CN102659937B - 一种重组蛋白及其单克隆抗体的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种重组蛋白，该重组包含人心脏型脂肪酸结合蛋白两个优势抗原表位，并采用大肠杆菌偏爱密码子将该重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，化学合成该核苷酸序列并构建重组表达载体，从而提高该重组蛋白在大肠杆菌中的表达量。本发明还涉及该重组蛋白单克隆抗体的制备，经过免疫、细胞融合及多轮筛选后得到杂交瘤细胞株，纯化单克隆抗体并分别标记辣根过氧化物酶(HRP)，ELISA正交实验确定最佳单抗配对组合，可用于心肌梗死早期诊断。

Description

一种重组蛋白及其单克隆抗体的制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体的说，本发明涉及一种新的重组蛋白，编码该重组蛋白的核苷酸序列，以及含有上述核苷酸序列的质粒载体，转化有上述质粒载体的菌株，还涉及使用上述的重组蛋白制备心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，并应用于急性心肌梗死(AMI)早期诊断。

背景技术

急性心肌梗死是指急性、持续性缺血、缺氧(冠状动脉功能不全)所引起的心肌坏死，是一种严重影响人类健康的心血管疾病。近年来，该疾病的发病率逐年上升，患病人群年轻化趋势愈演愈烈，但治疗效果却不甚理想，其中的一个关键原因是无法实现急性心肌梗死的早期快速诊断以争取治疗时间。从而导致患者病情恶化甚至死亡。因此，能够在心肌梗死的早期做出正确的诊断显得尤为重要。

研究表明，人心脏型脂肪酸结合蛋白(fabp3)是目前早期诊断AMI最具有特异性和敏感性的生化指标。该蛋白等电点为5.1，分子量为15KD左右，它可将脂肪酸从细胞质膜向发生酯化和氧化的部位运输，从而进入线粒体的能量代谢体系之中，是脂肪酸在此氧化分解并最终生成三磷酸腺苷(ATP)，为心肌收缩提供能量。正常人的血液中不含有心脏型脂肪酸结合蛋白，但在胸痛后0.5-3小时后浓度开始上升，在4-8小时内达到最高值，在12-24小时内恢复到正常水平；而且心脏型脂肪酸结合蛋白专一于心肌的损伤，具有高度特异性，基于心脏型脂肪酸结合蛋白的以上特点使得其成为理想的AMI早期诊断指标。因此，特异性检测识别人心脏型脂肪酸结合蛋白显得尤为重要。

目前，以免疫学为基础的血清学检测，由于其操作简便，结果易于判定，已成为主流方向。该方法主要是通过制备得到的人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体实现对人心脏型脂肪酸结合蛋白的特异性检测。常规的人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体制备所使用的免疫原是基因工程技术表达的完整蛋白，但由于碱基密码子的缘故，该蛋白在大肠杆菌中表达困难，表达量极低，导致后续的纯化工作难以开展，严重阻碍其单克隆抗体的制备。另外，由于抗原表位氨基酸序列同源性的缘故，使用心脏型脂肪酸结合蛋白全长序列作为免疫原制备得到的单克隆抗体特异性差，可能识别其它蛋白，从而导致检测结果失真。

发明内容

设计目的：避免背景技术中的不足之处，通过设计一种重组蛋白并制备其单克隆抗体，从而实现心脏型脂肪酸结合蛋白的特异性检测识别，既增强了检测灵敏度，又不会导致检测结果失真。

设计方案：为了实现上述设计目的。本申请：(1)以心脏型脂肪酸结合蛋白为靶抗原，分析并选择该抗原两个特异性优势抗原表位，序列比较结果显示所选择的两个抗原表位与其它蛋白序列无明显同源性。(2)为了促进所选择优势抗原表位对BALB／c小鼠免疫系统的刺激，增强免疫效果，故分别将所选择的两个优势抗原表位序列重复后通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接，形成重组蛋白氨基酸序列。(3)采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，以利于重组蛋白在大肠杆菌中的表达以提高表达量。(4)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入表达载体PET-28a(+)，构建重组蛋白表达载体。(5)重组蛋白表达载体转化大肠杆菌ER2566感受态细胞，筛选得到重组蛋白表达菌株。(6)重组蛋白表达菌株大规模培养后，超声破菌并低温离心后，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱亲和层析，洗脱得到纯化重组蛋白。(7)纯化后的重组蛋白多次免疫BALB／c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2／0骨髓瘤细胞融合，经过多轮筛选并最终得到杂交瘤细胞株。(8)将杂交瘤细胞株分别制备BALB／c小鼠腹水，使用辛酸-硫酸铵法及Protein G分两步纯化单克隆抗体，并分别标记辣根过氧化物酶(HRP)。(9)ELISA正交实验筛选显示7C3单抗包被与5F6-HRP配对检测心肌梗死为最佳组合。

