CN114929868A - 包含呼吸系统抗菌噬菌体的鸡尾酒式组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗和控制细菌感染，特别是呼吸系统细菌感染如细菌性肺炎的噬菌体疗法领域。更具体地说，本发明涉及新型噬菌体株及其混合物，以及它们的变体；和使用它们治疗和预防细菌感染的方法，该细菌感染包括由例如铜绿假单胞菌和/或克雷伯氏肺炎菌造成的呼吸系统感染。该混合物可单独用作药物组合物，或者进一步与其他疗法(如抗生素或其他用于呼吸系统感染的标准和非标准疗法)联合使用。

Description

包含呼吸系统抗菌噬菌体的鸡尾酒式组合物及其使用方法
1.技术领域
本发明涉及用于治疗和控制细菌感染，特别是呼吸系统细菌感染如 细菌性肺炎的噬菌体疗法领域。本发明的一个方面涉及一种新型噬菌体株混 合物，包含Kle_F391/08(SEQ ID NO:1)、Kle_F17/19(SEQ ID NO:2)和 Kle_F58/19(SEQ ID NO:3)及其变体；和使用其治疗和预防细菌感染的方法， 该细菌感染包括由例如克雷伯氏肺炎菌(Klebsiellapneumoniae)造成的呼吸 系统感染。这种混合物可与针对同一种类病原体或不同种类病原体(例如， 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))的其他噬菌体组合物(包括混合物)联合施用。该混合物可单独用作药物组合物，或者进一步与其他疗法(如抗 生素或其他用于呼吸系统感染的标准和非标准疗法)联合使用。
2.背景技术
噬细菌体(噬菌体)是特定感染和裂解细菌的病毒。噬菌体疗法是一 种使用完整噬菌体病毒治疗细菌感染性疾病的方法，由Felix d’Herelle于20 世纪20年代提出。然而，随着20世纪40年代抗生素的发展，西方世界对 基于噬菌体的疗法的兴趣有所降低。导致这种降低的最重要因素之一是缺乏 标准化的测试和生产方法。由于未能为噬菌体疗法的测试制定出全行业标 准，干扰了研究结果的编集，导致对于噬菌体疗法的价值认为缺乏功效以及 存在可信性问题。噬菌体生产中的另一个问题涉及商业化噬菌体制剂的纯度 级别，其中制剂含有不想要的细菌成分，例如内毒素。相应地，不良事件通 常与制剂有关，特别是在以静脉内方式接受制剂治疗的患者中。
然而，在抗生素的使用受到限制的东欧和苏联，噬菌体疗法的发展 和使用继续与抗生素联合或替代抗生素。此外，随着许多细菌的抗生素抗性 菌株的增加，西方世界对基于噬菌体的疗法的兴趣重新出现。也就是说，尽 管可能会开发出新的抗生素类别，但细菌最终会对新药产生耐药性，这一前 景使人们更倾向于寻找控制、预防和治疗细菌感染的非化学治疗手段。
噬菌体疗法，特别是噬菌体混合物疗法，为治疗细菌感染特别是呼 吸系统感染(包括医院肺部感染)提供了抗生素的替代选项。呼吸系统感染每 年造成超过400万人死亡。医院获得性细菌性肺炎(HABP)是一种急性肺部 感染，也是在重症监护室环境中获得的最常见的感染类型之一，并与死亡率 增加有关(范围从33％至41％)(Guzman-Herrador B等人,2014,J Hosp Infect 86(1):53-56)。医院肺部感染通常由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)(MRSA)、革兰氏阴性肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(如 克雷伯氏肺炎菌)或革兰氏阴性非肠杆菌科(如铜绿假单胞菌和不动杆菌属(Acinetobacter)物种)造成(Quartin AA等人,2013,BMC Infect Dis 13:561-566； 和DiPasuale M等人,2014,Crit Care Med 42(2):303-312)。
HABP中常规使用抗生素疗法，但是对于多重耐药(MDR)细菌，尤 其是革兰氏阴性菌的治疗选择却很少。最近没有推出新药物类别，目前可供 选择的少数选项包括粘菌素、替加环素(tigecycline)和磷霉素。对于严重的医 院感染，可供选择的抗生素非常少(OrsiGB等人,2011,Expert Rev Anti Infect Ther 9(8):653-679)。
与静脉内施用抗生素相比，抗生素的雾化可使得更多抗生素递送至 肺实质(LuytCE等人,2009,Crit Care 13(6):R200)。然而，迄今为止，由于抗 生素对气道和肺实质的直接毒性带来的副作用，在治疗肺部感染中使用雾化 抗生素(如粘菌素)没有明显的临床获益。这些副作用包括，例如粘膜刺激， 以及由抗生素的全身性吸收而导致的副作用，如氨基糖苷类和多粘菌素类的 肾毒性(Luyt CE等人,2013,Expert Rev Anti Infect Ther 11(5):511-521；和Quon BS等人,2014,Ann Am Thorac Soc 11(3):425-434)。
不同的研究试图使用通过不同途径施用的噬菌体来治疗细菌性肺 部感染(Hoe S等人,2013,J Aerosol Med Pulm Drug Deliv 26:317-335；Morello E.等人,2011,PLoSOne 6(2):e16963；和Debarbieux L等人,2010,J Infect Dis 201(7):1096-1104)。然而，几乎没有公开的实验研究证据表明使用雾化噬菌 体可以治愈既定感染(Ryan EM等人,2011,J Pharm Pharmacol 63:1253-1264)。先前发表的研究尚未评估噬菌体雾化在既定感染中的作用， 大多是在感染仅数小时后检查结果(Wilson KR等人,2007,Microbiology153(第4部分):968-979；和Alemayehu D.等人,2012,MBio 3(2):e00029-12)。 此外，几乎没有针对不同细菌具有抗微生物活性的噬菌体混合物，这可能是 因为难以在保持储存稳定性的同时联合噬菌体的不同特异性。
因此，仍然需要开发新型噬菌体产品作为治疗剂和/或预防剂，用于 体内对抗致病细菌，特别是肺部细菌。对于呼吸系统感染，还需要更好的治 疗尤其是雾化治疗。特别是，需要能够裂解导致医院呼吸系统感染的细菌(包 括铜绿假单胞菌和/或克雷伯氏肺炎菌)的噬菌体混合物。本申请解决了这些 和其他需求。
3.发明内容
本文提供了新型克雷伯氏肺炎菌噬菌体及其在治疗细菌感染中的 用途。包含本文公开的噬菌体混合物或本文描述的三种或更多种噬菌体的组 合的药物组合物可用于治疗、管理或预防细菌感染，特别是铜绿假单胞菌和 /或克雷伯氏肺炎菌感染。
而且，本文还提供了新型克雷伯氏肺炎菌噬菌体混合物及其在治疗 细菌感染中的用途。包含本文公开的噬菌体混合物或本文描述的三种或更多 种噬菌体的组合的药物组合物可用于治疗、管理或预防细菌感染，特别是铜 绿假单胞菌和/或克雷伯氏肺炎菌感染。这种药物组合物可特别用于治疗、管 理或预防呼吸系统感染，并且可以配制该组合物用于肺部递送。
本发明的一个方面涉及新型克雷伯氏肺炎菌噬菌体。本文提供了具 有包含核酸序列SEQ ID NO:2或由核酸序列SEQ ID NO:2组成的基因组的 纯化的克雷伯氏肺炎菌噬菌体Kle_F17/19，和具有包含核酸序列SEQ ID NO: 3或由核酸序列SEQ ID NO:3组成的基因组的纯化的克雷伯氏肺炎菌噬菌体 Kle_F58/19，以及保持这些噬菌体裂解活性的其变体，它们具有对抗克雷伯 氏肺炎菌的抗细菌活性。已经保藏了这些噬菌体：Kle_F17/19的保藏登录号 为NCIMB 43534，而Kle_F58/19的保藏登录号为NCIMB 43535。这些噬菌 体特别能裂解克雷伯氏肺炎菌菌株57/15(NCIMB登录号为43536)和237/14 (NCIMB登录号为43537)。
在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的噬菌体F17/19，其具 有包含核酸序列SEQ ID NO:2的基因组，并表现出针对一种或多种克雷伯 氏肺炎菌菌株的抗菌活性。
在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的噬菌体F58/19，其具 有包含核酸序列SEQ ID NO:3的基因组，并表现出针对一种或多种克雷伯 氏肺炎菌菌株的抗菌活性。
本发明的另一方面涉及包含以鸡尾酒式组合方式存在的三种或更 多种不同纯化的噬菌体的组合物。一方面，噬菌体混合物包含三种克雷伯氏 肺炎菌噬菌体Kle_F391/08、Kle_F17/19和Kle_F58/19(包括保持噬菌体裂解 活性的其变体)，并具有针对克雷伯氏肺炎菌的抗菌活性。在本发明的其它 方面，这种混合物可以进一步包括一种、两种、三种或更多种其它噬菌体(例 如，针对铜绿假单胞菌)的混合物，或者与该混合物联合施用。在一个方面， Kle_F391/08(保藏号为NCIMB 42918)、Kle_F17/19和Kle_F58/19的混合物 与铜绿假单胞菌噬菌体Psa_F99/10(保藏号为NCIMB 42915)、Psa_F27/12(保 藏号为NCIMB42916)和Psa_F95/13(保藏号为NCIMB 42917)(在 US2019/0290709中公开)的混合物一起配制和/或联合施用。在其它实施方案 中，将本文公开的噬菌体混合物与一种或多种针对克雷伯氏肺炎菌、铜绿假 单胞菌或非克雷伯氏肺炎菌或铜绿假单胞菌的细菌具有抗菌活性的其它纯 化的噬菌体一起施用。在更优选的实施方案中，配制组合物用于作为气雾剂施用并用于肺部递送。
本发明的另一方面涉及包含本发明的噬菌体或噬菌体产物和药学 上可接受的载剂的药物组合物。在一些实施方案中，该药物组合物还包含一 种或多种针对克雷伯氏肺炎菌具有抗菌活性的其他噬菌体或噬菌体产物。在 一些实施方案中，将组合物配制成这样一种剂型，其中噬菌体的存在量使得 在向有此需要的受试者施用该组合物时，可提供约1至约10的感染复数 (MOI)。在某些实施方案中，将每种噬菌体以109个pfu至1010个pfu的剂量施用，并且例如以109个pfu/ml存在于组合物中。在优选实施方案中，配制 组合物用于作为气雾剂施用。
