CN103592441B - 一种重组猪干扰素ɑ双抗体夹心法免疫胶体金检测试纸条的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组猪干扰素ɑ双抗体夹心法免疫胶体金检测试纸条及其制备方法，是将兔抗重组猪干扰素ɑ多克隆抗体、胶体金标记重组猪干扰素ɑ单克隆抗体根据抗原抗体反应原理，分别固定在硝酸纤维素膜和玻璃纤维素膜上，组成重组猪干扰素ɑ双抗体夹心法免疫胶体金检测试纸条。试纸条由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜及PVC底板4个部分组成，样品垫用玻璃纤维素膜。本发明建立了敏感快速的检测重组猪干扰素ɑ样品的方法，具有高特异性，高稳定性，供实验室和市场上对重组猪干扰素ɑ产品的鉴定和验证用。

Description

一种重组猪干扰素ɑ双抗体夹心法免疫胶体金检测试纸条的制备方法

技术领域

本发明涉及重组猪干扰素ɑ的检测，具体是一种重组猪干扰素ɑ双抗体夹心法免疫胶体金检测试纸条及其制备方法，供实验室和市场上对重组猪干扰素ɑ产品的鉴定和验证用。

背景技术

猪干扰素在畜牧业生产上的应用已受到高度关注。最早在国内应用于兽医临床的是猪白细胞干扰素，由于这种干扰素存在工艺成本高等问题。而基因工程技术的发展为猪干扰素大量生产提供了新的平台。我室采用基因工程技术获得了一种重组猪干扰素ɑ（重组猪α干扰素的制备方法，专利号2008100201804），临床试用结果表明其可有效治疗猪病毒性腹泻等疾病。但目前市场上尚无重组猪干扰素ɑ产品的检测试剂盒，阻碍了其广泛应用，因此有必要研制重组猪干扰素ɑ相应检测试剂盒，确立检测方法，供实验室和市场上对重组猪干扰素ɑ产品的鉴定和验证用。

胶体金免疫层析技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。它是继传统三大免疫标记技术之后又一较为成熟的、得到广泛应用的免疫标记技术。当待测样品加入到样品膜上后，由于微孔滤膜的毛细管作用，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，检测一般只要5～10 min 就会出结果,相比其它方法（如ELISA 需1～2 h）大大的缩短了检测时间。其测试结果以肉眼可见的显色条带来判断，不需要特别仪器设备，只需要试纸条或渗滤试剂盒，样品只要做非常简单的处理或不需要做前处理。且具有成本较低、操作简单、试剂稳定不受温度等外界因素影响、方便快捷、特异敏感、稳定性强、结果判断直观等优点，因而特别适合于现场快速检查，具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景，代表了诊断试剂简单快速、便于普及的发展方向。本发明制备了一种重组猪干扰素ɑ双抗体夹心法免疫胶体金检测试纸条。

发明内容

本发明目的就是为提供一种重组猪干扰素ɑ双抗体夹心法免疫胶体金检测试纸条及其制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种重组猪干扰素ɑ双抗体夹心法免疫胶体金检测试纸条及其制备方法，包括以下步骤：

（1）纯化抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体的制备：小鼠腹腔内注射0.5 ml液体石蜡，第7 d后每只小鼠腹腔注射1×10⁷/ml抗重组猪干扰素ɑ杂交瘤细胞悬液0.5 ml，7~10 d后观察小鼠腹部膨胀程度收集腹水，经离心去沉淀后以辛酸-饱和硫酸铵粗纯，再以DEAE阴离子交换层析进一步纯化抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体， -80℃保存；

（2）胶体金的制备：采用柠檬酸三钠还原法制备40 nm胶体金，取0.01％ HAuCl₄ 水溶液100 ml，加热煮沸，迅速加入1％柠檬酸三钠水溶液1ml，继续煮沸约5 min，制成粒径40 nm 金颗粒，此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸三钠加入后很快变成灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成酒红色，冷却至室温后4℃避光保存；

（3）胶体金标记抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体：用0.1 mol/L K₂CO₃将胶体金溶液调到pH8.2，然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100 ml溶液加入4.5 mg纯化的抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体，将蛋白缓慢滴加到胶体金溶液中，再滴加入到终浓度为0.05％的PEG 20000或l％的BSA封闭，标记结束后2500 r/min离心18~22 min，去除大的聚合物，再将上清以12000 r/min离心28~32 min，弃去上清，以含0.05％PEG的0.01 mol/L PBS重悬沉淀，离心，重复操作两次，最后以原体积1/10（含0.05％PEG）0.01 mol/L PBS重悬沉淀，3~5℃保存，然后将标记胶体金溶液加样于玻璃纤维素膜上，在温度20~25℃干燥2~4 h，制成胶体金垫，干燥备用；

