CN112679607A - 一种肌钙蛋白i e13单链抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明首先以E13杂交瘤细胞株为原料提取总mRNA，以此为模板反转录得到cDNA，选用IgG保守区序列特异性引物扩增单抗的轻链可变区和重链可变区基因，将扩增得到的轻、重链可变区基因序列在IMGT数据库进行生物信息学分析，得到序列准确可靠的候选轻链和重链可变区基因，通过本发明的制备方法获得cTnI E13单克隆细胞株的轻重链可变区基因序列，实现以基因序列形式对E13单抗细胞株实现永久保种；并提供一种原核表达E13单链抗体的制备方法，为后续建立过程简易，成本低廉的诊断抗体原料制备工艺提供基础。

Description

一种肌钙蛋白I E13单链抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及肌钙蛋白I E13单链抗体的制备，具体是从E13单克隆细胞株中克隆出轻重链可变区基因，并构建单链抗体重组表达工程菌，得到能用于配制肌钙蛋白I测定试剂(免疫法)的单链抗体原料。

背景技术

据世界卫生组织统计，目前冠心病是世界十大死因中排行第一的疾病，全球每年约有1700万人死于冠心病，被称为“人类健康的第一杀手”。急性心肌梗死(acutemyocardial infarction，AMI)是造成冠心病人死亡的主要原因。AMI典型病例可以根据病史、症状及心电图的特殊改变进行诊断，但大量的临床实践发现，约有25％的AMI病人发病早期并无典型的临床症状，约50％的AMI病人缺乏心电图的特异改变，在此情况下，检测血液中的心肌损伤标志物具有重要价值。目前，肌钙蛋白I(cTnI)因在稳定性、特异性及灵敏度等方面的综合优势，已获得美国心脏协会(AHA)，美国心脏病学会(ACC)和欧洲心脏病学会(ESC)等众多权威组织的认可，逐渐成为AMI诊断的“金标准”。

临床应用的cTnI免疫检测试剂盒主要包括免疫反应体系(抗体特异性识别抗原)和信号输出体系(反应信号放大和读取方式)，其中免疫反应体系中所需的抗体质量对免疫检测系统性能起决定性作用，目前常用的cTnI抗体大多是通过杂交瘤技术制备的全长单抗，但因全长单抗制备的生产工艺流程复杂、开发周期长、投入成本高等原因，致使抗体原料成为免疫检测试剂生产成本降低的一大制约因素。另外，分泌全长单抗的杂交瘤细胞株使用几代后逐渐退化，产量降低，甚至有染色体丢失失去抗体分泌能力的风险。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种肌钙蛋白I E13单链抗体的制备方法。

本发明的目的是通过基因克隆技术获得cTnI E13单克隆细胞株的轻重链可变区基因序列，从而实现以基因序列形式对E13单抗细胞株实现永久保种；另一目的是提供一种原核表达E13单链(scFv)抗体的制备方法。

本发明的目的将通过以下技术方案实现：

1).E13单克隆细胞株总RNA提取

取适量分泌cTnI E13单抗的杂交瘤细胞株，采用Trizol试剂法提取总RNA，再依次经氯仿萃取和乙醇洗涤后获得总RNA。通过测定RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀值确定RNA浓度和受蛋白污染情况；通过琼脂糖电泳观测28S/18S条带情况，确定提取的RNA完整性和DNA污染情况。具体步骤如下：

1.1)取适量杂交瘤细胞按一定比例加入Trizol试剂后，室温放置一定时间，使其充分裂解。12000g离心5min，弃沉淀；

1.2)按与加入Trizol体积的一定比例加入氯仿，振荡混匀后室温放置一定时间。4℃12000g离心15min；

1.3)吸取上层水相，至另一离心管中。按加入Trizol体积的一定比例加入异丙醇混匀，室温放置一定时间；4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；

1.4)按加入Trizol体积的一定比例加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；4℃8000g离心5min，尽量弃上清；