技术方案1：一种重组蛋白质，该重组蛋白质具有如序列表SEQID No：1所示的氨基酸序列。

技术方案2：一种重组蛋白质，该重组蛋白质包含如序列表SEQID No：2和SEQID No：3所示的氨基酸序列。

技术方案3：一种核苷酸序列，该核苷酸序列如序列表SEQID No：4所示，可编码权利要求1-2所述的重组蛋白质。

技术方案4：一种质粒载体，该质粒载体含有权利要求3所述的核苷酸序列。

技术方案5：一种采用权利要求4所述质粒载体转化的菌株。

本申请与背景技术相比，一是通过分子生物学技术，实现了心脏型脂肪酸结合蛋白两个优势抗原表位的重复及串联表达，增强了目的抗原表位对小鼠免疫系统的刺激，排除了无关序列可能带来的干扰；二是作为免疫原的重组蛋白仅含有人心脏型脂肪酸结合蛋白特有的优势抗原表位，保证了最终得到的单克隆抗体仅特异性识别人心脏型脂肪酸结合蛋白，并筛选得到了最优单抗配对组合，提高了检测的灵敏度；三是采用大肠杆菌偏爱密码子优化重组蛋白对应的核苷酸序列，从而大大提高了重组蛋白在大肠杆菌中的表达水

具体实施方式

以下实施例虽然对本发明的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单文字描述，而不是对本发明设计思路的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入到本发明的保护范围内。

实施例1：心脏型脂肪酸结合蛋白优势抗原表位选择

以人心脏型脂肪酸结合蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAssi st2.0分析其抗原表位序列的亲水性及抗原性，选择A优势抗原表位(SEQ ID No：2)和B优势抗原表位(SEQ ID No：3)。同时，序列比较结果表明所选择的A、B两个优势抗原表位序列特异性高，与其它蛋白序列无明显同源性。

实施例2：心脏型脂肪酸结合蛋白优势抗原表位的串联

为增强所选择抗原表位对小鼠免疫系统的刺激以利于后续实验的进行，将心脏型脂肪酸结合蛋白A、B两个优势抗原表位序列分别重复后再通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接，得到重组蛋白氨基酸序列，其具体序列如序列表SEQID No：1所示。

实施例3：优化编码重组蛋白的核苷酸序列

为了提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，在重组蛋白氨基酸序列不变的前提下，根据大肠杆菌偏爱密码子将编码重组蛋白的氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列，具体序列如序列表SEQ ID No：4所示，并在其上下游分别添加酶切位点BamHI和EcoRI对应的核苷酸序列后，由杭州贤至生物科技有限公司合成。合成后的目的基因克隆于pMD19-T载体(宝生物工程大连有限公司)中。

实施例4：构建重组蛋白表达载体

用限制性内切酶BamHI和EcoRI(宝生物工程大连有限公司)于37℃分别双酶切含目的基因的pMD19-T载体和PET-28a(+)载体(德国Novagen公司)12小时，酶切产物分别行1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和PET-28a(+)载体(本发明所使用的胶回收试剂盒均来自宁波中鼎生物技术有限公司)。使用T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收的目的基因和PET-28a(+)载体按一定的比例于4℃连接12小时后，连接产物转化DH5α感受态细胞(杭州贤至生物科技有限公司)，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg／mL)的LB平板，于37℃恒温培养12小时之后，于平板上挑取单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg／mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒(本发明所使用的质粒纯化试剂盒均来自于宁波中鼎生物技术有限公司)提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体。

