CN110812484B - Spd_0310蛋白作为靶点在制备用于防治肺炎链球菌感染的药物中的应用 - Google Patents

Spd_0310蛋白作为靶点在制备用于防治肺炎链球菌感染的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了SPD_0310蛋白作为靶点在制备用于防治肺炎链球菌感染的药物中的应用。本发明中发现SPD_0310在肺炎链球菌的三个主要铁转运基因同时被敲除的三突变株中表达量提高且可以正常生长，说明SPD_0310蛋白可能参与了多种铁转运蛋白的相互作用。本发明还发现了spd_0310基因敲除株对于小鼠的感染力下降，基于此，可将SPD_0310用于制备该蛋白质的抗体，以便于研发出抗体类药物。此外，本发明还发现了该蛋白的活性中心可以结合血红素，并证明了卟啉类药物可以作为底物与血红素形成竞争，说明卟啉类药物可作为SPD_0310的抑制剂，抑制肺炎链球菌的毒性，这在抗菌药物领域具有广阔的应用前景。

Description

SPD_0310蛋白作为靶点在制备用于防治肺炎链球菌感染的药 物中的应用
技术领域
本发明属于蛋白质科学技术领域，特别涉及SPD_0310蛋白作为靶点在制备用于防治肺炎链球菌感染的药物中的应用。
背景技术
肺炎链球菌是一种革兰氏阳性致病菌，也是当今世界范围内引起人类感染甚至是死亡的主要病原微生物，尤其是作用于抵抗力较弱的老人和小孩，据世界卫生组织(WHO)的不完全统计，该细菌每年大约引起160万人死亡。这种细菌侵染人体之后，主要引起肺炎、中耳炎(AOM)、败血症、急性肾功能衰竭和脑膜炎等重大疾病。目前世界上还没有一种特效药可以完全抑制该菌的毒性，因此人们对于该菌的策略主要是预防为主、防治结合，可见对于该菌侵染宿主所依赖的粘附因子或毒力蛋白的发现和研究非常重要，基于这些蛋白而设计的药物也急需开发。
改变肺炎链球菌对于宿主的毒性，目前主要有两种方式。其一，依靠锚定在细胞膜表面的粘附因子或者金属转运蛋白来发挥作用。例如已经报道的PspA， Ply，PcpA，CbpA和CbpD等，这五种粘附因子蛋白所对应的基因被敲除之后，会导致细菌粘附和侵袭宿主细胞的能力下降，其作用机理是通过减少粘附因子的数量而降低细菌毒性；例如，PiaA，PiuA，PsaA和PitA蛋白是肺炎链球菌表面的金属转运蛋白，分别转运hemin、铁色素(ferrichrome,fch)，锰离子(Mn2+) 和铁离子(Fe3+)，有英文文献报道了这些蛋白的基因被敲除之后，会造成细菌摄取铁的含量降低，从而导致细菌活力下降、毒性下降。其二，基于肺炎链球菌的关键蛋白而设计成药物靶点，即利用药物也可以达到抑菌的目的。例如， PiaA、PiuA、PsaA均已经被设计为药物靶点，对应的药物分别是ZnMP、吉他霉素酒石酸盐(白霉素)、Fragment-58。
肺炎链球菌对于人体的高致病性和高死亡率，是由于该菌体内约2200个基因的功能并未完全研究透彻。在检测上，目前对于该菌毒力蛋白的了解依然停留在PspA，Ply，PcpA，CbpA和CbpD等粘附因子上，而这五种蛋白在菌体内的表达量普遍较低，当感染者体内的活菌量较少时，上述粘附因子的检测灵敏度较低甚至无法检测，由于上述五种蛋白在市面上没有抗体药物，所以检测的过程费时费力，容易造成假阳性，因此需要开发一种新的毒力蛋白标志物。在预防上，主要依靠接种疫苗PPV23和PCV7，该措施的弊端在于只能针对特定的血清型肺炎链球菌种属具有效果，无法真正达到预防的目的，反而使感染其他血清型病原菌的患者病情无法及时控制。由此可见，对肺炎链球菌中关键蛋白质的发现及研究非常重要，而针对这些蛋白而设计的药物也是治疗该菌感染的关键。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供SPD_0310蛋白作为靶点在制备用于防治肺炎链球菌感染的药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种肺炎链球菌的药物靶点。
本发明的目的通过下述技术方案实现：SPD_0310蛋白作为靶点在制备用于防治肺炎链球菌感染的药物中的应用。
所述的SPD_0310蛋白即血红素转运蛋白SPD_0310，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的药物为抑制或沉默SPD_0310蛋白表达的药物。
所述的SPD_0310蛋白可以调控ply、cbpA、pspA和pcpA等粘附因子的转录水平，在spd_0310基因的敲除株中ply、cbpA、pspA和pcpA等粘附因子的转录水平均有所下调。
一种肺炎链球菌的药物靶点，该药物靶点为SPD_0310蛋白，氨基酸序列如 SEQ IDNO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SPD_0310蛋白作为靶点在制备用于防治肺炎链球菌感染的筛药模型中的应用。
SPD_0310蛋白在制备肺炎链球菌感染的检测试剂中的应用(非诊断和治疗目的)，所述检测试剂以SPD_0310蛋白作为肺炎链球菌的生物标志物。
检测SPD_0310蛋白表达量的试剂在制备检测肺炎链球菌感染的试剂中的应用。
SPD_0310蛋白在制备防治肺炎链球菌感染的抗体药物中的应用；将 SPD_0310用于制备该蛋白质的抗体，制备出抗体类药物，直接作用于靶点蛋白 SPD_0310上，阻断其在菌体内的活性，从而达到降低肺炎链球菌毒性甚至杀死肺炎链球菌。
卟啉类药物在制备SPD_0310蛋白抑制剂中的应用；卟啉类药物可以作为 SPD_0310的抑制剂，从而抑制肺炎链球菌的毒性。
所述的卟啉类药物优选为锌卟啉(ZnMP)。
所述的锌卟啉的浓度为30mM。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)现有的检测肺炎链球菌感染的标志物，主要集中在PspA，Ply，PcpA， CbpA和CbpD等粘附因子上，而由于肺炎链球菌有上千个亚种，每个亚种之间的编码区与非编码区基因都存在着微小的区别。这些毒力蛋白的保守性较低，本发明开发出一种利用抗体检测肺炎链球菌感染的广谱标志物SPD_0310蛋白， SPD_0310是一个自然界中稳定存在的四聚体蛋白，该蛋白具有保守性较高和广谱性良好的特性，同时它是所有血清型肺炎链球菌都含有的蛋白质，在判断患者是否感染肺炎链球菌方面，SPD_0310具有更好的广谱性。