本发明的另一方面涉及用于在有此需要的受试者中治疗或降低细 菌感染的发生或管理细菌感染的方法，包括向受试者施用治疗或预防有效量 的本发明的药物组合物，以及涉及该药物组合物在这方面的用途。在一些实 施方案中，细菌感染由克雷伯氏肺炎菌细菌菌株造成，在某些方面，和/或由 铜绿假单胞菌细菌菌株造成，所述菌株包括对一种或多种已知抗生素显示出 抗性和/或能够形成生物膜的细菌菌株。在优选实施方案中，待治疗或降低发 生的细菌感染是呼吸系统感染，更优选的是医院获得性细菌性肺炎或与囊性 纤维化相关的呼吸系统感染。在特别优选的实施方案中，将组合物作为气雾 剂施用至肺部。在一些实施方案中，该组合物在初始施用后约4、6或8小 时再次施用。
本发明的另一方面涉及一种用于诊断细菌感染的致病因子和/或用 于评估感染因子是否对噬菌体的裂解活性易感的方法，包括(i)培养来自患者 的样品，例如拭子或痰或适于培养引起感染的细菌的其它样品；(ii)使步骤(i) 的培养物与本文公开的噬菌体或噬菌体产物进行接触；和(iii)监测培养物生 长或裂解的证据，其中培养物裂解的证据表明培养物包含已知对步骤(ii)中使 用的噬菌体或噬菌体产物易感的细菌菌株。在一些实施方案中，样品是从患 者呼吸道采集的组织活检或拭子。例如，样品可以包括支气管肺泡灌洗液或 支气管分泌物。
本发明的又一方面提供了一种用于降低或抑制细菌在表面上定殖 或生长的方法，包括使该表面与本发明的噬菌体或噬菌体产物进行接触。在 一些实施方案中，该表面是哺乳动物的粘膜，优选人类呼吸道的粘膜。在一 些实施方案中，该表面为非生物表面，优选为医疗器械或一部分医疗设备的 表面，更优选为手术器械或一部分手术设备的表面。
3.1定义
如本文所用的，在核酸分子的上下文中，术语“分离的”指的是第一 核酸分子，其与存在于第一核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离开。 “分离的核酸分子”例如“orf”或噬菌体基因组，当通过重组技术产生时，基本 上不含其它细胞物质或培养基，或者当化学合成时，基本上不含化学前体或 其它化学物质；并且可以不含其它DNA或其它基因组DNA分子，例如， 当它已经从核酸文库中的其它克隆或从分离的噬菌体中纯化和分离出时。此 外，当通过重组技术产生或从噬菌体中分离时，“分离的”基因组DNA基本 上不含其它病毒或细胞物质或培养基，或者当化学合成时，基本上不含化学 前体或其它化学物质，并且可以不含其它DNA或其它基因组DNA分子， 例如，当它已经从含有其它噬菌体或细胞物质的制备物中纯化和分离出时。
就噬菌体而言，术语“纯化的”意指噬菌体的浓度已经通过任何纯化 过程可测量地增加，包括但不限于从环境或培养物中分离，例如在繁殖和/ 或扩增、离心等之后从培养物中分离，从而部分、基本上、几乎完全或完全 去除杂质，例如宿主细胞和宿主细胞成分。本领域技术人员将会理解给定用 途所需的纯化量。例如，根据监管标准和良好的生产规范，拟用于向人类施 用的治疗性组合物中的纯化噬菌体通常必须具有高纯度。
就肽、多肽、融合蛋白或核酸分子而言，术语“纯化的”意指肽、多 肽、融合蛋白或核酸分子的浓度已经通过任何纯化过程可测量地增加，包括 但不限于柱层析、HPLC、沉淀、电泳等，从而部分、基本上、几乎完全或 完全去除杂质，例如参与制备肽、多肽、融合蛋白或核酸分子的前体或其他 化学物质。本领域技术人员将会理解给定用途所需的纯化量。例如，根据监 管标准和良好的生产规范，拟用于向人类施用的治疗性组合物中的分离和纯化的基因组DNA或蛋白质或多肽通常必须具有高纯度。
如本文所用的，术语“噬菌体产物”或“活性噬菌体产物”指的是蛋白 质或其片段或变体，以及编码它们的核酸，它们已经从本发明的噬菌体中分 离或衍生出来，并且它们保留了与从中分离或衍生出它们的噬菌体相关的生 物学功能或活性(例如，抗细菌活性，如裂解性细胞杀伤)。
如本文所用的，在核苷酸序列的上下文中，术语“变体”指的是一种 核苷酸序列，其包含或组成为与参考核酸序列具有至少70％、75％、80％、 85％、90％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性 的核苷酸序列。可以选择保持参考核酸序列的一种或多种功能的变体。例如， 变体噬菌体可以表现出衍生出该变体噬菌体的噬菌体的至少一种生物活性， 例如抗细菌活性，如裂解性杀伤活性。本领域技术人员将会理解，噬菌体中 的核酸复制的准确度不到100％，使得给定的噬菌体在其复制时(包括在其作 为抗生素剂(antibiotic agent)的产生期间)将显示出至少1％的变异。在噬菌体 的制备和使用过程中预期的基因组变异可能导致后代为与亲本基因组的核 苷酸序列具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同 一性的变体。由此可见，在某些实施方案中，本发明的噬菌体包含或组成为 与亲本噬菌体的核苷酸序列具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％ 或至少99％序列同一性的基因组，同时保留针对亲本噬菌体的靶(宿主)细菌 的抗菌活性。在噬菌体的上下文中，“变体”是一种噬菌体，其基因组与亲本 基因组的核苷酸序列具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％ 的序列同一性，并保持如同亲本噬菌体的裂解活性(即裂解相同的一种或多 种细菌菌株)。在某些方面，“变体”仅通过其针对1、2或3种细菌菌株的裂 解活性(例如，如本文实施例中所述)来鉴定。
例如，在某些实施方案中，噬菌体是Kle_F391/08、Kle_F17/19或 Kle_F58/19的变体，并且保留了针对克雷伯氏肺炎菌菌株57/17、237/14和 397/07中的一种、两种或三种的抗菌和/或裂解活性。
在提及本文中任何新型噬菌体时的术语“后代”，意指包含根据本文 中鉴定的特定核酸的噬菌体的传代培养或通过本领域普通技术人员已知的 方法产生的后代的噬菌体复制物，或具有与本文中鉴定的特定核酸的噬菌体 基本上等同的RFLP(限制性片段长度多态性)DNA谱的噬菌体。将术语“具 有基本上等同或相等的RFLP”表示为代表生物体之间的可变性，其根据 Tenover等人提出的方法(Tenover,F.C.等人Interpreting ChromosomalDNA Restriction Patterns Produced by Pulsed-Field Gel Electrophoresis:Criteria for Bacterial Strain Typing.J.Clin.Microbiol 33:2233-2239(1995))。Tenover等人 提出了一个可接受的可变性水平，但条件是用限制性酶来限定等同增殖的生物体的基因组，然后进行电泳。根据Tenover等人提出的标准，具有等同RFLP DNA谱的后代可以被视为是与本文鉴定的特定核酸的噬菌体基本上等同的 噬菌体，也就是说，基本上等同于包含具有SEQ ID NO:1-3中任一核苷酸序 列的核酸序列的噬菌体。
如本文所用的，术语“宿主细胞”指的是用核酸分子转染的特定对象 细胞以及含有该核酸分子或其染色体整合形式的这种细胞的后代或潜在后 代。这种细胞的后代可能与用核酸分子转染的亲本细胞不完全相同，这是由 于在后续世代中可能发生的突变或环境影响，或者核酸分子整合到宿主细胞 基因组内。“宿主细胞”还指被噬菌体(例如，完整噬菌体)感染的细胞，例如 细菌细胞，噬菌体在其中生存并复制。为了产生噬菌体，宿主细胞可能属于 或不属于从中分离或培养噬菌体的同一物种或菌株。
如本文所用的，术语“片段”指的是包含全长蛋白氨基酸序列的至少 5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残 基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连 续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至 少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基 酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150 个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残 基或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列的肽或多肽。在特定实施方案 中，片段是功能性片段，因为它保留了从中分离出它的蛋白质的至少一种功 能，例如保留了抗菌活性，如裂解性细胞杀伤。
如本文所用的，术语“以联合方式”或“进一步联合”或“还联合”指的 是将其它的预防剂和/或治疗剂与本发明的噬菌体或噬菌体产物(包括本发明 不同噬菌体的噬菌体混合物)一起使用。使用术语“以联合方式”不限制向受试 者施用预防剂和/或治疗剂的顺序。可在向受试者施用第二预防剂或治疗剂 (不同于第一预防剂或治疗剂)之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分 钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、 96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、同时或 之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、 6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、 4周、5周、6周、8周或12周之后)施用第一预防剂或治疗剂。
