CN111269297B

CN111269297B - 一种结核分枝杆菌刺激抗原的制备方法

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Publication number: CN111269297B
Application number: CN202010076333.8A
Authority: CN
Inventors: 刘梁涛; 李新乐; 尚朋林; 张文婧; 赵巧辉; 李欢欢; 李桂林; 付光宇; 吴学炜; 杨增利
Original assignee: Zhengzhou Immuno Biotech Co Ltd
Current assignee: Zhengzhou Immuno Biotech Co Ltd
Priority date: 2020-01-23
Filing date: 2020-01-23
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2040-01-23
Also published as: CN111269297A

Abstract

本发明涉及生物医学检验领域，尤其涉及结核分枝杆菌刺激抗原及其制备方法。本发明提供的结核分枝杆菌刺激抗原其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同源性的序列。并且还提供了编码该抗原片段的多核苷酸、表达载体，以及重组产结核分枝杆菌刺激抗原的大肠杆菌菌株，并通过控制培养及发酵诱导条件，实现重组大肠杆菌的高密度培养的同时，避免了后期因自身所产生的蛋白对菌体所带来的异常现象。该抗原在刺激γ‑干扰素的产生时，能够降低干扰，从而使检测具有更好的特异性和灵敏度，检测结果更加可靠。

Description

一种结核分枝杆菌刺激抗原的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学检验领域，尤其涉及结核分枝杆菌刺激抗原及其制备方法。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌(tubercle bacillus，TB)感染引起的人畜共患的慢性传染病。结核菌可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。结核病是青年人容易发生的一种慢性和缓发的传染病。潜伏期4～8周。其中80％发生在肺部，其他部位(颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼)也可继发感染。人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式。结核病的病因包括：①原发性：当人体抵抗力降低时，经呼吸道或消化道初次侵入人体的结核菌，常在肺部或肠壁形成原发病灶。②血型播散：当机体抵抗力降低时，大量结核菌一次或在极短时间内多次侵入血循环而引起，此时，由于机体变态反应增高，可致血管通透性增强。③继发性：指原发感染过程中肺内遗留下的潜在性病灶重新复燃或结核杆菌再次感染所引起的。我国是结核病流行严重的国家之一、同时也是全球耐多药结核病流行严重的国家之一，人类的健康受到了结核病的严重威胁。结核分枝杆菌的检测对结核病的诊断和防治存在重要意义。

近年来，随着免疫学和基因组学的发展，利用双抗体夹心ELISA法定量测释放出的IFN-γ含量，IFN-γ的含量与结核菌的量有很好的对应关系，从而判断是否感染结核分枝杆菌。目前已经有以结核分枝杆菌基因组RD1区编码的结核特异性抗原ESAT-6和CFP-10为刺激物的商品化IGRA试剂，用于检测外周血中结核特异性释放γ干扰素的T淋巴细胞，呈现较高的灵敏性和特异性。

但是，目前的结核分枝杆菌刺激抗原序列在制备过程中，菌株死亡较多，出现自溶的现象，其溶氧及pH变化较大，收菌离心后，出现离心分层现象较为严重，同时蛋白的表达率较低，在大量制备结核分枝杆菌刺激抗原时需要多批次培养，延长了抗原获取周期，且在高密度/高表达发酵控制过程中，发酵液中葡萄糖、乙酸含量需要得到控制，葡萄糖、乙酸常规的检测方法易受培养基成分、菌体代谢产物的影响测定结果，不仅造成了检测的不准确性，还增加了成本，并且最终得到的结核分枝杆菌刺激抗原纯度较低，使得结核检测灵敏度较低。

虽然很多学者克隆出不少的结核刺激抗原相似基因，也都在酵母、大肠杆菌等表达体系中进行表达，但表达分泌能力较弱，到现在为止并没有可以应用于大规模生产的工程菌。究其原因，可能在于选取的序列并不合适，或者未获得蛋白表达较高菌株做为克隆模板，表达稳定性差等。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供结核分枝杆菌刺激抗原及其制备方法，该抗原片段表达量高，纯度良好，用于刺激γ-干扰素可以提高特异性。

