CN113960025A

CN113960025A - 一种奶牛早期妊娠的检测方法

Info

Publication number: CN113960025A
Application number: CN202111187814.7A
Authority: CN
Inventors: 王相国; 乔富强; 肖龙菲; 倪和民; 郭勇; 李志明; 杨宇泽
Original assignee: Beijing University of Agriculture
Current assignee: Beijing University of Agriculture
Priority date: 2021-10-12
Filing date: 2021-10-12
Publication date: 2022-01-21

Abstract

本申请属于生物诊断学技术领域，具体公开了一种奶牛早期妊娠的检测方法，其包括如下步骤：将PAG6抗体溶液点样至NC膜的点样孔中，于4℃‑37℃恒温固定30 min‑8 h；向点样孔中加入封闭液进行封闭，封闭后进行清洗；将待测样品加入到点样孔中进行第一孵育，4℃‑37℃孵育30 min‑8 h；向点样孔中加入二抗孵育后，清洗，加入显色液进行显色，滴加双蒸水终止反应，风干，观察结果。本申请提供的奶牛早期妊娠的检测方法至少具有以下有益效果之一：本申请提供的奶牛早期妊娠的检测方法，其操作简单，无需昂贵的设备，肉眼即可进行判断，降低了成本，而且检测效率高，适合于大型的养牛场对奶牛早期妊娠状况的诊断。

Description

一种奶牛早期妊娠的检测方法

技术领域

本申请属于生物诊断学技术领域，更具体地说，它涉及一种奶牛早期妊娠的检测方法。

背景技术

反刍动物胎儿胎盘的滋养层双核细胞在与母体子宫上皮细胞融合时，会释放包括PAG在内的物质到母畜血液中。利用蛋白质的抗体能够检测母体外周循环中PAG蛋白质的存在，这些蛋白质对胎盘组织来说具有特异性，所以检测母体血液里面的PAGs能够作为妊娠的指标。通过免疫学方法检测PAGs与B超结果符合率非常高，并且能够在配种后30天即可获得是否怀孕的结果。但是目前检测PAGs大多采用ELISA检测方法，需要特殊检测设备，这对于养牛场来说，成本较高，而且也要求操作人员的技术水平较高。

发明内容

为了脱离特殊检测设备的限制，本申请提供一种奶牛早期妊娠的肉眼可视化检测方法，该方法无需特殊检测设备，操作简单，肉眼即可判断而且所需检测时间较短，适合于大型养牛场快速诊断奶牛的妊娠状况。

本申请是通过以下方案实现的：

本申请提供一种快速判断奶牛早期妊娠的检测方法，其包括如下步骤：将PAG6抗体溶液点样至NC膜的点样孔中，于4℃-37℃恒温固定30 min-8 h；向点样孔中加入封闭液进行封闭，封闭后进行清洗；将待测样品加入到点样孔中进行第一孵育，4℃-37℃孵育30min-8 h；向点样孔中加入二抗孵育后，清洗，加入显色液进行显色，滴加双蒸水终止反应，风干，观察结果。

在本申请的一个具体实施方式中，所述PAG6抗体溶液为PAG6抗体水溶液。

在本申请的一个具体实施方式中，所述PAG6抗体溶液为PAG6抗体的PBS缓冲液，pH为7.2。

在本申请的一个具体实施方式中，所述PAG6抗体溶液为PAG6抗体的PBS缓冲液，pH为7.2，且含有1% BSA。

本申请的发明人通过实验不同的PAG6抗体溶液对检测结果的影响，从而选出显色效果最好的PAG6抗体溶液。

在本申请的一个具体实施方式中，所述PAG6抗体溶液的浓度为2-50μg/mL。例如，所述PAG6抗体溶液的浓度为2μg/mL、5μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL或50μg/mL等。

在本申请的一个具体实施方式中，所述PAG6抗体溶液的浓度为8-15μg/mL。

在本申请的一个具体实施方式中，所述PAG6抗体溶液的浓度为10μg/mL。

在本申请的一个具体实施方式中，恒温固定温度为4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或37℃。

在本申请的一个具体实施方式中，恒温固定时间为30 min、40 min、50 min、1 h、1.2 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、4.5 h、5 h、5.5 h、6 h、6.5 h、7 h、7.5 h或8 h。