如本文所用的，术语“加强”或“加强剂”指的是随后重复使用相同或 基本上相同的预防剂和/或治疗剂，例如重复剂量的本发明的噬菌体、噬菌体 产物或噬菌体混合物。可在向受试者第二次施用预防剂或治疗剂之前(例如， 5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12 小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)，首先施用相同或基本上相同的预防剂或治疗剂。
如本文所用的，术语“预防剂”和“多种预防剂”指的是试剂/药剂，例 如本发明的噬菌体、噬菌体产物或噬菌体混合物，其可用于预防、管理、控 制疾病或病症的一种或多种症状或者降低其发生，特别是与细菌感染相关的 疾病或病症，更具体而言是与呼吸系统细菌感染相关的疾病或病症，例如但 不限于医院获得性细菌性肺炎或与囊性纤维化相关的呼吸系统细菌感染。
如本文所用的，术语“治疗剂”和“多种治疗剂”指的是试剂/药剂，例 如本发明的噬菌体、噬菌体产物或噬菌体混合物，其可用于治疗、管理或控 制疾病或病症的一种或多种症状，特别是与细菌感染相关的疾病或病症，更 具体而言是与呼吸系统细菌感染相关的疾病或病症，例如但不限于医院获得 性细菌性肺炎或与囊性纤维化相关的呼吸系统细菌感染。
如本文所用的，术语“治疗/处理(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”指的是在接受药物组合物的受试者中获得治疗益处。就实现治疗益 处而言，目的是对与病理状况或病症相关的症状或根本原因(例如，细菌感 染)进行消除、减轻、降低其严重程度、改善或延缓其进展。“治疗有效量” 指的是治疗剂(例如，本发明药物组合物中的噬菌体或噬菌体产物)的量，其 足以在接受药物组合物的受试者中实现至少一种治疗益处。
如本文所用的，术语“预防/防护(prevent)”、“预防(prevention)”和“预 防(preventing)”指的是在接受药物组合物的受试者中获得预防益处。就实现 预防益处而言，目的是延迟、防止与病理状况或病症相关的症状或根本原因 (例如，细菌感染)，或者降低其发生。“预防有效量”指的是预防剂(例如，本 发明药物组合物中的噬菌体或噬菌体产物)的量，其足以在接受药物组合物 的受试者中实现至少一种预防益处。
如本文所用的，在提及噬菌体或噬菌体产物(例如，噬菌体蛋白)， 或者其变体或片段时的术语“抗菌活性”和“抗微生物活性”，可互换使用来指 杀伤和/或抑制微生物(尤其是噬菌体感染的细菌的种类或菌株)生长或繁殖 的能力。在某些实施方案中，通过根据标准技术(例如，在液体培养中或在 琼脂平板上)培养细菌，例如革兰氏阴性细菌(例如，铜绿假单胞菌或克雷伯 氏肺炎菌)，使培养物与本发明的噬菌体、噬菌体蛋白或其变体接触或者与 噬菌体、噬菌体蛋白或其变体的混合物接触，并在所述接触之后监测细胞生 长，来评估抗菌活性。例如，在液体培养中，细菌可以生长至代表培养物指 数生长中点的光密度(“OD”)；将培养物暴露于一种或多种浓度的一种或多种 本发明的噬菌体、噬菌体产物或其变体，并且相对于对照培养物监测OD值。 相对于对照培养物的OD值降低代表一种或多种噬菌体或噬菌体产物表现出 抗菌活性(例如，裂解杀伤活性)。类似地，可以允许在琼脂平板上形成细菌 菌落，将该平板暴露于一种或多种本发明的噬菌体或噬菌体产物或者其变体，并且随后相对于对照平板评估菌落的生长。菌落大小减小或菌落总数减 少表明一种或多种噬菌体或噬菌体产物具有抗菌活性。
4.附图说明
本专利或申请文件包含至少一幅绘制为彩色的附图。带有彩色附图的 本专利或专利申请公布文本的副本将在请求和支付必要费用后由主管局提 供。
图1展示了噬菌体Kle_F391/08(A)、Kle_F17/19(B)和Kle_F58/19(C) 的形态学特征。使用透射电子显微术(Hitachi H-7650)对这些噬菌体进行表 征。
图2a和图2b示出了F391/08基因组的组构示意图。约113kb基因 组中预测的orf用箭头表示，并用黑色编号。箭头的方向表示转录的方向。 颜色编码：黑色–可以根据同源蛋白对其产物进行功能解析的开放阅读框 (orf)；灰色–编码与未知功能蛋白质相似的产物的orf；空箭头–编码与数据库 中的蛋白质没有显著同源性的蛋白质的orf。
图3示出了Kle_F17/19基因组的组构示意图。约45kb基因组中预测 的orf用箭头表示，并用黑色编号。箭头的方向表示转录的方向。颜色编码： 黑色–可以根据同源蛋白对其产物进行功能解析的orf；灰色–编码与未知功 能蛋白质相似的产物的orf；空箭头–编码与数据库中的蛋白质没有显著同源 性的蛋白质的orf。
图4a和图4b示出了Kle_F58/19基因组的组构示意图。约170kb基 因组中预测的orf用箭头表示，并用黑色编号。箭头的方向表示转录的方向。 颜色编码：黑色–可以根据同源蛋白对其产物进行功能解析的orf；灰色–编 码与未知功能蛋白质相似的产物的orf；空箭头–编码与数据库中的蛋白质没 有显著同源性的蛋白质的orf。
图5代表F391/08和Kle_F58/19噬菌体(MOI为10)对克雷伯氏肺炎 菌57/17的单一裂解曲线。通过10倍连续稀释法对活细胞计数进行定量，并 在8h内每隔1h监测一次，并在24h ppi时再次监测。
图6代表Kle_F17/19噬菌体(MOI为10)对克雷伯氏肺炎菌237/14的 单一裂解曲线。通过10倍连续稀释法对活细胞计数进行定量，并在8h内每 隔1h监测一次，并在24h ppi时再次监测。
图7描绘了MOI约为10时，F391/08、Kle_F17/19和Kle_F58/19噬 菌体的联合裂解曲线。通过10倍连续稀释法对活细胞计数进行定量，并在8 小时内每隔1小时监测一次，并在ppi 24h时再次监测。
图8展示了感染后24h的细菌载量，其使用菌株2并进行雾化型纯 化的噬菌体混合物/抗生素(联合)处理或NaCl(模拟)处理。细菌载量以每个精 切肺切片的cfu给出。柱表示n＝1个实验中2次技术重复的均值±SD。
图9描绘了感染后24h的组织活力，其使用菌株2与经雾化型纯化 的噬菌体混合物/抗生素(联合)处理或NaCl(模拟)处理。通过钙黄绿素染色评 估组织活力并以相对光单位给出。柱表示n＝1个实验中2次技术重复(每个 测量一式两份)的均值±SD。
图10示出了经雾化型噬菌体处理在大鼠PCLS上的噬菌体滴度功效。 使用空斑测定法和所示检测株测量p.i.1h和24h时PCLS中的噬菌体滴度。 噬菌体滴度以每个PCLS的空斑形成单位(PFU)给出。柱表示n＝1个实验的 2-4次技术重复(1-2个暴露平板，各具有2个PCLS，显示为单个点)的均值 ±SD。
图11示出了雾化型噬菌体处理在大鼠PCLS上的细菌载量功效。感 染后用雾化型噬菌体混合物或NaCl(媒介物)处理，之后1h或24h的细菌载 量。细菌载量以每个PCLS的CFU给出。柱表示n＝1个实验的4次技术重 复(2个暴露平板，各具有2个PCLS，每个平板的均值显示为点)的均值±SD。
图12示出了雾化型噬菌体处理和抗生素共处理(噬菌体裂解物)在大 鼠PCLS上的噬菌体滴度功效。使用空斑形成测定法测量接种物以及感染菌 株1和用噬菌体混合物处理后1和24h的噬菌体滴度。噬菌体滴度以空斑形 成单位给出。柱表示n＝3个实验的2次技术重复(显示为单个点)的均值±SD。
图13示出了雾化型噬菌体和抗生素共处理在大鼠PCLS上的细菌载 量功效。经雾化型NaCl或噬菌体混合物单独处理或者与浸没式抗生素共处 理后，p.i.24h时的细菌载量。细菌载量以每个PCLS的CFU给出。柱表示 n＝3个实验的2次技术重复(显示为单个点)的均值±SD。***表示根据单因素 方差分析和Sidak's多重比较后续检验，与对照柱(p.i.24h时的感染+NaCl) 相比，p<0.001的显著性。###表示根据非配对双侧t检验对所示组进行直接 比较，p<0.001的显著性。
图14示出了雾化型噬菌体处理和抗生素共处理在大鼠PCLS上的组 织活力功效。感染后24h以及用NaCl(媒介物)、雾化型噬菌体混合物单独 处理或与抗生素共处理的组织活力。通过钙黄绿素染色评估组织活力并以相 对光单位(RLU)给出。柱表示n＝3个实验的2次技术重复(显示为单个点，每 个测量一式两份)的均值±SD。**、***表示根据单因素方差分析和Sidak's多 重比较后续检验，与对照柱(p.i.24h时的感染+NaCl)相比，p<0.01；p<0.001 的显著性。
5.发明详述
本发明涉及用于治疗和控制细菌感染(特别是呼吸系统细菌感染， 例如细菌性肺炎和与囊性纤维化相关的呼吸系统感染)的噬菌体疗法。本发 明的一个方面涉及新型噬菌体株，包括克雷伯氏肺炎菌噬菌体Kle_F17/19 和Kle_F58/19，以及其变体。本发明的另一方面涉及一种或多种本发明噬菌 体和/或噬菌体产物的鸡尾酒式组合物，以及与其它噬菌体(包括先前在 PCT/PT2011/000031中公开的Kle_F391/08)的组合。本发明的另一方面涉及 克雷伯氏肺炎菌噬菌体Kle_F391/08、Kle_F17/19和Kle_F58/19及其变体的 鸡尾酒式组合物。又一方面涉及噬菌体的药物组合物，以及使用其治疗和预 防细菌感染，特别是由克雷伯氏肺炎菌导致的呼吸系统感染的方法。本发明 的其它方面还涉及噬菌体及其组合作为诊断工具和消毒剂的用途。
5.1噬菌体和其变体
本发明的另一方面涉及靶向许多克雷伯氏肺炎菌菌株的新型克雷 伯氏肺炎菌噬菌体。克雷伯氏肺炎菌是一种革兰氏阴性、非运动性杆状细菌， 存在于口腔、皮肤和肠道的正常菌群中。作为一种荚膜型兼性厌氧菌，该细 菌也天然存在于土壤中。在临床上，它是肠杆菌科克雷伯氏菌属(Klebsiella genus)中最重要的成员。克雷伯氏菌感染往往发生在因饮食不当而导致免疫 系统减弱的人群中，例如酗酒者和糖尿病患者。克雷伯氏菌也是慢性肺病、 鼻黏膜萎缩、囊性纤维化和鼻硬结病患者的机会性病原体。克雷伯氏肺炎菌 新的抗生素抗性菌株正在出现，并且越来越多发现为医院感染，例如，由于 接触受污染的器械。