1.5)室温晾干或真空干燥5min。用50μl H₂O溶解RNA样品，60℃水浴孵育10min(注：H₂O须用DEPC处理并高压灭菌)；

1.6)测OD值定量RNA浓度，提取RNA的A₂₆₀/A₂₈₀值在1.6-1.8之间；

1.7)琼脂糖电泳鉴定RNA，确定制备RNA完整性和DNA污染情况。

上述1.1)中加入Trizol试剂比例为0.1～1.0ml/10⁶个杂交瘤细胞；

上述1.1)中室温放置时间为1.0～10min；

上述1.2)中加入氯仿试剂比例为20～1000μl/ml Trizol；

上述1.2)中室温放置时间为1.0～20min；

上述1.3)中加入异丙醇试剂比例为0.1～1.0ml/ml Trizol；

上述1.3)中室温放置时间为1.0～10min；

上述1.4)中加入异丙醇试剂比例为0.1～2.0ml/ml Trizol；

2).E13单抗基因克隆

采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术进行单抗基因的克隆扩增，RACE技术是一种基于PCR技术的快速扩增cDNA5′和3′末端的有效方法。因仅需克隆单抗的可变区序列，故只进行5′RACE实验即可。采用商品化的

RACE5’/3’试剂盒(Clonetech公司)进行试验，具体试验步骤如下：

2.1)CDNA合成

2.1.1)取4.0μl 5×First-Strand buffer，0.5μl 100mM DTT，1.0μl 20mM dNTPs在离心管中轻混，室温下放置至第2.1.4)步完成；

2.1.2)取1.0μl提取的总RNA，1.0μl 5’-CDS Primer A，9μl纯水在另一离心管中混合；

2.1.3)72℃孵育3min后冷却至42℃再孵育2min，冷却后，14000g离心10sec，收集管底成分；

2.1.4)每个反应体系中加入1μl SMARTer II A寡核苷酸；

2.1.5)取5.5μl 2.1.1)混合液，0.5μl RNase抑制剂(40Μ/μl)，2.0μl SMARTScribe Reverse Transcriptase(100Μ)混合；

2.1.6)将2.1.4)，2.1.5)两组成分混合，移液器轻轻吹混，轻微离心；42℃90min后，70℃下孵育10min；

2.1.7)加90μl Tricine-EDTA buffer稀释以上cDNA反应体系；

以上即获得用于5’RACE的cDNA；

2.2)RACE试验

2.2.1)将15.5μl PCR-Grade H₂O，25.0μl 2×SeqAmp Buffer，1.0μl SeqAmpDNAPolymerase混合；

2.2.2)将41.5μl上步预混液，2.5μl cDNA，5μl 10×ΜPM引物，1μl GSP引物(目的基因特定引物，轻/重链引物分别设计)在PCR管中混合；

2.2.3)在PCR仪中编辑程序：94℃30sec，68℃30sec，72℃3min，共25个循环

2.2.4)EtBr-琼脂糖电泳，UV下确定目的条带位置，切胶并称重，切胶回收试剂盒回收DNA。

2.3)In-Fusion Cloning

2.3.1)将1μl lineareizedp RACE载体，7μl DNA产物，2μl In-Fusion HD MasterMix混合，50℃孵育15min后冰浴，取2.5μl In-fusion混合液与stellar感受态细胞进行转化；

2.3.2)分别取1/100～1/5转化液体积的多个样液至离心管中，并用SOC培养基补充至100μl，分别涂至氨苄抗性LB板上。将剩余的转化液6000rpm离心5min，弃上清并分别用100μl SOC培养基补至100μl，涂LB板。将所有板放置于37℃过夜培养；

2.3.3)从培养板中挑选阳性克隆菌送测序服务公司进行Sanger测序确认(选择M13F和M13R为测序引物)。

上述2.2.2)中所用的轻链GSP引物为以下所列引物中的一条或几条并用：

VL-primer1:5’TCGTTCACTGCCATCAATCTTCCAC 3’

VL-primer2:5’GTTCACTGCCATCAATCTTCCACTT 3’

VL-primer3:5’GTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC 3’

VL-primer4:5’TTCAAGAAGCACACGACTGAGGCACC 3’

VL-primer5:5’TGCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGA3’

VL-primer6:5’GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGAT 3’

上述2.2.2)中所用的重链GSP引物为以下所列引物中的一条或几条并用：

VH-primer1:5’ACGTTGCAGGTGACGGTCTCGCT 3’

VH-primer2:5’GTTGCAGGTGACGGTCTCGCT GG 3’

VH-primer3:5’ACGTTGCAGGTGACGGTCTCGCT GG 3’

VH-primer4:5’CAACGTTGCAGGTGACGGTCTCGCT 3’

3).轻重链可变区测序结果分析

采用IMGT数据库以及NCBI数据库中的IgBLAST功能分别对轻、重链可变区基因的Sanger测序结果进行分析，包括对胚系基因同源性、开放阅读框的合理性、可变区的互补决定区(CDR)和骨架区(FR)序列长度以及信号肽序列完整性等生物信息进行分析，并排除来源宿主细胞的抗体基因和假基因。最终选择完整准确的可变区基因序列进行下一步的scFv基因构建。