在本申请的一个具体实施方式中，恒温固定条件为37℃固定30-60min。

本申请的发明人通过实验恒温固定的温度和时间，从而摸索出时间最短，显色最佳的条件，以提高检测效率。

在本申请的一个具体实施方式中，所述封闭液为5%BSA或5%脱脂乳。本申请的发明人通过实验不同的封闭液，从而摸索出显色效果较佳，成本最低的封闭液，以降低成本。

在本申请的一个具体实施方式中，所述第一孵育的温度为4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或37℃。

在本申请的一个具体实施方式中，所述第一孵育的时间为30 min、40 min、50min、1 h、1.2 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、4.5 h、5 h、5.5 h、6 h、6.5 h、7 h、7.5h或8 h。

在本申请的一个具体实施方式中，所述第一孵育的温度为37℃，孵育时间为60min。

本申请的发明人通过实验孵育时的温度和时间，从而摸索出时间最短，显色最佳的条件，以提高检测效率。

在本申请的一个具体实施方式中，所述二抗为山羊抗鼠IgG。

在本申请的一个具体实施方式中，所述显色液为DAB、TMB或ECL。本申请的发明人通过实验不同的显色液的显色效果，从而筛选出显色效果最佳的显色液。通过筛选，最终选择DAB作为显色液。

在本申请的一个具体实施方式中，所述显色的时间为1-10 min。例如显色时间为1min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min、8 min、9 min或10 min。

在本申请的一个具体实施方式中，所述显色的时间为3 min。

本申请提供的奶牛早期妊娠的检测方法至少具有以下有益效果之一：

本申请提供的奶牛早期妊娠的检测方法，其操作简单，无需昂贵的设备，肉眼即可进行判断，降低了成本，克服了牛场基层兽医文化水平低的问题而且检测效率高。

附图说明

图1为本申请实施例中固定载体的选择的实验结果图。

图2为本申请实施例中PAG抗体溶液选择的实验结果图。

图3为本申请实施例中PAG抗体浓度选择的实验结果图。

图4为本申请实施例中固定条件选择的实验结果图。

图5为本申请实施例中封闭剂种类选择的实验结果图。

图6为本申请实施例中待检血清孵育条件选择的实验结果图。

图7为本申请实施例中显色液选择的实验结果图。

图8为本申请实施例中显色时间选择的实验结果图。

图9为本申请实施例中PAG6抗体与PAG6融合蛋白（抗原）特异性结合的实验结果图。其中，M为marker；1为PAG6抗体与PAG6融合蛋白（抗原）的特异性结合后的产物。

具体实施方式

除非另有定义，本申请中使用的所有技术和科学术语具有与本申请所述技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

下面将结合本申请实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本申请提供一种奶牛早期妊娠的检测方法，其包括如下步骤：

将PAG6抗体溶液点样至NC膜的点样孔中，于4℃-37℃恒温固定30 min-8 h；

向点样孔中加入封闭液进行封闭，封闭后进行清洗；

将待测样品加入到点样孔中进行第一孵育，4℃-37℃孵育30 min-8 h；

向点样孔中加入山羊抗鼠IgG H&L（HRP）二抗孵育1 h后，PBST洗涤3次；

加入显色液进行显色，滴加双蒸水终止反应，风干，观察结果。

实施例1 PAG6抗体的制备

1. Balb/c小鼠的免疫及PAG6融合蛋白免疫原性的测定

Balb/c小鼠的免疫取6周龄~8周龄Balb/c小鼠5只，用PAG6融合蛋白（Genebank中的序列号为NP_788790.1）免疫，具体程序如下：1.5 mL抗原（含150 μg PAG6融合蛋白）与等量福氏完全佐剂用微量混匀器充分搅拌混匀使混合液呈乳化状态，每只Balb/c小鼠经背部或腹部多点皮下注射抗原0.5 mL（含25 μg PAG6融合蛋白），2周后改用福氏不完全佐剂，按照以上步骤进行加强免疫，共加强免疫4次，每次加强免疫后1周左右，断尾或眼眶采血，用间接ELISA测定抗体效价；另取1只小鼠不做任何处理，作为阴性对照。以被检血清OD 450与阴性血清OD 450之比大于2（P/N>2），且被检血清OD 450>0.2、阴性血清OD 450<0.2的样品判为阳性。

2. 骨髓瘤细胞的制备

将骨髓瘤细胞从液氮中取出，立即放入37℃~42℃水浴中，待完全融化后1000 r/min离5 min，弃上清液，将沉淀细胞用含20% 1640完全培养基培养，细胞经过一次传代后，用含8-AG(20 μg/mL)的1640完全培养基悬浮培养两次。

