CN111925432A - 一种心肌肌钙蛋白i重组抗原及其单克隆抗体的制备方法 - Google Patents
一种心肌肌钙蛋白i重组抗原及其单克隆抗体的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种心肌肌钙蛋白I重组抗原，该心肌肌钙蛋白I重组抗原与天然cTnI抗原决定簇以及构象相似，具有很强的免疫原性和免疫反应性，与全长或者分段重组cTnI以及其他序列拼接方式相比，具有更高的分泌表达量以及生物活性。本发明该公开了一种心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的制备方法，利用心肌肌钙蛋白I重组抗原结合免疫学方法和杂交瘤技术来制备细胞株，以快速、大量获得特异性单克隆抗体，得到的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体稳定且分泌量较高，生物活性、特异性和灵敏度较高，可用于检测临床血清。
Description
技术领域
本发明涉及一种心肌肌钙蛋白I重组抗原，尤其是涉及一种心肌肌钙蛋白I重组抗原及其单克隆抗体的制备方法。
背景技术
近年来，心血管疾病患病率、发病率以及死亡率持续增长，已成为危害人类生命健康的首要因素。据统计，全球每年超千万人死于心血管疾病，占全球死亡总数的30%以上；相比欧美国家，我国心血管病患者呈年轻化，患病人数估计2.9亿，我国新生儿先天性心脏病的发病率约为0.6%~1%，农村地区死亡率较城镇地区更高，且出现增长，占我国居民死亡构成的40%以上。其中急性冠状动脉综合征（ACS）发病急、死亡率高，尤以急性心肌梗死（AMI）为重。
鉴于ACS的特点，以及AMI早期诊断和即时治疗对于降低风险的重要性，对早期准确诊断出AMI提出了更高的要求。20世纪80年代以前，一直将特征性心电图衍变以及心肌酶谱活性等血清生物标志物的动态变化作为急性心肌梗死（AMI）的诊断标准，但约50%的患者缺乏心电图的特异改变，且心肌酶谱敏感性以及特异性都较差，整体诊断符合率较低。后期发现的肌钙蛋白在敏感性以及特异性上均优于传统肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）等生物标志物。其中，心肌肌钙蛋白I（cTnI）仅存在于心肌，是心肌细胞的特异性标志物，其异常会影响心脏功能，造成心肌损伤，在损伤发生后4~8小时血清中即可检测到其水平升高，且持续升高时间长达6~10天，因此cTnI能够用于心肌坏死的早期诊断、心肌损伤的判断等，被公认为是快速诊断AMI和急性冠脉综合症（ACS）等的主要生化指标。
心肌肌钙蛋白I是一个具有210的氨基酸，分子量大约23kDa，在血液中稳定性差，80%以上以肌钙蛋白C（cTnC）-肌钙蛋白I的复合体形式存在，少量游离的cTnI。正常人血液中cTnI含量一般不超过0.1ug/L，当心肌细胞遭到破坏损伤时，细胞中的 cTnI迅速进入到血液中。在临床诊断中，低于0.1ng/ml即可排除心肌损伤风险，0.1~0.5ng/ml心肌损伤低风险，0.5~25ng/ml即存在高损伤风险，高于25ng/ml即存在严重的心肌损伤，在发病初期快速、灵敏且准确检测血清中cTnI的变化趋势对于AMI的诊断、以及损伤程度的预判有着重要的临床意义。临床上用于检测cTnI的方法主要有免疫组化、化学发光、免疫层析等，不同方法有着各自的优缺点，但是都需要针对cTnI的特异性单克隆抗体。
现在市面上的cTnI检测试剂多依赖于进口，价格相对较高，在一些不确定因素的干扰下直接影响到临床的应用。导致众多患者初期并没有接受很好的检测与治疗，病情贻误，从而造成居高不下的病死率。但是现有cTnI抗体的检测灵敏度依然较低，多数检测灵敏度>0.5ng/ml，且存在检测假阳以及非自身抗体结合的漏检的情况，无法很好的应用在cTnI的临床检测中，为了更好的适应后续的临床应用，必须制备高性能的cTnI抗体。
现有cTnI抗体性能不足的主要原因是免疫原的限制，现多以cTnI特异性序列的原核表达蛋白作为免疫原制备抗体，已成为主流的方法，但cTnI特异区间存在着很多的翻译后修饰，原核表达蛋白与天然蛋白的构象之间存在着较大的差异；哺乳动物细胞真核表达的成本极高、操作繁琐、表达量极低、很难满足免疫的需求；天然cTnI蛋白主要存在于心脏中，极难获得试验材料，无法提取人cTnI蛋白作为免疫原；同时其他动物中同源性较高的是灵长类动物，以及一些保护性动物，绝大多数的实验室没有满足试验的实验条件，且成本过高。优质免疫原的来源限制了优质cTnI抗体的制备。因此，快速获得大量具有cTnI蛋白天然构象的免疫原势在必行。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种心肌肌钙蛋白I重组抗原，该心肌肌钙蛋白I重组抗原与天然cTnI抗原决定簇以及构象相似，具有很强的免疫原性和免疫反应性，与全长或者分段重组cTnI以及其他序列拼接方式相比，具有更高的分泌表达量以及生物活性。
