CN114164181B - 一种产生牛妊娠相关糖蛋白pag8单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

一种产生牛妊娠相关糖蛋白pag8单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种产生牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于生物化工技术领域。本发明分泌牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.45017和CGMCC No.45021。本发明糖蛋白PAG8单克隆抗体细胞株可用于食品安全检测中牛妊娠相关糖蛋白PAG8的分析检测。本发明提供两种杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对PAG‑8具有较好的特异性和检测灵敏度(ELISA方法灵敏度为2ng/mL)。且基于此对抗体制备的胶体金试纸条，可以快速、准确地检测到PAG‑8蛋白，灵敏度可达30ng/mL。

Description

一种产生牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体的杂交瘤细胞株 及其应用
技术领域
本发明属于生物技术工程技术领域，尤其是指一种产生牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
对于奶牛养殖场来说，早期、准确的妊娠诊断是提高牛只繁殖效率，增加牧场经济效益的重要措施。传统的牛怀孕早期诊断的主要方法有观察法、直肠触诊法、超声波检测法、孕酮检测法等。其中观察法是观察牛的饮食等行为的变化，如饮食量增加、发情周期停止等。此方法依赖于观察人员的经验，且准确度难以保证，因此具有局限性。直肠触诊法和超声波检测法都要求特定人员的操作技术成熟和临床经验丰富，操作不当易对牛产生伤害，且超声检测需要专业设备。对于大规模的养殖场来说，这些方法耗时耗力，要求高，不具备广泛应用的条件。而孕酮检测法虽然简便快速，但是灵敏度和特异性达不到要求。
妊娠相关糖蛋白(PAGs)是反刍动物滋养细胞产生的一大类分泌型蛋白。在牛胚胎附植过程中，滋养层双核细胞与子宫上皮细胞融合，释放PAGs，通过母胎连接组织进入母体外周循环系统。目前已知的PAGs有22种，包括PAG1、PAG2、PAG4、PAG6、PAG8、PAG9等。有研究表明，奶牛体内的PAGs浓度与妊娠阶段是相关的，部分PAGs在妊娠早期含量升高明显，妊娠28天左右即可检测出，且含量在整个妊娠期间呈现总体上升趋势。这为牛怀孕早期诊断提供了有效方案。美国IDEXX公司研发生产的牛早孕检测产品是采用ELISA试剂盒的方法检测牛血清或EDTA血浆中的PAGs，准确率达95％以上，是当前应用最广的牛妊娠早期诊断产品。
基于免疫学原理的检测方法，是以抗体作为原料，检测待检样品中的目的抗原，因此制备出灵敏度高，特异性强的单克隆抗体是关键。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种产生牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其胶体金试纸条应用。
一种产生牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体的杂交瘤细胞株DIF，所述杂交瘤细胞株于2021年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45017。
一种产生牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体的杂交瘤细胞株DMM，所述杂交瘤细胞株于2021年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45021。
进一步的，所述杂交瘤细胞株DIF、DMM的制备方法，具体为：
S1：重组质粒构建：
根据GenBank公开的PAG-8基因序列(其中抗原PAG-8的基因序列见SEQ ID No.1)，以及氨基酸序列(SEQ ID No.2)，由无锡天霖生物科技有限公司负责优化和合成完整基因pCMV3-PAG8，之后转化至Trans10感受态细胞中，涂布平板培养。
S2：蛋白表达与纯化
从S1的平板中挑选单菌落接种至液体培养基培养，大提质粒转染HEK293细胞。细胞培养4-6天后，10000-12000xg离心20-30min收集上清液，采用Ni-NTA纯化系统纯化出目的蛋白PAG-8，PBS透析去除咪唑，NanoDrop One仪器测定浓度，-2至-30℃保存。
S3：小鼠免疫
取纯化后透析完成的PAG-8，与等量的佐剂混合乳化。首次免疫使用弗氏完全佐剂，皮下多点注射BALB/c小鼠。后续免疫使用弗氏不完全佐剂，第二次免疫与首次免疫间隔28天，第三次免疫与第二次免疫间隔21天。第三次免疫之后测定小鼠血清效价，达到融合水平后，与最后一次免疫间隔18-21天准备腹腔冲刺免疫。
S4：细胞融合与筛选
取冲刺免疫后的小鼠脾脏，与小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT选择培养基培养。采用间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测阳性细胞孔，通过有限稀释法对阳性值最高、细胞团数最少的阳性细胞孔进行四次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株DIF和DMM。
一种牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体DIF，所述牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体由权利要求1中所述杂交瘤细胞株DIF分泌得到。
一种牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体DMM，所述牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体由权利要求2中所述杂交瘤细胞株DMM分泌得到。