克雷伯氏肺炎菌确实是人类呼吸道感染最重要的致病病原体之一， 并且仅它就占革兰氏阴性菌导致的医院性肺炎的25-43％(Chibber S等人, 2008,J Med Microbiol57(12):1508-1513)。多药抗性细菌的高发生率导致了目 前抗生素的效力有限，以及耐药菌株定殖患者的高概率。荚膜多糖是克雷伯 氏菌属菌株的重要毒力因子，也是噬菌体感染的限制因子。文献描述了78 种荚膜类型(Hus CR等人,2013,PLoS One 8(8):e70092)，感染这些物种的噬 菌体已经克服了这一“障碍”。克雷伯氏肺炎菌毒力株主要与K1和K2荚膜 血清型相关(Cleg S等人,2016,Microbiol Spectr 4(1)；和Lin TZ等人,2014,J Infect Dis210:1734-1744)，例如在化脓性肝脓肿中，不过K1荚膜血清型与 社区获得性分离物而非医院分离物相关(Tsay RW等人,2002,Arch Intern Med 162(9):1021-1027)。尽管如此，根据感染的类型，菌株可以表现出各种 各样的荚膜血清型，并且克雷伯氏肺炎菌荚膜血清型的分布在世界各地有所 不同(Hus CR等人,2013,PLoS One 8(8):e70092)。
在一个实施方案中，提供了纯化的噬菌体F17/19(该名称可与 “Kle_F17/19”互换使用)，其靶向许多克雷伯氏肺炎菌菌株。
在另一实施方案中，提供了纯化的噬菌体F58/19(该名称可与 “Kle_F58/19”互换使用)，其也靶向许多克雷伯氏肺炎菌菌株。
在某些实施方案中，本发明的噬菌体包含或组成为与核酸序列SEQ ID NO:2或SEQID NO:3具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或 至少99％序列同一性的基因组，该噬菌体表现出噬菌体F17/19和F58/19中 一种或多种的至少一种生物学活性，例如抗微生物或抗细菌活性(例如，裂 解杀伤活性)。
本文公开的噬菌体和某些细菌菌株于2019年12月13日保藏在 NCIMB(NCIMBLtd.Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn, Aberdeen UK)：
表1
Figure BDA0003671342020000131
5.2鸡尾酒式组合物
本发明的一个特定方面涉及不同噬菌体的鸡尾酒式组合物。该“鸡 尾酒/混合物”可以包含至少两种不同的纯化噬菌体，例如，两种、三种、四 种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的纯化噬菌体或其 变体。该混合物可以单独使用或进一步与其他疗法(例如，抗生素剂和/或抗 真菌剂)联合使用。
噬菌体混合物提供了优于使用单一噬菌体的优势，例如，增强了针 对特定细菌物种或菌株的裂解活性和/或降低了出现对单一噬菌体具有抗性 的细菌的可能性。不同的噬菌体也可以像鸡尾酒一样混合，以拓宽它们的特 性，优选产生总体来说更大的抗菌活性谱。然而，很少存在对不同细菌具有 抗微生物活性的噬菌体混合物，这可能是因为在不同株存在的情况下，难以 组合噬菌体株的不同特异性同时保持各种噬菌体的感染能力和/或裂解活性。
在一些实施方案中，本发明提供了包含至少三种不同的纯化噬菌体 的鸡尾酒式组合物，它们具有针对相同或不同细菌种类或菌株的抗菌活性。 在一些特定实施方案中，本发明提供了一种鸡尾酒式组合物，其至少包含纯 化的噬菌体Kle_F391/08、Kle_F17/19和Kle_F58/19或其变体，或由纯化的 噬菌体Kle_F391/08、Kle_F17/19和Kle_F58/19或其变体组成，这些变体包 括对克雷伯氏肺炎菌57/17、237/14和/或397/07中的一种或全部具有裂解活 性的变体。
在一些特定实施方案中，提供了包含至少两种不同的纯化噬菌体或 由其组成的组合物，所述噬菌体包括F17/19或F58/19中的至少一种或者其 变体。
在一些优选实施方案中，在不同的噬菌体株存在的情况下，该组合 不会削弱或降低(或者不会实质上或显著削弱或降低)各种噬菌体的感染能力 或宿主范围和/或裂解活性。在一些特别优选的实施方案中，由于鸡尾酒式组 合中至少一种其他噬菌体的存在，该鸡尾酒式组合中至少一种噬菌体的效力 得到增强或提高，从而产生协同效应。
在一些实施方案中，该鸡尾酒式组合物包含至少三种对克雷伯氏肺 炎菌表现出抗菌活性的噬菌体。在一些特定实施方案中，本发明提供了一种 鸡尾酒式组合物，其包含至少三种不同的纯化噬菌体或由三种纯化的噬菌体 F391/08、F17/19和F58/19，或者针对克雷伯氏肺炎菌具有抗菌活性的其变 体组成。
在特别优选的其它实施方案中，该组合物包含或组成为纯化的噬菌 体F391/08、F17/19和F58/19或其变体，以及针对铜绿假单胞菌具有抗菌活 性三种纯化的噬菌体F99/10、F27/12和F95/13。备选地，将包含或组成为纯 化的噬菌体F391/08、F17/19和F58/19的组合物与包含或组成为纯化的噬菌 体F99/10、F27/12和F95/13的组合物联合施用。F99/10、F27/12和F95/13 公开于US2019/0290709。这些噬菌体和某些铜绿假单胞菌菌株已于2017年 12月1日保藏在NCIMB(NCIMB Ltd.Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen UK)：
表2
Figure BDA0003671342020000151
在一些实施方案中，提供了一种鸡尾酒式组合物，其包含至少两种 不同的纯化噬菌体，其中一种为F17/19或F58/19，以及至少一种选自F92/15、 F105/15、F134/15和F141/15的纯化噬菌体，其对抗一种或多种克雷伯氏菌 属物种的菌株，更优选地包括克雷伯氏肺炎菌，所有这些噬菌体均在US 2019/0290709中公开。
在一些实施方案中，本发明提供了一种鸡尾酒式组合物，其包含至 少F17/19或F58/19，进一步与至少一种其它噬菌体组合，该其它噬菌体选 自下组：对一种或多种粪肠球菌(E.faecalis)和/或屎肠球菌(E.faecium)菌株具 有抗生素活性的噬菌体F168/08(如WO 2010/090542所公开)、对一种或多种 粪肠球菌和/或屎肠球菌菌株具有抗生素活性的噬菌体F170/08(如WO 2010/090542所公开)、对一种或多种铜绿假单胞菌菌株具有抗菌活性的噬菌 体F770/05(如WO 2010/090542所公开)、对一种或多种金黄色葡萄球菌菌株 具有抗菌活性的噬菌体F197/08(如WO 2010/090542所公开)、对一种或多种 金黄色葡萄球菌菌株具有抗菌活性的噬菌体F86/06(如WO 2010/090542所 公开)、对一种或多种金黄色葡萄球菌菌株具有抗菌活性的噬菌体F87s/06(如 WO 2010/090542所公开)、对一种或多种金黄色葡萄球菌菌株具有抗菌活性 的噬菌体F91a/06(如WO 2010/090542所公开)、对一种或多种鲍氏不动杆菌 (Acinetobacter baumanni)菌株具有抗菌活性的噬菌体F1245/05(如WO 2010/090542所公开)、对一种或多种鲍氏不动杆菌菌株具有抗菌活性的噬菌 体F394/08(如WO 2012/036580所公开)、对一种或多种大肠杆菌(Escherichia coli)菌株具有抗菌活性的噬菌体F488/08(如WO 2012/036580所公开)、对一 种或多种铜绿假单胞菌菌株具有抗菌活性的噬菌体F510/08(如WO 2012/036580所公开)、对一种或多种金黄色葡萄球菌菌株具有抗菌活性的噬 菌体F44/10(如WO 2012/036580所公开)、对一种或多种克雷伯氏肺炎菌菌 株具有抗菌活性的噬菌体F387/08(如WO 2012/036580所公开)和对一种或 多种金黄色葡萄球菌菌株具有抗菌活性的噬菌体F125/10(如WO 2012/036580所公开)。
本发明的噬菌体和/或用于本发明的鸡尾酒式组合物中的噬菌体可 以通过本领域已知的和/或本文公开的任何方法获得。在一些实施方案中，本 发明提供了例如从本文公开的保藏菌株中产生和纯化噬菌体F391/08、F17/19 和/或F58/19的方法。
此外，还可以使用本文所述或本领域已知的任何方法从细菌样品中 分离出噬菌体(参见，例如Carlson,“Working with bacteriophages:common techniques andmethodological approaches,”在Kutter和Sulakvelidze(编著)的 Bacteriophages:Biology and Applications中,第5版CRC Press(2005))。可以 使用的特定细菌菌株包括，例如克雷伯氏肺炎菌57/17、397/07或237/14菌 株(例如，用于分离噬菌体F391/08、F17/19或F58/19)、铜绿假单胞菌391/08、 92/15、105/115或121/15菌株(例如，用于分离噬菌体F99/10、F110/10、F27/12、 F83/13和/或F95/13)；或者噬菌体也可以从易受一种或多种噬菌体感染并且 噬菌体在其中复制的任何其他细菌菌株中分离出来。
熟练的技术人员还可以使用一种或多种方法来增殖或扩增噬菌体， 特别是纯化的噬菌体F391/08、F17/19或F58/19，以及它们的变体，以便获 得更大量的给定噬菌体。在一些实施方案中，产生和/或分离其它噬菌体的方 法可以包括(i)获得克雷伯氏肺炎菌的培养物；(ii)用噬菌体F391/08、F17/19 或F58/19或者其变体感染它；(iii)培养，直至观察到培养物的显著裂解；和(iv)从该培养物中分离出噬菌体。所用的宿主细胞可以是任何细菌菌株，例 如，可用于复制噬菌体的任何易受噬菌体感染的克雷伯氏肺炎菌菌株。在一 些实施方案中，所用的宿主细胞可以是例如，克雷伯氏肺炎菌57/17菌株、 克雷伯氏肺炎菌237/14菌株或克雷伯氏肺炎菌397/07菌株。
5.3药物组合物
