CN115184593A - 一种基于tp0136nh亚型的神经梅毒诊断试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，公开一种基于TP0136NH亚型的神经梅毒诊断试剂盒，包括以下组分：(1)样本稀释液；(2)NanoLuc荧光素酶和梅毒螺旋体Nichols Houton株TP0136蛋白组成的融合蛋白液；(3)proteinA/G包被的酶标板；(4)洗涤液；(5)荧光素酶底物。本发明利用分子生物学基因克隆表达技术，获得梅毒螺旋体Nichols Houton株TP0136重组蛋白，建立检测梅毒螺旋体Nichols Houton株TP0136抗体的神经梅毒诊断方法，并组装成试剂盒，基于神经梅毒感染者脑脊液中Nichols Houton株TP0136抗体水平来区分是否为神经梅毒患者，有利于指导临床合理用药，避免过度腰穿，为神经梅毒的诊治提供一种快速、简便的检测方法。

Description

一种基于TP0136NH亚型的神经梅毒诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体地说是一种基于TP0136NH亚型的神经梅毒诊断试 剂盒。
背景技术
神经梅毒是指梅毒螺旋体侵入中枢神经系统造成脑膜、大脑、血管或脊髓等损害。神 经梅毒危害大，可造成脑膜炎、脑卒中、麻痹性痴呆、失明、甚至死亡等严重后果。
由于神经梅毒早期症状轻微，晚期临床表现不特异，因此神经梅毒的诊断更主要依靠 脑脊液的实验室检测。作为神经梅毒脑脊液诊断“金标准”的性病研究实验室试验(venereal disease research laboratory test,VDRL)，特异性90％，敏感性仅为50％，因此VDRL阴性无 法排除神经梅毒。此外，由于存在生物学假阳性问题(即非梅毒患者出现VDRL阳性)， 进一步限制该方法在神经梅毒诊断中的应用。而其他常用的脑脊液检测方法，或不敏感、 或不特异，因此造成神经梅毒诊断困难、误诊率高。一项回顾性研究显示，脑脊液检测神 经梅毒的误诊率高达84.6％(126/149)。
荧光素酶免疫共沉淀系统(luciferase immunoprecipitation system,LIPS)通过在哺乳动 物细胞中将荧光素酶与抗原进行融合表达，以测定血清中未知抗体的检测技术。LIPS将抗 原与荧光素酶融合表达，血清中抗体与抗原特异性结合，抗体再与大颗粒物质protein A/G plus agarose结合，三者形成复合物，通过分析复合物上的荧光素酶与底物作用时荧光强度， 以评估血清中的抗体水平。LIPS系统选择在哺乳动物细胞表达会形成空间构象抗原，可以 提高检测效率。同时该系统采用的抗原不需要经过纯化，简化了实验步骤。因此，LIPS系 统广泛用于多种自身免疫性疾病和病原体检测。然而LIPS采用单管操作，无法实现高通量 检测，实验费时。
因此，亟需开发一种基于TP0136NH亚型的神经梅毒诊断试剂盒。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于TP0136NH亚型的神经梅毒诊断试剂盒。 利用分子生物学基因克隆表达技术，获得梅毒Nichols Houton株TP0136重组蛋白，建立检测 Nichols Houton株TP0136抗体的荧光素酶免疫共沉淀方法，并组装成试剂盒，基于神经梅毒 感染者Nichols Houton株TP0136抗体水平来区分神经梅毒，有利于指导临床合理用药，避免 过度腰穿，为神经梅毒的诊治提供一种快速、简便的检测方法。
本发明为实现上述目的，采取以下技术方案予以实现：
一种基于TP0136NH亚型的神经梅毒诊断试剂盒，包括以下组分：
(1)样本稀释液；
(2)NanoLuc荧光素酶和梅毒螺旋体Nichols Houton株TP0136抗原组成的融合蛋白液；
(3)proteinA/G包被的酶标板；
(4)洗涤液；
(5)荧光素酶底物。
优选地，所述样本稀释液为2％脱脂牛奶。
优选地，所述融合蛋白液通过以下方法制备而成：
a、以Nichols Houton株TP0136抗原基因序列为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物经凝 胶电泳及核酸纯化获得Nichols Houton株TP0136抗原基因片段；