(2)在前期的蛋白组学研究中，本发明发现SPD_0310在肺炎链球菌的三个主要铁转运基因同时被敲除的三突变株(ΔpiaA/ΔpiuA/ΔpitA)中，与野生型相比，表达量提高约3倍。更重要的是，我们发现三突变株依然可以正常生长，这说明肺炎链球菌仍然存在其他的铁转运通道未被发现，所以我们推测 SPD_0310可能直接或间接参与了铁代谢，该蛋白与多种铁转运蛋白特异性的发生相互作用，使细菌更有利的获得铁源，从而使细菌的毒性更强。
(3)本发明发现了spd_0310基因敲除株对于小鼠活体动物的感染力下降，这说明该基因直接决定着肺炎链球菌的毒性强弱。基于此，可以将SPD_0310 用于制备该蛋白质的抗体，以便于研发出抗体类药物，直接作用于靶点蛋白 SPD_0310上，阻断其在菌体内的活性，从而达到降低毒性甚至杀死细菌。
(4)本发明SPD_0310蛋白可以用于制备抗体药物，能够有效的封闭 SPD_0310在菌体内的功能，从而阻断与其他铁转运蛋白的相互作用，此外，本发明首次发现了该蛋白的活性中心可以结合血红素(hemin)，进一步证明了卟啉类药物ZnMP可以作为底物与hemin形成竞争，卟啉类药物也可以竞争该蛋白的活性位置，从而干扰了蛋白质原先的功能，这提示我们可以设计出卟啉类似物来作为抗菌药物的筛选重点。卟啉类药物可以作为SPD_0310的抑制剂，从而抑制肺炎链球菌的毒性，这在抗菌药物领域具有广阔的研发及上市前景。
附图说明
图1是本发明spd_0310基因敲除策略示意图。
图2是spd_0310基因敲除及过表达大片段LFH的PCR扩增结果图；其中，图A为spd_0310基因敲除；图B为过表达质粒p169-spd_0310的双酶切验证；图C为Western blot验证基因敲除及过表达。
图3是SPD_0310蛋白与hemin结合、SPD_0310蛋白与hemin-Agarose和apo-Agarose磁珠分别进行孵育并进行SDS-PAGE电泳分析结果图；其中，图A 为SPD_0310蛋白与hemin结合；图B为0310-hemin的紫外-可见吸收光谱。
图4是SPR生化试验检测SPD_0310蛋白与hemin的亲和力情况分析图。
图5是apo-0310和0310-hemin的二级结构的CD光谱图。
图6是ICP-MS检测细菌体内的金属离子含量结果图。
图7是Δspd_0310突变株中其他主要铁转运蛋白的表达的Western blot检测结果图。
图8是肺炎链球菌摄取锌卟啉的检测结果图。
图9是突变株Δspd_0310对于宿主的粘附侵袭能力检测结果图；其中，图A 为粘附A549细胞；图B为侵袭A549细胞；图C为qRT-PCR检测四种常见毒力因子的转录水平。
图10是肺炎链球菌侵染小鼠的实验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。下述实施例中所使用的各原料以及试剂，除特别指出的以外，均可由市售获得。
本发明中涉及到的SPD_0310蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示 (GenBank登录号：ABJ54480.1)，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(GenBank 登录号：CP000410.2)。其中SPD_0310蛋白可采用本领域中常规技术手段制备得到。实施例中涉及的SPD_0310蛋白通过如下方法获得：
1、构建spd_0310-的基因敲除株
1.1构建基因敲除株的原理和过程
基因敲除的原理是基于同源多聚酶链式反应(如图1)，用红霉素 (Sigma-Aldrich)基因Em替换目的片段spd_0310基因[1]。
首先，以S.pneumoniae D39(肺炎链球菌D39，购自美国菌种保藏中心 Americantype culture collection，ATCC)的DNA基因组作为模板，对spd_0310 基因的上游片段(引物P1和P3)和下游片段(引物P2和P4)分别进行PCR 扩增，分别扩增出两个小片段(500bp和528bp)；并用引物erm-R和erm-F扩增出红霉素抗性基因Em(829bp)。其中，P3携带部分Em基因的5’端碱基，而P4携带一部分Em基因的3’端碱基，由于上游、下游片段均含有红霉素片段，所以有利于同源重组；利用P1和P2将上游、Em、下游片段进行PCR扩增并使之连接成长臂同源大片段(Long flanking homology fragments,LFH)。接下来，将大片段LFH导入到肺炎链球菌D39感受态当中，采用37℃热激，最终通过 Em抗性的血平板筛选出spd_0310基因的敲除株。其中，构建spd_0310基因的敲除株引物序列如表1所示。
表1各基因引物序列
引物 序列(5’-3’)
P1 AAGAGGCTGTGGTCCTTGTAG
P2 TTTATCTCACCAGTCTTTCCAC
P3 ATCAAACAAATTTTGGGCCCGGAGATTTCAACCTCTCCAGCCT
P4 ATTCTATGAGTCGCTGCCGACTACCTCTGACCTCTATTATAATA
erm-F CCGGGCCCAAAATTTGTTTGAT
erm-R AGTCGGCAGCGACTCATAGAAT
上游、下游及红霉素Em片段的PCR反应体系(100μL体系)均为：50μL 的Premix，上游引物-F和下游引物-R各4μL，2μL的模板DNA，40μL的ddH2O。
上游、下游及红霉素Em片段PCR条件：95℃预变性5min，94℃热变性 30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，72℃延伸5min。
大片段LFH的PCR条件：95℃预变性5min，94℃热变性30s，59℃退火 90s，72℃延伸120s，72℃延伸5min。
2、构建spd_0310的基因过表达株
基因的过表达质粒是由堪萨斯大学医学中心提供的pIB169质粒[2](p169质粒，全基因序列如SEQ ID NO.3所示)。根据p169质粒的全碱基测序设计出p169 质粒的通用引物，然后以p169质粒的全基因组序列为模板进行PCR扩增，再将目的基因转入E.coli DH5a中，得到p169质粒；其中，
169-F(5’-3’)：GAATTCGGGACCGCGGTCTC；