4).scFv基因修饰及合成

scFv(single chain antibody fragment，单链抗体)是由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过几十个氨基酸的短肽(Linker)连接而成。将通过基因克隆获得的E13单抗VH和VL序列用短肽连接，在其-NH₂端添加原核分泌信号肽，在-COOH端添加定点标记和纯化短肽标签，可供后续scFv单链抗体进行生物素化或信号物质标记的定点修饰，以及进行金属螯合亲和层析的纯化标签。另外，分别在scFv基因的5’和3’端添加合适的限制性酶切位点，便于后续重组表达载体的构建。将以上基因序列外送基因合成服务公司合成scFv基因。

上述连接短肽选用GGGGS，(GGGGS)₂，(GGGGS)₃，(GGGGS)₄中的一种；

上述分泌信号肽为PelB、OmpA、DsbA中的一种；

上述定点标记或纯化短肽标签选用Cys-Gly-(His)₆，Cys-Gly-Gly-(His)₆，Cys-Cys-Gly-(His)₆，Cys-Cys-Gly-Gly-(His)₆中的一种；

上述所选用的限制性内切酶位点为BamH I，EcoR I，EcoR V，Nde I，Not I，Nhe I，Xho I，Sal I中的两种。

5).scFv重组载体构建及表达

将合成的scFv基因片段和选定的表达载体采用对应的限制性内切酶在合适温度下进行一定时间的酶切反应，采用T4 DNA连接酶在合适温度下反应一定时间进行连接，得到重组表达载体。最后将重组载体转化至合适的感受态细胞，涂Amp-LB培养基平板，在37℃条件下过夜培养，挑选单菌落进行PCR及酶切鉴定，将阳性克隆菌送至外包服务公司进行基因测序确认。

将测序正确的scFv重组载体质粒分别转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂Amp-LB培养基平板，在37℃条件下过夜培养后挑取单菌落，接种至含Amp-LB液体培养基中在一定温度下进行摇床培养，当菌液生长密度达到OD600＝0.8时，加入一定终浓度的IPTG，再继续培养一定时间进行诱导表达，离心收集菌体。

6).scFv重组表达蛋白纯化

scFv蛋白纯化：取适量scFv菌体重悬于缓冲液I中，超声破碎后进行离心，收集离心上清，在

pure蛋白纯化系统上进行层析柱纯化，最后将含目的蛋白的洗脱液透析至缓冲液II中，收样待用；如scFv蛋白以不可溶的包涵体形态表达时，破碎离心收集沉淀，并重悬于一定浓度的尿素中，再离心收集上清，在

pure蛋白纯化系统上进行层析柱纯化，最后将含目的蛋白的洗脱液透析至缓冲液II中，收样待用。

上述步骤5)所选用的限制性内切酶位点为BamH I，EcoR I，EcoR V，Nde I，Not I，Nhe I，Xho I，Sal I中的两种；

上述步骤5)所选用的表达载体为pET-22b，pET-28a，pET-30a，pET-32a，pET-44a中的一种；

上述步骤5)中限制性内切酶酶切温度为16℃～37℃，酶切时间为0.5h～4h；

上述步骤5)中DNA连接酶反应温度为4℃～37℃，反应时间为2h～24h；

上述步骤5)中所用的感受态细胞为Top10，DH5a，JM109，Stbl 3中的一种；

上述步骤5)中摇菌温度为4℃～37℃；

上述步骤5)中加入的诱导剂IPTG终浓度为0.05mM～0.2mM间；

上述步骤5)中进行诱导表达的时间为2h～24h；

上述步骤6)中选用的缓冲液I为磷酸盐、Tris-Hcl、硼酸盐、碳酸盐、HEPES、MOPSO缓冲液中的一种，缓冲液的使用浓度为10mM～1000mM，且pH范围在6.0～9.0之间；

上述步骤6)中所用的尿素浓度为4M～8M间；

上述步骤6)中选用的缓冲液II为Tris-Hcl、HEPES、MOPSO缓冲液中的一种，缓冲液的使用浓度为10mM～1000mM，且pH范围在6.0～9.0之间；