本发明提供的结核分枝杆菌刺激抗原，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同源性的序列。

一些实施例中，所述结核分枝杆菌刺激抗原具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。该实施例中，所述结核分枝杆菌刺激抗原的分子量为23.1Kda。

本发明在研究过程中，根据抗原的cds区，设计了数个TB结核杆菌的刺激抗原，进行了大量的筛选验证工作，其中如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的抗原片段具有最佳的表达效果，其余片段在表达过程中表达分泌能力较弱，无法应用于大规模生产。

本发明还提供了编码所述结核分枝杆菌刺激抗原的多核苷酸。

本发明中，所述“多核苷酸”是指有多个核苷酸聚合形成的生物大分子化合物，所述核苷酸可为核糖核酸或脱氧核糖核酸以及它们的修饰物，包括双链或单链的DNA、cDNA、RNA、mRNA等，其可为环状也可为线性，也可为环状载体中的一部分或基因组中的一个片段。本发明对编码结核分枝杆菌刺激抗原的核酸序列进行了密码子优化，一些实施例中，编码结核分枝杆菌刺激抗原的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种核酸载体，包括所述的多核苷酸。

所示核酸载体由骨架载体和多核苷酸组成。一些实施例中，所述核酸载体的骨架载体为pET30a。

本发明还提供了一种重组宿主，其转化有所述的核酸载体。

本发明所述的重组宿主的制备方法为：由所述的重组表达载体转化入宿主而成。本发明所述的重组宿主中，宿主为大肠杆菌。一些实施例中，所述宿主为大肠杆菌BL21DE3。

本发明还提供了结核分枝杆菌刺激抗原的制备方法，包括：培养本发明所述的重组宿主，诱导结核分枝杆菌刺激抗原的表达。

为了提高结核分枝杆菌刺激抗原的表达的表达效果，本发明对诱导表达的方法进行了优化。

一些实施例中，所述培养步骤的条件为：37℃，压力0.05Mpa，溶氧40％，搅拌速度为200-400rpm；以氨水或磷酸水溶液调节pH值为6.8～7.0，培养至OD₆₀₀值为5.0～7.0；

所述培养步骤中：培养基包括水和葡萄糖40g/L，酵母粉50g/L，磷酸二氢钠4.2g/L，磷酸氢二钾8.7g/L，硫酸铵5.5g/L，硫酸镁2.5g/L，微量元素溶液2.2ml/L。

一些实施例中，所述诱导步骤具体包括：

16℃以浓度为0.5mM的IPTG诱导，搅拌速度为275-350rpm溶氧浓度为30％，pH值为7.0～7.2；

诱导7～8h后，以1.5～3.5mL/min的速度补加补料培养基，搅拌速度为275-350rpm溶氧浓度为30％；

补料培养基包括水和：葡萄糖1000g/L，酵母粉400g/L，磷酸二氢钠12.6g/L，磷酸氢二钾26g/L，硫酸铵16.5g/L，硫酸镁20g/L，微量元素溶液12ml/L。

所述微量元素溶液包括水和：CoCl₂·6H₂O 2.1mg/L，MnCl₂·4H₂O 13mg/L，H₃BO₃3mg/L，钼酸钠2.5mg/L，柠檬酸铁12.5mg/L，EDTA8.4mg/L。

所述培养和诱导的过程中，以氨水和磷酸水溶液调节pH值，以消泡剂消除因搅拌产生的泡沫，从而维持溶氧浓度。本发明中，所述消泡剂及磷酸均已高压灭菌，通过蠕动泵进行添加至发酵罐。