169-R(5’-3’)：GAGCTCGGTACCCGGGGATC；
(1)对该p169质粒进行全碱基测序，并根据其多克隆位点设计出的上下游引物0310-169-F和0310-169-R，酶切位点均为EcoR I；其中，
0310-169-F(5’-3’)：
ATCAAACAAATTTTGGGCCCGGAGATTTCAACCTCTCCAGCCT；
0310-169-R(5’-3’)：
CGGGTACCGAGCTCGAATTCTTAGTGATGGTGATGGTGATGCTTA；
(2)通过PCR扩增出spd_0310基因的片段产物，PCR条件为：95℃预变性5min，94℃热变性30s，59℃退火60s，72℃延伸60s，72℃延伸5min；
(3)再通过传统的构建质粒的方法转化感受态，即冰浴30min，42℃热激 90s以便于质粒进入E.coli BL21感受态细菌体内；
(4)在冰上静止放置5min，加入4倍体积的LB培养基，置于摇床37℃培养1小时；
(5)将200μL菌液涂布在含有20μg/mL的氯霉素抗性的LB固体培养基，挑单菌落并抽提质粒测序验证；
(6)将构建好的过表达质粒p169-spd_0310转化进上述spd_0310的基因敲除株中，即为回复突变，转化进肺炎链球菌WT-D39(野生型肺炎链球菌D39) 体内即为过表达菌株(WT-p169-spd_0310)。通过western blot技术检测突变株和过表达株是否成功，结果如图2所示，表明该目的基因的序列正确。
3、SPD_0310蛋白的体外表达纯化
(1)采用pGEX-4T-1质粒(大连宝生物工程公司)即GST标签系统表达纯化SPD_0310，构建pGEX-4T-1-spd_0310表达质粒，质粒的构建过程同上；其中，涉及的spd_0310的PCR引物(上游引物0310-F： 5’-CGTATCGGATCCATGAAAAAACAAGCT-3’和下游引物0310-R：5’-GCGGCGGTCGACTTACTTACGATATAA-3’)；
(2)将构建好的pGEX-4T-1-spd_0310表达质粒导入E.coli BL21中，与上述步骤相同；
(3)当该菌的OD600大约为0.6时，加入0.5mM终浓度的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，购自Sigma-Aldrich)诱导剂进行6个小时的诱导表达；
(4)12000×g离心10分钟，收菌，并用1×PBS缓冲液清洗3次；
(5)用25mL的1×PBS重悬E.coli BL21的菌体沉淀，超声波裂解菌体(5 s开/5s关)；在4℃条件下，12000×g离心60分钟，弃去沉淀，将上清的蛋白液转移至新的50mL离心管中；
(6)过柱，即将上一步得到的蛋白液进行GST层析柱亲和层析(购买自Sigma-Aldrich公司)，GST-0310融合蛋白挂在GST磁珠上，用5倍柱体积的1 ×PBS缓冲液清洗杂蛋白；
(7)用10mL配制好的pH＝8.0，10mM的谷胱甘肽(含50mM的Tris-HCl) 将融合蛋白GST-0310洗脱下来，用一支新的50mL离心管收集；
(8)用10kDa的超滤管对上述收集液进行浓缩，离心机转速为5000×g，浓缩成500μL左右的体积，运用BCA法测定蛋白的浓度；
(9)用凝血酶Thrombin(GE公司)对GST-0310进行酶切，酶切条件为： 22℃酶切20个小时。酶切体系为：100μL的1unit凝血酶可以切割10mg的蛋白。
(10)将酶切之后的蛋白液进行GST磁珠层析柱分离，收集流出液，因为被切割的0310蛋白质不含有GST标签，即无法与磁珠结合；对于流出液进行浓缩，并测定SPD_0310蛋白的浓度。经过SDS-PAGE跑胶验证，我们最终得到了纯度为95％以上的SPD_0310目的蛋白，待用。
实施例1SPD_0310蛋白质与hemin的特异性结合
我们先后探索了SPD_0310蛋白与Fe3+、血红素(hemin，购自Sigma-Aldrich)， fch(铁色素,购自Sigma-Aldrich)以及Mn2+的结合情况，即蛋白质分别与上述5种配体小分子进行孵育6个小时，然后利用螯合的PBS缓冲液进行过夜透析处理3次，最终我们通过ICP-MS检测发现其他金属都未能结合0310蛋白，只有0310-hemin的铁含量检测值为7.524mg/L，即134μM，而蛋白质的浓度为 30μM。由此可见，SPD_0310蛋白质与hemin的结合比例大约为1:4，这表明 hemin有可能是该蛋白的结合底物。
为了进一步验证这个推论，我们首先分别将4μg的0310蛋白与 hemin-Agarose和apo-Agarose磁珠(购自Sigma-Aldrich)进行孵育2小时，不断地轻微晃动以保证充分结合，随后经过轻微离心将沉淀与上清液分离，此时的沉淀即为结合的样品(Bound)，上清即为为流出的结合的样品(Flow Through， FT)。另外，将0.2μg的0310蛋白作为阳性对照(Input)，经过SDS-PAGE电泳鉴定(图3A)，我们发现hemin-Agarose组的Bound样品存在SPD_0310蛋白条带，而FT组却没有；apo-Agarose组的Bound样品没有蛋白条带，而FT组有条带。这些实验证明了SPD_0310蛋白质与hemin配体存在特异性的结合。
进而我们利用紫外分光光度计检测0310与hemin的结合。结果如图3B所示，hemin配体在400nm处呈现出特异性的吸收峰；Apo-0310仅在280nm处有蛋白质的吸收峰，而在可见光区没有任何吸收峰；0310-hemin复合物不仅在 280nm处表现出蛋白质的吸收峰，而且在410nm处出现了二者共同造成的新吸收峰。根据文献报道hemin被蛋白质摄取而形成的复合物会造成hemin从400nm 波峰移动到410nm[3]，这也充分证明了0310蛋白与hemin属于特异性结合。
实施例2表面等离子共振(SPR)检测SPD_0310蛋白与hemin的结合