进一步的，牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体DIF、DMM的制备方法为：
将BALB/c小鼠腹腔分别注射杂交瘤细胞DIF和DMM，制备腹水，腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，得到纯化后的抗体DIF和DMM。抗体在PBS中透析，测定浓度后，置于-20至30℃保存。
本发明还提供了所述杂交瘤细胞株在制备牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体DIF中的应用。
本发明还提供了所述杂交瘤细胞株在制备牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体DMM中的应用。
一种组合物，所述组合物中含有所述牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体DIF和所述的牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体DMM。
一种胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括所述的组合物。
本发明所述胶体金试纸条的制备方法如下：
(1)金纳米粒子的合成：采用柠檬酸还原法合成金纳米粒子，在烧瓶中加入氯金酸溶液，搅拌下加热至沸腾，向溶液中加入柠檬酸三钠溶液，期间溶液颜色由无色变为黑色再转变为透亮的酒红色。将溶液继续煮沸，随后将烧瓶置于室温冷却并保藏。
(2)金标抗体的制备：用碳酸钾溶液将步骤(1)中金纳米粒子的胶体金溶液的pH调至7.0，将单克隆抗体DMM逐滴滴加至溶液中，并在室温下搅拌反应，加入的BSA溶液封闭。将溶液离心，去除未偶联的胶体金和单克隆抗体。用含有3％-5％蔗糖，0.3％-0.5％BSA，0.3％-0.5％Tween 20的0.01MPBS洗涤金标抗体3次。最后用重悬液重悬。
(3)金标试纸条的制备：将单克隆抗体DIF(1-2mg/mL)和羊抗鼠IgG二抗(1-2mg/mL)用喷膜机分别喷至T线和C线处，37℃烘干2h并切条备用。
一种试剂盒，包括所述的胶体金试纸条。
本发明还提供了所述组合物、所述的胶体金试纸条或所述的试剂盒在检测PAG8重组蛋白中的应用。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明提供两种杂交瘤细胞株DIF和DMM分别分泌的单克隆抗体DIF、DMM，对PAG-8具有较好的特异性和检测灵敏度(ELISA方法灵敏度为2ng/mL)。且基于此对抗体制备的胶体金试纸条，可以快速、准确地检测到PAG-8蛋白，灵敏度可达30ng/mL。这为牛妊娠早期诊断提供了原料以及快速检测的方法，具有实际应用价值。此胶体金试纸条原理如下：
基于双抗体夹心法原理，将捕获抗体DIF固定在T线处，当样品PAG-8滴加至样品垫时，会首先与胶体金标记的检测抗体DMM结合。结合物继续迁移，到T线位置时，PAG-8的其他结合部位与T线上捕获抗体DIF结合，形成：金标检测抗体DMM-PAG-8-捕获抗体DIF的三明治结构复合物，于是T线变红色。多余的胶体金标记的DMM在C线上被羊抗鼠IgG抗体捕获，最终形成红色的T线和C线。T线的颜色强度与PAG-8浓度成正比。若样品不含PAG-8，胶体金标记的DMM只会在C线上与羊抗鼠IgG抗体结合，因此只能观察到一条红色的C线。
两株分泌抗PAG-8单克隆抗体的杂交瘤细胞株DIF和杂交瘤细胞株DMM，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株DIF和单克隆细胞株DMM，保藏日期2021年12月16日，保藏编号分别为45017、45021。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为PAG-8重组蛋白表达纯化后SDS-PAGE鉴定图；
图2为构建的胶体金试纸条示意图；
图3为胶体金试纸条检测PAG-8的结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明通过哺乳动物细胞HEK293体外重组表达PAG-8蛋白，免疫小鼠，通过细胞融合、HAT选择性培养基培养、亚克隆等步骤，最终得到了对PAG-8有较高灵敏度的配对单克隆抗体杂交瘤细胞株DIF和DMM。
实施例1PAG-8重组蛋白制备
1，重组质粒构建
根据GenBank公开的PAG-8基因序列(其中抗原PAG-8的基因序列见SEQ ID No.1)，以及氨基酸序列(SEQ ID No.2)，由无锡天霖生物科技有限公司负责优化和合成完整质粒pCMV3-PAG8。将质粒转化至Trans10感受态细胞中，涂布在含有卡那霉素的LB平板上培养。
SEQ ID No.1：
1 gcaagctcag aactcaatat tccctgagta cttgaaacca ggaaagaagc atgaagtggc
61 ttgtgcttct cgggctggtg gccctctcag agtgcatagt caaaatccct ctaacgaaga
121 tgaagaccat gcaagaagcc atcagggaaa aacaattgct ggaagatttc ttggatgaac
181 aacctcacag cctgtcccag cattctgatc ctgacaagaa attctcttct caccaactga
241 agaatttcca gaatgctgtc tactttggta cgatcaccat tggaacacct cctcaagagt
301 tccaggtcaa ctttgacacc ggctcatctg acttgtgggt gccctctgtc gactgccaaa
361 gtccctcctg ctctaaacat aagagattcg accctcagaa gtccaccacc ttccagcctt
421 tgaaccagaa aattgaactc gtctacggct ctgggagcat gaaaggggtt cttggctctg
481 acaccattca gatcgggaac cttgtcatcg tgaaccagat ttttggcttg agccagaatc