b、将获得的Nichols Houton株TP0136抗原基因片段与NanoLuc荧光素酶基因的pNLF1 载体质粒分别进行Eco RⅠ和XbaⅠ双酶切，并使用T4连接酶将酶切产物连接得到重组质粒；
c、将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，通过菌液PCR筛选转基因阳性菌；
d、在200ml LB液体培养基中扩繁转基因阳性菌，并用质粒提取试剂盒提取重组质粒；
e、通过琼脂糖凝胶电泳验证步骤d提取重组质粒的质量，通过紫外分光光度计检测提 取重组质粒的纯度和浓度；
f、在10cm2细胞培养皿中培养He La细胞，当细胞铺板率达到80～90％时，以脂质体核 酸转染试剂：步骤d所得重组质粒按照3μL:1μg的比例进行转染，37℃、5％CO2培养箱中培 养48～72h，弃细胞培养液，并加入5ml 0.01M、pH7.4的磷酸缓冲液用细胞刮刀将细胞收 集至15ml离心管中，最后将细胞收集液在冰浴中超声处理15～30min得细胞裂解液，然后将 细胞裂解液于4℃，12000rpm离心15～45min，弃沉淀，收集上清液即为融合蛋白；
g、将上述所得融合蛋白用0.01M、pH7.4的PBS磷酸盐缓冲液稀释得融合蛋白液，要求 融合蛋白液每10μL中有107个荧光单位，-20℃保存备用。
融合蛋白液是稀释后的融合蛋白，这个稀释液也就是细胞裂解液，只是在细胞裂解之 前要要保证融合蛋白的浓度，所以用量少。裂解后再调整至使用浓度，调整浓度后的融合 蛋白液再放置试剂盒中，这样试剂盒检测过程就方便了(不需要再去检测蛋白的浓度)。
优选地，步骤a中，PCR扩增的引物为：
上游引物：5'-ATGACGTGCGATTTCACTGG-3'，
下游引物：5'-CTCGCGGTTCCAGGAGCACG-3'。
优选地，所述proteinA/G包被的酶标板的制备方法如下：
a、proteinA/G用0.01M、pH7.4PBS溶解为1μg/mL的浓度；
b、按照100μL/孔将上述proteinA/G溶液加入酶标板中，酶标板覆膜，4℃孵育12～16h；
c、弃proteinA/G溶液，300μL/孔用0.1％PBST洗3次，4℃保存。
优选地，所述洗涤液配置方法为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.63g，KH2PO4 0.24g，加水定容至1L，灭菌。
优选地，所述荧光素酶底物为Promega公司的furimazine荧光素酶底物。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明采用荧光素酶免疫共沉淀法，根据荧光强度可以用于神经梅毒诊断，该方法快 速简便、高灵敏度、高信噪比，测量值稳定可靠。
本发明通过检测Nichols Houton株TP0136抗体水平用于神经梅毒诊断，弥补了神经梅毒 诊断检测方法的空白；具有检测通量大、结果确切、灵敏度高、操作简单的特点，易于推 广。
本发明在LIPS基础上进行优化，采用ELISA板包被的双抗原夹心法，将protein A/G plus agarose包被ELISA白板上，血清中抗体先与protein A/G plus agarose结合，含荧光素酶抗原 再与血清中抗体特异性结合。改良的LIPS实现高通量检测血清抗体的特点，其敏感性高于 EIA的104倍，还可进行定量检测(定量范围从25pg/mL～107pg/mL)，因此更符合临床大样 本检测需求。
附图说明
图1是本实施例200例梅毒患者脑脊液中Nichols Houton株TP0136抗体水平经Kruskal-Wallis H检验的统计学差异性；
图2是脑脊液中Nichols Houton株TP0136抗体水平根据最大约登指数选择最佳截断值用 于神经梅毒的预测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但需要说明的是，实施例并不对本发明要 求保护范围的构成限制。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常规的。下 述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例