（4）胶体金标记抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体的纯化：先1800r/min、4℃低速离心18~22min，弃去凝聚的沉淀，然后14000r/min、4℃高速离心1~1.2h，吸出上清，沉淀物用0.0l mol/L PBS溶液重悬，将沉淀重悬为原体积的1/10，再经1500r/min离心18~22min，取上清加至AKTA^TM explorer蛋白纯化仪葡聚糖凝胶层析柱纯化，将纯化的胶体金标记结合物过滤除菌、分装，4℃保存；

（5）抗重组猪干扰素ɑ多克隆抗体的包被：用0.0l mol/L pH7.4 PBS将抗重组猪干扰素ɑ多克隆抗体稀释为l mg/ml，然后用喷膜仪将抗原在硝酸纤维素膜上按1μl/cm进行划线包被，同时在硝酸纤维素膜上包被羊抗鼠多克隆抗体，用于产品的质控，包被完成后将硝酸纤维素膜在干燥间干燥6-8h，备用；

（6）试纸条的组装：在干燥间内准备好吸水滤纸、样品垫、PVC底板，在PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜下缘粘贴胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成4 mm宽的试纸条，再将试纸条密封于铝箔袋中，完成产品的组装。

本发明的优点是：

  一种重组猪干扰素ɑ双抗体夹心法免疫胶体金检测试纸条及其制备方法，为兽药管理部门提供一套实用有效的检测试剂产品。

附图说明

图1 制备并纯化的抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体SDS-PAGE检测结果

泳道1：蛋白分子标准;

泳道2 ：辛酸-饱和硫酸铵粗纯抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体结果；

泳道3 ：DEAE阴离子交换层析进一步纯化抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体结果；

图2 重组猪干扰素ɑ双抗体夹心法免疫胶体金检测试纸条结构示意图。

具体实施方式

实施例1：

（1）纯化抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体的制备：小鼠腹腔内注射0.5 ml液体石蜡，第7 d后每只小鼠腹腔注射1×107/ml抗重组猪干扰素ɑ杂交瘤细胞悬液0.5 ml，7～10 d后观察小鼠腹部膨胀程度收集腹水，经离心去沉淀后以辛酸-饱和硫酸铵粗纯，再以DEAE阴离子交换层析进一步纯化抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体，经SDS-PAGE电泳检测其纯度可达90%以上（所图1所示），-80℃保存；

（2）胶体金的制备：采用柠檬酸三钠还原法制备40 nm胶体金，具体操作方法如下：取0.01％ HAuCl₄ 水溶液100 ml，加热煮沸，迅速加入1％柠檬酸三钠水溶液1ml，继续煮沸约5 min，制成粒径40 nm 金颗粒，此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸三钠加入后很快变成灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成酒红色，冷却至室温后4℃避光保存。

（3）胶体金标记抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体：用0.1 mol/L K₂CO₃将胶体金溶液调到pH8.2。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100 ml溶液加入4.5 mg纯化的抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体，将蛋白缓慢滴加到胶体金溶液中，再滴加入到终浓度为0.05％的PEG 20000或l％的BSA封闭，标记结束后2500 r/min离心20 min，去除大的聚合物，再将上清以12,000 r/min离心30 min，弃上清，以含0.05％PEG的0.01 mol/L PBS重悬沉淀，离心，重复操作两次，最后以原体积1/10（含0.05％PEG）0.01 mol/L PBS重悬沉淀，4℃保存。然后将标记胶体金溶液加样于玻璃纤维素膜上，在温度20℃～25℃干燥2～4 h，制成胶体金垫，干燥备用。

（4）胶体金标记抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体的纯化：先1800r/min4℃低速离心20min，弃去凝聚的沉淀，然后14000r/min 4℃高速离心1h。仔细吸出上清，沉淀物用0.0l mol/L PBS溶液重悬，将沉淀重悬为原体积的1/10，再经1500r/min离心20min，取上清加至AKTA^TM explorer蛋白纯化仪葡聚糖凝胶层析柱纯化，最终纯度达95%以上。将纯化的胶体金标记结合物过滤除菌、分装，4℃保存。