在所述的诱导表达后，还包括纯化的步骤；

所述纯化包括收菌，离心分离，洗涤，破菌，过滤，最后经Ni柱、DEAE柱、内毒素亲和层析三步分离得到纯化后的结核分枝杆菌刺激抗原。

本发明所述的结核分枝杆菌刺激抗原在制备刺激γ-干扰素产生的试剂中的应用。

本发明提供的结核分枝杆菌刺激抗原氨基酸序列适合大肠杆菌的表达，并且，本发明进一步通过控制培养及发酵诱导条件，实现重组大肠杆菌的高密度培养的同时，避免了后期因自身所产生的蛋白对菌体所带来的异常现象。将单批次菌体产能提高为传统工艺的3.5倍以上，单批得率为传统工艺的2.98mg/g倍，经蛋白纯化，其纯度高达98.7％，大大提高了结核刺激抗原的纯度和得率。由于蛋白纯度的提高，其在刺激γ-干扰素的产生时，能够降低干扰，从而使检测具有更好的特异性和灵敏度，检测结果更加可靠。

本发明提供了结核分枝杆菌刺激抗原其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同源性的序列。并且还提供了编码该抗原片段的多核苷酸、表达载体，以及重组产结核分枝杆菌刺激抗原的大肠杆菌菌株，并通过控制培养及发酵诱导条件，实现重组大肠杆菌的高密度培养的同时，避免了后期因自身所产生的蛋白对菌体所带来的异常现象。将单批次菌体产能提高为传统工艺的3.5倍以上，单批得率为传统工艺的2.98mg/g倍，经蛋白纯化，其纯度高达98.7％，大大提高了结核刺激抗原的纯度和得率。因此，其在刺激γ-干扰素的产生时，能够降低干扰，从而使检测具有更好的特异性和灵敏度，检测结果更加可靠。

附图说明

图1是重组大肠杆菌发酵过程阶段示意图；

图2是重组大肠杆菌发酵过程中菌体湿重及OD₆₀₀随时间变化关系图；

图3是重组大肠杆菌发酵液中葡萄糖、乙酸含量曲线图；

图4结核刺激抗原不同诱导阶段蛋白表达电泳图；图注：1泳道为空白样；2,3,4,5,6,7,8泳道分别为诱导0h,3h,6h,9h,12h,15h,18h后的电泳结果；

图5经Ni柱纯化后的蛋白电泳结果；图注：1泳道为超声破碎离心后沉淀样品；2泳道为超声破碎离心后上清样品；3泳道为流穿后样品；4泳道为解离后样品；

图6经DEAE柱纯化后的蛋白电泳结果；图注：注：1泳道为DEAE柱上样溶液；2,3,4,5,6,7泳道分别为流穿分管后电泳样；8泳道为2-7合管后电泳样；

图7经去毒素亲和层析纯化后的蛋白电泳结果；图注：1,2,3,4泳道分别为经去内毒素亲和层析流穿分管后电泳样；5泳道1-4合管后电泳样；

图8优化后(A)与常规发酵(B)蛋白纯化电泳结果；图注：图A显示的是优化后的蛋白电泳结果，图B显示的是常规发酵的蛋白电泳结果；

图9实施例3中各组培养基诱导获得蛋白表达情况。

具体实施方式

本发明提供了结核分枝杆菌刺激抗原及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1制备大量表达结核分枝杆菌刺激抗原的重组大肠杆菌

第一步，经对结核刺激抗原的分析和免疫效果比对，选取致病性结核分枝杆菌中特有的RD1区ESAT-6、CFP-10抗原序列，经序列分析，利用同源克隆技术合成一个全长为651bp的TB基因，该基因序列SEQ ID No:1为：

第二步，根据得到的基因序列和多克隆酶切位点，设计特异性引物进行扩增：

5’端引物为TB-F1:5’-CCGGAATTCATGGCAGAGATGAAGACCGAT-3’(含EcoRI酶切位点)，

3’端引物为TB-R1:5’-CCCAAGCTTTCAGAAGCCCATTTGCGAGGAC-3’(含HindIII酶切位点)。

然后以第一步得到的TB基因为模板，以TB-F1、TB-R1为引物进行PCR扩增。PCR反应体系(25μl)为：DNA模板1μl，上下游引物各1μl，合mix12.5μl，ddH₂O9.5μl，反应条件：95℃，5min预变性；变性95℃，1min，退火50℃，30s，延伸72℃，2min，共30个循环；72℃延伸10min，胶回收得到扩增片段，并进行测序；