一种基于TP0136NH亚型(即Nichols Houton株TP0136蛋白)的神经梅毒诊断试剂盒， 包括以下组分：(1)样本稀释液；(2)NanoLuc荧光素酶和梅毒螺旋体Nichols Houton株TP0136 抗原组成的融合蛋白液；(3)proteinA/G包被的酶标板；(4)洗涤液；(5)荧光素酶底物。
其中，样本稀释液为2％脱脂牛奶。
融合蛋白液通过以下方法制备而成：
a、以Nichols Houton株TP0136抗原基因序列为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物经凝 胶电泳及核酸纯化获得Nichols Houton株TP0136抗原基因片段；
b、将获得的Nichols Houton株TP0136抗原基因片段与NanoLuc荧光素酶基因的pNLF1 载体质粒分别进行Eco RⅠ和XbaⅠ双酶切，并使用T4连接酶将酶切产物连接得到重组质粒；
c、将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，通过菌液PCR筛选转基因阳性菌；
d、在200ml LB液体培养基中扩繁转基因阳性菌，并用质粒提取试剂盒(PlasmidPlus Midi Kit，Qiagen)提取重组质粒；
e、通过琼脂糖凝胶电泳验证步骤d提取重组质粒的质量(条带无拖尾现象，条带大小正 确)，通过紫外分光光度计检测提取重组质粒的纯度和浓度(OD260/OD280＝1.8～2.0时纯度 高，质粒浓度ng/ml＝OD260×50ng/ml×稀释倍数)；
f、在10cm2细胞培养皿中培养He La细胞，当细胞铺板率达到80～90％时，以脂质体核 酸转染试剂(lipofectamine 2000，invitrogen)：步骤d所得重组质粒按照3μL:1μg的比例进行转 染，37℃、5％CO2培养箱中培养48～72h，弃细胞培养液，并加入5ml 0.01M、pH7.4的磷 酸缓冲液用细胞刮刀将细胞收集至15ml离心管中，最后将细胞收集液在冰浴中超声处理 15～30min得细胞裂解液，然后将细胞裂解液于4℃，12000rpm离心15～45min，弃沉淀， 收集上清液即为融合蛋白；
g、将上述所得融合蛋白用0.01M、pH7.4的PBS磷酸盐缓冲液稀释得融合蛋白液，要求 融合蛋白液每10μL中有107个荧光单位，-20℃保存备用。
融合蛋白液是稀释后的融合蛋白，这个稀释液也就是细胞裂解液，只是在细胞裂解之 前要要保证融合蛋白的浓度，所以用量少。裂解后再调整至使用浓度，调整浓度后的融合 蛋白液再放置试剂盒中，这样试剂盒检测过程就方便了(不需要再去检测蛋白的浓度)。
上述步骤a中，PCR扩增的引物为：
上游引物：5'-ATGACGTGCGATTTCACTGG-3'，
下游引物：5'-CTCGCGGTTCCAGGAGCACG-3'。
proteinA/G包被的酶标板的制备方法如下：
a、proteinA/G用0.01M、pH7.4PBS溶解为1μg/mL的浓度；
b、按照100μL/孔将上述proteinA/G溶液加入酶标板中，酶标板覆膜，4℃孵育12～16h；
c、弃proteinA/G溶液，300μL/孔用0.1％PBST洗3次，4℃保存。
洗涤液配置方法为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.63g，KH2PO4 0.24g，加水 定容至1L，灭菌。
荧光素酶底物为Promega公司的furimazine荧光素酶底物。
下面对本实施例的一些细节作详细介绍：
1、梅毒螺旋体Nichols Houton株的培养和基因组DNA的提取
将梅毒螺旋体Nichols Houton株接种于3月龄新西兰兔睾丸，接种前保证每只兔的梅 毒血清学试验检测结果阴性，予以不含抗生素的饲料和水喂养，4周后无菌取兔睾丸浸于 无菌生理盐水并清洗后，用无菌剪刀将睾丸组织剪碎后置于EP管中，通过暗视野显微镜 鉴定，若发现白色、折光力强、纤细的螺旋状微生物，螺旋整齐，具有蛇行、旋转、伸缩 等缓慢而规律的运动方式，即可判为梅毒螺旋体。