本发明的另一发明目的是提供一种心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的制备方法，得到的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体稳定且分泌量较高，生物活性、特异性和灵敏度较高，可用于检测临床血清。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种心肌肌钙蛋白I重组抗原，通过以下步骤制得：
（1）通过Uniprot数据库获取人cTnI蛋白序列，对比骨骼肌肌钙蛋白序列的差异以及小鼠肌钙蛋白的同源性后，选择人cTnI蛋白序列第23~50位氨基酸残基为第一段特异性cTnI氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，共28aar；选择人cTnI蛋白序列第83~130位氨基酸残基为第二段cTnI特异性氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，共48aar。本发明根据物种间的保守区间、同其他蛋白的交叉性、有无嗜异性、存不存在假阳性、存不存在氨基酸识别位点封闭、是否具有较高的心肌特异性等因素综合考虑，选择选择人cTnI蛋白序列第23~50位氨基酸残基为第一段特异性cTnI氨基酸序列，选择人cTnI蛋白序列第83~130位氨基酸残基为第二段cTnI特异性氨基酸序列。
（2）选择如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列作为柔性链，选择如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列作为可溶性链，按SEQ ID NO：2- SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4- SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：1的顺序将上述氨基酸序列进行拼接，得到拼接氨基酸序列。利用Lasergene 分析软件进行氨基酸序列免疫原性、亲疏水性、柔韧性、表面可及性以及其他三级结构分析，最终确定以SEQ ID NO：2- SEQ ID NO：3- SEQ ID NO：4- SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：1的顺序进行拼接；为获得更好模拟天然构象的蛋白，特意加入柔性链；为保证亲水性/可溶性，额外增加可溶性链；本发明的拼接顺序非常关键，只有利用本发明中限定的拼接顺序进行拼接，最终获得的人心肌肌钙蛋白I重组抗原才能较好的模拟其天然构象。
（3）在该拼接氨基酸序列对应的DNA序列N端端添加纯化标签HIS6以及酶切位点NedⅠ，C端添加酶切位点XhoⅠ，并根据表达载体密码子偏好性进行优化、合成目的DNA序列，该目的DNA序列命名为X231，其序列如SEQ ID NO：5所示；最后构建表达载体进行表达，选择HIS6镍柱对目的蛋白进行纯化，得人心肌肌钙蛋白I重组抗原X231。
作为优选，所述表达载体选择pET30a载体，质粒扩增菌株选择大肠杆菌DH5a，表达菌株选择大肠杆菌菌株DE3，于培养上清液中分泌表达，表达条件选择：LB培养基，25℃恒温震荡培养，β-半乳糖苷酶（IPTG）诱导。
一种心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
（a）选择5~6周龄的免疫缺陷小鼠，以人心肌肌钙蛋白I重组抗原X231对小鼠进行免疫；采集静脉血测试抗血清效价，效果达到10^6后进行细胞融合。免疫为本领域的常规手段，可根据所使用的佐剂适用的最佳免疫剂量以及免疫间隔分别进行不同方式的免疫注射，包括皮下、肌肉、腹腔等。
（b）采用小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行PEG法融合；融合细胞使用甲基纤维素承载的半固体方式培养后，保留高效价且稳定的杂交瘤细胞株。采用杂交瘤技术来制备细胞株为本领域的常规手段。
（c）将杂交瘤细胞株接种培养基收集培养上清，将亲和纯化后经鉴定所分泌抗体具有目的序列的表位特异性且活性佳的杂交瘤细胞株，接种至经石蜡油免疫抑制的小鼠腹腔，诱生腹水第8天可开始腹水采集，腹水以蛋白A亲和纯化的方式分离得到特异性单克隆抗体。
作为优选，步骤（b）中，PEG法融具体步骤为：融合前7天复苏SP2/0细胞，融合前4天观察到SP2/0状态良好，即将进入对数期，此时进行细胞融合前的冲击免疫，直接进行脾脏免疫，50ug/脾脏无佐剂X231重组抗原，次日小鼠状态良好，进行一次尾静脉冲击免疫，50ug/只无佐剂X231重组抗原；冲击免疫结束后48小时进行脾脏细胞提取融合。
作为优选，脾脏细胞提取融合的具体步骤为：利用研磨的方法获得分离的脾脏细胞，分别对脾脏细胞以及SP2/0细胞进行计数，以SP2/0：脾脏细胞为1：8的比例混合，使用50%的PGE 4000进行诱导融合；融合细胞使用甲基纤维素承载的半固体方式培养。