第三步，将第二步得到的正确的扩增片段与pET30a载体连接，转化至BL21DE3表达菌株中，挑取阳性转化子，提取质粒经酶切鉴定后测序，最终得到重组产TB抗原的大肠杆菌。

实施例2利用实施例1得到的重组大肠杆菌发酵制备结核刺激抗原

第一步，种子液制备

挑取实施例1得到的重组大肠杆菌菌株接种到50mLLB培养基(含有50μg/mL卡那霉素50μl)中过夜培养15-16h(培养条件为：摇床内晃动培养，晃动速度为230rpm，培养温度为37℃)，得一级种子液；

锥形瓶(容积为1L)内加入250mlLB培养基(含有50μg/mL卡那霉素250μl)，将得到的一级种子按照10％的接种量接种到三角瓶内进行二级种子培养(培养条件：摇床内晃动培养，晃动速度为230rpm，培养温度为37℃)至OD₆₀₀为4-7，得到二级种子液；

第二步，发酵、诱导培养

a)在发酵培养前预先配制发酵培养基10L、补料培养基2L、氨水、10％消泡剂、10％磷酸备用；其中发酵培养基的配方为：葡萄糖40g/L，酵母粉50g/L，磷酸二氢钠4.2g/L，磷酸氢二钾8.7g/L，硫酸铵5.5g/L，硫酸镁2.5g/L，微量元素溶液2.2ml/L；补料培养基的配方为：葡萄糖1000g/L，酵母粉400g/L，磷酸二氢钠12.6g/L，磷酸氢二钾26g/L，硫酸铵16.5g/L，硫酸镁20g/L，微量元素溶液12ml/L；微量元素溶液配方：CoCl₂·6H₂O 2.1mg/L，MnCl₂·4H₂O13mg/L，H₃BO₃ 3mg/L，钼酸钠2.5mg/L，柠檬酸铁12.5mg/L，EDTA8.4mg/L。

b)在总体积为30L、培养体积为10L的发酵罐中注入10L发酵培养基进行实消，实消结束后，开启搅拌，将发酵培养基温度设置为37℃自动控制，并向罐体内充入无菌空气使罐体压力维持在0.05MPa；将第一步得到的二级种子液按5％接种量接种到发酵罐内进行发酵培养；

c)培养阶段：因前期大肠杆菌会代谢葡萄糖产生乙酸，使pH值下降，菌体正常的溶氧消耗水平会逐渐增加，此时应及时调节转速并进行氨水的补加、消泡剂的添加以免影响氧气的利用，使得溶氧浓度维持在40％左右，以氨水和磷酸水溶液调节，使pH维持在6.8-7.0水平；

d)诱导阶段：培养3.35h后，通过取样测得菌体OD₆₀₀值为5.0-7.0区间时，进行降温至16℃后添加浓度为0.5mM的IPTG，此时发酵培养基成分尚未消耗殆尽，维持溶氧浓度为30％水平，pH设置为自动控制(氨水和磷酸水溶液调节)维持在7.0-7.2水平；降温诱导7-8h后，出现溶氧升高的现象，此时培养基营养成分耗尽，pH开始升高，一方面因补料培养基呈酸性，另一方面可通过补料维持菌体的正常生长繁殖，通过设置溶氧与补料速率关联，以1.5～3.5mL/min的速度补加补料培养基，添加消泡剂(antifoam204，sigma)，将溶氧浓度控制在30％，发酵过程阶段各参数示意图如图1所示；