本文公开的纯化噬菌体，包括其变体和噬菌体鸡尾酒式组合，可以 单独施用或掺入药物组合物中施用，以用于治疗或预防细菌感染，例如，由 细菌(包括但不限于铜绿假单胞菌和克雷伯氏肺炎菌)导致的感染。可以将一 种或多种噬菌体或噬菌体产物与药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂组 合。药学上可接受的载剂、赋形剂和稳定剂的实例包括但不限于缓冲剂，例 如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量多 肽；蛋白质，例如血清白蛋白和明胶；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮； 氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖 和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖 醇类，例如甘露醇或山梨糖醇；成盐反离子，例如钠；和/或非离子型表面活 性剂，例如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLUONICSTM。例如，除了上述 成分之外，本发明的药物组合物(例如，抗菌组合物)还可以包括润滑剂、润 湿剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。在具体方面，将纯化的噬菌体配制在NaCl 溶液(例如0.9％NaCl)中。
在一些实施方案中，将药物组合物配制成用于作为气雾剂施用。用 于气雾剂递送的配制品可以是干粉、细颗粒、纳米颗粒、溶液、冻干制剂、 脂质体制剂等形式。脂质体配制品可以保护噬菌体免受痰的恶劣条件影响， 以及提高对生物膜的穿透性和/或允许药剂在气道内更持久的释放。用于气雾 剂递送的配制品通常包含灭菌水和少量或不含防腐剂，以减少副作用如支气 管刺激和支气管痉挛。用于气雾剂递送的配制品优选具有与气道表面液体层 的渗透度(osmolality)相同或基本上相同的渗透度。
可以将本文公开的噬菌体和噬菌体混合物与一种或多种如本文所 述和/或本领域已知的可用于治疗细菌感染的其它治疗剂和/或预防剂(例如， 一种或多种其它噬菌体或抗生素)相组合。例如，本发明的药物组合物可以 包含两种或更多种本文公开的纯化噬菌体(对相同或不同的细菌种类或菌株 具有抗菌活性)和本领域已知的噬菌体。在特定的实施方案中，组合的治疗 组分靶向两种或更多种细菌种类或菌株。
还可以将本发明的药物组合物与如本文所述和/或本领域已知的一 种或多种可用于治疗和/或预防细菌感染的非噬菌体治疗剂和/或预防剂(例 如，一种或多种传统抗生素剂)相组合。可与本发明的噬菌体或噬菌体产物 联合使用的其它治疗剂和/或预防剂包括但不限于抗生素剂、抗炎剂、抗病毒 剂、抗真菌剂或局部麻醉剂。在一些优选实施方案中，将药物组合物配制成 用于治疗和/或预防肺部感染，并且包含一种或多种选自抗生素剂、抗真菌剂 和局部麻醉剂的其它治疗剂和/或预防剂。在一些实施方案中，药物组合物包含本发明的噬菌体鸡尾酒式组合，将其在不存在标准或传统抗生素剂的情况 下施用。
在特定的实施方案中，将噬菌体混合物与广谱抗生素，特别是具有 抗革兰氏阴性菌活性的抗生素，例如抗假单胞菌β-内酰胺(例如，哌拉西林、 他唑巴坦、头孢他啶或美罗培南)和/或氨基糖苷类(例如，阿米卡星)一起施用， 和/或与抗革兰氏阳性菌的抗生素，例如万古霉素或恶唑烷酮类(例如，利奈 唑胺(linesolid))，和/或与粘菌素联合施用。标准或传统抗生素剂包括但不限 于阿米卡星、艮他霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、红链霉 素(rhodostreptomycin)、链霉素、妥布拉霉素、阿泊拉霉素、利福霉素、萘霉素、莫匹罗星、格尔德霉素(geldanamycin)、安丝菌素、碳头孢烯类、亚胺培 南、美罗培南、厄他培南、法罗培南、多尼培南、帕尼培南/倍他米隆、比阿 培南、PZ-601、头孢菌素类、腈甲基头孢菌素、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头 孢来星、头孢洛宁、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢匹林、头孢曲嗪、头孢氮氟、 头孢西酮、头孢唑林、头孢拉定、头孢沙定、头孢替唑、头孢克洛、头孢尼 西、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢唑南、头孢美唑、头孢替坦、头孢西丁、头 孢卡品(cefcapene)、头孢达肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢他美(cefetamet)、 头孢克肟、头孢甲肟、头孢特仑、头孢布烯、头孢噻呋、头孢噻林、头孢唑 肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、拉氧头孢(latamoxef)、头孢林定 (cefclidine)、头孢吡肟、头孢瑞南(cefluprenam)、头孢噻利、头孢唑兰、头孢 匹罗、头孢喹肟、氟氧头孢、头孢吡普(ceftobiprole)、阿奇霉素(azithromycin)、 克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、氨曲南、青霉素和青霉素衍生物、 放线菌素、杆菌肽、粘菌素、多粘菌素B、西诺沙星、氟甲喹、萘啶酸、恶 喹酸(oxolinicacid)、吡咯酸、吡哌酸、罗索沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟 罗沙星、洛美沙星、那氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、芦氟沙星、 巴洛沙星、加替沙星、格帕沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、帕珠沙星、司氟 沙星、替马沙星、妥舒沙星、克林沙星、加雷沙星、吉米沙星、西他沙星(stifloxacin)、曲伐沙星(trovalfloxacin)、普卢利沙星(prulifloxacin)、乙酰唑胺、 苯唑拉胺(benzolamide)、布美他尼(bumetanide)、塞来昔布、氯噻酮、氯帕胺 (clopamide)、二氯非那胺(dichlorphenamide)、多佐胺、依索唑胺 (ethoxyzolamide)、呋塞米、氢氯噻嗪、吲达帕胺、马芬迪特(mafendide)、美 夫西特、美托拉宗(metolazone)、丙磺舒、乙酰磺胺、磺胺二甲氧嘧啶 (sulfadimethoxine)、磺胺多辛、磺胺类、磺胺甲噁唑、柳氮磺胺吡啶、舒噻 嗪、舒马曲坦(sumatriptan)、希帕胺、四环素、氯四环素、氧四环素、多西 环素、赖甲环素、甲氯环素、美他环素、米诺环素、罗利环素、甲氧西林、 萘夫西林、苯唑西林、氯唑西林、万古霉素、替考拉宁(teicoplanin)、克林霉 素、复方新诺明(co-trimoxazole)、氟氯西林、双氯西林、氨苄青霉素、阿莫 西林及其任意组合。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含对铜绿假单胞菌和/ 或克雷伯氏肺炎菌具有抗菌活性的抗生素剂。在一些其它实施方案中，本发 明的药物组合物包含对除铜绿假单胞菌和/或克雷伯氏肺炎菌以外的细菌具 有抗菌活性的抗生素剂。在优选实施方案中，抗生素剂的使用量可有效地附 加或协同增强本发明噬菌体、噬菌体产物或噬菌体混合物对给定感染的治疗 和/或预防效果。
标准的抗真菌剂包括两性霉素B，例如脂质体两性霉素B和非脂质 体两性霉素B。
在一些优选实施方案中，将本发明的药物组合物配制成用于作为气 雾剂施用，并进一步包含一种或多种同样用于气雾剂递送的抗生素。用于气 雾剂递送的抗生素包括，例如，吸入性氨基糖苷类例如妥布拉霉素如妥布拉 霉素溶液或妥布拉霉素干粉，艮他霉素，阿米卡星，吸入性多粘菌素例如粘 菌素溶液或粘菌素干粉，和多粘菌素E甲磺酸钠(colistimethate sodium)；和 吸入性单环β-内酰胺类(例如，氨曲南溶液或雾化型氨曲南赖氨酸)；以及气 雾剂化的左氧氟沙星、头孢他啶、磷霉素、艮他霉素、万古霉素、两性霉素、卷曲霉素、利福平、异烟肼和环丙沙星(Quon BS等人,2014,Annals ATS 11(3):425-434)。在一些实施方案中，本发明的气雾剂化的药物组合物还包含 一种或多种同样用于气雾剂递送的抗真菌剂，例如脂质体两性霉素B。
在一些实施方案中，将本发明的药物组合物配制成用于治疗和/或预 防由克雷伯氏菌属物种如克雷伯氏肺炎菌导致的细菌感染。在一些这样的实 施方案中，药物组合物包含鸡尾酒式组合物，该鸡尾酒式组合物包含一种或 多种纯化的F17/19或F58/19噬菌体和任选的F391/08噬菌体或者其变体， 并且在一个实施方案中，包含F17/19、F58/19和F391/08或其变体，或者由 它们组成。该组合物进一步包含具有抗铜绿假单胞菌活性的纯化噬菌体 F99/10、F27/12和F95/13或其变体，或者进一步由它们组成。在一些实施方 案中，该药物组合物可以进一步包含其它药剂，例如对克雷伯氏肺炎菌和/ 或铜绿假单胞菌具有抗菌活性的抗生素剂，和/或对除克雷伯氏肺炎菌或铜绿 假单胞菌以外的细菌具有抗菌活性的抗生素剂。在一些实施方案中，将组合 物配制成这样一种剂型，其中噬菌体的存在量使得在向有此需要的受试者施 用该组合物时，可提供约1至约10的感染复数(MOI)。在某些实施方案中， 每种噬菌体以109个pfu至1010个pfu的剂量施用，并且例如，以109个pfu/ml 存在于组合物中。在优选实施方案中，将组合物配制成用于作为气雾剂施用。
可以将包含本发明的纯化噬菌体混合物的药物组合物配制成单位 剂量或多剂量配制品。优选的配制品是可以作为如上文所述的气雾剂递送的 配制品。其他合适的配制品包括混悬剂、乳剂、洗剂、溶液剂、乳膏、软膏 或撒布剂，或者以皮肤贴剂的形式。