作为优选，半固体方式培养采用的半固体培养基为HAT选择性培养基，含质量体积比1.25%甲基纤维素、1X的IMDM基础培养基、体积比25%的胎牛血清、青霉素-链霉素抗生素、100uM 次黄嘌呤、0.4uM氨基蝶呤、16uM 胸腺嘧啶核苷；融合细胞与培养基充分混合后，分置于3.5cm平皿，置于二氧化碳含量5%、恒温37℃的无菌培养箱中培养，设置阴性对照为SP2/0孔，次日观察SP2/0生长状态，SP2/0停止生长状态正常；培养4天左右，显微镜下可见明显细胞集落；培养7天有肉眼可见的细胞集落，可进行细胞集落的斑点挑选，所挑选的斑点即为单克隆，以96孔-48孔-24孔-6孔-T25细胞培养瓶的顺序进行单克隆杂交瘤细胞株的传代培养，传代过程中均进行ELISA检测，保留高效价且稳定的杂交瘤细胞株。
因此，本发明具有如下有益效果：
（1）提供了一种心肌肌钙蛋白I重组抗原，可替代天然人cTnI作为免疫原制备抗体，且具有天然cTnI同等的构象和免疫原性，同时较全长以及cTnI分段重组蛋白有更高的亲水性和免疫原性，具有更高的分泌表达量以及生物活性，有利于抗原生物活性的保持以及高效抗血清的产生；
（3）提供了一种心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的制备方法，得到的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体稳定且分泌量较高，生物活性、特异性和灵敏度较高，可用于检测临床血清。
附图说明
图1是实施例1中XJ21-8特异性单克隆抗体的间接ELISA活性。
图2 是实施例1中得到的XJ21-8特异性单克隆抗体同雅培诊断临床检测标本对照符合性。
图3是实施例2中XJ24-6特异性单克隆抗体的间接ELISA活性。
图4 是实施例2中得到的XJ24-6特异性单克隆抗体同雅培诊断临床检测标本对照符合性。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的描述。
实施例
一、心肌肌钙蛋白I重组抗原X231制备
（1）通过Uniprot数据库获取人cTnI蛋白序列，对比骨骼肌肌钙蛋白序列的差异以及小鼠肌钙蛋白的同源性后，选择人cTnI蛋白序列第23~50位氨基酸残基为第一段特异性cTnI氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，共28aar；选择人cTnI蛋白序列第83~130位氨基酸残基为第二段cTnI特异性氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，共48aar。
（2）选择如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列作为柔性链，选择如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列作为可溶性链，按SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：1的顺序将上述氨基酸序列进行拼接，得到拼接氨基酸序列。
（3）在该拼接氨基酸序列对应的DNA序列N端端添加纯化标签HIS6以及酶切位点NedⅠ，C端添加酶切位点XhoⅠ，并根据表达载体密码子偏好性进行优化、合成目的DNA序列，该目的DNA命名为X231，其序列如SEQ ID NO：5所示；最后构建表达载体进行表达，选择HIS6镍柱对目的蛋白进行纯化，得人心肌肌钙蛋白I重组抗原X231；表达载体选择pET系列的pET30a载体，质粒扩增菌株选择大肠杆菌DH5a，表达菌株选择大肠杆菌菌株DE3，于培养上清液中分泌表达，表达条件选择：LB培养基，25℃恒温震荡培养，β-半乳糖苷酶（IPTG）诱导；选择HIS6 SMART BEADS 6FF填料对目的蛋白进行纯化。ELISA检测显示具抗人cTnI抗体的检测活性。
二、 针对X231的单克隆抗体制备
（a）选择5周龄的免疫缺陷小鼠（BALB/C小鼠，北京维通利华），以人心肌肌钙蛋白I重组抗原X231对小鼠进行免疫；采用皮下多点免疫，初次免疫使用弗氏完全佐剂，免疫剂量100ug/只，单次共免疫同批次小鼠8只；两周后使用不完全佐剂加强免疫，免疫剂量100ug/只，免疫加强后7天采尾静脉血备用；第二次加强免疫后间隔两周再进行一次加强，加强后7天采尾静脉血。测试第一次、第二次免疫加强后所采尾静脉血的抗血清效价，效价已达10^5，继续进行第3次免疫加强，免疫加强7天后采尾静脉血测试抗血清效价，平均效价达0.2*10^6左右且出现平台期，进行融合。
（b）采用小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行PEG法融合；融合前7天复苏SP2/0细胞，融合前4天观察到SP2/0状态良好，即将进入对数期，此时进行细胞融合前的冲击免疫，直接进行脾脏免疫，50ug/脾脏无佐剂X231重组抗原，次日小鼠状态良好，进行一次尾静脉冲击免疫，50ug/只无佐剂X231重组抗原；冲击免疫结束后48小时进行脾脏细胞提取融合；利用研磨的方法获得分离的脾脏细胞，分别对脾脏细胞以及SP2/0细胞进行计数，以SP2/0：脾脏细胞为1：8的比例混合，使用50%的PGE 4000进行诱导融合；融合细胞使用甲基纤维素承载的半固体方式培养；半固体培养基为HAT（H为次黄嘌呤、A为氨基喋呤、T为胸苷）选择性培养基，含质量体积比1.25%甲基纤维素、1X的IMDM基础培养基、体积比25%的胎牛血清、青霉素-链霉素抗生素、100uM 次黄嘌呤、0.4uM氨基蝶呤、16uM 胸腺嘧啶核苷；融合细胞与培养基充分混合后，分置于3.5cm平皿，置于二氧化碳含量5%、恒温37℃的无菌培养箱中培养，设置阴性对照为SP2/0孔，次日观察SP2/0生长状态，SP2/0停止生长状态正常；培养4天左右，显微镜下可见明显细胞集落；培养7天有肉眼可见的细胞集落，可进行细胞集落的斑点挑选，所挑选的斑点即为单克隆，以96孔-48孔-24孔-6孔-T25细胞培养瓶的顺序进行单克隆杂交瘤细胞株的传代培养，传代过程中均进行ELISA检测，保留高效价且稳定的杂交瘤细胞株（X231作为免疫原获得稳定细胞株60株）。