利用Open-SPR仪器(普瑞麦迪，nicoya，Canada)检测蛋白质与配体hemin 的结合，以1×PBS缓冲液作为流动相缓冲液，用0.2M的N-羟基琥珀酰亚胺 (EDC)和50mM的N-乙基-N’-(二乙氨基丙基)-碳二亚胺(NHS)1:1(体积比) 混合液将购买的纳米金-COOH传感器芯片(普瑞麦迪，nicoya，Canada)表面的氨基激活，用pH 4.5的10nM醋酸钠缓冲溶液稀释至终浓度约为50μg/mL，以30μL/min的流速进样500s，然后注射稀释好的SPD_0310蛋白溶液，以1M 乙醇胺pH 8.5的封闭液进样7min，封闭活化的芯片表面，即将SPD_0310蛋白通过流动相与芯片的氨基紧密结合在一起。将hemin用样品稀释液稀释至不同浓度梯度，每个样品与芯片上的SPD_0310蛋白结合的情况将根据浓度的不同而生成不同的曲线，对曲线进行
Figure BDA0001764664170000081
模式的拟合即可得出kon和koff(koff表示解离速率常数；kon表示结合平衡常数)以及解离常数KD。不同的样品之间需要采用pH 2.5盐酸溶液作为再生液，即避免样品间的互相干扰。
因此，我们通过SPR技术对SPD_0310蛋白与hemin的亲和力做进一步的验证[4]，分别用1μM、3μM和10μM浓度的配体(hemin)进行检测，通过对三次实验数据进行拟合，我们可以观察到二者表现出极强的亲和力，其中kon＝ (5.05±1.10)×102M-1s-1，koff＝(4.89±0.20)×10-5s-1计算得到的平衡解离常数KD＝(9.69±0.50)×10-8M(图4)。这些实验结果都证明了SPD_0310蛋白质与配体小分子hemin具有较强的亲和力。
实施例3SPD_0310蛋白质与Hemin结合的CD图谱检测
上述SPR实验的检测结果提示我们SPD_0310蛋白质的主要生物学功能为 hemin的结合转运。那么，0310蛋白结合该配体之后会引起蛋白构象的变化吗？为此，我们采用圆二色谱技术对Apo-0310和0310-hemin分别进行了二级结构 (secondary-structure)的检测[5]。
如图5所示，Apo-0310蛋白与0310-hemin的CD峰型几乎一致，经过CDPro 软件检测二级结构各项指标的含量，发现二者并没有明显的差异，这说明该蛋白结合hemin并不会引起其二级结构的剧烈改变。
实施例4SPD_0310蛋白质对于肺炎链球菌中铁锰锌等金属离子含量的影响
我们已经在体外的生化表征等实验证明了SPD_0310蛋白质可以结合hemin，为了确定这个蛋白是否对肺炎链球菌中hemin的运输有影响，我们在正常THY 培养基中分别培养了WT-D39(野生型肺炎链球菌D39)、Δspd_0310(构建方法同实施例1)和WT-p169-spd_0310这三株细菌(构建方法同实施例1)，均在 OD值为0.6时收菌以保证菌量一致，并采取ICP-MS(电感耦合等离子体质谱仪)对Fe、Mn、Zn这三种常见的金属离子进行含量的测定。如图6，在spd_0310 敲除株中检测到的铁含量明显低于WT-D39，而金属锰和锌的含量却没有出现明显的差异；而在spd_0310的过表达株中铁含量又恢复到与WT-D39接近的水平。这些数据证明了spd_0310基因可能参与了肺炎链球菌体内的铁转运和存储，对维持细胞内金属离子平衡起到关键作用。
实施例5SPD_0310基因的敲除对肺炎链球菌中其他铁转运蛋白表达的影响
我们在体外研究实验中已经证明了0310蛋白可以结合hemin，为了进一步验证在肺炎链球菌体内是不是也受该配体小分子的调控，我们通过western blot 检测了四种典型的铁转运蛋白，本次western blot实验采用的是PsaA蛋白作为内参，因为该蛋白是锰转运蛋白，其表达水平与spd_0310基因的缺失与否没有关系。如图7，我们课题组在先前的研究中已经证明SPD_0090和PiuA蛋白都参与了hemin转运[6]，二者在Δspd_0310菌株中的表达量均为上调；而fch(铁色素)转运蛋白PiaA和铁离子转运蛋白SPD_1609在WT-D39和Δspd_0310菌株中的表达情况均没有明显差异。这些结果说明0310蛋白质在体内与hemin的转运相关，与铁色素和铁离子无关。
实施例6锌卟啉与血红素的竞争实验
(1)分别过夜培养5mL肺炎链球菌D39野生菌株(WT-D39)，spd_0310-单突变株(Δspd_0310)，piaA-单突变株(ΔpiaA，阴性对照组)[7]和 WT-p169-spd_0310，在OD600＝0.5时采用离心机(6000×g)收集菌体；其中，piaA-单突变株的构建方法同Δspd_0310的构建方法，涉及的引物如下:
piaA-P1：
5’-GAAACTCTGAATTATTTGGAAC-3’；
piaA-P2：
5’-TTTATCTCACCAGTCTTTCCAC-3’；
piaA-P3：
5’-ATCAAACAAATTTTGGGCCCGG CTCTAACTTGAGCTTTTATGTT-3’；
piaA-P4：
5’-ATTCTATGAGTCGCTGCCGACT GCCACTTCAAACTCAATTTAAT-3’；
erm-F：
5’-CCGGGCCCAAAATTTGTTTGAT-3’；
erm-R：
5’-AGTCGGCAGCGACTCATAGAAT-3’；
(2)分别加入5mL(1×108CFU/mL)铁限制培养基重悬细菌，每个样品分成6等份(600mL/份，1×107bacteria/mL)，两份加入30mM锌卟啉(ZnMP，购自Sigma-Aldrich)，两份同时加入30mM ZnMP和30mM Hemin(购自 Sigma-Aldrich)，两份不加任何东西。37℃孵育1h；
(3)加入等体积预冷的1×PBS缓冲液(含5％的BSA)，6000×g，4℃离心5min，去掉上清；
(4)加入等体积预冷的1×PBS缓冲液(含2％的BSA)，4℃孵育10min，去掉细菌表面的ZnMP，6000×g，4℃离心5min，去掉上清；
(5)加入1mL预冷的1×PBS缓冲液重悬细菌，6000×g，4℃离心5min，去掉上清；
(6)加入1mL预冷的1×PBS缓冲液重悬细菌，并进行流式细胞仪的分析，选用FL3检测平均荧光强度。
结果：在螯合培养基中添加ZnMP，而不添加hemin的情况下，四株细菌 WT-D39、ΔpiaA(阴性对照组)、Δspd_0310和WT-p169-spd_0310都有FL3-H 的荧光吸收(图8)，其中Δspd_0310和阴性对照组的荧光吸收值都显著低于 WT-D39，在过表达株中荧光值高于WT-D39，这些结果说明由于spd_0310的缺失阻碍了该突变株从培养基中获得ZnMP。另外，在螯合培养基中同时添加ZnMP 和hemin的条件下，肺炎链球菌则会优先摄取hemin底物分子，从而降低了ZnMP 的摄入能力，所以导致野生株和突变株的荧光检测值普遍较低。这一结果表明 0310蛋白在细菌体内参与了hemin的转运。