另外地或备选地，本文提供的药物组合物可以以栓剂或阴道栓剂的 形式施用、口服(例如，作为片剂，其可含有赋形剂如淀粉或乳糖，作为胶 囊剂、珠剂(ovule)、酏剂、溶液剂或混悬剂，每种均任选地含有矫味剂、着 色剂和/或赋形剂)或者可以通过胃肠外(例如，静脉内、肌内或皮下)注射。对 于胃肠外施用，该组合物可以以无菌水溶液的形式使用，该水溶液可以含有 其他物质，例如足够的盐类或单糖类以使溶液与血液等渗。对于经颊或舌下 施用，该组合物可以片剂或锭剂的形式施用，所述片剂或锭剂可按常规方式 配制。局部配制品通常包括无菌缓冲剂，诸如无菌PBS、水或盐水缓冲液， 或者无菌SM缓冲液。
本文所述和/或本领域已知的施用模式可用于递送所需剂量的本发 明的噬菌体、噬菌体产物和/或噬菌体混合物，并按照适当的给药方案进行。 剂量和给药方案可以根据特定的配制品、施用途径、所治疗的病况和其他因 素而变化。例如，在普通医师的技能范围内，动物实验可以为确定人类疗法 中的有效剂量提供可靠的指导。本领域普通技术人员可遵循以下中描述的原 理进行有效剂量的物种间推算，例如Mordenti,J.等人的“The useof interspecies scaling in toxicokinetics”in Toxicokinetics and New DrugDevelopment,Yacobi等人编著,Pergamon Press,New York 1989,第42-96页。 例如，急性肺部感染的鼠模型可用于评估本发明药物组合物的效力，如以下 实施例中所详述。
本发明的药物组合物可以根据给药方案进行施用。在一些实施方案 中，给药方案包括每6或8小时施用一次本发明的鸡尾酒式组合物(例如， 局部应用噬菌体混合物治疗糖尿病皮肤创伤的多次给药方案(Mendes JJ等人, 2013,Wound Repair Regen 21:595-603))。在优选实施方案中，初始施用后是 第二次或“加强”剂量，涉及药物组合物的再次施用。例如，可以跟随初始剂 量在约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时、12小时、1天或2天后施用加强。在优选实施方案中，例如，在治 疗呼吸系统或肺部感染，包括但不限于医院获得性细菌性肺炎(HABP)时， 在初始剂量后约4、约5、约6小时或约8小时使用加强剂量。
5.4治疗性用途
另一方面涉及纯化的噬菌体和噬菌体混合物在用于预防和/或治疗 细菌感染的药物组合物中的用途。噬菌体在治疗细菌感染方面表现出巨大的 潜力，这是由于它们在裂解致病细菌，包括与多药抗性相关的致病细菌 (Larche J等人,2012,Antimicrob AgentsChemother 56(12):6175-6180)方面的 特异性和有效性，它们对抗生物膜中细菌的潜在效率(Phee A等人,2013,J Endod 39(3):364-369)；它们对人类和动物细胞缺少致病性(Abedon ST等人, 2011,Bacteriophage 1(2):66-85)，并且即使在高细菌载量的微需氧环境中也具 有活性(Azeredo J等人2008.Curr Pharm Biotechnol 9:261-266)。与使用单一噬菌体相比，噬菌体混合物尤其可以提供额外的优势，例如，增加针对特定 细菌菌株的裂解活性，扩大宿主范围，和/或降低细菌针对单一噬菌体出现抗 性的可能性。事实上，不同的噬菌体以鸡尾酒的形式进行混合以拓宽它们的 特性，优选地产生总体上更大的抗菌谱，例如宿主范围扩大，这使得接受该 药剂的受试者不太可能形成抗性。
在特定的实施方案中，接受本发明的药物组合物的受试者是哺乳动 物(例如，牛科动物、绵羊属动物、山羊属动物、马科动物、灵长类动物(如 人类)、啮齿类动物、兔形目动物或禽类(如，鸡、鸭、鹅))。在优选实施方 案中，接受本发明药物组合物的受试者是人类，特别是患有呼吸系统或肺部 感染或者处于患呼吸系统或肺部感染风险的患者，包括医院获得性细菌性肺 炎(HABP)、呼吸设备获得性肺炎(VAP)和医疗保健相关肺炎(HCAP)或囊性纤维化相关感染。在某些实施方案中，感染是由MDR、XDR和PDR感染 因子造成的。
在优选实施方案中，本发明的药物组合物具有抗多种细菌菌株的活 性。在一些优选实施方案中，药物组合物包含对多种铜绿假单胞菌和/或克雷 伯氏肺炎菌菌株具有活性的噬菌体鸡尾酒式组合。相应地，本发明提供了使 用本发明的噬菌体、噬菌体产物或噬菌体鸡尾酒式组合物治疗和/或预防人类 和动物中与铜绿假单胞菌和/或克雷伯氏肺炎菌相关的感染的方法。在其它方 面，本发明提供了治疗和/或预防与这些细菌的相关种类或菌株有关的感染的 方法。
铜绿假单胞菌和克雷伯氏肺炎菌是许多严重机会性感染的罪魁祸 首，尤其是在免疫系统受损的个体中。涵盖将本发明的药物组合物用于治疗 和/或预防与铜绿假单胞菌和/或克雷伯氏肺炎菌相关的或与其他细菌种类或 菌株相关的任何感染，包括但不限于肺部和呼吸道感染、术后感染、与导管 和外科引流管相关的感染以及血液感染。在优选实施方案中，本发明的药物 组合物可用于治疗和/或预防与肺部和呼吸道相关的细菌感染。
呼吸系统和肺部感染包括但不限于与囊性纤维化相关的感染，诸如 囊性纤维化支气管扩张；肺炎，包括医院获得性细菌性肺炎、呼吸设备相关 肺炎和支气管肺炎；非囊性纤维化支气管扩张；支气管炎；慢性阻塞性肺病； 分枝杆菌病、肺移植后感染；与结核病相关的感染；脓胸伴有胸壁瘘；胸膜 炎伴有瘘、肺脓肿；鼻炎；化脓性囊肿；和肺源性败血症。呼吸系统或肺部 感染的症状包括，例如咳嗽、喘息、咳痰、呼吸急促(呼吸困难)、发音困难(言 语困难)和总体生活质量下降。在特别优选的实施方案中，呼吸系统或肺部 感染是医院获得性细菌性肺炎(HABP)。
关于HABP，住院期间的发病时间是特定病原体和结果的风险指标。 对于早期发病，例如在住院的前4天内，最常见的病原体是内源性微生物群， 如肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，以及对抗生素敏感的革兰氏阴性和社区金黄色葡萄球菌。对于 晚期发病，例如在住院后超过5天发病，革兰氏阴性菌占大多数病例，其中 许多对抗生素具有抗性，例如铜绿假单胞菌、克雷伯氏肺炎菌、肠杆菌属菌 种和不动杆菌属菌种的某些菌株，以及某些金黄色葡萄球菌感染，特别是神 经外科患者、糖尿病患者和慢性肾病患者中的感染(2005,Am J Respir Crit CareMed Vol 171(4):388:416)。铜绿假单胞菌、克雷伯氏肺炎菌的菌株尤其 与晚发型HABP相关。
克雷伯氏肺炎菌和铜绿假单胞菌也与牵涉具有高液体含量的其他 器官系统的感染有关，并且涵盖本发明的噬菌体混合物对此类感染具有治疗 性和/或预防性用途。例如，本发明的药物组合物可用于预防或治疗脑脊髓液、 腹膜液和尿路感染。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗和/或预防呼吸系统或肺部感 染的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的药物 组合物。在优选实施方案中，施用引起呼吸改善，例如使呼吸困难或呼吸急 促恢复正常。
在特别优选的实施方案中，本发明提供了使用本发明的噬菌体混合 物处理出人意料范围的克雷伯氏肺炎菌以及在某些实施方案中处理铜绿假 单胞菌菌株的方法。例如，当与同源克雷伯氏肺炎菌噬菌体相比时，包含克 雷伯氏肺炎菌噬菌体F391/08、F17/19和F58/19的噬菌体混合物显示出对抗 高度多样化范围的克雷伯氏肺炎菌临床菌株的功效(53％感染)。在其它实施 方案中，例如当与某些其它铜绿假单胞菌噬菌体相比时，进一步包含铜绿假 单胞菌噬菌体F99/10、F27/12和F95/13的噬菌体混合物显示出对抗呈现多 种荚膜血清型的高度多样化范围的铜绿假单胞菌临床菌株的功效(57％)。
在优选实施方案中，施用包括通过气雾剂将药物组合物施用到受试 者的一个或多个气道中，例如通过吸入施用。通过吸入施用可以改善药物向 感染靶部位(即，气道)的递送和/或限制全身性副作用的可能性。以气雾剂形 式施用药物组合物包括但不限于通过吸入、鼻内滴注、气管插管、递送至肺 部胸膜腔或通过支气管镜来施用(Abedon ST,2015,Bacteriophage, 5(1):e1020260-1to e1020260-13)。在以气雾剂形式施用药物组合物的过程中， 噬菌体保持活力并且可以包含在合适大小的颗粒中以到达下呼吸道。例如， 在特别优选的实施方案中，大多数雾化颗粒的直径小于5μm，例如至少 50％、60％、70％或80％的颗粒直径小于5μm，更优选的直径约为2μm。
对于鼻内施用或通过吸入施用，本发明的噬菌体和/或噬菌体产物可 以以干粉、细颗粒、纳米颗粒、溶液、冻干制剂、脂质体制剂等形式递送。 通常，包含本发明的噬菌体、噬菌体产物和/或噬菌体混合物的配制品以干粉 吸入剂或气雾剂喷雾的形式，其从加压容器、泵、喷雾器或雾化器递送，使 用合适的抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃 如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134A.TM)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(FIFA227EA.TM)、二氧化碳或者其它合适的气体。
在加压气雾剂的情况下，剂量单位可通过提供用于递送计量的量的 阀门来确定。加压容器、泵、喷雾器或雾化器可以包含活性化合物的溶液或 悬浮液，例如使用乙醇和抛射剂的混合物作为溶剂，其可以另外包含润滑剂， 例如山梨聚糖三油酸酯。用于吸入剂或吹入剂的胶囊和药罐(例如，由明胶 制成)可以配制成含有本发明的噬菌体、噬菌体产物和/或噬菌体混合物以及 合适的粉末基料如乳糖或淀粉的粉末混合物。