上述步骤6)中选用的柱层析纯化方法为阴离子交换层析、阳离子交换层析、Ni²⁺离子螯合亲和层析和疏水相互作用层析中的一种或几种并用。

7).scFv抗体性能验证

7.1)抗原反应性验证

采用双抗夹心法验证scFv抗体的抗原反应性，具体步骤是：同时将scFv抗体及E13全长单抗用包被液稀释，按一列一株每孔加100μl的方式包被于96孔酶标板，4℃过夜；每孔加200μl封闭液进行封闭，37℃孵育1h；添加夹心cTnI抗原，37℃孵育1h；加入一定浓度的HRP标记F12单抗和外购单抗(能与E13单抗相互配对)，37℃孵育1h；以上各步骤之间均用缓冲液III洗涤酶标板，最后加100μl/孔TMB，避光静置5min显色，再每孔加入50μl 2M H₂SO₄，终止酶反应，用酶标仪读数(波长450nm)，测定每孔的光吸收值(OD值)。根据OD值强弱评估scFv单链抗体与cTnI抗原反应性。

上述所用的包被液为磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、硼酸盐、HEPES、MOPS缓冲液中的一种，使用浓度为10mM～1000mM，且pH范围在4.0～10.0之间；

上述中的单抗包被稀释浓度为1.0μg/ml～10μg/ml；

上述所用的封闭液为5％脱脂奶粉、2％BSA、1％酪蛋白和1％牛血清中的一种(均为质量百分比浓度)。

上述中的夹心cTnI抗原浓度为0.1ng/ml～100ng/ml；

上述中的HRP标记单抗的使用浓度为0.1μg/ml～10μg/ml；

上述所用的缓冲液III为PBS，Tris-Hcl，PBST，TBST缓冲液中的一种，使用浓度为10mM～1000mM，且pH范围在4.0～10.0之间；

7.2)临床样本反应性验证

采用双抗夹心法验证scFv单链抗体的临床样本反应性，将scFv单链抗体及E13全长单抗同时包被于96孔酶标板，取1份cTnI混合样本，按首孔原倍再对倍稀释加至96孔ELISA板中，以HRP标记F12单抗作二抗，显色后读OD值。评判cTnI scFv单链抗体与全长抗体检测临床样本的反应性差异。

本发明首先以E13杂交瘤细胞株为原料提取总mRNA，以此为模板反转录得到cDNA，选用IgG保守区序列特异性引物扩增单抗的轻链可变区和重链可变区基因，将扩增得到的轻、重链可变区基因序列在IMGT数据库进行生物信息学分析，得到序列准确可靠的候选轻链和重链可变区基因。采用短肽linker将重链可变区基因与轻链可变区基因连接构建单链抗体序列，并在序列两端修饰原核表达分泌信号肽、纯化标签、定向偶联位点及限制性酶切位点等并进行基因合成，构建重组表达载体后转入BL21(DE3)大肠杆菌系统进行诱导表达，采用柱层析纯化获得纯度大于90％的单链抗体，并进行间接法酶联免疫法验证单链抗体活性，结果表明单链抗体与cTnI抗原和临床样本均有较好的反应性。通过本发明的制备方法获得cTnI E13单克隆细胞株的轻重链可变区基因序列，实现以基因序列形式对E13单抗细胞株实现永久保种；并提供一种原核表达E13单链抗体的制备方法，为后续建立过程简易，成本低廉的诊断抗体原料制备工艺提供基础。

附图说明

图1为E13单克隆细胞株总RNA琼脂糖电泳图。

图2为实施例中E13单抗基因克隆琼脂糖电泳图，图中：(Lane 1:VL，Lane2:VH，Lane 3:阴性对照，Lane 4:阳性对照，Marker从上至下依次是：10000bp，7000bp，4000bp，2000bp，1000bp，500bp，250bp)。

图3为实施例中scFv蛋白BL21(DE32)菌表达及纯化结果示意图，图中：(Lane 1:Protein Marker，Lane 2:破碎全菌液；Lane 3:破碎菌离心上清液；Lane 4:破碎菌离心沉淀；Lane 5:Ni2+柱纯化前，Lane 6:Ni2+柱纯化后)。

具体实施方式

下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。

实例1：E13单克隆细胞株总RNA提取

采用Trizol试剂法提取总RNA，每ml Trizol试剂约可裂解5×10⁶个杂交瘤细胞，再依次经氯仿萃取和乙醇洗涤后获得总RNA。具体步骤如下：

1)取适量cTnI E13杂交瘤细胞加入Trizol试剂后，室温放置5min，使其充分裂解。12000g离心5min，弃沉淀；

2)按200μl氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min(注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂)。4℃12000g离心15min；

3)吸取上层水相，至另一离心管中。按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min；4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；