实施例5：构建重组蛋白C表达菌株

将构建好的重组表达载体转化E.coli ER2566感受态细胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg／mL)的LB平板，于37℃过夜培养。第二日，挑取平板上单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg／mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养8小时后，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(终浓度为1.0mmol／L)诱导表达4个小时后制备蛋白电泳样品。13.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明重组蛋白成功表达，得到重组蛋白表达菌株。

实施例6：纯化重组蛋白C

接种重组蛋白表达菌株至LB液体培养基，加卡那青霉素至终浓度为50μg／mL，37℃恒温摇床培养8小时后，用含50μg／mL卡那青霉素的LB液体培养基将该菌按1：100比例稀释后，分装至细菌培养瓶中，置37℃恒温摇床培养至OD600＝0.8，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度为1.0mmol／L，继续培养诱导4小时。离心收集菌体后，低温超声破菌，低温离心后取上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，经洗涤、洗脱最终得到纯化重组蛋白。

实施例7：杂交瘤细胞株的获得

取5-7周龄雌性BALB／c小鼠，基础免疫每只小鼠皮下多点注射福氏完全佐剂乳化的50μg重组蛋白。15天后进行加强免疫，方法为取相同量的重组蛋白用福氏不完全佐剂乳化后，皮下多点注射。30天后，取15μg重组蛋白尾静脉加强注射，并于尾静脉加强注射后72小时后，眼眶取血，并处死小鼠，取其脾脏制备细胞悬液，细胞计数，按1／5于脾细胞的数量取生长状态良好的sp2／0小鼠骨髓瘤细胞，混和离心后，加入聚乙二醇(PEG-4000)使二者融合。另外，再加入等体积的饲养细胞，混匀后分置于96孔细胞板(200μL／孔)，于5％二氧化碳培养箱培养。5天后，半保留换液，10天后采用间接酶联免疫吸附法检测96孔细胞培养板中的杂交瘤细胞培养上清。具体方法如下：

重组蛋白经包被液稀释后(终浓度为1μg／mL)，以100μL／孔加入酶标板(深圳金灿华实业有限公司)，4℃包被12小时后用洗涤液洗涤五次并拍干；加入封闭液，150μL／孔，37℃封闭2小时，弃孔内液体，拍干；加待检细胞培养上清及对照血清，100μL／孔，37℃孵育1小时后，洗涤液洗涤五次并拍干；加HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG，100μL／孔，37℃孵育30分钟后，洗涤液洗涤五次并拍干；每孔加显色液A和显色液B各50μL，37℃避光显色10分钟后，加终止液终止反应，50μL／孔，酶标仪450nm波长空白孔校零后读取OD值。以免疫小鼠的血清作为阳性对照，相关溶液配方如下：

包被液：Na₂CO₃1.5g，NaHCO₃2.9g，加双蒸水定容至1000mL(pH9.6)。

封闭液：Na₂HPO₄.12H₂O2.68g，NaH₂PO4.2H₂O0.39g，NaCl8.5g，20g牛血清白蛋白，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。

洗涤液：Na₂HPO₄.12H₂O2.68g，NaH₂PO₄.2H₂O0.39g，NaCl8.5g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。

显色液A：200mg TMB溶于100mL无水乙醇，加双蒸水定容至1000mL。

显色液B：柠檬酸2.1g，Na₂HPO₄.12H₂O71g，加双蒸水定容至1000mL。

使用时：1mL显色液A+1mL显色液B+0.4μL30％H₂O₂

终止液：2M H₂SO₄，21.7mL浓H₂SO₄加双蒸水定容至1000mL。

对于检测阳性的杂交瘤细胞克隆，再使用有限稀释法进行亚克隆。经过三次亚克隆，共筛选得到7株杂交瘤细胞株(1F4、2B6、3D7、5F6、7C3、7E5、8A1)。

实施例8：单克隆抗体的大量制备及纯化

取8-9周龄的健康BALB／c小鼠，腹腔注射降植烷，每只200μL，7天后腹腔注射杂交瘤细胞(约1×10⁶个／只)，15天后，小鼠腹部鼓起，收集腹水，3000rpm离心10分钟，收集上清，按1：4的比例加入60mmol／L pH4.0醋酸缓冲液，用100mmol／L NaOH调pH4.5。以每毫升腹水上清加入25μL正辛酸的比例，在磁力搅拌条件下缓慢加入正辛酸，在室温条件下继续搅拌30min后，4℃5000rpm离心30分钟，弃沉淀。将上清液在4℃条件下预冷，以1mL体积上清液加入0.227g硫酸铵的比例，缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，室温条件下继续搅拌30min之后，5000rpm离心15分钟，沉淀溶于1／10体积的10mmol／L PBS(pH7.4)缓冲液中，透析至无硫酸铵。将透析后的单抗用Protein G吸附纯化，洗涤后收集洗脱峰，即得到纯化后的单抗。