可以使用本领域中或如本文所述的任何已知方式来实现雾化。通 常，雾化是通过喷射式雾化器来实现的，它使用空气或氧气在高压下产生气 雾剂。其他雾化器包括振动筛网式雾化器，其由压电致动器驱动，可减少尺 寸可变性并缩短雾化时间(参见，例如Aeroneb、Nebutec 4、Nebutec 6)。另 一种方法包括机械通气，其中雾化器连接到呼吸设备管路的吸气分支。还有 一种方法使用基于乳液的“喷雾-干燥”将溶液或乳液从流体状态转变为具有 均匀尺寸分布的细颗粒(约1-5μm)。两种典型类别的喷雾器包括AeroEclips(Trudell Medical International)，这是一种喷射式雾化器，仅在患者吸气时才 进行雾化；和Omron(Omron,MicroAir U22)，这是一种电池供电的筛网式雾 化器，它依靠压电晶体的振动迫使药剂通过细筛网，从而产生气雾剂(Sahota 等人,2015,J.Aerosol Medicineand Pulmonary Drug Delivery 28(0):1-8)。在一 些优选实施方案中，使用了SYSTAML290(SYSTAM,Villeneuve Sur Lot, France)雾化器。该雾化器产生超声雾化剂，其中约70％的颗粒直径小于5μm。
本发明的药物组合物将包含治疗和/或预防有效量的一种或多种如 本文所述的噬菌体或噬菌体产物。治疗和/或预防有效量指的是在接受所述量 的受试者中分别产生治疗和/或预防益处所需的量。治疗和/或预防有效量将 取决于特定的配制品、施用途径、所治疗的病况、是否将其他药剂或疗法与 本发明的方法联合使用以及其他因素。
在一些实施方案中，将药物组合物递送至有此需要的受试者，以提 供一种或多种噬菌体，其量对应于约1至约10的感染复数(MOI)。通过评估 肺部的近似细菌载量，或计算特定患者肺部的细菌载量，或使用给定类型呼 吸系统感染的估计值来确定MOI；然后提供以下量的噬菌体，其计算为提供 所需的MOI(例如，2x107个pfu/g肺提供的MOI为10)。可以基于“10的倍 数规则”来选择MOI，该规则讲述的是当每个细菌平均吸附大约10的倍数的噬菌体时，细菌密度显著降低(Abedon ST,2009,Foodborne Pathog Dis 6:807-815；和Kasman LM等人,2002,J Virol 76:5557-5564)；而低滴度噬菌 体施用(例如，使用低于10的MOI)则不太可能成功(Goode D等人,2003,App Environ Microbiol 69:5032-5036；Kumari S等人,2010,J Infect Dev Ctries 4:367-377)。
在一些优选实施方案中，递送包含F391/08、F17/19和F58/19的噬 菌体混合物以提供每种噬菌体1至10的MOI，引起肺部的克雷伯氏肺炎菌 减少约80％、约85％、约95％、约97％、约98％或多达约100％(其中活细 胞计数减少至零)。在一些优选实施方案中，递送进一步包含(或与之联合施 用)纯化的噬菌体F99/10、F27/12和F95/13的噬菌体混合物，以提供每种噬 菌体1至10的MOI，引起肺部的铜绿假单胞菌减少约80％、约85％、约95％、 约97％、约98％或多达约100％。在一些特别优选的实施方案中，与每种噬 菌体本身相比，噬菌体混合物出乎意料地显示出协同溶菌作用。
在一些实施方案中，令人惊讶的是，较低剂量可以提供优于较高剂 量的优势。例如，在一些实施方案中，与MOI为10或约为10相比，MOI 为1或约为1在肺部维持低水平细菌的时期更长。例如，在受感染动物的肺 部，在治疗后更长时期内，较低MOI的F391/08、F17/19和F58/19可实现 较低的克雷伯氏肺炎菌载量，而较低MOI的F99/10、F110/10和/或F27/12 可实现较低的铜绿假单胞菌载量，例如，在治疗后12小时、15小时、18小 时、24小时、30小时、36小时或更长时期内。不希望受到理论的束缚，这 可能是由于对较低剂量噬菌体的响应延迟了细菌抗性的出现。
在一些其它实施方案中，低至约0.2至0.4的MOI可产生功效，例 如，在受感染动物的肺部克雷伯氏肺炎菌和/或铜绿假单胞菌的载量在统计学 上显著降低。不受特定理论的束缚，功效可能归因于活性疗法。也就是说， MOI为10的噬菌体剂量提供了足以超过靶细菌群体的噬菌体，以降低细菌 载量而无需进行噬菌体复制或完成生命周期。较低的噬菌体剂量可能依赖于 活性疗法，这涉及噬菌体感染/复制周期以减少靶细菌(Loc Carrillo C等人, 2005,Appl Environ Microbiol 71:6554-6563；另见Cairns BJ等人,2009,PLoSPathog 5:e1000253；和Hooton SP等人,2011,Int J Food Microbiol 151:157-163)。
在某些实施方案中，将本发明的纯化噬菌体或噬菌体鸡尾酒式组合 物用作治疗或预防由铜绿假单胞菌和/或克雷伯氏肺炎菌导致的感染(例如， 呼吸系统或肺部感染)的单一药剂。在其它实施方案中，将本文公开的噬菌 体或噬菌体混合物进一步与其他药剂联合使用，所述其他药剂包括靶向相同 或不同种类细菌的标准抗生素，所述细菌包括选自任何革兰氏阳性菌、任何 革兰氏阴性菌和未被分类为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌的任何其他细菌 类群的细菌。还可以将本发明的组合物与本领域技术人员已知的任何其他治 疗细菌感染的手段，特别是与任何其他治疗呼吸系统感染的手段联合使用。
在一些特别优选的实施方案中，本发明提供了治疗和/或预防呼吸系 统或肺部感染的方法，包括将本发明的噬菌体混合物与标准和/或非标准疗法 联合施用。呼吸系统感染的标准疗法包括吸入和/或全身施用抗生素剂，例如 妥布拉霉素、阿米卡星、粘菌素、氨曲南，以及左氧氟沙星、头孢他啶、磷 霉素、艮他霉素、万古霉素、两性霉素、卷曲霉素、利福平、异烟肼和环丙 沙星；还有吸入和/或全身施用抗真菌剂，例如两性霉素B。
在一些实施方案中，将本发明的噬菌体、噬菌体产物或噬菌体鸡尾 酒式组合物以气雾剂的形式施用，而全身施用其它药剂。例如，在一些优选 实施方案中，通过吸入施用本发明的噬菌体鸡尾酒式组合物，而全身施用抗 生素剂，例如具有抗铜绿假单胞菌和/或克雷伯氏肺炎菌活性的抗生素剂。在 一些实施方案中，将本发明的噬菌体鸡尾酒式组合物与同样以气雾剂形式施 用的其它药剂一起通过吸入施用。例如，在一些优选实施方案中，将本发明 的噬菌体混合物药物组合物与另一抗生素剂或抗真菌剂一起以气雾剂的形 式施用至肺部。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗和/或预防呼吸系统或肺部感 染的方法，包括将本发明的噬菌体、噬菌体产物或噬菌体鸡尾酒式组合物与 呼吸系统感染的非标准疗法联合施用。非标准疗法通常用于一种或多种标准 疗法对呼吸系统感染难治的情况。
5.5消毒剂和抗感染用途
细菌病原体最常在粘膜处感染(例如，通过上呼吸道或下呼吸道的 粘膜，通过泌尿生殖系统、眼部结构等)。粘膜本身通常是环境中存在的致 病细菌的储存库，有时是唯一的储存库。尽管研究表明，减少或消除这种储 存库(尤其是在一些环境诸如医院和疗养院中)明显降低感染的发生，但设计 用于控制这种致病细菌储存库的抗感染剂非常少。
本发明的噬菌体、噬菌体产物和噬菌体混合物可用于抗感染组合物 中，用来控制细菌特别是克雷伯氏肺炎菌和铜绿假单胞菌的生长，从而防止 或降低医院感染的发生。抗感染组合物可用于减少或抑制细菌在与其接触的 表面上的定殖或生长。可以将本发明的噬菌体、噬菌体产物和噬菌体混合物 掺入组合物中，将该组合物配制成应用于生物表面例如皮肤和粘膜以及应用 于非生物表面。
可用于生物表面上的抗感染配制品包括但不限于凝胶、乳膏、软膏、 喷雾剂等。在特定的实施方案中，该抗感染配制品用于对手术场景或者医护 人员和/或患者的手和/或暴露的皮肤进行灭菌。在优选实施方案中，生物表 面是哺乳动物的粘膜，更优选的是人类的粘膜。在特别优选的实施方案中， 生物表面是呼吸道的粘膜，例如鼻粘膜，咽、喉、气管、支气管和/或肺的内 膜。
可用于非生物表面上的抗感染配制品包括喷雾剂、溶液、悬浮液、 浸渍有溶液或悬浮液的擦拭物等。在特定的实施方案中，将抗感染配制品用 于医院、疗养院、救护车等中的固体表面上，包括例如，器具、工作台面和 医疗器械、医院设备。在优选实施方案中，非生物表面是医院器械或部分医 院设备的表面。在特定优选的实施方案中，非生物表面是手术器械或部分手 术设备。
5.6诊断方法
本发明还包括用于确定细菌感染中的致病因子的诊断方法。在某些 实施方案中，细菌感染致病因子的诊断通过以下进行：(i)培养来自患者的样 品，例如拭子、痰或其他适合培养导致感染的细菌的样品；(ii)使培养物与本 发明的一种或多种噬菌体、噬菌体产物和噬菌体混合物进行接触；和(iii)监 测该培养物细胞生长和/或裂解的证据。因为噬菌体和/或其分离产物(例如， 多肽、其生物活性片段或变体，或者编码它们的核酸)的活性倾向是物种或 菌株特异性的，所以对本发明的一种或多种噬菌体、噬菌体产物和噬菌体混 合物存在易感性或缺乏易感性可以指示导致感染的细菌的种类或菌株。
在一些实施方案中，从患者获取测试培养物并与F391/08、F17/19 或F58/19或者其变体中的一种或多种进行接触。培养物的生长降低和/或裂 解可以表明测试样品包含克雷伯氏肺炎菌，尤其是易受如本文公开的所用噬 菌体或噬菌体混合物感染的克雷伯氏肺炎菌的菌株，从而鉴定感染因子并允 许进行适当的诊断和/或治疗。
样品可以是从患者采集的组织活检或拭子，或者是流体样品，例如 血液、泪或尿。在优选实施方案中，从患者的呼吸道获取组织样品，例如粘 液样品、痰或来自鼻孔的拭子。
6.实施例
应当理解，本文描述的以下实施例和实施方案仅用于说明目的，本 领域技术人员会根据这些实施例和实施方案提出各种修改或改变，并且将包 括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。
除非另有说明，根据以下方法分离、处理和分析本文公开的特定噬 菌体。此外，根据葡萄牙法律，下文描述的研究在当地获得了分子医学研究 所动物伦理委员会的批准，并在全国获得了葡萄牙兽医服务总局(
Figure BDA0003671342020000281
Geral de
Figure BDA0003671342020000282