经鉴定后的组织样本按照基因组DNA提取试剂盒说明书操作：(1)在EP管中按1:1比例加入Buffer ATL使组织细胞裂解；(2)吸取20μl蛋白酶K加入EP管；(3)加 入200μl样本充分混匀；(4)加入200μl Buffer AL，涡旋振荡15s充分混匀；(5)56℃ 孵育10min；(6)10000rpm离心2min，取上清；(7)加入200μl无水乙醇，涡旋振荡 15s充分混匀，取上清；(8)将上清转移至吸附柱，8000rpm离心1min；(9)弃去滤液 和收集管，将吸附柱放入新的收集管，加入500μl Buffer AW1，8000rpm离心1min；(10) 弃去滤液和收集管，将吸附柱放入新的收集管，加入500μl Buffer AW2，14000rpm离心 3min；(11)弃去滤液和收集管，将吸附柱放入新的收集管，14000rpm离心1min；(12) 弃去滤液和收集管，将吸附柱放入新的收集管，开盖3min；(13)向吸附柱内悬空滴加30μl Buffer AE，室温静置1min，8000rpm离心1min，-20℃保存。
2、PCR扩增
(1)引物的设计与合成
从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中查询Nichols Houton株TP0136的 基因序列(NC_000919)，根据引物设计原则，结合载体质粒pNLF1-N酶切位点，利用Primer Premier 6.0软件遵循引物设计原则设计引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
(2)PCR扩增
以梅毒螺旋体DNA为模板，以Nichols Houton株TP0136为引物，PCR反应总体积为20μl， 扩增体系如下：
1)DNA模板0.2μl
2)Upstream Primer(P1)0.4μl
3)Downstream Primer(P2)0.4μl
4)ddH2O 9μl
5)
Figure BDA0003474601390000061
HS DNA Polymerase 10μl
扩增体系总体积20μl。以上操作需在冰上进行，旋涡振荡混匀后短暂离心。PCR扩增 参数设置：94℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火2min，72℃延伸1min，共45 个循环；最后72℃延伸10min，终止反应。扩增产物取5μl，通过1.0％琼脂糖凝胶电 泳检测扩增结果，剩余产物保存于-20℃冰箱备用。
(3)PCR扩增产物初步鉴定
取5μl PCR产物加入1μl 6×loading buffer，混匀，以100V电压在1.0％琼脂糖凝胶 中进行电泳，电泳结束后，置于凝胶成像系统中进行观察，并保存结果。
3、真核表达体系pNLF1-N-TP0136构建
将纯化回收后Nichols Houton株TP0136PCR扩增产物与pNLF1-N载体分别经Eco RⅠ和XbaⅠ双酶切后进行连接，构建重组质粒pNLF1-N-TP0136。
(1)pNLF1-N质粒双酶切，酶切反应体系40μl，反应体系如下：
1)pNLF1-N 12μl
2)Eco RⅠ2μl
3)XbaⅠ2μl
4)10×Buffer 4μl
5)ddH2O 20μl
反应体系总体积40μl。振荡混匀后置于水浴锅内反应2h。
(2)pNLF1-N经Eco RⅠ和XbaⅠ双酶切，酶切反应体系40μl，反应体系如下：
1)pNLF1-N 12μl
2)Eco RⅠ2μl
3)XbaⅠ2μl
4)10×Buffer 4μl
5)ddH2O 20μl
反应体系总体积40μl。振荡混匀后置于水浴锅内反应2h。
(3)PCR回收产物双酶切，酶切反应体系40μl，反应体系如下：
1)Nichols Houton株TP0136回收产物 18μl
2)Eco RⅠ 2μl
3)XbaⅠ 2μl
4)10×Buffer 4μl
5)ddH2O 14μl
反应体系总体积40μl。振荡混匀后置于水浴锅内反应2h。
酶切结束后应用DNA纯化回收试剂盒对目的片段进行回收，操作步骤遵循试剂盒说 明书。
