CN112129952A - 一种检测人可溶性cd14的化学发光试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测人可溶性CD14的化学发光试剂盒，包括吖啶酯标记76‑G3‑G5检测抗体、生物素标记8‑A8‑B8捕获抗体；所述吖啶酯标记76‑G3‑G5检测抗体是将单克隆抗体76‑G3‑G5通过吖啶酯标记后制得，所述单克隆抗体76‑G3‑G5是由杂交瘤细胞株76‑G3‑G5分泌获得；所述生物素标记8‑A8‑B8捕获抗体是先将单克隆抗体8‑A8‑B8利用生物素标记，然后再与包埋有亲和素的磁珠结合后制得，所述单克隆抗体8‑A8‑B8是由杂交瘤细胞株8‑A8‑B8分泌获得。在制备筛选杂交瘤细胞株时采用质粒免疫和蛋白免疫相结合的方式，检测灵敏度高、特异性好、线性范围宽、精密度高、稳定性好，操作安全，方法简便快速。

Description

一种检测人可溶性CD14的化学发光试剂盒
技术领域
本发明属于人可溶性CD14(Presepsin)的检测技术领域，特别是一种检测人可溶性 CD14的化学发光试剂盒。
背景技术
脓毒症发生率高，全球每年有超过1800万严重脓毒症病例，并且这一数字还以每年 1.5％～8.0％的速度上升。脓毒症的病情凶险，病死率高，全球每天约14,000人死于其并发症。据流行病学调查显示，脓毒症的病死率已经超过心肌梗死，成为重症监护病房内非心脏病人死亡的主要原因。近年来，尽管抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，脓毒症的病死率仍高达30％～70％。脓毒症治疗花费高，医疗资源消耗大，严重影响人类的生活质量，已经对人类健康造成巨大威胁。脓毒血症所致的反应是一个非常复杂的连锁过程，涉及促炎和抗炎过程，体液反应和细胞反应以及血流动力学异常。随着人口老龄化，侵入性操作增加和耐药微生物的持续出现，脓毒症的发生率不断上升。早期诊断脓毒血症有助于快速治疗、改善预后和减少不必要的抗生素治疗。目前，对于脓毒血症的诊断没有理想的金标准，因为微生物学阳性率低，常规实验室检查没有特异性。生物标志物可以在这个过程中发挥重要作用，因为它们可以指示脓毒血症的存在或不存在或严重程度，指导临床医生作出快速诊断，选择合理高效的治疗方案。
PCT(降钙素原)诊断脓毒症敏感度和特异度跨度较大，并不能有效区分是细菌感染还是非细菌感染引起的全身炎性反应综合征。Presepsin又称sCD14-ST。CD14分为膜性CD14(m-CD14)和可溶性CD14(s-CD14)。mCD14是细胞膜上的一种糖蛋白，是脂多糖和脂多糖结合蛋白的受体，可以激活PTK和MAPK通路，引起炎症反应，激活凝血和纤溶系统，引起脓毒血症、脓血性休克、弥散性血管内凝血(DIC)、(多器官功能障碍综合征) MODS。Presepsin产生的主要起因是细菌入侵，许多细菌产物，包括革兰阳性(G+)菌细胞壁的主要成分肽聚糖，革兰阴性(G-)菌细胞壁的内毒素脂多糖(LPS)和脂多糖结合蛋白(LBP)作为受体与mCD14结合，脱落至血浆形成sCD14，随后被蛋白酶组织酶D等蛋白酶水解成sCD14-ST。脓毒血症患者Presepsin水平显著高于局部感染者，Presepsin早期诊断价值更高，可有效区分是细菌感染还是非细菌感染引起的全身炎性反应综合征，同时Presepsin的诊断准确度高于PCT。因此，Presepsin作为新的感染相关生物学指标在脓毒症早期诊断和指导治疗方面具有显著优势。
目前，临床有多种生物标志物，如血清降钙素原(PCT)、C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、髓系细胞表达的触发受体-1(TREM-1)等用于单独或联合诊断脓毒血症。其中以PCT在国内外研究最多、最广，但在严重创伤、大面积烧伤、器官移植、胰腺炎、外科手术等非感染的SIRS患者中，PCT浓度也可升高。因此，PCT的诊断性能较低，其诊断脓毒症的敏感性和特异性的均值均为7l％(95％可信区间为67％～ 76％)，故PCT不能单独在急危重患者中用来鉴别脓毒血症，必须要结合其他指标综合评估、诊断。通常情况在临床上对疑似感染而发热的患者，根据外周血白细胞计数(WBC)、中性粒百分比(Neu％)的结果来初步判断是否存在细菌感染。实际上，外周血白细胞计数、中性粒百分比的高低易受诸多因素的影响，机体受感染的程度及感染时的免疫状态都会使其变化，所以特异性和敏感性都有较大的局限性。
针对Presepsin这一新型脓毒症标志物，可有效的区分局部感染和脓毒血症，较PCT 在诊断脓毒血症效能上更高，可以作为早期诊断脓毒血症的有效指标。目前国内尚无厂家有相关产品上市，因此开发一种具有核心原料的化学发光诊断试剂盒具有非常重要的意义。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种检测人可溶性CD14的化学发光试剂盒，具体通过以下技术实现。
一种检测人可溶性CD14的化学发光试剂盒，包括吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体、生物素标记8-A8-B8捕获抗体；
所述吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体是将单克隆抗体76-G3-G5通过吖啶酯标记后制得，所述单克隆抗体76-G3-G5是由杂交瘤细胞株76-G3-G5分泌获得；