3. 饲养层细胞的制备

采用腹腔细胞作为饲养层细胞。试验操作过程如下：

在融合前1 d选择小鼠1只颈椎脱臼致死，75%酒精浸泡消毒5 min，将小鼠表面酒精空干后用大头针将小鼠腹部向上固定在泡沫板上，移入超净台。用一次性无菌注射器吸取冰浴的基础培养液10 mL注入小鼠腹腔，右手固定注射器保持不动，左手用镊子夹取酒精棉球轻轻揉动小鼠腹部4 min~5 min后吸出培养液，当颜色变黄即证明其中含有足够数量的腹腔细胞，将基础培养液1000 r/min，离心5 min，用HAT培养液悬浮细胞，用微量移液器加入96孔细胞培养板中，100 μL/孔，37℃，5%CO₂培养箱中培养。

4. 制备免疫脾细胞

脱颈处死一只免疫的Balb/c小鼠，75％的酒精浸泡消毒5 min后，用大头针左侧向固定在泡沫板上，用无菌剪刀剪开左侧腹腔，轻轻取出脾脏，放入装有5 mL不完全培养基的培养皿。用注射器内芯碾轧脾脏，之后转入100目的细胞筛过滤，将脾细胞悬液移入10 mL离心管中，充分混匀后1000 r/min离心5 min，弃去上清。用4℃，0.91%氯化铵溶液对红细胞裂解进行充分裂解。裂解充分的脾细胞用基础培养液悬浮。

5. 细胞融合

取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，1000 r/min离心5 min，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数。同时制备免疫脾细胞悬液。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10的比例混合在50 mL塑料离心管内，1000 r/min，8 min。弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。

在室温下融合：30s内加入预热的1 mL 50％PEG1450溶液，边加边摇动，作用90 s，加预热的不完全培养液终止PEG作用，每隔2 min分别加入1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL或10mL不完全培养液。离心，800 r/min，6 min。弃上清，用10 mL左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔细胞培养板，100μL/孔，37℃，5％CO₂孵箱培养。

6. 观察细胞的生长情况

融合次日检查有无污染，融合后第3天采用半量换液更换板内的培养液。之后每隔3天换液一次。第10天到第12天吸取少量上清液用于检测、筛选。第14天左右改换HT培养液。

7. 杂交瘤细胞的筛选

从每个孔里取出0.1 mL上清液作检测用，同时补加等量的HT培养液继续培养。用间接ELISA法进行筛选，测定OD值，通过检测结果筛选出阳性克隆孔。采用有限稀释法克隆杂交瘤细胞株。

8. 杂交瘤细胞的扩大培养

对于筛选为阳性的孔转移到24孔培养板扩大培养，取上清使用proteinG纯化柱进行纯化获得PAG6抗体。将纯化获得的PAG6抗体与PAG6融合蛋白（抗原）孵育后进行琼脂糖凝胶电泳检测，其实验结果如图9所示。从图9中可以看出，PAG6抗体与PAG6融合蛋白（抗原）能够特异性结合。

实施例2 固定载体的选择

本申请的发明人实验了NC膜和PVDF膜对最终显色效果的影响。具体过程如下。

将实施例1中制备的PAG6抗体水溶液分别点样至NC膜和PVDF膜的点样孔中，于37℃恒温固定1h，向点样孔中加入5%BSA进行封闭，PBST洗涤3次；将待测血清样品稀释3200倍后，滴加至点样孔中，37℃孵育60 min，再向点样孔中加入山羊抗鼠IgG H&L（HRP）二抗（ab102167，Abcam）37℃孵育1 h，PBST洗涤3次。加入DAB显色液进行显色10 min，滴加双蒸水终止反应，风干，观察，其实验结果如图1所示。

从图1中可以看出，利用PVDF膜作为固定载体时，显色后的颜色较浅，不利于区分，因此，选用NC膜作为固定载体。

实施例3 抗体溶液的选择

本实施例中利用不同的溶剂溶解抗体，实验不同溶剂对检测结果的影响。溶剂分别选取无菌水、PBS（0.01 mol/L，pH7.2）、含1%BSA 的PBS（0.01 mol/L，pH7.2），溶解实施例1中制备的PAG6抗体，分别点样至NC膜的点样孔中，于37℃恒温固定1 h，向点样孔中加入5%BSA进行封闭，PBST洗涤3次；将待测血清样品稀释3200倍后，滴加至点样孔中，37℃孵育60min，再向点样孔中加入山羊抗鼠IgG H&L（HRP）二抗，37℃孵育1h，PBST洗涤3次。加入DAB显色液进行显色10 min，滴加双蒸水终止反应，风干，观察，其实验结果如图2所示。