应用分光光度计检测目的片段回收产物的浓度，根据载体与待连接的目的片段摩尔比 为1:6，连接反应体系15μl，反应体系如下：
1)酶切后的pNLF1-N 5.5μl
2)酶切后的目的片段 2μl
3)DNA Ligation solution 7.5μl
反应体系总体积15μl，振荡混匀，16℃连接12h。
4、连接产物的转化
(1)从-80℃冰箱中取出E.coli DH5α感受态细胞100μl，置于冰中；
(2)预热水浴锅至42℃；
(3)加入连接产物5μl至E.coli DH5α感受态细胞，轻轻混匀，冰上孵育30min；
(4)42℃热激感受态细胞90s；
(5)立即转移至冰上放置2min；
(6)加入800μl 37℃预温好的无抗性LB液体培养基；
(7)37℃200rpm摇床中复苏1小时；
(8)在超净工作台中，取100μl均匀涂抹于含氨苄青霉素的LB培养基，37℃倒置 孵育过夜。
5.重组菌的筛选鉴定
(1)挑选10个单个菌落接种于500μl含有AMP的LB液体培养基中，37℃ 150rpm摇床中培养5h；
(2)重组菌的PCR鉴定：用PCR扩增验证转化子，扩增体系如下：
1)菌液 1μl
2)Upstream primer(P1) 0.2μl
3)Downstream primer(P2) 0.2μl
4)Taq DNA Polymerase 5μl
5)ddH2O 3.6μl
总体积10μl。
PCR扩增参数设置：94℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火2min，72℃延伸1min，共45个循环；最后72℃延伸10min，终止反应。扩增产物取5μl，通过1.0％ 琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。取5μl PCR产物加入1μl 6×loading buffer，混匀，以100V 电压在1.0％琼脂糖凝胶中进行电泳。将转化正确的菌液取5μl接种于含有AMP的LB 液体培养基，37℃200rpm培养过夜。
(3)重组质粒的提取：按照质粒小提试剂盒说明书进行操作：1)取5ml菌液，12000rpm 离心1min，弃去上清液；2)向装有菌体沉淀的EP管中加入150μl溶液P1，涡旋振荡混匀；3)向EP管中加入150μl溶液P2，温和翻转使菌体裂解；4)向EP管中加入300μl 溶液P5，立即温和翻转使充分混匀。12000rpm离心2min；5)收集上清液加入吸附柱CP3 内，12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液；6)向吸附柱CP3内加入300μl漂洗液 PW，12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液，重复此步骤；7)将吸附柱CP3放入收 集管中，12000rpm离心2min；8)吸附柱CP3开盖后放置于室温5min晾干吸附柱内残 余漂洗液；9)将吸附柱CP3置于新的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50μl洗脱缓冲 液EB，室温放置5min，12000rpm离心2min，将离心后得到的溶液重新加入吸附柱内， 再次离心以增加回收效率。
(4)重组质粒分别进行Eco RⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定。
6.序列测定
由上海生工生物科技有限公司对重组质粒pNLF1-N-TP0136碱 基序列进行检测。测序结果通过BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi)与已公布的基因序列进行比对。
7.细胞转染(脂质体介导法)
(1)转染前1d接种He La细胞，细胞融合度达80％时进行转染；
(2)A液50μl：4μl Lipofectamine 3000+46μl Opti-MeM，B液50μl：3μl P3000+ 重组质粒+Opti-MeM；
(3)将A、B液混合后静置5min；
(4)每孔加入A、B混合液和900μl Opti-MeM，混匀，37℃培养48h。
8.细胞裂解物的制备：