（c）将杂交瘤细胞株接种培养基收集培养上清，亲和纯化后经鉴定所分泌抗体具有目的序列的表位特异性且活性佳共24株，抗体对应的24株细胞接种至经石蜡油免疫抑制的小鼠腹腔，诱生腹水第8天可开始腹水采集。腹水以蛋白A亲和纯化的方式分离得到特异性单克隆抗体，命名为XJ21-8。
经ELISA检测，XJ21-8抗体活性如图1所示；XJ21-8特异性单克隆抗体同雅培诊断临床检测标本对照符合性如图2所示。
对比例1
一、心肌肌钙蛋白I重组抗原X214制备
（1）通过Uniprot数据库获取人cTnI蛋白序列，对比骨骼肌肌钙蛋白序列的差异以及小鼠肌钙蛋白的同源性后，选择人cTnI蛋白序列第23~50位氨基酸残基为第一段特异性cTnI氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，共28aar；选择人cTnI蛋白序列第83~130位氨基酸残基为第二段cTnI特异性氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，共48aar。
（2）选择如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列作为柔性链，选择如SEQID NO：7所示的氨基酸序列作为可溶性链，按SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：1-SEQID NO：6-SEQ ID NO：7的顺序将上述氨基酸序列进行拼接，得到拼接氨基酸序列。
（3）在该拼接氨基酸序列对应的DNA序列N端端添加纯化标签HIS6以及酶切位点NedⅠ，C端添加酶切位点XhoⅠ，并根据表达载体密码子偏好性进行优化、合成目的DNA序列，该目的DNA序列命名为X214，其序列如SEQ ID NO：8所示；最后构建表达载体进行表达，选择HIS6镍柱对目的蛋白进行纯化，得人心肌肌钙蛋白I重组抗原X214；表达载体选择pET系列的pET30a载体，质粒扩增菌株选择大肠杆菌DH5a，表达菌株选择大肠杆菌菌株DE3，于大肠杆菌包涵体表达，表达条件选择：LB培养基，37℃恒温震荡培养，β-半乳糖苷酶（IPTG）诱导；8M尿素裂解包涵体，使用超声破碎将目的蛋白X214释放，选择HIS6 SMART BEADS 6FF填料对目的蛋白进行纯化，纯化蛋白含有8M尿素，经磷酸缓冲液有限次透析复性，出现复性蛋白沉淀，目的蛋白总量损失20%。ELISA检测显示具抗人cTnI抗体的检测活性。
二、针对X214的单克隆抗体制备
以人心肌肌钙蛋白I重组抗原X214对小鼠进行免疫，其余步骤与实施例1相同。
X214作为免疫原获得稳定细胞株32株，杂交瘤细胞株接种培养基收集培养上清，亲和纯化后经鉴定所分泌抗体具有目的序列的表位特异性且活性佳的抗体共18株，抗体对应的18株细胞接种至经石蜡油免疫抑制的小鼠腹腔，诱生腹水第8天可开始腹水采集。腹水以蛋白A亲和纯化的方式分离得到特异性单克隆抗体，命名为XJ24-6。
经ELISA检测，XJ24-6抗体活性如图3所示；XJ24-6特异性单克隆抗体同雅培诊断临床检测标本对照符合性如图4所示。
对比例2
一、心肌肌钙蛋白I重组抗原X312制备
（1）通过Uniprot数据库获取人cTnI蛋白序列，对比骨骼肌肌钙蛋白序列的差异以及小鼠肌钙蛋白的同源性后，选择人cTnI蛋白序列第23~50位氨基酸残基为第一段特异性cTnI氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，共28aar；选择人cTnI蛋白序列第83~130位氨基酸残基为第二段cTnI特异性氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，共48aar。
（2）选择如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列作为柔性链，选择如SEQID NO：9所示的氨基酸序列作为可溶性链，按SEQ ID NO：9-SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：1-SEQID NO：3-SEQ ID NO：2的顺序将上述氨基酸序列进行拼接，得到拼接氨基酸序列。