（5）抗重组猪干扰素ɑ多克隆抗体的包被：用0.0l mol/L pH7.4 PBS将抗重组猪干扰素ɑ多克隆抗体稀释为l mg/ml，然后用喷膜仪将抗原在硝酸纤维素膜上按1μl/cm进行划线包被，同时在硝酸纤维素膜上包被羊抗鼠多克隆抗体，用于产品的质控，包被完成后将硝酸纤维素膜在干燥间干燥6～8h，备用。

（6）试纸条的组装：在干燥间内准备好吸水滤纸、样品垫、PVC底板，在PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜下缘粘贴胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成4 mm宽的试纸条。再将试纸条密封于铝箔袋中，完成产品的组装（所图2所示）。

 (7) 利用上述试剂条检测重组猪干扰素ɑ样品：

将试纸条水平放置，准确滴加2滴（约100μl）样本溶液在试纸条的样品垫。10分钟内读取结果。

结果判断：

阳性：控制线出现红色条带，测试线出现红色条带，则为样品含有重组猪干扰素ɑ蛋白；     阴性：控制线出现红色条带，测试线不出现红色条带，则为样品不含有重组猪干扰素ɑ蛋白。     失效：控制线不出现红色条带，或控制线、测试线均不出现红色条带，为试纸条失效。

Claims (1)

1.一种重组猪干扰素ɑ双抗体夹心法免疫胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）纯化抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体的制备：小鼠腹腔内注射0.5 ml液体石蜡，第7 d后每只小鼠腹腔注射1×10⁷个细胞/ml抗重组猪干扰素ɑ杂交瘤细胞悬液0.5 ml，7~10 d后观察小鼠腹部膨胀程度收集腹水，经离心去沉淀后以辛酸-饱和硫酸铵粗纯，再以DEAE阴离子交换层析进一步纯化抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体，-80℃保存；

（2）胶体金的制备：取0.01％ HAuCl₄ 水溶液100 ml，加热煮沸，迅速加入1％柠檬酸三钠水溶液1ml，继续煮沸约5 min，制成粒径40 nm 金颗粒，此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸三钠加入后很快变成灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成酒红色，冷却至室温后4℃避光保存；

（3）胶体金标记抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体：用0.1 mol/L K₂CO₃将胶体金溶液调到pH8.2，然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100 ml溶液加入4.5 mg纯化的抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体，将蛋白缓慢滴加到胶体金溶液中，再滴加入到终浓度为0.05％的PEG 20000或l％的BSA封闭，标记结束后2500 r/min离心18~22 min，去除大的聚合物，再将上清以12000 r/min离心28~32 min，弃去上清，以含0.05％PEG的0.01 mol/L PBS重悬沉淀，离心，重复操作两次，最后以原体积1/10的含0.05％PEG的0.01 mol/L PBS重悬沉淀，3~5℃下保存，然后将标记胶体金溶液加样于玻璃纤维素膜上，在温度20~25℃干燥2~4 h，制成胶体金垫，干燥备用；

（4）胶体金标记抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体的纯化：先1800r/min、4℃低速离心18~22min，弃去凝聚的沉淀，然后14000r/min 、4℃高速离心1~1.2h，吸出上清，沉淀物用0.0l mol/L PBS溶液重悬，将沉淀重悬为原体积的1/10，再经1500r/min离心18~22min，取上清加至AKTA^TM explorer蛋白纯化仪葡聚糖凝胶层析柱纯化，将纯化的胶体金标记结合物过滤除菌、分装，4℃保存；

（5）抗重组猪干扰素ɑ多克隆抗体的包被：用0.0l mol/L pH7.4 PBS将抗重组猪干扰素ɑ多克隆抗体稀释为l mg/ml，然后用喷膜仪将该抗体在硝酸纤维素膜上按1μl/cm进行划线包被，同时在硝酸纤维素膜上包被羊抗鼠多克隆抗体，用于产品的质控，包被完成后将硝酸纤维素膜在干燥间干燥6~8h，备用；

（6）试纸条的组装：在干燥间内准备好吸水滤纸、样品垫、PVC底板，在PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜下缘粘贴胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成4 mm宽的试纸条，再将试纸条密封于铝箔袋中，完成产品的组装。