4)按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；4℃8000g离心5min，尽量弃上清；

5)室温晾干或真空干燥5min。可用50μl H₂O(DEPC处理并高压灭菌)溶解RNA样品，60℃水浴孵育10min；

6)测OD值定量RNA浓度，此方法提取RNAA₂₆₀/A₂₈₀值在1.6-1.8之间；

7)甲醛变性琼脂糖电泳鉴定RNA，确定制备RNA完整性和DNA污染情况(28s(～5000bp)，18s(～2000bp)条带无降解)。

通过测定RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀值＝1.91确定受蛋白污染情况良好；通过琼脂糖电泳观测28S/18S条带深浅比例约为2:1(如图1所示)，确定提取的RNA结构完整，未发生严重降解情况。提取的总RNA质量良好可用于后续单抗基因克隆试验。

实例2：E13单抗基因克隆

以提取的E13单抗总RNA为原料，设计合成轻重链恒定区特异性引物(VL-GSP:5’TCGTTCACTGCCATCAATCTTCCAC 3’，VH-GSP:5’ACGTTGCAGGTGACGGTCTCGCT 3’)，采用cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术分别进行单抗轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因的克隆扩增，经过反转录cDNA和目的基因PCR扩增两步，将PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定，如图2可见，分别获得在500bp附近单一清晰的VL和VH基因条带。

将VL和VH扩增基因条带分别进行切胶回收，然后与Lineareizedp RACE载体相连，连接产物转化Stellar感受态细胞，涂氨苄抗性的LB培养基板后置于37℃培养箱过夜培养，挑选8个克隆菌落接种扩培后，提交至测序服务公司进行Sanger测序。

实例3：轻重链可变区测序结果分析

采用IMGT数据库以及NCBI数据库中的IgBLAST模块分别对VL和VH基因的测序结果进行分析，包括对胚系基因同源性、开放阅读框的合理性、可变区的互补决定区(CDR)和骨架区(FR)序列长度以及信号肽序列完整性等生物信息进行分析，如下所列分析结果可见VL和VH基因均由CDR1，CDR2，CDR3三段抗原决定簇区和FR1，FR2，FR3和FR4四段骨架区组成，且分界清晰明确完整；其中VL和VH基因序列长度分别为324bp和360bp，氨基酸序列长度分别为108aa和120aa。由表1可见，VL基因与IGKV10-96*01胚系基因有96.8％同源性，VH基因与IGHV1S29*02胚系基因有93.9％同源性，且两者开放阅读框唯一正确可实现正常表达，因此推断基因克隆获取的E13单抗VL和VH基因序列正确，后续将进行下一步的基因修饰及合成。

获得的E13轻链可变区基因序列如SEQ ID No:1所示。

E13轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

获得的E13重链可变区基因序列如<SEQ ID No:3所示。

E13重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。

表1 E13单抗VH和VL基因序列分析

实例4：scFv基因合成

将基因克隆获得的VH与VL基因序列去掉各自原来的真核表达信号肽序列，以VH-Linker-VL形态进行串联，其中Linker为(GGGGS)₃短肽序列，并添加原核表达OmPA分泌肽，-COOH端添加Cys-Gly-(His)₆标签序列，其中半胱氨酸(Cys)含有游离-SH，可供后续scFv单链抗体进行生物素化或信号物质标记的定点修饰，甘氨酸(Gly)为间隔臂，6个组氨酸(His)作为后续进行金属螯合亲和层析的纯化标签。最后在5’和3‘端分别添加限制性酶切位点NdeI和XhoI，将序列提交至金唯智生物公司进行基因合成，

E13 scFv基因序列如SEQ ID No:5所示。

E13 scFv氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。

实例5：scFv蛋白重组表达及纯化

将合成的scFv基因片段和pET-22b质粒同时采用NdeI和XhoI限制性内切酶进行酶切，回收后再用T4 DNA连接酶进行连接，得到scFv-pET22b重组表达载体。最后将重组载体转化Top10感受态细胞，涂Amp-LB培养基平板，37℃过夜培养，挑选菌落接种扩培，将阳性克隆菌送至外包服务公司进行测序确认。

将测序正确的scFv-pET22b重组质粒分别转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂Amp-LB培养基平板，过夜培养后挑取单菌落，接种至含Amp的LB液体培养基中37℃摇床培养，当OD600到0.8时，加入终浓度为0.4mM的IPTG，再继续培养4h，离心收集菌体，超声破碎后，SDS-PAGE分析重组蛋白表达量及表达状态情况。由图3可见，重组scFv蛋白(～28kDa)主要存在于超声破碎后的离心沉淀中，而破碎离心上清液中含量微弱，说明scFv蛋白以包涵体状态表达。