实施例9：HRP标记单抗的制备

取10mg HRP加0.1mol／L醋酸钠2mL，充分混匀，约5分钟后加0.08mol／L NaIO₄溶液1mL，混匀后，室温反应20分钟。加0.4mol／L乙二醇溶液0.5mL，室温静置30分钟后，加21％NaCl溶液0.3mL，再加1.2mL冰冷的无水乙醇沉淀醛化酶，离心去上清，沉淀酶再用6mL80％冰冷的乙醇溶液浸泡洗涤一次后，离心倾去除乙醇)。沉淀用0.05mol／L碳酸盐缓冲液(pH9.6)2mL溶解，然后单抗20mg，搅拌均匀，于4℃过夜。次日加10mg NaBH₄混匀，反应3小时后加等量饱和硫酸铵沉淀酶结合物，4℃搅拌反应30分钟，4℃5000rpm离心分钟，弃上清，沉淀用0.01mol／L PBS3mL溶解，置透析袋中用0.01mol／L PBS于4℃过夜透析，加3mL无菌甘油，混匀后于-20℃保存。

以上述方法分别对1F4、2B6、3D7、5F6、7C3、7E5、8A1单抗进行HRP标记。

实施例10：配对单抗的筛选

七种单克隆抗体(1F4、2B6、3D7、5F6、7C3、7E5、8A1)分别经包被液稀释后(终浓度为1μg／mL)，以100μL／孔加入酶标板(深圳金灿华实业有限公司)，4℃包被12小时后用洗涤液洗涤五次并拍干；加入封闭液，150μL／孔，37℃封闭2小时，弃孔内液体，拍干；加心肌梗死患者临床血清标本及正常人血清标本，100μL／孔，37℃孵育1小时后，洗涤液洗涤五次并拍干；加入100μL实施例9制备得到的HRP标记单抗，100μL／孔，37℃孵育30分钟后，洗涤液洗涤五次并拍干；每孔加显色液A和显色液B各50μL，37℃避光显色10分钟后，加终止液终止反应，50μL／孔，酶标仪450nm波长空白孔校零后读取OD值。相关溶液配方如下：

包被液：Na₂CO₃1.5g，NaHCO₃2.9g，加双蒸水定容至1000mL(pH9.6)。

封闭液：Na₂HPO₄.12H₂O2.68g，NaH₂PO4.2H₂O0.39g，NaCl8.5g，20g牛血清白蛋白，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。

洗涤液：Na₂HPO₄.12H₂O2.68g，NaH₂PO₄.2H₂O0.39g，NaCl8.5g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。

显色液A：200mg TMB溶于100mL无水乙醇，加双蒸水定容至1000mL。

显色液B：柠檬酸2.1g，Na₂HPO₄.12H₂O71g，加双蒸水定容至1000mL。

使用时：1mL显色液A+1mL显色液B+0.4μL30％H₂O₂

终止液：2M H₂SO₄，21.7mL浓H₂SO₄加双蒸水定容至1000mL。

以上述方法正交检测各包被单抗与酶标单抗配对，求P／N值(阳性标本检测均值与阴性标本检测均值比值)值，见表1。

表1各单抗与酶标单抗P／N值统计

通过上表可知，7C3单抗包被与5F6-HRP配对检测心肌梗死为最佳组合。

SEQID NO1：重组蛋白的氨基酸序列；

SEQID NO2：心脏型脂肪酸结合蛋白A优势抗原表位的氨基酸序列；

SEQID NO3：心脏型脂肪酸结合蛋白B优势抗原表位的氨基酸序列；

SEQID NO4：编码重组蛋白的核苷酸序列。

序列表

<110> 杭州贤至生物科技有限公司

<120> 一种重组蛋白及其单克隆抗体的制备

<160> 4

<210> 1

<211> 138

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含人心脏型脂肪酸结合蛋白优势抗原表位

 