541 agtccagtgg cgtcctggaa caagtacctt atgatggcat cctgggcttg gcctacccca
601 gcctcgccat ccaggggacc accccagtct tcgacaacct gaagaatcga gaagtcattt
661 ctgagccagt ctttgccttc tacttgagct cccggccaga aaacatcagc acggtgatgt
721 ttggcggggt ggaccacacc taccacaagg gaaaactcca gtggatccca gtgacccaag
781 cccgcttctg gcaggtagcc atgagcagca tgaccatgaa cgggaatgtg gtcggttgtt
841 cccaaggatg tcaggccgtt gtggatactg ggacctcgtt gctggttggg ccaactcacc
901 tggtcactga catcctgaag ctcatcaacc ctaatcctat cctgaatgac gagcaaatgc
961 tttcatgtga tgccatcaat agcctgccta cgctcctcct caccatcaac ggcatcgtct
1021 accctgtgcc ccctgactac tacatccaga ggttttctga aaggatctgctttatcagct
1081 ttcaaggggg cacagagatc ttgaaaaatt tgggaacctc ggagacctggatcctgggtg
1141 atgtcttcct gaggctgtat tttt.
SEQ ID No.2：
1 mkwlvllglv alsecivkip ltkmktmqea irekqlledfldeqphslsq hsdpdkkfss
61 hqlknfqnav yfgtitigtp pqefqvnfdt gssdlwvpsv dcqspscskh krfdpqkstt
121 fqplnqkiel vygsgsmkgv lgsdtiqign lvivnqifgl sqnqssgvle qvpydgilgl
181 aypslaiqgt tpvfdnlknr evisepvfafylssrpenis tvmfggvdht yhkgklqwip
241 vtqarfwqva mssmtmngnv vgcsqgcqav vdtgtsllvg pthlvtdilk linpnpilnd
301 eqmlscdain slptllltin givypvppdy yiqrfseric fisfqggtei lknlgtsetw
361 ilgdvflrly fsvydrgnnr iglapaa.
2，蛋白表达与纯化
从LB的平板中挑选单菌落接种至含有卡那霉素的LB液体培养基培养16h，收集菌体，使用质粒提取试剂盒大提质粒，转染HEK293细胞。细胞在恒温摇床培养4天后，12000xg离心30min收集上清液，采用Ni-NTA纯化系统纯化出目的蛋白PAG-8(参照Ni-NTA纯化系统说明书进行)。取梯度洗脱的收集液进行SDS-PAGE验证，对有目的条带的洗脱液用0.01MPBS透析去除咪唑。用NanoDrop One仪器测定浓度，-20℃保存备用。
实施例2杂交瘤细胞株DI、DMM的制备
1，小鼠的免疫
选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取PAG-8蛋白与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫使用弗氏完全佐剂，后续免疫都用弗氏不完全佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血(小鼠断尾采血5μL+995μL抗体稀释液＝200倍稀释的抗血清)，使用ic-ELISA测定小鼠血清的效价，选择效价高的小鼠，在第四次免疫后21天腹腔注射免疫原冲刺免疫。
2，细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG方法进行细胞融合，具体步骤如下：
(1)处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，并挑选丢弃非细胞的组织成分。最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
(2)收集鼠源骨髓瘤SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1～4×107，保证融合前SP2/0细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
(3)融合过程7min。第1min，将1mL的PEG由慢到快滴加到离心管的细胞中，期间摇动离心管(后续滴加过程也是如此)；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mLRPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
3，细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复四次，获得细胞株DIF、DMM。
4，单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。0.01M PBS透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
对制备的单克隆抗体DIF和DMM，采用这两种抗体，建立双抗体夹心ELISA方法测定其对PAG-8的灵敏度，并验证其对PAG-2等蛋白的交叉反应，具体如表1所示。其中，双抗体夹心ELISA方法的原理是将捕获抗体DIF包被在板孔上，然后加入抗原PAG-8与其反应，洗涤后再加入HRP标记的检测抗体DMM，形成捕获抗体-抗原-酶标检测抗体复合物，加底物显色，加终止液后测定OD450，根据数值判断抗原含量。
表1单克隆抗体DIF和DMM灵敏度及特异性测定结果
实施例3：杂交瘤细胞株DIF和DMM的应用
将杂交瘤细胞株DIF和DMM应用于制备胶体金试纸条，检测PAG-8，其中，DIF作为捕获抗体喷涂于NC膜上，DMM标记胶体金后作为检测抗体，具体步骤如下：