取适量诱导表达后的scFv菌体重悬于10mM PBS7.4缓冲液中，超声破碎后进行离心，因scFv以不可溶的包涵体形态表达，故收集离心沉淀，经PBS7.4和2M尿素各洗涤一次后，重悬于8M尿素中，透析至PBS7.4中进行复性，离心收集上清液，在

pure蛋白纯化系统上进行Ni²⁺预装柱纯化，因scFv蛋白以包涵体形态表达，被其它杂蛋白污染少，如图3可见，在Ni²⁺柱纯化前，因scFv蛋白为包涵体状态即有较高纯度，仅在主条带上、下方存在少许杂蛋白条带，经Ni²⁺柱纯化后，杂蛋白被去除，scFv蛋白纯度进一步提高，可达95％以上。

实例6：scFv抗体的抗原反应性验证

采用双抗夹心法验证scFv抗体与cTnI抗原的反应性，将2μg/ml scFv抗体及E13全长单抗按一列一株方式包被于96孔ELISA板，夹心cTnI抗原从50ng/ml对倍稀释6梯度浓度，检测抗体为1μg/ml HRP-F12单抗和HRP-B90外购单抗，由表2可见，scFv单链抗体与F12单抗或B90外购单抗配对，均表现出与cTnI抗原有一定反应性，且呈较好反应梯度，说明重组表达制备的scFv单链抗体具有较好抗原反应活性。

表2 scFv单链抗体抗原反应性

实例7：scFv抗体临床样本反应性验证

采用双抗夹心法验证scFv抗体与cTnI临床样本的反应性，将scFv抗体及E13全长单抗同时包被于96孔ELISA板，取1份cTnI混合样本(测值为22.7ng/ml)，在96孔ELISA板中按首孔原倍再对倍稀释6个浓度梯度，再加入HRP标记F12单抗，显色后读取OD值，如表3可见，scFv抗体与cTnI临床样本反应OD值与样本稀释梯度呈较好线性，说明scFv单链抗体能够较好地识别临床样本中的cTnI抗原，与对照组E13全长单抗比较，scFv单链抗体与临床样本的反应性相对较弱，可能与重组表达单链抗体的活性回收率不足有关。

表3 scFv单链抗体临床样本反应性

以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

序列表

<110> 美康生物科技股份有限公司

<120> 一种肌钙蛋白I E13单链抗体的制备方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 386

<212> DNA

<213> E13轻链可变区基因序列(E13 VL gene sequence)

<400> 1

atgtcctctg ctcagttcct tggtctcctg ttgctctgtt ttcaaggtac cagatgtgat 60

atccagatga cacagactac atcctccctg tctgcctctc tgggagacag agtcaagagt 120

caccatcagt tgcagggcaa gtcaggacat taccaattat ttaaactggt atcagcagaa 180

accagatgga actgttaaac tcctgatcta ctacacatca agattacact cgggagtccc 240

atcaaggttc agtggcagtg ggtccggacc agattattct ctcaccattt cccacctgga 300

gcatgaagat attgccactt acttttgcca acagggtcat acgcttccgc tcacgttcgg 360

tgatgggacc accctggagc tgaaac 386

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> E13轻链可变区氨基酸序列( E13 VL peptide sequence)

<400> 2

Gln Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser

1 5 10 15

Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Thr

20 25 30

Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser His Leu

65 70 75 80

Glu His Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu

85 90 95

Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Glu Leu

100 105

<210> 3

<211> 417

<212> DNA

<213> E13重链可变区基因序列(E13 VH gene sequence)

<400> 3

atgggatgga gctggatctt tctcttcctc ctgtcaggaa ctgcaggcgt ccgctctgag 60

gtccagcttc agcagtcagg acctgaactg gtgaaacctg gggcctcagt gaagatatcc 120

tgcaaggctt cgggatacac attcactgac tacaacatgc actggctgaa gcagagccat 180

ggaaagagcc ttgagtggat tggatatatt tatccctaca gtggtggtac tgcctacaat 240

cagaaattta agaacaaggc cacattgact gcagacactt cctccagtac agcccacatg 300

gaactccgca gcctgacatc tgaggactct tcattctatt actgtgcaag acaccatgat 360

tacgacggag ggacgtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 417

<210> 4

<211> 120

<212> PRT

<213> E13重链可变区氨基酸序列( E13 VH peptide sequence)

<400> 4

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Leu Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala His

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ser Phe Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His His Asp Tyr Asp Gly Gly Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 5