（3）在该拼接氨基酸序列对应的DNA序列N端端添加纯化标签HIS6以及酶切位点NedⅠ，C端添加酶切位点XhoⅠ，并根据表达载体密码子偏好性进行优化、合成目的DNA序列，该目的DNA序列命名为X312，其序列如SEQ ID NO：10所示；最后构建表达载体进行表达，选择HIS6镍柱对目的蛋白进行纯化，得人心肌肌钙蛋白I重组抗原X312；表达载体选择pET系列的pET30a载体，质粒扩增菌株选择大肠杆菌DH5a，表达菌株选择大肠杆菌菌株DE3，于大肠杆菌包涵体表达，表达条件选择：LB培养基，25℃恒温震荡培养，β-半乳糖苷酶（IPTG）诱导，选择HIS6 SMART BEADS 6FF填料对目的蛋白进行纯化，ELISA检测显示具抗人cTnI抗体的检测活性。ELISA检测显示具抗人cTnI抗体的检测活性。
二、针对X312的单克隆抗体制备
以人心肌肌钙蛋白I重组抗原X312免疫5周龄BALB/C小鼠（北京维通利华）。采用皮下多点免疫，初次免疫使用弗氏完全佐剂，免疫剂量100ug/只，单次共免疫同批次小鼠8只；两周后使用不完全佐剂加强免疫，免疫剂量100ug/只，免疫加强后7天采尾静脉血备用；第二次加强免疫后间隔两周再进行一次加强，加强后7天采尾静脉血。
测试第一次、第二次免疫加强后所采尾静脉血的抗血清效价，测试免疫滴度极低，达不到细胞融合的条件。
X312免疫滴度低，说明X312并不适合作为免疫原进行小鼠免疫。
对比例3
一、心肌肌钙蛋白I重组抗原X 142制备
（1）通过Uniprot数据库获取人cTnI蛋白序列，对比骨骼肌肌钙蛋白序列的差异以及小鼠肌钙蛋白的同源性后，选择人cTnI蛋白序列第23~50位氨基酸残基为第一段特异性cTnI氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，共28aar；选择人cTnI蛋白序列第83~130位氨基酸残基为第二段cTnI特异性氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，共48aar。
（2）选择如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列作为柔性链，选择如SEQID NO：11所示的氨基酸序列作为可溶性链，按SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：11-SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：2的顺序将上述氨基酸序列进行拼接，得到拼接氨基酸序列。
（3）在该拼接氨基酸序列对应的DNA序列N端端添加纯化标签HIS6以及酶切位点NedⅠ，C端添加酶切位点XhoⅠ，并根据表达载体密码子偏好性进行优化、合成目的DNA序列，该目的DNA序列命名为X 142，其序列如SEQ ID NO：12所示；最后构建表达载体进行表达，表达载体选择pET系列的pET30a载体，质粒扩增菌株选择大肠杆菌DH5a，表达菌株选择大肠杆菌菌株DE3。
经检测大肠杆菌包涵体以及培养上清液中均无表达，说明本对比例中的拼接方式不合适作为重组蛋白的构建方式。
通过比较实施例、对比例1、对比例2、对比例3可以知晓，目的DNA序列X231（实施例）与X214（对比例1）可获得原核表达的纯化蛋白，且可以作为免疫原制备特异性抗体；X312（对比例2）可获得原核表达的纯化蛋白，但是不符合免疫原的要求；X142（对比例3）在大肠杆菌中无表达；另外，X231表达与培养上清中，X214作为包涵体表达，X214复性时蛋白活性损失20%，同时影响真实构象；X231免疫可获得稳定株的数量较X214多出接近1/2。
从图1-图4可以知晓，抗体活性、符合性方面XJ21-8同XJ24-6相近，但是X231的免疫滴度略高于X214的免疫滴度。
综上所述，实施例中的X231为最优拼接方式，且能够产生足以商用的特异性抗人cTnI单克隆抗体，能够很好的检测临床样本，满足市场应用条件。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州启泰生物技术有限公司
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<130> 2020
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<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> 人cTnI蛋白序列第23~50位氨基酸残基
<400> 1
Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys
1 5 10 15
Ser Lys Ile Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gln Leu Lys
20 25
<210> 2
<211> 48
<212> PRT
<213> 人cTnI蛋白序列第83~130位氨基酸残基
<400> 2
Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe Ala Glu Leu Gln Asp Leu Cys Arg
1 5 10 15
Gln Leu His Ala Arg Val Asp Lys Val Asp Glu Glu Arg Tyr Asp Ile