(1)从待测细胞孔中将培养液吸出，用PBS仔细漂洗2次，Trypsin 37℃消化2min，1ml培养液终止消化；
(2)将细胞吸入离心管中，1500rpm离心5min，弃上清；
(3)加入500μl PBS漂洗，12000rpm离心1min，弃上清；
(4)加入150μl/孔裂解液放置30min。12000rpm离心4min，取上清。细胞裂解物 于-80℃保存。
9.包板：
(1)96孔白板中每孔加入50μl protein G(5μg/ml)，4℃包被过夜。PBST洗板1次；
(2)封闭：每个包被孔中加入300μl封闭液(5％脱脂牛奶)，37℃孵育1h。
10.试剂盒的检测操作流程如下：
(1)加样：每孔中加入50μl神经梅毒患者脑脊液，每个样本重复3个孔，同时设 置阳性对照、阴性对照、空白对照；
(2)孵育：37℃恒温箱孵育1h；
(3)洗板：洗涤液洗板5次；
(4)加裂解液：每孔加入50μl以1:100样本稀释液稀释后的Nichols Houton株TP0136 裂解液；
(5)孵育：37℃恒温箱孵育30min；
(6)洗板：洗涤液洗板5次；
(7)显色：避光，每孔中加入50μl furimazine荧光素酶底物；
(8)结果判读：使用Gaomax荧光光度计读取样本荧光值(light units，LU)。
11.本发明试剂盒的诊断效能评价
根据患者临床症状、体征和血清、脑脊液检查结果将200例梅毒患者分为神经梅毒组、 可疑神经梅毒组和非神经梅毒组，其中神经梅毒组46例，可疑神经梅毒组23例，非神经梅毒组131例，分别应用本发明试剂盒对三组患者的脑脊液进行检测。神经梅毒患者的诊断标准为脑脊液中VDRL阳性的任何阶段梅毒患者。可疑神经梅毒患者的诊断标准为任何阶段的梅毒患者，脑脊液VDRL试验阴性，并且符合以下两项：(1)脑脊液FTA-ABS 阳性和(2)脑脊液WBC计数升高(>5/ul)或脑脊液蛋白浓度升高(>45mg/dl)或有与神 经梅毒相符合的神经系统症状，排除由其他疾病引起。
研究结果显示：
(1)脑脊液中Nichols Houton株TP0136抗体水平经Kruskal-Wallis H检验：神经梅毒＞可 疑神经梅毒＞非神经梅毒，三者有统计学差异(如图1所示，其中***P<0.001；**P<0.01；* P<0.05)；
(2)根据最大约登指数(灵敏度+特异度-1)确定最佳截断值，当脑脊液中NicholsHouton 株TP0136抗体水平的截断值选择大于7，其曲线下面积(AUC)为0.898，敏感性为75.4％， 特异性为89.3％，阳性预测值(PPV)为78.8％，阴性预测值为(NPV)为87.3％，预测准确率(Agreement)为84.5％。具体结果见图2；
(3)利用logistic回归方程，结合患者年龄、性别、有无神经系统症状、血清TRUST及 脑脊液中Nichols Houton株TP0136抗体水平能够进一步提高神经梅毒预测的准确率至93.3％。
预测公式为：ln(P/1-P)＝-16.840+0.06×年龄+1.009×性别+3.967×有无神经系 统症状+0.082×血清TRUST+1.621×脑脊液中Nichols Houton株TP0136抗体水平。
其中，年龄以患者具体年龄赋值；性别：男性赋值为1，女性赋值为0；有神经系统症状赋值为1，无神经系统症状赋值为0；血清TRUST以检测到的具体数值赋值；脑脊液中Nichols Houton株TP0136抗体水平以本发明试剂盒检测到的具体数值赋值。
根据预测公式，其敏感性为89.2％，特异性为95.6％，阳性预测值(PPV)为92.1％，阴性预测值为(NPV)为94.0％，预测准确率(Agreement)为93.3％。
可以看出，本发明用于神经梅毒诊断中，和VDRL相比(敏感性仅为50％)，敏感性高。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本 发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明 实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式 以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (7)