<211> 834

<212> DNA

<213> E13 单链抗体基因序列(E13 scFv gene sequence)

<400> 5

catatgaaaa agactgctat tgccatcgca gttgcgttag ctggttttgc caccgtcgca 60

caagcggaag ttcagcttca gcagtcaggc cctgaacttg ttaaacctgg cgcttcagtt 120

aaaatttcat gtaaggcttc aggctataca tttacagatt ataacatgca ttggcttaaa 180

cagtcacatg gcaaatcact tgaatggatt ggctatattt atccttattc aggcggcaca 240

gcttataacc agaaatttaa gaataaggct acacttacag ctgatacatc atcatcaaca 300

gctcacatgg aacttcgctc acttacatca gaagattcat cattctacta ctgtgctcgc 360

catcatgatt atgatggcgg cacatttgct tattggggac aaggcacact tgttacagtt 420

tcagctgcta agactacggg aggaggcggg tcaggaggtg gtgggagtgg cggtggaggt 480

tcgcaagcag atattcagat gacacagaca acatcatcac tttcagcttc acttggcgat 540

cgcgttacaa tttcatgtcg cgcttcacag gatattacaa actatcttaa ctggtatcag 600

cagaaacctg atggcacagt taaacttctt atttattata catcacgcct tcattcaggc 660

gttccttcac gcttctctgg ttcaggctca ggccctgatt attcacttac aatttcacat 720

cttgaacatg aagatattgc tacatatttc tgccaacagg gccatacact tcctcttaca 780

tttggcgatg gcacaacact tgaacttcat catcatcatc atcattgact cgag 834

<210> 6

<211> 255

<212> PRT

<213> E13 单链抗体氨基酸序列(E13 scFv peptide sequence)

<400> 6

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Leu Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala His

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ser Phe Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His His Asp Tyr Asp Gly Gly Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Asp Ile Gln

130 135 140

Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val

145 150 155 160

Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr Leu Asn Trp

165 170 175

Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr

180 185 190

Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Pro Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser His Leu Glu His Glu Asp Ile

210 215 220

Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Leu Thr Phe Gly

225 230 235 240

Asp Gly Thr Thr Leu Glu Leu Cys Gly His His His His His His

245 250 255

Claims (8)

1. 一种肌钙蛋白I E13单链抗体，其特征在于，其基因序列如SEQ ID No:5所示。

2. 根据权利要求1所述的肌钙蛋白I E13单链抗体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID No:6所示。

3. 一种肌钙蛋白I E13单链抗体的制备方法，其特征在于，制备步骤包括：

（1）E13单克隆细胞株总RNA提取：

取适量分泌cTnI E13单抗的杂交瘤细胞株，采用Trizol试剂法提取总RNA，再依次经氯仿萃取和乙醇洗涤后获得总RNA；通过测定RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀值确定RNA浓度和受蛋白污染情况；通过琼脂糖电泳观测28S/18S条带情况，确定提取的RNA完整性和DNA污染情况；

（2）E13单抗基因克隆：

采用cDNA 末端快速扩增技术进行单抗基因的克隆扩增，采用商品化的SMARTer^® RACE5’/3’试剂盒进行试验；

（3）轻重链可变区测序结果分析：

采用IMGT数据库以及NCBI数据库中的IgBLAST功能分别对轻、重链可变区基因的Sanger测序结果进行分析，包括对胚系基因同源性、开放阅读框的合理性、可变区的互补决定区（CDR）和骨架区（FR）序列长度以及信号肽序列完整性等生物信息进行分析，并排除来源宿主细胞的抗体基因和假基因，最终选择完整准确的可变区基因序列进行下一步的scFv基因构建；

（4） scFv基因修饰及合成：

scFv是由抗体重链可变区VH和轻链可变区VL通过几十个氨基酸的短肽连接而成，将通过基因克隆获得的E13单抗VH和VL序列用短肽连接，在其-NH₂端添加原核分泌信号肽，在-COOH端添加定点标记和纯化短肽标签，可供后续scFv单链抗体进行生物素化或信号物质标记的定点修饰，以及进行金属螯合亲和层析的纯化标签；另外，分别在scFv基因的5’和3’端添加合适的限制性酶切位点，便于后续重组表达载体的构建，将以上基因序列合成scFv基因；