实施例7spd_0310基因的缺失降低肺炎链球菌的粘附和侵袭能力
我们以A549细胞(购自美国菌种保藏中心American type culture collection，ATCC)作为宿主，检测了WT-D39、ΔpiaA(阴性对照组)、Δspd_0310的毒性。具体过程如下：
肺炎链球菌及其突变株对A549细胞的粘附和侵袭实验：
(1)首先在12孔板中培养A549细胞至其长成单层，用到的培养基为无酚红的RPMI1640培养基(含10％(v/v)FBS)；
(2)培养肺炎链球菌WT-D39、ΔpiaA突变株、Δspd_0310突变株至OD值为0.5，并收菌；用培养基RPMI 1640(无酚红，含1％(v/v)FBS)分别稀释成1×107个/mL；
(3)用灭过菌的PBS缓冲液冲洗A549细胞3次，并弃去PBS液体；
(4)加入1×107个细菌的至A549细胞中，使之侵染细胞，培养条件为5％ (v/v)CO2，37℃，两小时；
(5)再次用PBS缓冲液洗涤A549细胞，目的是清除游离的细菌；
(6)消化细胞：向上述培养板中加入150μL的胰蛋白酶(0.25％含量)；
(7)预冷PBS缓冲液，并吸取1000μL额外添加了Triton X-100的PBS，目的是使细胞充分裂解，持续时间为30min；
(8)将上述含有细菌的裂解液稀释适当倍数；涂布在无抗性的血平板中， 5％CO2，37℃倒置培养20小时，观察并计算菌落数目。
结果如图9所示，从图9可以看出Δspd_0310菌株与阴性对照组的粘附侵袭能力较为接近，二者均比野生型WT-D39的毒性弱，即无论是粘附在A549细胞表面或者侵袭到胞内的能力都是减弱的。这说明spd_0310基因在肺炎链球菌体内与毒性相关，该基因编码的蛋白质不仅仅可以摄取hemin，而且影响了细菌对宿主的侵袭和粘附能力。进而，我们通过实时荧光定量PCR技术检测了四种常见的毒力因子mRNA的转录情况，由图9C可知ply、cbpA、pspA和pcpA基因的转录水平分别下调了5.2倍、6.7倍、3.6倍和8.1倍。进一步证实了spd_0310 基因的缺失会导致该该细菌毒力的下降。
实施例8Δspd_0310对Balb/c小鼠的感染效果
为了能够反映出细菌感染高等动物之后的表型，所以我们进而采用与人类同源性较高的模式生物Balb/c小鼠(4周龄，雌性，购买自广东省医学实验动物中心)作为感染对象。选取24只4周龄的雌性小鼠，平均分为3组，分别用 WT-D39、Δspd_0310和WT-p169-spd_0310菌株感染小鼠，每个小鼠被注射的菌量都控制在2×106个。具体步骤如下：
(1)培养WT-D39、spd_0310基因敲除株、spd_0310过表达株；分别扩大培养至10mL体积的THY培养基中；
(2)吸取10mL菌全部吸至50mL离心管，收沉淀，用5mL的1×PBS 缓冲液悬起沉淀，调节OD值为0.5，全程放在冰上以防止细菌生长，即严格控制OD值；
(3)取灭过菌的EP管并标记样品名称，将100mL的OD＝0.5的菌液加入 EP管，此时细菌个数大约为1×107个；
(4)吸取50μL菌液，对四周龄雌性的Balb/c小鼠进行尾部静脉注射，观察小鼠的生长状态以及统计死亡率。
(5)感染细菌4天之后，进行安乐死处理，并取肺部、脾组织浸泡在福尔马林液体中，并观察不同的细菌对于小鼠的作用情况[8]。
结果如图10所示，Δspd_0310的存活时间显著高于WT-D39(p<0.05)，而 spd_0310基因的过表达株WT-p169-spd_0310感染的8只小鼠存活率是最低的(p <0.05)。这些结果充分地证明了spd_0310基因具有增强肺炎链球菌感染力的功能，敲除该基因之后会导致细菌的毒性降低，这些活体动物的实验数据为治疗肺炎链球菌感染而造成的人类疾病带来新思路。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
参考文献
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序列表
<110> 暨南大学
<120> SPD_0310蛋白作为靶点在制备用于防治肺炎链球菌感染的药物中的应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 494
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SPD_0310蛋白的氨基酸序列
<400> 1
Met Lys Lys Gln Ala Phe Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Asn Leu Gln Arg
1 5 10 15
Asp His Ile Leu Glu Arg Ile Asn Gln Phe Asp Gly Lys Leu Tyr Leu
20 25 30
Glu Phe Gly Gly Lys Met Leu Glu Asp Phe His Ala Ala Arg Val Leu
35 40 45
Pro Gly Tyr Glu Pro Asp Asn Lys Ile Lys Leu Leu Gln Glu Leu Lys
50 55 60
Glu Gln Val Glu Val Val Ile Ala Ile Asn Ala Ser Asn Ile Glu His
65 70 75 80
Ser Lys Ala Arg Gly Asp Leu Gly Ile Ser Tyr Asp Gln Glu Val Leu
85 90 95
Arg Leu Ile Asp Lys Phe Asn Glu Leu Gly Ile Phe Val Gly Ser Val
100 105 110
Val Ile Thr Gln Tyr Ala Gly Gln Pro Ala Ala Asp Ala Phe Arg Asn
115 120 125
Gln Leu Glu Lys Asn Gly Ile Asp Ser Tyr Leu His Tyr Pro Ile Lys
130 135 140
Gly Tyr Pro Thr Asp Met Asp His Ile Ile Ser Pro Glu Gly Met Gly