从图2中可以看出，其中以PBS组效果最好，其他两组的显色均较浅，不利于区分。因此，选择PBS作为抗原点样缓冲液。

实施例4 抗体浓度的选择

本实施例中以PBS（0.01 mol/L，pH7.2）作为溶剂溶解实施例1制备的PAG6抗体，实验不同浓度的PAG6抗体对检测结果的影响。具体如下：利用PBS（0.01 mol/L，pH7.2）溶解实施例1中制备的PAG6抗体，制备浓度分别为50 μg/mL，10 μg/mL和2 μg/mL的PAG6抗体溶液，并分别点样至NC膜的点样孔中，于37℃恒温固定1h，向点样孔中加入5%BSA进行封闭，PBST洗涤3次；将待测血清样品稀释3200倍后，滴加至点样孔中，37℃孵育60 min，再向点样孔中加入山羊抗鼠IgG H&L（HRP）二抗，37℃孵育1 h，PBST洗涤3次。加入DAB显色液进行显色10min，滴加双蒸水终止反应，风干，观察，其实验结果如图3所示。

从图3中可以看出，其中PAG6抗体浓度为10 μg/mL时显色效果最好，因此，PAG6抗体浓度选择PBS 10 μg/mL。

实施例5 固定条件的选择

本实施例中以PBS（0.01 mol/L，pH7.2）作为溶剂溶解实施例1制备的PAG6抗体，实验不同固定条件对检测结果的影响。具体如下：利用PBS（0.01 mol/L，pH7.2）溶解实施例1中制备的PAG6抗体，PAG6抗体浓度为10 μg/mL，点样至NC膜的点样孔中，分别于37℃恒温固定1 h、37℃固定30 min、25℃固定2 h或4℃固定8 h，向点样孔中加入5%BSA进行封闭，PBST洗涤3次；将待测血清样品稀释3200倍后，滴加至点样孔中，37℃孵育60 min，再分别向点样孔中加入山羊抗鼠IgG H&L（HRP）二抗，37℃孵育1 h，PBST洗涤3次。加入DAB显色液进行显色10 min，滴加双蒸水终止反应，风干，观察，其实验结果如图4所示。

从图4中可以看出，在37℃时，固定30 min和60 min时，显色效果均较好，为了提高效率，选择在37℃时，固定30 min。

实施例6 封闭剂的选择

本实施例中实验不同封闭剂对检测结果的影响。具体如下：利用PBS（0.01 mol/L，pH7.2）溶解实施例1中制备的PAG6抗体，PAG6抗体浓度为10 μg/mL，点样至NC膜的点样孔中，于37℃恒温固定30min，分别向点样孔中加入5%BSA或5%脱脂乳进行封闭，PBST洗涤3次；将待测血清样品稀释3200倍后，滴加至点样孔中，37℃孵育60 min，再分别向点样孔中加入山羊抗鼠IgG H&L（HRP）二抗，37℃孵育1 h，PBST洗涤3次。加入DAB显色液进行显色10 min，滴加双蒸水终止反应，风干，观察，其实验结果如图5所示。

从图5中可以看出，5%BSA和5%脱脂乳作为封闭剂，均能够显色，但5%脱脂乳作为封闭剂时，背景颜色较浅，更容易观察，而且成本较低，因此，以5%脱脂乳作为封闭剂。

实施例7 待测样本孵育条件的选择

本实施例中实验待测样本孵育条件对检测结果的影响。具体如下：利用PBS（0.01mol/L，pH7.2）溶解实施例1中制备的PAG6抗体，PAG6抗体浓度为10 μg/mL，点样至NC膜的点样孔中，于37℃恒温固定30min，向点样孔中加入5%脱脂乳进行封闭，PBST洗涤3次；将待测血清样品稀释3200倍后，滴加至点样孔中，分别于37℃恒温孵育1 h、37℃孵育30 min、25℃孵育2 h或4℃孵育8 h；再分别向点样孔中加入山羊抗鼠IgG H&L（HRP）二抗，于37℃恒温孵育1 h，PBST洗涤3次。加入DAB显色液进行显色10 min，滴加双蒸水终止反应，风干，观察，其实验结果如图6所示。