（5）scFv重组载体构建及表达：

将合成的scFv基因片段和选定的表达载体采用对应的限制性内切酶在合适温度下进行一定时间的酶切反应，采用T4 DNA连接酶在合适温度下反应一定时间进行连接，得到重组表达载体，最后将重组载体转化至合适的感受态细胞，涂Amp-LB培养基平板，在37°C条件下过夜培养，挑选单菌落进行PCR及酶切鉴定，对阳性克隆菌进行基因测序确认；将测序正确的scFv重组载体质粒分别转化E.coli BL21（DE3)感受态细胞，涂Amp-LB培养基平板，在37°C条件下过夜培养后挑取单菌落，接种至含Amp-LB液体培养基中在一定温度下进行摇床培养，当菌液生长密度达到OD600=0.8时，加入一定终浓度的IPTG，再继续培养一定时间进行诱导表达，离心收集菌体；

（6）scFv重组表达蛋白纯化：

取适量scFv菌体重悬于缓冲液I中，超声破碎后进行离心，收集离心上清，在ÄKTA pure蛋白纯化系统上进行层析柱纯化，最后将含目的蛋白的洗脱液透析至缓冲液II中，收样待用；

（7）scFv片段抗体性能验证：

采用双抗夹心法验证scFv单链抗体的抗原反应性。

4. 根据权利要求1所述的肌钙蛋白I E13单抗单链抗体的制备方法，其特征在于， 步骤（2）中PCR采用的轻链GSP引物为以下所列引物中的一条或几条并用：

VL-primer1: 5’ TCGTTCACTGCCATCAATCTTCCAC 3’

VL-primer2: 5’ GTTCACTGCCATCAATCTTCCACTT 3’

VL-primer3: 5’ GTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC 3’

VL-primer4: 5’ TTCAAGAAGCACACGACTGAGGCACC 3’

VL-primer5: 5’ TGCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGA 3’

VL-primer6: 5’ GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGAT 3’

重链GSP引物为以下所列引物中的一条或几条并用：

VH-primer1: 5’ ACGTTGCAGGTGACGGTCTCGCT 3’

VH-primer2: 5’ GTTGCAGGTGACGGTCTCGCT GG 3’

VH-primer3: 5’ ACGTTGCAGGTGACGGTCTCGCT GG 3’

VH-primer4: 5’ CAACGTTGCAGGTGACGGTCTCGCT 3’。

5. 根据权利要求1所述的肌钙蛋白I E13单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所获得的E13细胞株轻链可变区基因序列为SEQ ID No: 1，获得的E13细胞株轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No: 2，获得的E13细胞株重链可变区基因序列为SEQ ID No: 3，获得的E13细胞株重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No: 4。

6. 根据权利要求1所述的肌钙蛋白I E13单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤（4）中scFv连接短肽选用GGGGS， (GGGGS)2， (GGGGS)3， (GGGGS)4中的一种，分泌信号肽为PelB、OmpA、DsbA中的一种，定点标记或纯化短肽标签选用Cys-Gly-(His)₆，Cys-Gly-Gly-(His)₆，Cys-Cys-Gly-(His)₆，Cys-Cys-Gly-Gly-(His)₆中的一种，所选用的限制性内切酶位点为BamH I，EcoR I，EcoR V，Nde I，Not I，Nhe I，Xho I，Sal I中的两种。

7. 根据权利要求1所述的肌钙蛋白I E13单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤（5）中选用的限制性内切酶位点为BamH I，EcoR I，EcoR V，Nde I，Not I，Nhe I，Xho I，Sal I中的两种；所选用的表达载体为pET-22b，pET-28a，pET-30a，pET-32a， pET-44a中的一种；限制性内切酶酶切温度为16 °C~37 °C，酶切时间为0.5 h~4 h；DNA连接酶反应温度为4 °C~37 °C，反应时间为2 h~24 h；所用的感受态细胞为Top10，DH5a，JM109，Stbl 3中的一种；所用的摇菌温度为4 °C~37 °C，加入的诱导剂IPTG终浓度为0.05 mM~0.2 mM间，进行诱导表达的时间为2 h~24 h。

8. 根据权利要求1所述的肌钙蛋白I E13单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤6）中选用的缓冲液I为磷酸盐、Tris-Hcl、硼酸盐、碳酸盐、HEPES、MOPSO缓冲液中的一种， 缓冲液的使用浓度为10 mM～1000 mM，且pH范围在6.0～9.0之间；选用的缓冲液II为Tris-Hcl、HEPES、MOPSO缓冲液中的一种， 缓冲液的使用浓度为10 mM～1000 mM，且pH范围在6.0～9.0之间；选用的柱层析纯化方法为阴离子交换层析、阳离子交换层析、Ni²⁺离子螯合亲和层析和疏水相互作用层析中的一种或几种并用。

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