待测样品A_450nm－阴性对照样品平均值NCx）÷（阳性对照样品平均值PCx－阴性对照样品平均值NCx）。

6.根据权利要求5所述的基于重组融合抗原蛋白的γ-干扰素夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述酶标结合物为辣根过氧化物酶与γ-干扰素单克隆抗体分子数按照1:1结合得到。

7.根据权利要求6所述的基于重组融合抗原蛋白的γ-干扰素夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述γ-干扰素单克隆抗体其制备过程为：

步骤a动物免疫：以γ-干扰素重组蛋白为免疫抗原注射小鼠3~6次，每次注射量为100ul，每次注射间隔时间7~21天，最后一次免疫注射3天后，获取 P/N值≥2.5的免疫小鼠脾细胞；

步骤b细胞融合：将骨髓瘤细胞和步骤a得到P/N值≥2.5的免疫小鼠脾细胞进行细胞融合得到杂交瘤细胞；

步骤c杂交瘤细胞筛选：获取步骤b得到的杂交瘤细胞，筛选出 P/N值≥2.5的杂交瘤细胞，转入培养瓶中扩大培养，得到大量P/N值≥2.5的杂交瘤细胞；

步骤d杂交瘤细胞克隆：在小鼠腹腔内接种步骤c得到的大量P/N值≥2.5的杂交瘤细胞1~5×10⁶个，使其在小鼠腹腔内增2~3周后，注射器采集得到小鼠腹水；

步骤e纯化：等体积PBS稀释步骤d得到的小鼠腹水后，搅拌加入等体积饱和硫酸铵溶液，继续搅拌20~30min，高速离心弃上清液；沉淀溶于饱和硫酸铵溶液中，搅拌20~30min，高速离心弃上清液；将沉淀溶于原腹水体积1/10的PBS溶液中，于4℃透析过夜，得到纯化的γ-干扰素单克隆抗体。

8.根据权利7所述的基于重组融合抗原蛋白的γ-干扰素夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述γ-干扰素重组蛋白为以水牛基因组为克隆模版，利用基因重组表达方法获得；所述注射为腹腔注射或皮下注射；所述P/N值为按照间接ELISA方法测定待测样品复孔的OD_450nm和阴性复孔的OD_450nm，再计算P/N值=待测样品复孔的OD_450nm÷阴性复孔的OD_450nm。

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