所述生物素标记8-A8-B8捕获抗体是先将单克隆抗体8-A8-B8利用生物素标记，然后再与包埋有亲和素的磁珠结合后制得，所述单克隆抗体8-A8-B8是由杂交瘤细胞株8-A8-B8 分泌获得；
所述杂交瘤细胞株76-G3-G5保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号为 CCTCC NO：C2020139，保藏日期2020年08月11日，保藏地址是中国.武汉.武汉大学；所述杂交瘤细胞株8-A8-B8保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号为CCTCC NO：C2020140，保藏日期2020年08月11日，保藏地址是中国.武汉.武汉大学。
除上述试剂以外，上述化学发光试剂盒还包括市面上常用的人工合成人可溶性CD14 标准品、人工合成人可溶性CD14质控品、磷酸盐(PBS)缓冲液、吖啶酯标记碳酸盐(CBS) 缓冲液、生物素标记碳酸盐(CBS)缓冲液、稀释生物素标记的抗体试剂缓冲液R1、稀释吖啶酯标记的抗体试剂缓冲液R2、磁珠及磁珠稀释液、标准品和质控品稀释液；
上述试剂盒中，吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体、生物素标记8-A8-B8捕获抗体已与2020年08月17日保存至中国典型培养物保藏中心并存活。通过将吖啶酯标记76-G3-G5 检测抗体、生物素标记8-A8-B8捕获抗体与人可溶性CD14放入孵育槽中孵育，使吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体和生物素标记8-A8-B8捕获抗体分别与人可溶性CD14结合得到双抗体夹心复合物。所用的杂交瘤细胞株76-G3-G5和8-A8-B8是从筛选出的若干种不同的杂交瘤细胞株中进一步筛选出的。经过验证可知，只有将杂交瘤细胞株76-G3-G5分泌的单克隆抗体76-G3-G5与吖啶酯标记，将杂交瘤细胞株8-A8-B8分泌的单克隆抗体8-A8-B8 与生物素标记，再与磁珠结合，形成的双抗体夹心复合物才能具有最好的灵敏度、精密度。而如果反过来将单克隆抗体8-A8-B8与吖啶酯标记，单克隆抗体76-G3-G5与生物素结合，或者采用筛选出的其他杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体标记，所获得双抗体夹心复合物均不能获得最佳的灵敏度、精密度均。
人可溶性CD14标准品、人可溶性CD14质控品、磷酸盐(PBS)缓冲液、吖啶酯标记碳酸盐(CBS)缓冲液、生物素标记碳酸盐(CBS)缓冲液、稀释生物素标记的抗体试剂缓冲液R1、稀释吖啶酯标记的抗体试剂缓冲液R2、磁珠稀释液、标准品(质控品)稀释液等属于市面上销售的，或常用的试剂，其配置方法也属于常见的配置方法。
优选地，所述杂交瘤细胞株76-G3-G5和杂交瘤细胞株8-A8-B8是利用人工合成的人可溶性CD14基因制备重组质粒，进行蛋白质表达纯化，再通过动物免疫、细胞融合、间接Elisa筛选、亚克隆获得若干杂交瘤细胞株，最后从若干杂交瘤细胞株中进一步筛选配对获得。配对获得的具体方法如下：
S1、人工合成人可溶性CD14基因，将人可溶性CD14基因重组到表达载体质粒pATX2-FC 中，得到sCD14-pATX1-FC表达载体质粒；克隆位点为EcoRI/XbaI，人可溶性CD14基因的基因序列如SEQ NO.1所示；
制备mGM-CSF免疫佐剂质粒的基因序列如SEQ NO.2所示；
S2、将sCD14-pATX1-FC表达载体质粒转染到293F细胞系中培养，收集上清液进行镍柱纯化得到人可溶性CD14；
S3、将sCD14-pATX1-FC表达载体质粒和mGM-CSF免疫佐剂质粒加至乳酸林格氏缓冲液中，sCD14-pATX1-FC表达载体质粒和mGM-CSF免疫佐剂质粒的浓度分别为200μg/mL、2.5μg/mL；对小鼠进行尾静脉注射，注射剂量2mL/次，每周免疫1次，共免疫3次；
第3次免疫结束后，用人可溶性CD14免疫若干小鼠，每只小鼠的免疫剂量为50μg，取血清效价检测合格的小鼠进行细胞融合，再进行间接Elisa筛选，将筛选得到的阳性克隆用有限稀释法进行亚克隆，得到若干株杂交瘤细胞株；
S4、将步骤S3所得的若干杂交瘤细胞株分泌的抗体分别进行吖啶酯标记和生物素标记，得到吖啶酯标记的检测抗体和生物素标记的捕获抗体，并制备人可溶性CD14的标准品、质控品；
S5、选择步骤S4所得吖啶酯标记的检测抗体、生物素标记的捕获抗体进行配对，再与含有人可溶性CD14的溶液同时加至孵育槽中孵育，再通过清洗、磁性分离，得到若干组双抗体夹心复合物；加入化学发光底物液测定各组的发光强度，筛选出最佳配对的吖啶酯标记的检测抗体和生物素标记的检测抗体，即获得对应的最佳配对的杂交瘤细胞株。
一般情况下，步骤S3中选择10只小鼠，共免疫4次即可达到目的，其中用 sCD14-pATX1-FC表达载体质粒、mGM-CSF免疫佐剂质粒免疫前3次，再用人可溶性CD14 免疫第4次。相比于目前本领域普遍采用的使用人可溶性CD14连续免疫4次的方法，先用质粒免疫，再用的人可溶性CD14蛋白免疫的方法能够有效刺激动物产生B细胞表位，这种表位可以针对抗原的线性片段(也称线性B细胞表位)或者空间构象性区域(也称构象性B细胞表位)；而且母克隆在亚克隆中比较稳定，不容易丢失。对免疫后的小鼠采用常规的方法进行血清效价检测，当血清效价达到1:64000以上即为血清效价合格的小鼠，进行细胞融合，再经过间接Elisa筛选。