20 25 30
Glu Ala Lys Val Thr Lys Asn Ile Thr Glu Ile Ala Asp Leu Thr Gln
35 40 45
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Tyr Ala Pro Ala Asp Pro
1 5
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Asp Asp Ile Tyr Lys Ala Ala Val Glu Gln Leu Thr Glu Glu Gln
1 5 10 15
Lys Asn Glu Phe Lys Ala Ala Phe Asp Ile Phe Val Leu Gly Ala Glu
20 25 30
Asp Gly Cys Ile Ser Thr Lys Glu Leu Gly Lys Val Met Arg Met Leu
35 40 45
Gly Gln Asn Pro Thr Pro Glu Glu Leu Gln Glu Met Ile Asp Glu Val
50 55 60
Asp Glu Asp Gly Ser Gly Thr Val Asp Phe Asp Glu Phe Leu Val Met
65 70 75 80
Met Val Arg Cys Met Lys Asp Asp Ser Lys Gly Lys Ser Glu Glu Glu
85 90 95
Leu Ser Asp Leu Phe Arg Met Phe Asp Lys Asn Ala Asp Gly Tyr Ile
100 105 110
Asp Leu Asp Glu Leu Lys Ile
115
<210> 5
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列X231
<400> 5
catatgcatc atcatcatca ccatctggaa ctggccggtc tgggttttgc cgaactgcag 60
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gaagcaaaag ttaccaaaaa cattacggaa atcgctgatc tgacccaggg atctggcggt 180
agtatggatg acatctataa agcggccgtg gaacagctga ccgaagaaca gaaaaacgaa 240
ttcaaagcag ctttcgatat cttcgtcctg ggcgcggaag acggttgtat cagcaccaaa 300
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atgatggtgc gttgcatgaa agatgactca aaaggcaaat cggaagaaga actgagcgac 480
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tacgcaccac aagacccatc gtccaactac cgtgcttatg cgaccgaacc gcatgcgaaa 600
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
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<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
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Glu Phe Leu Glu Phe Met Lys Gly Val Glu
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<212> DNA
<213> 人工序列X214
<400> 8
catatgcatc atcaccatca ccacctggaa ctggccggtc tgggttttgc cgaactgcag 60
gatctgtgtc gtcaactgca cgcccgcgtg gataaagttg acgaagaacg ttacgatatc 120
gaagcaaaag ttaccaaaaa cattacggaa atcgctgatc tgacccaggg atctggcggt 180
agttcgtcca actaccgtgc ttatgcgacc gaaccgcatg cgaaaaagaa aagcaaaatt 240
agcgcttctc gtaaactgca gctgaaatac gcaccacaag acccaatgct gcaggctacg 300
ggtgaaacca ttacggaaga tgacatcgaa gaactgatga aagatggcga caaaaacaac 360
gatggtcgca ttgattacga tgaatttctg gaatttatga aaggcgtgga ataactcgag 420