145 150 155 160
Lys Asn Asp Tyr Ile Lys Thr Ser Arg Asn Leu Ile Val Val Thr Ala
165 170 175
Pro Gly Pro Gly Ser Gly Lys Leu Ala Thr Cys Met Ser Asn Met Tyr
180 185 190
His Asp Gln Ile Asn Gly Ile Lys Ser Gly Tyr Ala Lys Phe Glu Thr
195 200 205
Phe Pro Ile Trp Asn Leu Pro Leu His His Pro Val Asn Leu Ala Tyr
210 215 220
Glu Ala Ala Thr Ala Asp Leu Asp Asp Val Asn Met Ile Asp Pro Phe
225 230 235 240
His Leu Gln Thr Tyr Gly Glu Thr Thr Val Asn Tyr Asn Arg Asp Ile
245 250 255
Glu Ile Phe Pro Val Leu Lys Arg Met Leu Glu Arg Ile Leu Gly Lys
260 265 270
Ser Pro Tyr Ala Ser Pro Thr Asp Met Gly Val Asn Met Val Gly Phe
275 280 285
Ala Ile Thr Asp Asp Glu Ala Ala Val Glu Ala Ser Lys Gln Glu Ile
290 295 300
Ile Arg Arg Tyr Tyr Gln Thr Val Leu Asp Phe Lys Ala Glu Lys Val
305 310 315 320
Gly Glu Ala Ala Val Lys Lys Ile Glu Leu Leu Met Asn Asp Leu Gly
325 330 335
Ile Thr Pro Ala Asp Arg Lys Val Ala Val Val Ala Arg Gln Lys Ala
340 345 350
Glu Glu Thr Gly Gly Pro Ala Leu Ala Phe Glu Leu Pro Asn Gly Glu
355 360 365
Ile Val Thr Gly Lys Asn Ser Glu Leu Phe Gly Pro Thr Ala Ala Ala
370 375 380
Leu Ile Asn Ala Ile Lys Lys Ser Ala Asp Ile Ala Lys Glu Val Lys
385 390 395 400
Leu Ile Glu Pro Glu Val Val Lys Pro Ile Gln Gly Leu Lys Ile Asp
405 410 415
His Leu Gly Ser Arg Asn Pro Arg Leu His Ser Asn Glu Ile Leu Ile
420 425 430
Ala Leu Ala Ile Thr Ala Thr Glu Asn Pro Asp Ala Ala Arg Ala Met
435 440 445
Glu Glu Leu Gly Asn Leu Lys Gly Ser Glu Ala His Ser Thr Ile Ile
450 455 460
Leu Thr Asp Glu Asp Lys Asn Val Leu Arg Lys Leu Gly Ile Asn Val
465 470 475 480
Thr Phe Asp Pro Tyr Tyr Gln Tyr Asp Arg Leu Tyr Arg Lys
485 490
<210> 2
<211> 1485
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SPD_0310蛋白的核苷酸序列
<400> 2
ttacttacga tataagcggt cgtattggta gtatgggtca aaggttacgt tgatacccag 60
tttacgaagg acattcttgt cttcatcagt caagatgatg gttgagtggg cttcgcttcc 120
tttgaggttg ccgagttctt ccatagcgcg ggcagcatca ggattttctg tagctgtgat 180
agcaagtgca atcaggattt catttgaatg aaggcgtgga ttgcggctac cgagatgatc 240
gattttaaga ccttggattg gcttaacaac ttcaggctcg attagtttta cttctttagc 300
gatgtcagct gattttttga tggcgttgat caaggcagcg gctgtagggc caaagagttc 360
tgagttctta ccagtgacga tttccccatt tggcaattca aaggctaggg ctggtccacc 420
agtttcttct gctttttggc gcgcaacgac agcaacctta cgatctgcag gtgtgatacc 480
gaggtcgttc atgagcaact caattttctt gacggcagct tctccaactt tttcagcttt 540
gaagtcaaga actgtttgat agtaacggcg gatgatttct tgtttagaag cttcgacagc 600
agcctcgtca tctgtaatag cgaaaccaac catgttgaca cccatatctg tcggtgaagc 660
gtatggtgat tttccgagaa tacgttccaa catgcgcttg agcactggga agatttcgat 720
atcacggttg tagttgacag tggtttctcc ataggtttgg agatggaagg ggtcaatcat 780
gttgacatca tcaaggtcag ctgtggcagc ttcataagcc aagttaactg gatgatgaag 840