取样分析：在诱导开始后每隔3h取样进行测定菌体OD₆₀₀及湿重的测定，并留样30ml离心后称重，按1:20的比例选取pH为7.2 0.01M的磷酸盐缓冲液稀释送样电泳分析检测蛋白含量。同时取样2mL，采用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，采用HPLC外标法定量检测样品中葡萄糖、乙酸含量，结果如图3所示；

e)在诱导培养阶段，重组大肠杆菌的菌体湿重及OD₆₀₀值随着诱导时间的延长而增加；当诱导时间在16-18h时，菌体得率增加缓慢并趋于恒定，具体如图2所示；在诱导培养阶段，随着诱导时间的延长，菌体中结核分枝杆菌刺激抗原的表达量越来越大，具体情况如图4所示；

第三步，分离纯化

a)诱导培养结束后，收菌，离心分离得514.48g菌体，用pH为7.2的0.01mm磷酸盐缓冲液按照1:20(体积比)重悬菌体，混匀后于4℃、10000rpm条件下离心10min，收集菌体，完成菌体的一次洗涤；再次用pH为7.2的0.1mmPBS缓冲液按1:10体积比重悬菌体，混匀后于4℃、10000rpm条件下离心10min，收集菌体，完成菌体的二次洗涤；

b)首先选取缓冲体系为pH7.4的20mM PBS+50mM咪唑进行Ni柱纯化，通过上样、流穿、洗杂等步骤后，经20mM PBS+250mM咪唑解离透析至pH7.4的20mM PB中进行后处理，此时蛋白纯度约在70-80％；

c)经Ni柱纯化后的样品转移至缓冲体系为pH7.4的20mM PB中，经pH7.4的20mM PB+100mM NaCl进行洗杂，洗杂后通过pH7.4的20mM PB+200mM NaCl进行解离，此时样品未挂住，均在流穿样中，解离完成经0.22μm滤膜过滤后进行去内毒素亲和层析，蛋白纯度约在98.7％，结果如图5所示；

d)经DEAE纯化后的蛋白，经缓冲体系为pH7.4的20mM PB+300mM NaCl去内毒素亲和层析，通过一系列的上样流穿，最后经0.22μm滤膜过滤后，得到纯度不低于98％的蛋白，结果如图6所示。

e)对实施例1中纯化得到的结核分枝杆菌刺激抗原电泳分析，纯化后的结核分枝杆菌刺激抗原均能在23.1KDa获得醒目的条带，表明纯化成功，具体如图7所示。

f)将利用本方法获得的结核刺激抗原(优化后)与常规发酵(优化前)进行蛋白浓度测定，其结果如图8所示，说明所得蛋白纯度较高。

实施例3不同发酵培养基及微量元素验证报告

验证不同结核分枝杆菌刺激抗原培养基、不同微量元素溶液对菌体生长、蛋白表达的影响。

1、菌株准备：

甘油菌：实施例1制备的重组大肠杆菌

2、培养基配制：

1号培养基pH7.2(1L)

磷酸氢二钠：6g/L；磷酸二氢钾：7g/L；葡萄糖：5g/L；硫酸铵：3g/L；胰蛋白胨：2g/L；酵母提取物：5g/L；七水合硫酸镁：2g/L；

2号培养基pH7.2(1L)

葡萄糖：6g/L；胰蛋白胨：10g/L；酵母提取物：5g/L；氯化钠：5g/L；磷酸氢二钠：7g/L；磷酸二氢钾：2g/L；磷酸氢二钾：4g/L；氯化铵：1.5g/L；七水合硫酸镁：1g/L；

3号培养基pH7.2(1L)

葡萄糖40g/L，酵母粉50g/L，磷酸二氢钠4.2g/L，磷酸氢二钾8.7g/L，硫酸铵5.5g/L，硫酸镁2.5g/L；

微量金属混合液A1000ml

CoCl₂·6H₂O 2.1mg/L，MnCl₂·4H₂O 13mg/L，H₃BO₃ 3mg/L，钼酸钠2.5mg/L，柠檬酸铁12.5mg/L，EDTA8.4mg/L。

微量金属混合液B1000ml

CoCl₂·6H₂O 2.5mg/L，MnCl₂·4H₂O 15mg/L，CuCl₂·2H₂O 1.5mg/L，H₃BO₃3mg/L，钼酸钠2.5mg/L，乙酸锌13mg/L，柠檬酸铁12.5mg/L，EDTA8.4mg/L。