金纳米粒子的合成：采用柠檬酸还原法合成30nm的金纳米粒子，在洗净的烧瓶中加入100mL 0.01％(w/v)的氯金酸溶液，在磁力搅拌下加热至完全沸腾，向溶液中快速加入5mL 1％(w/v)的柠檬酸三钠溶液，期间溶液颜色由无色变为黑色再迅速转变为透亮的酒红色。将溶液继续煮沸15min，随后，将烧瓶置于室温冷却，并保藏于4℃。
金标抗体的制备：用0.1M碳酸钾溶液将10mL胶体金溶液的pH调至7.0，将100μg单克隆抗体DMM逐滴滴加至溶液中，并在室温下搅拌反应1h。加入1mL 10％(w/v)的BSA溶液封闭2h。将溶液4℃、6000xg离心20min，去除未偶联的胶体金和单克隆抗体。用含有5％蔗糖，0.5％BSA，0.5％Tween 20的0.01M的PBS洗涤金标抗体3次。最后用1mL重悬液重悬。
金标试纸条的制备：试纸条的组建如图2所示，将单克隆抗体DIF(1mg/mL)和羊抗鼠IgG二抗(1mg/mL)用喷膜机分别喷至T线(检测线)和C线(控制线)处，37℃烘干2h并切条备用。
胶体金试纸条检测PAG-8：用胎牛血清将1mg/mLPAG-8依次稀释至1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、30ng/mL、10ng/mL。取100μL滴加至试纸条加样孔中，反应5min以上，观察试纸条显色。
结果分析：如图3所示，根据试纸条的显色情况，当PAG-8的浓度为30ng/mL时，试纸条T线开始有肉眼可见的显色，T线颜色随着PAG-8浓度升高而变深。显色结果表明建立的该胶体金试纸条可以检测到在胎牛血清基质里的PAG-8，vLOD为30ng/mL。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种产生牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1164
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 1
gcaagctcag aactcaatat tccctgagta cttgaaacca ggaaagaagc atgaagtggc 60
ttgtgcttct cgggctggtg gccctctcag agtgcatagt caaaatccct ctaacgaaga 120
tgaagaccat gcaagaagcc atcagggaaa aacaattgct ggaagatttc ttggatgaac 180
aacctcacag cctgtcccag cattctgatc ctgacaagaa attctcttct caccaactga 240
agaatttcca gaatgctgtc tactttggta cgatcaccat tggaacacct cctcaagagt 300
tccaggtcaa ctttgacacc ggctcatctg acttgtgggt gccctctgtc gactgccaaa 360
gtccctcctg ctctaaacat aagagattcg accctcagaa gtccaccacc ttccagcctt 420
tgaaccagaa aattgaactc gtctacggct ctgggagcat gaaaggggtt cttggctctg 480
acaccattca gatcgggaac cttgtcatcg tgaaccagat ttttggcttg agccagaatc 540
agtccagtgg cgtcctggaa caagtacctt atgatggcat cctgggcttg gcctacccca 600
gcctcgccat ccaggggacc accccagtct tcgacaacct gaagaatcga gaagtcattt 660
ctgagccagt ctttgccttc tacttgagct cccggccaga aaacatcagc acggtgatgt 720
ttggcggggt ggaccacacc taccacaagg gaaaactcca gtggatccca gtgacccaag 780
cccgcttctg gcaggtagcc atgagcagca tgaccatgaa cgggaatgtg gtcggttgtt 840
cccaaggatg tcaggccgtt gtggatactg ggacctcgtt gctggttggg ccaactcacc 900
tggtcactga catcctgaag ctcatcaacc ctaatcctat cctgaatgac gagcaaatgc 960
tttcatgtga tgccatcaat agcctgccta cgctcctcct caccatcaac ggcatcgtct 1020
accctgtgcc ccctgactac tacatccaga ggttttctga aaggatctgc tttatcagct 1080
ttcaaggggg cacagagatc ttgaaaaatt tgggaacctc ggagacctgg atcctgggtg 1140
atgtcttcct gaggctgtat tttt 1164
<210> 2
<211> 387
<212> PRT
<213> （人工合成）
<400> 2
Met Lys Trp Leu Val Leu Leu Gly Leu Val Ala Leu Ser Glu Cys Ile
1 5 10 15
Val Lys Ile Pro Leu Thr Lys Met Lys Thr Met Gln Glu Ala Ile Arg
20 25 30
Glu Lys Gln Leu Leu Glu Asp Phe Leu Asp Glu Gln Pro His Ser Leu
35 40 45
Ser Gln His Ser Asp Pro Asp Lys Lys Phe Ser Ser His Gln Leu Lys
50 55 60
Asn Phe Gln Asn Ala Val Tyr Phe Gly Thr Ile Thr Ile Gly Thr Pro
65 70 75 80