上述杂交瘤细胞株的筛选配对获得方法中，mGM-CSF免疫佐剂质粒的制备方法如下： mGM-CSF的基因序列按照SEQ NO.2所示；通过固相亚磷酰胺三酯法合成：溶液中的亚磷酰胺单体通过缩合反应形成3’-5’磷酸二酯键，连接到固相载体(CPG或树脂)上。并依次延伸，直到序列的最后一个5’碱基连接上后合成结束。整个合成过程仪器自动完成，每个循环分为脱保护、活化、偶合、盖帽(封闭)、氧化五个步骤。然后将合成好的基因序列溶于乳酸林格氏缓冲液中，浓度为1～10μg/ml。
将筛选得到的阳性克隆用有限稀释法进行亚克隆的具体方法如下：
(1)制备细胞悬液：在显微镜下观察，选择生长状态良好的杂交瘤细胞制备细胞悬液；
(2)按细胞计数方法准确计得细胞悬液的细胞数，一般在10个/mL左右；
(3)取1个新的24孔培养板置于超净工作台，分别在A1、A2、A3孔中加入900ul 的15％HT选择培养基，将做有限稀释的24孔培养板中的杂交瘤细胞混匀并取出100微升的细胞悬液，加入至新24孔培养板的A1孔，用1ml的移液管反复吹打10次左右，然后从A1孔单道移液器(20-100ul)取出100微升至A2孔。以此类推，直至稀释到A3孔；
(4)从A3孔取120个细胞放入V型槽中，用10ml移液管分两次吸取15％HT选择培养基于V型槽中，使V型槽中培养基的总体积为16ml，反复吹打8次左右。在接种96孔培养板时，200μl/孔加1-6六列为每孔1.5个细胞。余下6.4ml细胞悬液再补加6.4ml 15％HT选择培养基，反复吹打8次左右，200μl/孔加7-12六列，为每孔0.75个细胞；
(5)置37℃，8％的CO2培养箱，培养5天后，第7天在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，有单细胞克隆团的在板盖上打上标记“1”，有两个以及两个以上细胞克隆团的在板盖上打上标记“√”，做好记录并统计结果；
(6)约第8-9天可以收获培养液上清用于检测抗体；
(7)选择单克隆生长孔生长良好阳性强者，转移到24孔板再做克隆经培养或扩大培养。得到若干株杂交瘤细胞株。
细胞融合的方法为：
(1)将已进行免疫的Balb/c小鼠固定，摘除眼球取血，然后颈椎脱臼处死小鼠，置于75％的酒精中消毒至少30秒；
(2)取小鼠全血于室温下静置1小时，然后4℃过夜保存；次日将小鼠全血3000rpm离心15min，小心吸取上层血清做为杂交瘤筛选阳性对照，-20℃下分装保存；
(3)取出小鼠脾脏，分别取3个直径10cm的培养皿，加入10ml 1640基本培养基；在第一个培养皿中漂洗脾脏一次；在第二个培养皿中用镊子去除脾脏表面残留结缔组织 (注意不要撕破脾脏被膜)；在第三个培养皿中，用两个载玻片磨砂面轻轻碾磨，碾破脾脏被膜后，即可得到脾细胞；
(4)用10ml移液管吸取碾磨充分的脾细胞悬液经细胞筛过滤，转移到50ml的无菌离心管中；再次吸取10ml 1640基本培养基反复冲洗培养皿2-3次后经细胞筛过滤，转移到上述无菌离心管中，经1500rpm离心6min；
(5)弃去上清，用10ml 1640基本培养基反复吹打10-15次，充分悬浮脾细胞沉淀，再添加30ml 1640基本培养基反复吹打5次，混匀，经1500rpm离心6min；
(6)重复步骤(5)一次；弃去上清，用5ml 1640基本培养基反复吹打10-15次，重悬脾细胞沉淀；取出约0.2ml细胞悬液，经20-40倍稀释后进行脾细胞计数，融合之前室温放置；
(7)在小鼠脾细胞离心期间，将sp2/0细胞收集在50ml无菌离心管中，经1000rpm离心5min；
(8)弃去上清，用10ml 1640基本培养基反复吹打10-15次，悬浮骨髓瘤细胞沉淀，再添加30ml 1640基本培养基反复吹打5次，混匀，经1000rpm离心5min；
(9)重复步骤(8)一次，
(10)弃去上清，用5ml 1640基本培养基反复吹打10-15次重悬骨髓瘤细胞沉淀；取出约0.2ml细胞悬液，经10-20倍稀释后进行细胞计数，融合前室温放置；
(11)融合开始前，打开恒温水浴锅，将温度调到37℃；将PEG和1640基本培养基放在水浴锅中预热；
(12)根据细胞计数结果，将所需的脾细胞和骨髓瘤细胞分别混匀后按5:1比例在50ml 离心管中混合；
(13)1000rpm离心5min，弃去上清，轻弹离心管壁，松动细胞沉淀。
(14)将离心管置于37℃水浴中，向细胞沉淀内匀速加入已预热的PEG(1min内加入1ml)，加入PEG过程中，一边转动离心管一边用枪头的尖端温柔地搅拌，静止90s；匀速加入已预热的1640基本培养基(第一次)：1min内加入1ml，边加边温柔地搅拌；匀速加入已预热的1640基本培养基(第二次)：1min内加入2ml，边加边温柔地搅拌；匀速加入已预热的1640基本培养基(第三次)：3min内加入9ml，边加边温柔地搅拌；匀速加入已预热的1640基本培养基(第四次)，边加边温柔地搅拌直至40ml，将离心管置于 37℃水浴中静置3min；
(15)已融合的细胞悬液经800rpm离心5min，去上清，松动细胞沉淀；
(16)加5ml HAT培养基，温柔地吹打10次悬浮细胞沉淀，根据脾细胞数加入适量的HAT培养基，吹打混匀，接种到96孔细胞培养板。
所用的间接Elisa筛选方法为：
Ⅰ、包被：取抗原用包被液稀释至2-5μg/ml，根据所需的孔计算出所需的包被液的量，每孔加100ul，37℃作用1h后4℃过夜；