3、培养条件验证

3.1接菌：

接菌培养：三种不同的50ml培养基灼烧瓶口后分别加入50μl 50mg/ml的卡那霉素，然后接入50μl甘油菌，置于台式全温振荡器中，37℃、230rpm培养15-16h。

三种不同的250ml培养基灼烧瓶口后分别加入250μl 50mg/ml的卡那霉素，然后接入5ml过夜培养的菌液，置于落地式全温振荡器中，37℃、230rpm培养至OD值为0.8-1.0。

各无菌取样1ml于1.5ml灭菌离心管，4℃保存，送样电泳。

表1实验方案

	微量金属混合液A	微量金属混合液B
			1号培养基	1+A	1+B
2号培养基	2+A	2+B
			3号培养基	3+A	3+B

3.2、IPTG诱导：

加入1M IPTG 50ul至250ml菌液，终浓度0.2mM。16℃诱导培养6-8h后各无菌取样1ml于1.5ml灭菌离心管，4℃保存。

注：OD600小于1时取3ml菌液检测OD600，大于1时取1ml菌液检测，检测时稀释3倍。

4、各组蛋白表达结果如图9：

表2每L培养基培养细菌总蛋白表达量对比：

结果表明，微量元素在范围内的使用，对细菌生长、蛋白表达无抑制作用。从编号4、5对比来看，微量元素A对蛋白的得率具有明显的促进作用；从编号4、6对比来看，3号培养基较2号培养基作用最佳，从编号2、6对比来看，2号培养基较1号培养基效果最佳；总的来说，发酵最优培养基为编号4(3+A)。

实施例4分批培养与恒溶氧反馈高密度发酵培养对比

取实施例1制备的重组大肠杆菌，分别采用分批培养的方法以及恒溶氧反馈高密度发酵培养的方法进行效果比较。

1、培养方法

1.1分批培养培养基(pH7.4)：胰蛋白胨：12g/L；酵母提取物：24g/L；磷酸氢二钾：21g/L；磷酸二氢钾：3.84g/L；

维持培养温度为37℃，搅拌速度为200-350rpm，罐压0.05Mpa，溶氧40％，培养至OD600值为0.8-1.0进行诱导降温至16℃，诱导16h进行收菌；

1.2恒溶氧反馈高密度发酵培养：方法与实施例2中的步骤2相同。

培养效果如表3：

表3培养结果对比

通过数据分析，恒溶氧反馈高密度发酵培养单批收菌量平均值为514.48g，为分批培养的3.5倍；从单批得率上讲，现发酵工艺较原发酵工艺提升了2.98倍，并且蛋白的纯度也有了提升。

实施例5

结核患者淋巴细胞受刺激后可以分泌γ干扰素，首先静脉穿刺术采集全血样本，通过将阳性、阴性培养液及含结核分枝杆菌特异性抗原的培养液进行分装，37℃培养20±4h，收集细胞进行IFN-γ检测。

应用结核分枝杆菌特异性抗原(实施例2制得的重组蛋白，剂量为60μg/mL)刺激结核分枝杆菌感染者特异性T淋巴细胞并使其释放IFN-γ，通过(双抗夹心)IFN-γ包被抗体制备磁微粒混悬液，辣根过氧化物酶标记IFN-γ抗体制备酶结合物，通过免疫反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，从而催化底物发光，从而确定细胞分泌干扰素的量，从而确定是否为结核患者，通过TB-IGRA试剂诊断结核分枝杆菌感染的灵敏度为81.50％，特异度为55.74％，通过与结核菌素试验、细菌培养结果进行比较，该试剂的检出率均高于这两种方法，具有操作简单，特异性强的优势。

通过免疫反应形成抗体-抗原-酶标复合物，催化发光底物发出光子进行检测。重复性变异系数≤10.0％，线性相关系数r≥0.9900，具有较高的分析特异性，在IFN-γ含量为200IU/ml时，且不会出现HOOK效应。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 郑州伊美诺生物技术有限公司