1.一种基于TP0136NH亚型的神经梅毒诊断试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
(1)样本稀释液；
(2)NanoLuc荧光素酶和梅毒螺旋体Nichols Houton株TP0136蛋白组成的融合蛋白液；
(3)proteinA/G包被的酶标板；
(4)洗涤液；
(5)荧光素酶底物。
2.根据权利要求1所述的一种基于TP0136NH亚型的神经梅毒诊断试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液为2％脱脂牛奶。
3.根据权利要求1所述的一种基于TP0136NH亚型的神经梅毒诊断试剂盒，其特征在于，所述融合蛋白液通过以下方法制备而成：
a、以Nichols Houton株TP0136抗原基因序列为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物经凝胶电泳及核酸纯化获得Nichols Houton株TP0136抗原基因片段；
b、将获得的Nichols Houton株TP0136抗原基因片段与NanoLuc荧光素酶基因的pNLF1载体质粒分别进行Eco RⅠ和XbaⅠ双酶切，并使用T4连接酶将酶切产物连接得到重组质粒；
c、将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，通过菌液PCR筛选转基因阳性菌；
d、在200ml LB液体培养基中扩繁转基因阳性菌，并用质粒提取试剂盒提取重组质粒；
e、通过琼脂糖凝胶电泳验证步骤d提取重组质粒的质量，通过紫外分光光度计检测提取重组质粒的纯度和浓度；
f、在10cm2细胞培养皿中培养He La细胞，当细胞铺板率达到80～90％时，以脂质体核酸转染试剂：步骤d所得重组质粒按照3μL:1μg的比例进行转染，37℃、5％CO2培养箱中培养48～72h，弃细胞培养液，并加入5ml 0.01M、pH7.4的磷酸缓冲液用细胞刮刀将细胞收集至15ml离心管中，最后将细胞收集液在冰浴中超声处理15～30min得细胞裂解液，然后将细胞裂解液于4℃，12000rpm离心15～45min，弃沉淀，收集上清液即为融合蛋白；
g、将上述所得融合蛋白用0.01M、pH7.4的PBS磷酸盐缓冲液稀释得融合蛋白液，要求融合蛋白液每10μL中有107个荧光单位，-20℃保存备用。
4.根据权利要求1所述的一种基于TP0136NH亚型的神经梅毒诊断试剂盒，其特征在于，步骤a中，PCR扩增的引物为：
上游引物：5'-ATGACGTGCGATTTCACTGG-3'，
下游引物：5'-CTCGCGGTTCCAGGAGCACG-3'。
5.根据权利要求1所述的一种基于TP0136NH亚型的神经梅毒诊断试剂盒，其特征在于，所述proteinA/G包被的酶标板的制备方法如下：
a、proteinA/G用0.01M、pH7.4 PBS溶解为1μg/mL的浓度；
b、按照100μL/孔将上述proteinA/G溶液加入酶标板中，酶标板覆膜，4℃孵育12～16h；
c、弃proteinA/G溶液，300μL/孔用0.1％PBST洗3次，4℃保存。
6.根据权利要求1所述的一种基于TP0136NH亚型的神经梅毒诊断试剂盒，其特征在于，所述洗涤液配置方法为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.63g，KH2PO4 0.24g，加水定容至1L，灭菌。
7.根据权利要求1所述的一种基于TP0136NH亚型的神经梅毒诊断试剂盒，其特征在于，所述荧光素酶底物为Promega公司的furimazine荧光素酶底物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN116042678A (zh) * 2023-02-08 2023-05-02 南方医科大学皮肤病医院（广东省皮肤病医院、广东省皮肤性病防治中心、中国麻风防治研究中心） 一种用于检测神经梅毒的融合蛋白及其试剂盒
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