Ⅱ、封闭：次日取出酶标板用PBST加满各孔洗涤3次每次五分钟，每次充分拍干；然后每孔加入200ul的封闭液(1％BSA或者5％脱脂乳)，37℃作用2h，PBST洗涤3次；
Ⅲ、加一抗：按一定比例稀释相应的某杂交瘤细胞株分泌的抗体上清(一抗)，每孔加100ul稀释液。设置阴性对照和空白对照，阴性对照为对应的小鼠进行免疫之前的血清，空白对照为磷酸盐缓冲液，37℃作用1h，PBST洗涤3次；此步骤是加稀释受检血清，使血清中的特异性抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物，经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去；
Ⅳ、加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG的抗体：将其以1：10000稀释，每孔100ul，37℃作用1h，PBST洗涤3次。此步目的是加酶标抗免疫球蛋白(酶标抗体)，它与一抗相结合，从而使该抗体间接的标记上酶，清洗后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量；
Ⅴ、加底物：每孔加入100ul的底物反应液(现配现用，避光)置37℃，30min，然后取出加入2mol/L的H2SO4终止反应；加底物显色，颜色深度代表标本中受检抗体量；
Ⅵ、酶标仪测OD450值，以OD450值大于3倍阴性对照孔的值为标准，筛选出对应的一抗及对应的单克隆细胞株。
生物素标记的捕获抗体，是先将单克隆抗体与生物素结合，然后加入已预先包埋了亲和素的磁珠，搅拌后外加磁场，最终筛选而得到。亲和素是从卵白蛋白中提取的一种由4 个相同亚基组成的碱性糖蛋白，可以与生物素结合。当生物素标记的单克隆抗体加入到包埋有亲和素的磁珠后，就将单克隆抗体稳定结合在磁珠上。一般情况下，例如通过间接Elisa筛选获得了10株杂交瘤细胞株，则需要将这10株杂交瘤细胞株分别用吖啶酯标记和生物素标记，然后一对一地进行配对制备双抗体夹心复合物，即一共有100组双抗体夹心复合物，然后统一进行化学发光检测。
采用上述方法，制备含有人可溶性CD14基因序列的重组质粒，纯化人可溶性CD14，独创性先采用sCD14-pATX1-FC表达载体质粒和mGM-CSF免疫佐剂质粒进行前3次小鼠免疫，最后用人可溶性CD14进行第4次免疫，进行杂交瘤细胞株的筛选配对，就能够初步筛选出若干杂交瘤细胞株，并能够进一步筛选出上述杂交瘤细胞株76-G3-G5和杂交瘤细胞株8-A8-B81，最终发现采用吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体、生物素标记8-A8-B8捕获抗体配对制备的双抗体夹心复合物具有最好的灵敏度和精密度。而若改变了上述制备方法的各条件参数，就会对筛选的杂交瘤细胞株种类有很大影响，无法筛选出杂交瘤细胞株 76-G3-G5和杂交瘤细胞株8-A8-B8，进而导致制备的双抗体夹心复合物不能达到最佳的灵敏度和精密度。
进一步优选地，步骤S4中，杂交瘤细胞株分泌的抗体进行吖啶酯标记的具体方法为：
S411、取吖啶酯用N,N-二甲基甲酰胺溶解，浓度3mg/ml，得吖啶酯溶液；
S412、将杂交瘤细胞株分泌的抗体溶解于磷酸盐缓冲液中，并用碳酸盐缓冲液调至pH 值为9.0，终浓度2-5mg/ml，得抗体溶液Ⅰ；
S413、按每mg抗体加14ul吖啶酯溶液的比例，将吖啶酯溶液和抗体溶液Ⅰ混匀后于25℃避光搅拌2小时；
S414、按1:1的重量比加入赖氨酸终止反应，25℃避光搅拌0.5小时，收集反应物使用磷酸盐缓冲液透析过夜，中途更换磷酸盐缓冲液3-4次，得吖啶酯标记的检测抗体；
杂交瘤细胞株分泌的抗体进行生物素标记的具体方法为：
S421、生物素使用N,N-二甲基甲酰胺溶解，浓度20mg/ml，得生物素溶液；
S422、将杂交瘤细胞株分泌的抗体溶解于磷酸盐缓冲液中，并用碳酸盐缓冲液调至pH 值为8.5，终浓度1-10mg/ml，得抗体溶液Ⅱ；
S423、按每mg抗体加5ul生物素溶液的比例，将生物素溶液和抗体溶液Ⅱ混匀后于室温避光搅拌2小时；
S424、收集反应物使用磷酸盐缓冲液透析过夜，中途更换磷酸盐缓冲液3-4次；
S425、步骤S424所得溶液中加入包埋有亲和素的磁珠溶液，25℃避光搅拌2小时，得生物素标记的检测抗体。
优选地，步骤S5中，吖啶酯标记的检测抗体、生物素标记的捕获抗体的配对方式为十字交叉法配对。十字交叉法能够减少实验的检测样本数量，节省时间，不采用十字交叉法而采用一一配对的方法也同样能达到筛选的目的。
优选地，步骤S5中，清洗和磁性分离的方式为：对孵育后的产物溶液施加外加磁场，然后吸去上清液，用pH值7.4的含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液清洗缓冲液清洗3次，继续吸去上清液，去除外加磁场后即得到双抗体夹心复合物。
优选地，步骤S2中培养的时间为6天。