从图6中可以看出，在37℃孵育60 min时，显色效果最好。

实施例8 显色剂的选择

本实施例中实验不同显色剂对检测结果的影响。具体如下：利用PBS（0.01 mol/L，pH7.2）溶解实施例1中制备的PAG6抗体，PAG6抗体浓度为10 μg/mL，点样至NC膜的点样孔中，于37℃恒温固定30min，向点样孔中加入5%脱脂乳进行封闭，PBST洗涤3次；将待测血清样品稀释3200倍后，滴加至点样孔中，37℃孵育60 min，再分别向点样孔中加入山羊抗鼠IgG H&L（HRP）二抗，37℃孵育1h，PBST洗涤3次。分别加入DAB显色液、TMB显色液或ECL显色液进行显色10 min，滴加双蒸水终止反应，风干，观察，其实验结果如图7所示。

从图7中可以看出，三种显色液均可显色，但是在显色过程中，TMB显色液组用时过短，不宜观察，而ECL显色液需要配套专业显影仪器设备，因此，选择DAB显色液作为显色剂。

实施例9 显色时间的选择

本实施例中以DAB显色液作为显色剂，实验不同显色时间对检测结果的影响。具体如下：利用PBS（0.01 mol/L，pH7.2）溶解实施例1中制备的PAG6抗体，PAG6抗体浓度为10 μg/mL，点样至NC膜的点样孔中，于37℃恒温固定30 min，向点样孔中加入5%脱脂乳进行封闭，PBST洗涤3次；将待测血清样品稀释3200倍后，滴加至点样孔中，37℃孵育60 min，再分别向点样孔中加入山羊抗鼠IgG H&L（HRP）二抗，37℃孵育1 h，PBST洗涤3次。加入DAB显色液，分别显色1 min、3 min、5 min或10 min，滴加双蒸水终止反应，风干，观察，其实验结果如图8所示。

从图8中可以看出，显色时间控制在3 min即可。

根据以上实验，最终确定的奶牛早期妊娠的检测方法如下：

利用PBS（0.01mol/L，pH7.2）溶解PAG6抗体，PAG6抗体浓度为10μg/mL，点样至NC膜的点样孔中，于37℃恒温固定30 min，向点样孔中加入5%脱脂乳进行封闭，PBST洗涤3次；将待测血清样品稀释3200倍后，滴加至点样孔中，37℃孵育60 min，再分别向点样孔中加入山羊抗鼠IgG H&L（HRP）二抗，37℃孵育1 h，PBST洗涤3次。加入DAB显色液显色3 min，滴加双蒸水终止反应，风干，观察其结果即可。按照该方法进行检测时，3h之内即可出结果，大大提高了检测效率。

按照上述最终确定的检测方法分别检测了北京首农畜牧发展有限公司奶牛中心延庆牛场300头奶牛（50头未怀孕奶牛+250头怀孕奶牛）的血清（妊娠第30天），其检测结果与实际完全相符。

综上，本申请提供的奶牛早期妊娠的检测方法，该方法无需特殊昂贵的检测设备，检测人员也无需进行大量的培训，而且该方法操作简单，检测时间短，适合于大型的养牛场对奶牛早期妊娠状况的诊断。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims

1.一种奶牛早期妊娠的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

向点样孔中加入封闭液进行封闭，封闭后进行清洗；

向点样孔中加入二抗孵育后，清洗，加入显色液进行显色，滴加双蒸水终止反应，风干，观察结果。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述PAG6抗体溶液为PAG6抗体水溶液；或所述PAG6抗体溶液为PAG6抗体的PBS缓冲液，pH为7.2；或所述PAG6抗体溶液为PAG6抗体的PBS缓冲液，pH为7.2，且含有1% BSA。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述PAG6抗体溶液的浓度为2-50μg/mL。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述PAG6抗体溶液的浓度为10μg/mL。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，恒温固定条件为37℃固定30-60min。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述封闭液为5%BSA或5%脱脂乳。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第一孵育为37℃孵育60 min。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述显色液为DAB、TMB或ECL。

9.根据权利要求1-8任一项所述的检测方法，其特征在于，所述显色的时间为1-10min。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述显色的时间为3 min。