gggaagattc caaataggga aggtttcaaa tttagcgtag ccagacttga tgccattgat 900
ttggtcgtgg tacatattgg acatacacgt tgccaatttt ccagaaccgg gtccaggagc 960
ggttacgaca atcaagttgc gactggtttt gatgtagtcg tttttgccca tgccttctgg 1020
ggaaatgatg tgatccatat ccgtaggata tcctttgatt ggataatgaa gataagaatc 1080
aattccgttt ttctcaagtt ggttgcggaa ggcatctgca gcgggttggc cagcgtattg 1140
tgtaatgaca acggaaccaa caaaaatccc taattcattg aatttgtcaa tcaaacgaag 1200
aacttcttgg tcataagaaa tgcctaagtc gccacgtgct ttggaatgtt caatgttgct 1260
agcattaatg gcaatcacaa cctcaacctg ctctttcaat tcttgcaaga gcttgatttt 1320
gttgtcaggt tcataaccag gaaggacacg agcagcgtgg aaatcttcta acattttacc 1380
gccaaactct aagtagagct tgccgtcaaa ttggttaatg cgctccaaaa tatggtcgcg 1440
ttgtaaattc aaatattgtt cagaactaaa agcttgtttt ttcat 1485
<210> 3
<211> 4435
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pIB169质粒
<400> 3
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attggataaa gtgggatatt tttaaaatat atatttatgt tacagtaata ttgactttta 180
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aaaaatttag gaggcatatc aaatgaactt taataaaatt cactttagat aaaaatttag 300
gaggcatatc aaatgaactt taataaaatt gatttagaca attggaagag aaaagagata 360
tttaatcatt atttgaacca acaaacgact tttagtataa ccacagaaat tgatattagt 420
gttttatacc gaaacataaa acaagaagga tataaatttt accctgcatt tattttctta 480
gtgacaaggg tgataaactc aaatacagct tttagaactg gttacaatag cgacggagag 540
ttaggttatt gggataagtt agagccactt tatacaattt ttgatggtgt atctaaaaca 600
ttctctggta tttggactcc tgtaaagaat gacttcaaag agttttatga tttatacctt 660
tctgatgtag agaaatataa tggttcgggg aaattgtttc ccaaaacacc tatacctgaa 720
aatgcttttt ctctttctat tattccatgg acttcattta ctgggtttaa cttaaatatc 780
aataataata gtaattacct tctacccatt attacagcag gaaaattcat taataaaggt 840
aattcaatat atttaccgct atctttacag gtacatcatt ctgtttgtga tggttatcat 900
gcaggattgt ttatgaactc tattcaggaa ttgtcagata ggcctaatga ctggctttta 960
taatatgaga taatgccgac tgtacttttt acagtcggtt ttctaatgtc actaacctgc 1020
cccgttagtt gaagaaggtt tttatattac agctccagat ccatatcctt ctttttctga 1080
accgacttct cctttttcgc ttctttattc caattgcttt attgacgttg agcctcggaa 1140
cccttaacaa tcccaaaact tgtcgacttt cgtcaggggg gcttttattt attcaataat 1200
ccctcctctc aataaatcta ttgttgtact taattcaact tccatttctc tgtatctttc 1260
aatacgctct tttaagtcct taatttcttt ttttaattcc tcattttcag caaataactc 1320
tttttctttg tttgtcattt tatttccccc gtttcagcat caagaacctt tgcataactt 1380
gctctatatc cacactgata attgccctca aaccataatc taaaggcgct agagtttgtt 1440
gaaacaatat cttttacatc attcgtattt aaaattccaa actccgctcc cctaaggcga 1500
ataaaagcca ttaactcttt tgtatttacc aaattatagt catccactat atctaaaagt 1560
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ctgacagcca tagatacgcc caaactctct aatttttctt tccaatcatt aggaattgag 1980
tcaggatata ataaaaatcc aaaatttcta gctttagtat ttttaatagc catgatataa 2040