采用化学发光检测筛选的具体方法为：取上述制备的双抗体夹心复合物，取0.1M硝酸，0.1％过氧化氢，发光激发液A 100μl，立即放入化学发光免疫检测仪内，仪器自动加入0.25M氢氧化钠溶液，2％Triton-100发光激发液B 100μl；检测累计时间15s，检测各孔的发光强度(RLU)。发光强度与待测样本的浓度成正比关系，从而获得采用不同配对的吖啶酯标记的检测抗体、生物素标记的捕获抗体制备双抗体夹心复合物检测标准品浓度，最终筛选出检测结果与标准品浓度最接近的配对组合。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：利用本单位的蛋白表达平台293T(人胚胎肾细胞)细胞系表达纯化了人可溶性CD14(Presepsin)的蛋白，使用的抗体为单克隆抗体，与抗原之间反应特异性好。动物免疫方法采用质粒免疫和蛋白免疫相互结合的方式，这种免疫方法可有效刺激动物产生B细胞表位，这种表位可以针对抗原的线性片段(也称线性B 细胞表位)或者空间构象性区域(也称构象性B细胞表位)；母克隆在亚克隆中比较稳定，不容易丢失。本方法与日本三菱pathfast化学发光酶免试剂盒的一致性和相关性良好，检测灵敏度高、特异性好、线性范围宽、精密度高、稳定性好，操作安全，方法简便快速。
附图说明
图1为实施例1的步骤S1中对重组质粒sCD14-pATX1-FC进行电泳验证的电泳图；
图2为实施例1的步骤S1中对免疫佐剂质粒mGM-CSF进行电泳验证的电泳图；
图3为实施例1的步骤S2中对纯化后的人可溶性CD14进行SDS-PAGE电泳的电泳图；
图4为实施例1制备的试剂盒检测临床样品的标准样品的标准曲线；
图5为实施例1制备的试剂盒与日本三菱pathfast化学发光酶免试剂盒检测临床样品相关性的结果图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供的检测人可溶性CD14的化学发光试剂盒中，所选用的吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体、生物素标记8-A8-B8捕获抗体，采用如下方法筛选获得：
S1、人工合成人可溶性CD14基因，将人可溶性CD14基因重组到表达载体质粒pATX2-FC 中，得到sCD14-pATX1-FC表达载体质粒，结果如附图1；克隆位点为EcoRI/XbaI，人可溶性CD14基因的基因序列如SEQ NO.1所示；制备mGM-CSF免疫佐剂质粒的基因序列如SEQ NO.2所示，如附图2所示；
S2、将sCD14-pATX1-FC表达载体质粒转染到293F细胞系中培养，收集上清液进行镍柱纯化得到人可溶性CD14；纯化后的人可溶性CD14进行SDS-PAGE电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳)以验证其纯度达到95％以上，其电泳图如附图3所示；
S3、将sCD14-pATX1-FC表达载体质粒和mGM-CSF免疫佐剂质粒加至乳酸林格氏缓冲液中，sCD14-pATX1-FC表达载体质粒和mGM-CSF免疫佐剂质粒的浓度分别为200μg/mL、2.5μg/mL；对小鼠进行尾静脉注射，注射剂量2mL/次，每周免疫1次，共免疫3次，第 3次免疫结束后，用人可溶性CD14免疫若干小鼠，每只小鼠的免疫剂量为50μg，取血清效价检测合格的小鼠进行细胞融合，再进行间接Elisa筛选，得到25株杂交瘤细胞株，其编号如下表1所示；
表1间接Elisa筛选得到的18株杂交瘤细胞株编号
16-E10-G4 34-G3-G4 37-G6-F2 71-F6-F3 73-B5-F8 76-G3-G5
78-H3-C3 85-A10-C9 89-H10-B5 90-G5-G6 82-F2-B8 92-E11-F9
49-C7-E11 22-B9-G7-D4 41-D12-B9-H6 27-G5-B3 19-2-G2-C11 18-H5-H8
16-G7-B6 10-D4-B8 8-A8-B8 3-H6-B9 2-C2-B6 21-H11-H4
15-G7-E10-G6
S4、将步骤S3所得的若干杂交瘤细胞株分泌的抗体分别进行吖啶酯标记和生物素标记，得到吖啶酯标记的检测抗体和生物素标记的捕获抗体，并制备人可溶性CD14的标准品、质控品；
其中杂交瘤细胞株分泌的抗体进行吖啶酯标记的具体方法为：
S411、取吖啶酯用N,N-二甲基甲酰胺溶解，浓度3mg/ml，得吖啶酯溶液；
S412、将杂交瘤细胞株分泌的抗体溶解于磷酸盐缓冲液中，并用碳酸盐缓冲液调至pH 值为9.0，终浓度2-5mg/ml，得抗体溶液Ⅰ；
S413、按每mg抗体加14ul吖啶酯溶液的比例，将吖啶酯溶液和抗体溶液Ⅰ混匀后于25℃避光搅拌2小时；
S414、按1:1的重量比加入赖氨酸终止反应，25℃避光搅拌0.5小时，收集反应物使用磷酸盐缓冲液透析过夜，中途更换磷酸盐缓冲液3-4次，得吖啶酯标记的检测抗体；
杂交瘤细胞株分泌的抗体进行生物素标记的具体方法为：
S421、生物素使用N,N-二甲基甲酰胺溶解，浓度20mg/ml，得生物素溶液；
S422、将杂交瘤细胞株分泌的抗体溶解于磷酸盐缓冲液中，并用碳酸盐缓冲液调至pH 值为8.5，终浓度1-10mg/ml，得抗体溶液Ⅱ；
S423、按每mg抗体加5ul生物素溶液的比例，将生物素溶液和抗体溶液Ⅱ混匀后于室温避光搅拌2小时；
S424、收集反应物使用磷酸盐缓冲液透析过夜，中途更换磷酸盐缓冲液3-4次；
S425、步骤S424所得溶液中加入包埋有亲和素的磁珠溶液(所用的磁珠通过购买获得，货号JSR,Magnoshphere-MS160/Streptavidin)，25℃避光搅拌2小时，得生物素标记的检测抗体。
S5、选择步骤S4所得吖啶酯标记的检测抗体、生物素标记的捕获抗体进行配对，配对实验开始前需要将以下试剂稀释成工作浓度。
生物素标记的捕获抗体，工作浓度稀释至0.1μg/ml～4μg/ml。所用的抗体稀释缓冲液为R1：配置20mM HEPES溶液，pH7.4，然后分别加入BSA 30g，蔗糖50g，甘氨酸2g，tween-20 5ml，NaN3 0.5g，充分溶解后，定容至1L。