<120> 一种结核分枝杆菌刺激抗原的制备方法

<130> MP1938131

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 207

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly Asn Phe Glu

1 5 10 15

Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln Val Glu Ser Thr

20 25 30

Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly Thr Ala Ala

35 40 45

Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys Gln Lys Gln

50 55 60

Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly Val Gln Tyr

65 70 75 80

Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser Gln Met Gly

85 90 95

Phe Arg Leu His Arg Glu Phe Gln Asn Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn

100 105 110

Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr

115 120 125

Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu

130 135 140

Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln

145 150 155 160

Gln Lys Gln Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn

165 170 175

Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu

180 185 190

Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala Tyr Gly Asn Ala Glu Phe Ala

195 200 205

<210> 2

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atcgcagaga tgaagaccga tgccgctacc ctcgcgcagg aggcaggtaa tttcgagcgg 60

atctccggcg acctgaaaac ccagatcgac caggtggagt cgacggcagg ttcgttgcag 120

ggccagtggc gcggcgcggc ggggacggcc gcccaggccg cggtggtgcg cttccaagaa 180

gcagccaata agcagaagca ggaactcgac gagatctcga cgaatattcg tcaggccggc 240

gtccaatact cgagggccga cgaggagcag cagcaggcgc tgtcctcgca aatgggcttc 300

tgattgcatc gggaattcca aaacatgaca gagcagcagt ggaatttcgc gggtatcgag 360

gccgcggcaa gcgcaatcca gggaaatgtc acgtccattc attccctcct tgacgagggg 420

aagcagtccc tgaccaagct cgcagcggcc tggggcggta gcggttcgga ggcgtaccag 480

ggtgtccagc aaaaatggga cgccacggct accgagctga acaacgcgct gcagaacctg 540

gcgcggacga tcagcgaagc cggtcaggca atggcttcga ccgaaggcaa cgtcactggg 600

atgttcgcat acggcaacgc cgagttcgcg tagaatagcg aaacacggga t 651

Claims

1.结核分枝杆菌刺激抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述结核分枝杆菌刺激抗原的多核苷酸。

3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种核酸载体，包括权利要求2或3所述的多核苷酸。

5.根据权利要求4所述的核酸载体，其特征在于，其骨架载体为pET30a。

6.重组宿主，转化有权利要求4或5所述的核酸载体。

7.根据权利要求6所述的重组宿主，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌。

8.结核分枝杆菌刺激抗原的制备方法，包括：培养权利要求6或7所述的重组宿主，诱导结核分枝杆菌刺激抗原的表达。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，

所述培养步骤的条件为：37℃，压力0.05Mpa，溶氧40％，搅拌速度为200-400rpm；以氨水调节pH值为6.8～7.0，培养至OD₆₀₀值为5.0～7.0；

10.根据权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于，

所述诱导步骤具体包括：

16℃，以浓度为0.5mM的IPTG诱导，溶氧浓度为30％，搅拌速度为275～350rpm，pH值为7.0～7.2；

诱导7～8h后，以1.5～3.5mL/min的速度补加补料培养基，搅拌速度为275-350rpm，溶氧浓度为30％；

补料培养基包括水和葡萄糖1000g/L，酵母粉400g/L，磷酸二氢钠12.6g/L，磷酸氢二钾26g/L，硫酸铵16.5g/L，硫酸镁20g/L，微量元素溶液12ml/L。

11.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，所述微量元素溶液包括水和CoCl₂·6H₂O 2.1mg/L，MnCl₂·4H₂O 13mg/L，H₃BO₃3mg/L，钼酸钠2.5mg/L，柠檬酸铁12.5mg/L，EDTA8.4mg/L。

12.权利要求1所述的结核分枝杆菌刺激抗原或权利要求8～11任一项所述方法制备的抗原在制备刺激γ-干扰素产生的试剂中的应用。