ttaccttatc aaaaacaagt agcgaaaact cgtatccttc taaaaacgcg agctttcgct 2100
tatttttttt gttctgattc ctttcttgca tattcttcta tagctaacgc cgcaaccgca 2160
gattttgaaa aacctttttg tttcgccata tctgttaatt ttttatcttg ctcttttgtc 2220
agagaaatca taactctttt tttcgattct gaaatcacca tttaaaaaac tccaatcaaa 2280
taattttata aaattagtgt atcactttgt aatcataaaa acaacaataa agctacttaa 2340
atatagattt ataaaaaacg ttggcgaaaa cgttggcgat tcgttggcga ttgaaaaacc 2400
cctcaaaccc ttgagccagt tgggatagag cgtttttggc acaaaaattg gcactcggca 2460
cttaatgggg ggtcgtagta cggaagcaaa attcgcttcc tttcccccca tttttttcca 2520
aattccaaat ttttttcaaa aattttccag cgctaccgct cggcaaaatt gcaagcaatt 2580
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ataaaaattt aggaggcata tcaaatgaac tttaataaaa ttcactttag ataaa 4435
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<220>
<223> P3
<400> 6
atcaaacaaa ttttgggccc ggagatttca acctctccag cct 43
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P4
<400> 7
attctatgag tcgctgccga ctacctctga cctctattat aata 44
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> erm-F
<400> 8
ccgggcccaa aatttgtttg at 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> erm-R
<400> 9
agtcggcagc gactcataga at 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 169-F
<400> 10
gaattcggga ccgcggtctc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 169-R
<400> 11
gagctcggta cccggggatc 20
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 0310-169-F
<400> 12
atcaaacaaa ttttgggccc ggagatttca acctctccag cct 43
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 0310-169-R
<400> 13
cgggtaccga gctcgaattc ttagtgatgg tgatggtgat gctta 45
<210> 14
<211> 27
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cgtatcggat ccatgaaaaa acaagct 27
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 0310-R
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gcggcggtcg acttacttac gatataa 27
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> piaA-P1
<400> 16
gaaactctga attatttgga ac 22
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> piaA-P2
<400> 17
tttatctcac cagtctttcc ac 22
<210> 18
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> piaA-P3
<400> 18
atcaaacaaa ttttgggccc ggctctaact tgagctttta tgtt 44
<210> 19
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> piaA-P4
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attctatgag tcgctgccga ctgccacttc aaactcaatt taat 44
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> erm-F
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> erm-R
<400> 21
agtcggcagc gactcataga at 22

Claims (3)

1.沉默SPD_0310蛋白表达的试剂在制备用于防治肺炎链球菌感染的药物中的应用。
2.沉默SPD_0310蛋白表达的试剂在制备用于防治肺炎链球菌感染的筛药模型中的应用。
3.沉默SPD_0310蛋白表达的试剂在制备防治肺炎链球菌感染的抗体药物中的应用。
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