吖啶酯标记的检测抗体，工作浓度为0.1μg/ml～4μg/ml。所用的抗体稀释缓冲液为 R2：配置20mM HEPES溶液，pH5.5，然后分别加入BSA 30g，蔗糖20g，甘氨酸20g，tween-205ml，NaN3 0.5g，充分溶解后，定容至1L。准备磁珠，磁珠稀释液为：配置50mM PBS溶液pH7.4，加入BSA 2g，NaN3 0.5g，Tritonx-100 5ml，充分溶解后，定容至1L。
磁珠使用终浓度为1～5mg/ml。所用的磁珠稀释液：配置50mM PBS溶液pH7.4，加入BSA 2g，NaN3 0.5g，Tritonx-100 5ml，充分溶解后，定容至1L。
人可溶性CD14标准品和质控品，工作浓度1ug/ml，稀释液为pH＝7.4的磷酸盐缓冲液。
将上述4种试剂按照全自动化学发光仪器使用说明放入到对应的试剂仓中，进行上机操作。在全自动化学发光仪器中自动完成双抗体夹心复合物的制备以及筛选最佳配对的吖啶酯标记的检测抗体和生物素标记的捕获抗体。
将分组配对后得到的25×25共625组双抗体夹心复合物进行筛选。例如，将抗体16-E10-G4进行生物素标记后，与所有25株吖啶酯标记的捕获抗体(包括生物素标记的抗体16-E10-G4)进行双抗夹心配对筛选，得到25对吖啶酯标记的检测抗体和生物素标记的捕获抗体可以双抗体夹心检测人可溶性CD14标准品；然后将这25对配对抗体分别检测25 例阳性血清样本，每例样本重复检测3次，计算3次检测的变异系数。
作为其中几组例子，下表2-4是分别将生物素标记16-E10-G4捕获抗体与吖啶酯标记 73-B5-F8检测抗体，生物素标记34-G3-G4捕获抗体与吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体，以及生物素标记8-A8-B8捕获抗体与吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体进行双抗体夹心检测，结果如下表2-4。
表2变异系数检测结果1
Figure RE-GDA0002767485270000111
Figure RE-GDA0002767485270000121
表3变异系数检测结果2
Figure RE-GDA0002767485270000122
表4变异系数检测结果3
Figure RE-GDA0002767485270000131
通过上述对比发现，吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体和生物素标记8-A8-B8捕获抗体的检测阳性血清信号值高，变异系数小，为最佳配对；其对应的分别分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株即76-G3-G5和8-A8-B8。
将吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体和生物素标记8-A8-B8捕获抗体制备成用于检测人可溶性CD14的化学发光试剂盒，试剂盒中还包括人可溶性CD14标准品、人可溶性CD14 质控品、磷酸盐(PBS)缓冲液、吖啶酯标记碳酸盐(CBS)缓冲液、生物素标记碳酸盐(CBS) 缓冲液、稀释生物素标记的抗体试剂缓冲液R1、稀释吖啶酯标记的抗体试剂缓冲液R2、磁珠稀释液、标准品(质控品)稀释液等常用试剂。
1、灵敏度的检测
参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)发布的《临床实验室检验程序检测能力评价指南(第2版)》(EP17A)的实验方案，计算定量检测人附睾分泌蛋白4含量的化学发光试剂盒的灵敏度，求得的灵敏度＜1.5pg/mL，具有非常高的灵敏度。
2、线性的检测
选择浓度为0、3.75、7.5、15、37.5、75、150、375、750、1500、3750、7500、15000pg/mL的人可溶性CD14标准品，所用的标准品稀释液为：900ml去离子水，加入Na2HPO4 11.45g，NaH2PO4 2.28g，蔗糖30g，甘氨酸1g，Tritonx-100 5ml，NaN3 0.5g，充分溶解后，定容至1L。
采用上述化学发光试剂盒对上述不同浓度的标准品做线性分析，计算线性相关系数， r＝0.999，该化学发光试剂盒对人可溶性CD14(Presepsin)的检测的线性范围为37.5-15000pg/mL。
3、精密度的检测
取浓度为75pg/mL的低浓度人可溶性CD14样品和7500pg/mL高浓度人可溶性CD14样品，每个样品每个浓度各做3次平行测试，用3批试剂盒进行检测，计算上述化学发光试剂盒批内及批间差，结果表明上述化学发光试剂盒批内及批间差均＜3％。
4、与日本三菱pathfast化学发光酶免试剂盒检测临床样本相关性：
采用上述化学发光试剂盒与日本三菱pathfast化学发光酶免试剂盒检测同一批次的临床样品，根据所得结果比较两者的相关性。结果如下表5、附图4和5。
表5实施例1的试剂盒与雅培试剂盒检测临床样品相关性结果
Figure RE-GDA0002767485270000141
Figure RE-GDA0002767485270000151
利用本实施例的上述方法筛选得到的最佳配对抗体，对17例人血清样本进行检测，获得了血清中人可溶性CD14的浓度值，并同时利用日本三菱pathfast化学发光酶免试剂盒的试剂和仪器对该批样本进行了检测，绘制散点图。