<210> 9
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Met Asp Asp Ile Tyr Lys Ala Ala Val Glu Gln Leu Thr Glu Glu Gln
1 5 10 15
Lys Asn Glu Phe Lys Ala Ala Phe Asp Ile Phe Val Leu Gly Ala Glu
20 25 30
Asp Gly Cys Ile Ser Thr Lys Glu Leu Gly Lys Val Met Arg Met Leu
35 40 45
Gly Gln Asn Pro Thr Pro Glu Glu Leu Gln Glu Met Ile Asp Glu Val
50 55 60
Asp Glu Asp Gly Ser Gly Thr Val Asp Phe Asp Glu Phe Leu Val Met
65 70 75 80
Met Val Arg Cys Met Lys Asp Asp Ser Lys Gly Lys Ser Glu Glu Glu
85 90 95
Leu Ser Asp Leu Phe Arg Met Phe Asp Lys Asn Ala Asp Gly Tyr Ile
100 105 110
Asp Leu Asp Glu Leu Lys Ile
115
<210> 10
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列312
<400> 10
catatgcatc atcatcatca ccatatggat gacatctata aagcggccgt ggaacagctg 60
accgaagaac agaaaaacga attcaaagca gctttcgata tcttcgtcct gggcgcggaa 120
gacggttgta tcagcaccaa agaactgggc aaagtgatgc gcatgctggg tcagaatccg 180
acgccggaag aactgcaaga aatgatcgat gaagttgatg aagacggctc gggtaccgtc 240
gattttgacg aattcctggt catgatggtg cgttgcatga aagatgactc aaaaggcaaa 300
tcggaagaag aactgagcga cctgtttcgc atgttcgata aaaatgcaga cggctacatt 360
gatctggacg aactgaaaat cggatctggc ggtagttcgt ccaactaccg tgcttatgcg 420
accgaaccgc atgcgaaaaa gaaaagcaaa attagcgctt ctcgtaaact gcagctgaaa 480
tacgcaccac aagacccact ggaactggcc ggtctgggtt ttgccgaact gcaggatctg 540
tgtcgtcaac tgcacgcccg cgtggataaa gttgacgaag aacgttacga tatcgaagca 600
aaagttacca aaaacattac ggaaatcgct gatctgaccc agtaactcga g 651
<210> 11
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Met Leu Gln Ala Thr Gly Glu Thr Ile Thr Glu Asp Asp Ile Glu Glu
1 5 10 15
Leu Met Lys Asp Gly Asp Lys Asn Asn Asp Gly Arg Ile Asp Tyr Asp
20 25 30
Glu Phe Leu Glu Phe Met Lys Gly Val Glu
35 40
<210> 12
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列X142
<400> 12
catatgcatc atcatcatca ccattcgtcc aactaccgtg cttatgcgac cgaaccgcat 60
gcgaaaaaga aaagcaaaat tagcgcttct cgtaaactgc agctgaaagg atctggcggt 120
agtatgctgc aggctacggg tgaaaccatt acggaagatg acatcgaaga actgatgaaa 180
gatggcgaca aaaacaacga tggtcgcatt gattacgatg aatttctgga atttatgaaa 240
ggcgtggaat acgcaccaca agacccactg gaactggccg gtctgggttt tgccgaactg 300
caggatctgt gtcgtcaact gcacgcccgc gtggataaag ttgacgaaga acgttacgat 360