Pro Gln Glu Phe Gln Val Asn Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Leu Trp
85 90 95
Val Pro Ser Val Asp Cys Gln Ser Pro Ser Cys Ser Lys His Lys Arg
100 105 110
Phe Asp Pro Gln Lys Ser Thr Thr Phe Gln Pro Leu Asn Gln Lys Ile
115 120 125
Glu Leu Val Tyr Gly Ser Gly Ser Met Lys Gly Val Leu Gly Ser Asp
130 135 140
Thr Ile Gln Ile Gly Asn Leu Val Ile Val Asn Gln Ile Phe Gly Leu
145 150 155 160
Ser Gln Asn Gln Ser Ser Gly Val Leu Glu Gln Val Pro Tyr Asp Gly
165 170 175
Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Pro Ser Leu Ala Ile Gln Gly Thr Thr Pro
180 185 190
Val Phe Asp Asn Leu Lys Asn Arg Glu Val Ile Ser Glu Pro Val Phe
195 200 205
Ala Phe Tyr Leu Ser Ser Arg Pro Glu Asn Ile Ser Thr Val Met Phe
210 215 220
Gly Gly Val Asp His Thr Tyr His Lys Gly Lys Leu Gln Trp Ile Pro
225 230 235 240
Val Thr Gln Ala Arg Phe Trp Gln Val Ala Met Ser Ser Met Thr Met
245 250 255
Asn Gly Asn Val Val Gly Cys Ser Gln Gly Cys Gln Ala Val Val Asp
260 265 270
Thr Gly Thr Ser Leu Leu Val Gly Pro Thr His Leu Val Thr Asp Ile
275 280 285
Leu Lys Leu Ile Asn Pro Asn Pro Ile Leu Asn Asp Glu Gln Met Leu
290 295 300
Ser Cys Asp Ala Ile Asn Ser Leu Pro Thr Leu Leu Leu Thr Ile Asn
305 310 315 320
Gly Ile Val Tyr Pro Val Pro Pro Asp Tyr Tyr Ile Gln Arg Phe Ser
325 330 335
Glu Arg Ile Cys Phe Ile Ser Phe Gln Gly Gly Thr Glu Ile Leu Lys
340 345 350
Asn Leu Gly Thr Ser Glu Thr Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Leu Arg
355 360 365
Leu Tyr Phe Ser Val Tyr Asp Arg Gly Asn Asn Arg Ile Gly Leu Ala
370 375 380
Pro Ala Ala
385

Claims (10)

1.一种产生牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体的杂交瘤细胞株DIF，其特征在于，所述杂交瘤细胞株于2021年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45017。
2.一种产生牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体的杂交瘤细胞株DMM，其特征在于，所述杂交瘤细胞株于2021年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45021。
3.一种牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体DIF，其特征在于，所述牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体由权利要求1中所述杂交瘤细胞株DIF分泌得到。
4.一种牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体DMM，其特征在于，所述牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体由权利要求2中所述杂交瘤细胞株DMM分泌得到。
5.权利要求1中所述杂交瘤细胞株在制备牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体中DIF的应用。
6.权利要求2中所述杂交瘤细胞株在制备牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体DMM的应用。
7.一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求3所述牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体DIF和权利要求4所述的牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体DMM。
8.一种胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金试纸条包括权利要求7所述的组合物。
9.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求8所述的胶体金试纸条。
10.权利要求7所述组合物、权利要求8所述的胶体金试纸条或权利要求9所述的试剂盒在检测PAG8重组蛋白中的应用。
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