在比对试验中，如图5所示，人可溶性CD14浓度1.5～1500pmol/L线性拟合后，回归方程Y＝0.9813X+69.776，R2＝0.993，参照EP9-A3文件，计算医学决定水平处的偏移，以国家卫计委临床检验中心室间质评1/2Tea(15％)为可接受标准，计算医学决定性水平处的偏移结果为3.57％，偏移远远小于1/2TEa(15％)，比对通过。这说明结合表5和附图4、5，该试剂盒测定的病人和正常人的血清中可溶性CD14的浓度值，具有明显差异性，与日本三菱的检测数据的相关性非常好。
对比例1
本对比例制备检测人可溶性CD14的化学发光试剂盒的方法与实施例1的唯一区别在于，步骤S1中未制备mGM-CSF免疫佐剂质粒；步骤S3中4次免疫均使用纯化得到的人可溶性CD14蛋白进行免疫，未采用sCD14-pATX1-FC表达载体质粒和mGM-CSF免疫佐剂质粒免疫。
对比例2
本对比例制备检测人可溶性CD14的化学发光试剂盒的方法与实施例1的唯一区别在于，步骤S1中未制备mGM-CSF免疫佐剂质粒；步骤S3中前3次免疫均使用sCD14-pATX1-FC表达载体质粒进行免疫，未采用sCD14-pATX1-FC表达载体质粒和mGM-CSF免疫佐剂质粒共同免疫；第4次免疫采用纯化得到的人可溶性CD14蛋白进行免疫。
采用上述对比例1的传统方法，以及对比例2的方法，在进行筛选时不能得到更多的阳性母克隆，且在亚克隆时杂交瘤细胞不稳定，容易发生丢失，无法得到针对构象表位的抗体。
序列表
<110> 普健生物(武汉)科技有限公司
<120> 一种检测人可溶性CD14的化学发光试剂盒
<141> 2020-09-21
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattcgccg ccaccatgga gcgcgcgtcc tgcttgttgc tgctgctgct gccgctggtg 60
cacgtctctg cgaccacgcc agaaccttgt gagctggacg atgaagattt ccgctgcgtc 120
tgcaacttct ccgaacctca gcccgactgg tccgaagcct tccagtgtgt gtctgcagta 180
gaggtggaga tccatgccgg cggtctcaac ctagagccgt ttctaaagcg cgtcgatgcg 240
gacgccgacc cgcggcagta tgcttctaga gatgatgacg acaaggacaa gacccacacc 300
tgccctccct gccccgcccc tgagctgctg ggcggcccca gcgtgttcct gtttccacca 360
aagccaaagg atcagctgat gatctccagg acccctgagg tgacctgcgt ggtggtggac 420
gtgagccacg aggaccctga ggtgaagttt aattggtacg tggatggcgt ggaggtgcac 480
aatgccaaga caaagccacg cgaggagcag tacaattcca cctacagggt ggtgtccgtg 540
ctgacagtgc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgtaa ggtgtccaat 600
aaggccctgc ctgcccctat cgagaagacc atcagcaagg ccaagggcca gccacgcgag 660
ccacaggtgt acacactgcc tcctagccgg gaggagatga ccaagaacca ggtgtccctg 720
acctgtctgg tgaagggctt ctaccctagc gacatcgccg tggagtggga gtccaacggc 780
cagccagaga ataattacaa gacaacacca cctgtgctgg attccgatgg ctccttcttc 840
ctgtactcca agctgacagt ggataagtcc cgctggcagc agggcaatgt gttctcctgt 900
tccgtgctgc acgaggccct gcacaatcac tacacacaga agtccctgtc cctgtcccct 960
ggcaagtga 969
<210> 2
<211> 447
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctagcgccg ccaccatgtg gctgcagaat ttacttttcc tgggcattgt ggtctacagc 60
ctctcagcac ccacccgctc acccatcact gtcacccggc cttggaagca tgtagaggcc 120
atcaaagaag ccctgaacct cctggatgac atgcctgtca cgttgaatga agaggtagaa 180
gtcgtctcta acgagttctc cttcaagaag ctaacatgtg tgcagacccg cctgaagata 240
ttcgagcagg gtctacgggg caatttcacc aaactcaagg gcgccttgaa catgacagcc 300