atcgaagcaa aagttaccaa aaacattacg gaaatcgctg atctgaccca gtaactcgag 420
Claims (6)
1.一种心肌肌钙蛋白I重组抗原，其特征在于，通过以下步骤制得：
（1）通过Uniprot数据库获取人cTnI蛋白序列，对比骨骼肌肌钙蛋白序列的差异以及小鼠肌钙蛋白的同源性后，选择人cTnI蛋白序列第23~50位氨基酸残基为第一段特异性cTnI氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，共28aar；选择人cTnI蛋白序列第83~130位氨基酸残基为第二段cTnI特异性氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，共48aar；
（2）选择如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列作为柔性链，选择如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列作为可溶性链，按SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4- SEQ ID NO: 3-SEQ ID NO: 1的顺序将上述氨基酸序列进行拼接，得到拼接氨基酸序列；
（3）在该拼接氨基酸序列对应的DNA序列N端端添加纯化标签HIS6以及酶切位点NedⅠ，C端添加酶切位点XhoⅠ，并根据表达载体密码子偏好性进行优化、合成目的DNA序列，该目的DNA序列命名为X231，其序列如SEQ ID NO：5所示；最后构建表达载体进行表达，选择HIS6镍柱对目的蛋白进行纯化，得人心肌肌钙蛋白I重组抗原X231。
2.根据权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I重组抗原，其特征在于，所述表达载体选择pET30a载体，质粒扩增菌株选择大肠杆菌DH5a，表达菌株选择大肠杆菌菌株DE3，于培养上清液中分泌表达，表达条件选择：LB培养基，25℃恒温震荡培养，β-半乳糖苷酶（IPTG）诱导。
3.一种心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（a）选择5~6周龄的免疫缺陷小鼠，以人心肌肌钙蛋白I重组抗原X231对小鼠进行免疫；采集静脉血测试抗血清效价，效果达到10^6后进行细胞融合；
（b）采用小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行PEG法融合；融合细胞使用甲基纤维素承载的半固体方式培养后，保留高效价且稳定的杂交瘤细胞株；
（c）将杂交瘤细胞株接种培养基收集培养上清，将亲和纯化后经鉴定所分泌抗体具有目的序列的表位特异性且活性佳的杂交瘤细胞株，接种至经石蜡油免疫抑制的小鼠腹腔，诱生腹水第8天可开始腹水采集，腹水以蛋白A亲和纯化的方式分离得到特异性单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的一种心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤（b）中，PEG法融具体步骤为：融合前7天复苏SP2/0细胞，融合前4天观察到SP2/0状态良好，即将进入对数期，此时进行细胞融合前的冲击免疫，直接进行脾脏免疫，50ug/脾脏无佐剂X231重组抗原，次日小鼠状态良好，进行一次尾静脉冲击免疫，50ug/只无佐剂X231重组抗原；冲击免疫结束后48小时进行脾脏细胞提取融合。
5. 根据权利要求4所述的一种心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的制备方法，其特征在于，脾脏细胞提取融合的具体步骤为：利用研磨的方法获得分离的脾脏细胞，分别对脾脏细胞以及SP2/0细胞进行计数，以SP2/0：脾脏细胞为1：8的比例混合，使用50%的PGE 4000进行诱导融合；融合细胞使用甲基纤维素承载的半固体方式培养。
6. 根据权利要求2所述的一种心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的制备方法，其特征在于，半固体方式培养采用的半固体培养基为HAT选择性培养基，含质量体积比1.25%甲基纤维素、1X的IMDM基础培养基、体积比25%的胎牛血清、青霉素-链霉素抗生素、100uM 次黄嘌呤、0.4uM氨基蝶呤、16uM 胸腺嘧啶核苷；融合细胞与培养基充分混合后，分置于3.5cm平皿，置于二氧化碳含量5%、恒温37℃的无菌培养箱中培养，设置阴性对照为SP2/0孔，次日观察SP2/0生长状态，SP2/0停止生长状态正常；培养4天左右，显微镜下可见明显细胞集落；培养7天有肉眼可见的细胞集落，可进行细胞集落的斑点挑选，所挑选的斑点即为单克隆，以96孔-48孔-24孔-6孔-T25细胞培养瓶的顺序进行单克隆杂交瘤细胞株的传代培养，传代过程中均进行ELISA检测，保留高效价且稳定的杂交瘤细胞株。
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