<400> 1

Thr Arg Gln Val Ala Ser Met Thr Lys Pro Thr Thr Ile Ile Glu Lys

              5                10             15

Asn Gly Asp Ile Leu Th Leu Lys Thr His Ser Thr Phe Lys Asn Thr

            20               25                30

Arg Gln Val Ala Ser Met Thr Lys Pro Thr Thr Ile Ile Glu Lys Asn

35               40              45

Gly Asp Ile Leu Thr Leu Lys Thr His Ser Thr Phe Lys Asn Gly Gly

50               55              60

Gly Gly Val His Leu Gln Lys Trp Asp Gly Gln Glu Thr Thr Leu Val

65               70                75               80

Arg Glu Leu Ile Asp Gly Lys Leu Ile Leu Thr Leu Thr His Gly Thr

              85              90                95

Ala Val Cys Thr Arg Thr Val His Leu Gln Lys Trp Asp Gly Gln Glu

100               105              110     

Thr Thr Leu Val Arg Glu Leu Ile Asp Gly Lys Leu Ile Leu Thr Leu

115               120                125

Thr His Gly Thr Ala Val Cys Thr Arg Thr

   130               135

 

<210> 2

<211> 31

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 2

Thr Arg Gln Val Ala Ser Met Thr Lys Pro Thr Thr Ile Ile Glu Lys

              5                10             15        

Asn Gly Asp Ile Leu Thr Leu Lys Thr His Ser Thr Phe Lys Asn

           20               25              30

 

<210> 3

<211> 36

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 3

Val His Leu Gln Lys Trp Asp Gly Gln Glu Thr Thr Leu Val Arg Glu

              5                10               15

Leu Ile Asp Gly Lys Leu Ile Leu Thr Leu Thr His Gly Thr Ala Val

          20               25               30

Cys Thr Arg Thr

       35

 

<210> 4

<211> 414

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据大肠杆菌的偏爱密码子设计

<400> 4

ACCCGCCAGG TGGCCAGCAT GACCAAACCG ACCACCATTA TTGAAAAAAA 50

CGGCGATATT CTGACCCTGA AAACCCATAG CACCTTTAAA AACACCCGCC 100

AGGTGGCCAG CATGACCAAA CCGACCACCA TTATTGAAAA AAACGGCGAT 150

ATTCTGACCC TGAAAACCCA TAGCACCTTT AAAAACGGCG GCGGCGGCGT 200

GCATCTGCAG AAATGGGATG GCCAGGAAAC CACCCTGGTG CGCGAACTGA 250

TTGATGGCAA ACTGATTCTG ACCCTGACCC ATGGCACCGC CGTGTGCACC 300

CGCACCGTGC ATCTGCAGAA ATGGGATGGC CAGGAAACCA CCCTGGTGCG 350

CGAACTGATT GATGGCAAAC TGATTCTGAC CCTGACCCAT GGCACCGCCG 400

TGTGCACCCG CACC                                                                                                 414

Claims (5)

1.一种重组蛋白质，其特征在于该重组蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQ ID No: 1所示的氨基酸序列。

2.一种核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列如序列表SEQ ID No: 4所示，可编码权利要求1所述的重组蛋白质。

3.一种质粒载体，其特征在于该质粒载体含有权利要求2所述的核苷酸序列。

4.一种菌株，其特征在于该菌株包含采用权利要求3所述的质粒载体。

5.权利要求1所述的重组蛋白质在用于心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体制备的应用，其特征在于包括：

（a）合成权利要求2所述的核苷酸序列，并连接质粒载体，构建重组蛋白表达载体；

（b）将步骤（a）中的重组蛋白表达载体转化大肠杆菌，筛选得到重组蛋白表达菌株；

（c）大规模培养重组蛋白表达菌株后，经纯化获取重组蛋白；

（d）重组蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经过多轮筛选得到杂交瘤细胞株；

（e）纯化单抗并分别标记辣根过氧化物酶(HRP)，ELISA正交实验确定最佳单抗配对组合。