agctactacc agacatactg ccccccaact ccggaaacgg actgtgaaac acaagttacc 360
acctatgcgg atttcataga cagccttaaa acctttctga ctgatatccc ctttgaatgc 420
aaaaaaccaa gccaaaaatg atctaga 447

Claims (6)

1.一种检测人可溶性CD14的化学发光试剂盒，其特征在于，包括吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体、生物素标记8-A8-B8捕获抗体；
所述吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体是将单克隆抗体76-G3-G5通过吖啶酯标记后制得，所述单克隆抗体76-G3-G5是由杂交瘤细胞株76-G3-G5分泌获得；
所述生物素标记8-A8-B8捕获抗体是先将单克隆抗体8-A8-B8利用生物素标记，然后再与包埋有亲和素的磁珠结合后制得，所述单克隆抗体8-A8-B8是由杂交瘤细胞株8-A8-B8分泌获得；
所述杂交瘤细胞株76-G3-G5保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号为CCTCC NO：C2020139；所述杂交瘤细胞株8-A8-B8保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号为CCTCC NO：C2020140。
2.根据权利要求1所述的化学发光试剂盒，其特征在于，所述杂交瘤细胞株76-G3-G5和杂交瘤细胞株8-A8-B8的筛选配对获得的具体方法如下：
S1、人工合成人可溶性CD14基因，将人可溶性CD14基因重组到表达载体质粒pATX2-FC中，得到sCD14-pATX1-FC表达载体质粒；克隆位点为EcoRI/XbaI，人可溶性CD14基因的基因序列如SEQ NO.1所示；
制备mGM-CSF免疫佐剂质粒的基因序列如SEQ NO.2所示；
S2、将sCD14-pATX1-FC表达载体质粒转染到293F细胞系中培养，收集上清液进行镍柱纯化得到人可溶性CD14；
S3、将sCD14-pATX1-FC表达载体质粒和mGM-CSF免疫佐剂质粒加至乳酸林格氏缓冲液中，sCD14-pATX1-FC表达载体质粒和mGM-CSF免疫佐剂质粒的浓度分别为200μg/mL、2.5μg/mL；对小鼠进行尾静脉注射，注射剂量2mL/次，每周免疫1次，共免疫3次；
第3次免疫结束后，用人可溶性CD14免疫若干小鼠，每只小鼠的免疫剂量为50μg，取血清效价检测合格的小鼠进行细胞融合，再进行间接Elisa筛选，将筛选得到的阳性克隆用有限稀释法进行亚克隆，得到若干株杂交瘤细胞株；
S4、将步骤S3所得的若干杂交瘤细胞株分泌的抗体分别进行吖啶酯标记和生物素标记，得到吖啶酯标记的检测抗体和生物素标记的捕获抗体，并制备人可溶性CD14的标准品、质控品；
S5、选择步骤S4所得吖啶酯标记的检测抗体、生物素标记的捕获抗体进行配对，再与含有人可溶性CD14的溶液同时加至孵育槽中孵育，再通过清洗、磁性分离，得到若干组双抗体夹心复合物；加入化学发光底物液测定各组的发光强度，筛选出最佳配对的吖啶酯标记的检测抗体和生物素标记的检测抗体，即获得对应的最佳配对的杂交瘤细胞株。
3.根据权利要求2所述的化学发光试剂盒，其特征在于，步骤S4中，杂交瘤细胞株分泌的抗体进行吖啶酯标记的具体方法为：
S411、取吖啶酯用N,N-二甲基甲酰胺溶解，浓度3mg/ml，得吖啶酯溶液；
S412、将杂交瘤细胞株分泌的抗体溶解于磷酸盐缓冲液中，并用碳酸盐缓冲液调至pH值为9.0，终浓度2-5mg/ml，得抗体溶液Ⅰ；
S413、按每mg抗体加14ul吖啶酯溶液的比例，将吖啶酯溶液和抗体溶液Ⅰ混匀后于25℃避光搅拌2小时；
S414、按1:1的重量比加入赖氨酸终止反应，25℃避光搅拌0.5小时，收集反应物使用磷酸盐缓冲液透析过夜，中途更换磷酸盐缓冲液3-4次，得吖啶酯标记的检测抗体；
杂交瘤细胞株分泌的抗体进行生物素标记的具体方法为：
S421、生物素使用N,N-二甲基甲酰胺溶解，浓度20mg/ml，得生物素溶液；
S422、将杂交瘤细胞株分泌的抗体溶解于磷酸盐缓冲液中，并用碳酸盐缓冲液调至pH值为8.5，终浓度1-10mg/ml，得抗体溶液Ⅱ；
S423、按每mg抗体加5ul生物素溶液的比例，将生物素溶液和抗体溶液Ⅱ混匀后于室温避光搅拌2小时；
S424、收集反应物使用磷酸盐缓冲液透析过夜，中途更换磷酸盐缓冲液3-4次；
S425、步骤S424所得溶液中加入包埋有亲和素的磁珠溶液，25℃避光搅拌2小时，得生物素标记的检测抗体。
4.根据权利要求2所述的化学发光试剂盒，其特征在于，步骤S5中，吖啶酯标记的检测抗体、生物素标记的捕获抗体的配对方式为十字交叉法配对。
5.根据权利要求2所述的化学发光试剂盒，其特征在于，步骤S5中，清洗和磁性分离的方式为：对孵育后的产物溶液施加外加磁场，然后吸去上清液，用pH值7.4的含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液清洗缓冲液清洗3次，继续吸去上清液，去除外加磁场后即得到双抗体夹心复合物。
6.根据权利要求2所述的化学发光试剂盒，其特征在于，步骤S2中培养的时间为6天。
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