)的批准。研究中的所有动物均按照欧洲准则86/609/EC (欧洲共同体理事会，1986年11月24日关于各成员国有关用于实验和其他 科学目的动物保护的法律、法规和行政规定的协调与统一的理事会准则 86/609/EEC，Off J Eur Communities L358:1-28)、葡萄牙法律(条例1005/92)(葡萄牙农业部，10月23日关于用于实验和其他科学目的动物保护的第1005/92 号条例，Diário da República I–Série B 245:4930-4942)和《实验动物管理和 使用指南》(NRC2011)(实验动物研究学会.2011年.实验动物管理和使用指 南Washington(DC):NationalAcademies Press.)进行饲养。
本研究的一个目的是在急性肺部感染的鼠实验模型中研究雾化型 噬菌体混合物对铜绿假单胞菌和克雷伯氏肺炎菌的抗微生物活性。气雾剂形 式的噬菌体的雾化允许直接递送到受感染的肺部区域，克服了雾化抗生素的 某些副作用。
6.1实施例1-细菌菌株
2005年至2019年期间，在至少7个不同的医疗机构中收集了一组 选定的克雷伯氏肺炎菌细菌分离物(n＝36)。总体而言，这些分离物是从医院 环境(n＝25)、门诊患者(n＝9)或不明来源(n＝2)以及从多种多样的生物产物[尿 液(n＝10)、呼吸道分泌物(n＝5)、未知(n＝8)、腹腔积液(n＝5)和其它(n＝8)]中收 集的。通过圆盘扩散法对该组就抗生素易感性测试进行评估，针对的是选定 的一组临床上重要的抗生素(β-内酰胺类抗生素-氨苄青霉素、头孢他啶、哌 拉西林与他唑巴坦、和美罗培南；氟喹诺酮类-环丙沙星；氨基糖苷类-艮他 霉素；和磺胺类-三甲氧苄氨嘧啶与磺胺甲噁唑)。根据欧洲抗菌药物易感性 测试委员会(EUCAST,http://mic.eucast.org/Eucast2/)推荐的截留值对结果进 行解释。当分离物对三种或更多种结构上不相关的抗生素类别呈现出不易感 时，被认为具有多药抗性(MDR)(Magiorakos AP,Srinivasan A,Carey RB., Carmeli Y,Falagas ME等人2011.ClinMicrobiol Infect 2012；18:268–281)。
这组克雷伯氏肺炎菌细菌分离物(n＝36)也通过MLST进行了表征， 正如之前报道的那样，用于评估遗传多样性、克隆组和全球流行率。然后使 用Finch TV分析生成的序列，并使用MLST网站(https://pubmlst.org)上提供 的工具将其分配到各自的ST中。将每种细菌分离物划线接种到胰蛋白胨大 豆琼脂培养基平板(TSA,Biokar Diagnostics,PantinCedex,France)上，在 +37℃孵育18h。所有临床菌株都储存在-70℃的含有15％甘油(w/v)的胰蛋 白胨大豆肉汤(TSB,Biokar Diagnostics,Pantin Cedex,France)中，直到需要为止。
对于体外实验，将在-70℃冷冻保存的菌株在TSA上于37℃过夜生 长18h。将单个菌落于37℃振荡条件下在TSB中继续生长过夜。制备新的 细菌悬液(过夜培养物的稀释液)，并在37℃振荡孵育。当达到指数生长期(在 600nm处的光密度为0.3-0.5)时，收获细菌。在裂解曲线中使用了大约2.0×106 cfu/mL的接种物。
6.2实施例2-噬菌体来源、扩增和混合物
6.2.1噬菌体来源
从里斯本地区的污水中分离出克雷伯氏肺炎菌F391/08、Kle_F17/19 和Kle_F58/19烈性噬菌体，并在克雷伯氏肺炎菌397/07(F391/08)、克雷伯 氏肺炎菌237/14(Kle_F17/19)和克雷伯氏肺炎菌57/17(Kle_F58/19)临床菌株 中进行扩增。
为了分离抗克雷伯氏肺炎菌的溶菌噬菌体，使用了几种临床菌株。 对来自里斯本市区不同来源的污水进行了测试以根据感染克雷伯氏肺炎菌 临床菌株的能力来确定噬菌体的存在，其通过双层琼脂覆盖空斑测定法进行 (Kropinski A,Mazzocco A,Waddell TE,Lingohr E,Johnson RP.2009. Enumeration of bacteriophages by double agaroverlay plaque assay.Methods Mol Biol 501:69-76.)。
简言之，将细菌菌株于+37℃振荡条件下在TSB中生长过夜。制备 新的细菌悬液(过夜培养物的稀释液)，在+37℃振荡孵育，并且当达到指数生 长期(在600nm处的光密度为0.3-0.5)时，收获细菌。将每种培养物加入水样 品中，并将混合物在+37℃孵育30分钟期间向其中加入3ml预平衡的0.7％ 软琼脂。将琼脂-水-细菌悬液覆盖到1.5％的TSA平板上，使其在室温固化， 并在+37℃孵育。孵育18小时后，检查平板上菌苔内噬菌体空斑(透明圈)的 存在，表明存在噬菌体。使用无菌移液吸头挑取噬菌体空斑，转移到SM缓 冲液中，并储存在+4℃。
6.2.2噬菌体扩增
在评估宿主范围之前，在指示菌株中对新分离的噬菌体进行增殖、 扩增、纯化(3次连续洗脱)的过程。采用双层琼脂覆盖空斑测定法研究了36 种克雷伯氏肺炎菌细菌分离物对特定噬菌体感染的易感性。通过观察菌苔内 的噬菌体空斑来确定36种细菌分离物对特定噬菌体的敏感性。筛选出宿主 范围内感染百分比最高的噬菌体，进行新的扩增、高速离心浓缩、氯化铯 (CsCl)梯度纯化、噬菌体基因组DNA提取和限制性片段长度多态性分析过 程。
选择具有独特限制性图谱和更广泛宿主范围的噬菌体进行测序。使 用IlluminaHiSeq2000基因组分析仪通过焦磷酸测序确定全基因组序列。
在生物信息学分析之后，选择了最有希望的噬菌体来组成治疗性混 合物。在葡萄牙里斯本分子医学研究所的组织学和比较病理学实验室对克雷 伯氏肺炎菌F391/08、Kle_F17/19和Kle_F58/19噬菌体的形态进行了分析。 将这些数据与基因组分析相结合，并根据Ackermann分类法对这些噬菌体进 行分类(Ackermann HW.2009.Phage classificationand characterization. Methods Mol Biol 501:127-140)。
6.3实施例3-噬菌体分析
6.3.1表型表征
所收集细菌的表型表征表明，在β-内酰胺类抗生素中，100％的分 离物对氨苄青霉素不易感，97.2％的分离物对哌拉西林加他唑巴坦不易感， 86.1％的分离物对头孢他啶不易感，而77.8％的分离物对美罗培南不易感。 关于非β-内酰胺类抗生素，这组细菌分离物显示，91.7％对环丙沙星不易感， 72.2％对艮他霉素表现出不易感，而88.9％对三甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim) 与磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)表现出不易感。总体而言，33/36(91.7％)的 分离物是MDR(表3)。
表3.所选细菌分离物子集的克雷伯氏肺炎菌噬菌体感染、表型和基因型表 征(n＝36)。
Figure BDA0003671342020000311
Figure BDA0003671342020000321
Figure BDA0003671342020000331
此外，对抗生素易感性测试的解读表明产生了广谱β-内酰胺酶 (ESBL)或碳青霉烯酶(表1)。总体而言，大多数分离物对最后手段(last resource) 抗生素显示出不易感，例如碳青霉烯类(23/30,76.6％)、MDR(n＝22/30, 73.3％)，并产生临床上重要的碳青霉烯酶或ESBL(16/30,53.3％)，如全球传 播的VIM-2、KPC-2甚至NDM-1。
克隆谱系的鉴定显示出通过19种不同的ST代表的高度遗传多样 性，特别是检测到高风险克隆(ST11、ST13、ST14、ST15或ST258)，这些 克隆在世界范围内表现出广泛的流行性，并且实际上导致了疾病暴发以及高 发病率和死亡率(Brink,A.J.,2019.Epidemiology of carbapenem-resistant Gram-negative infectionsglobally.Curr Opin Infect Dis 32,609-616； Karakonstantis,S.,Kritsotakis,E.I.,Gikas,A.,2019.Pandrug-resistant Gram-negative bacteria:a systematic review ofcurrent epidemiology,prognosis and treatment options.J Antimicrob Chemother.；Li,J.,Li,Y.,Song,N.,Chen, Y.,2019.Risk factors for carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae infection: a meta-analysis.J Glob Antimicrob Resist.；Navon-Venezia,S.,Kondratyeva,K., Carattoli,A.,2017.Klebsiella pneumoniae:amajor worldwide source and shuttle for antibiotic resistance.FEMS MicrobiolRev 41,252-275；Sarda,C.,Fazal,F., Rello,J.,2019.Management of ventilator-associated pneumonia(VAP)caused by resistant gram-negative bacteria:which isthe best strategy to treat？Expert Rev Respir Med 13,787-798)。
6.3.2噬菌体形态学
利用透射电子显微术根据纯化噬菌体的病毒体形态对它们进行分 类。克雷伯氏肺炎菌F391/08、Kle_F17/19和Kle_F58/19噬菌体属于有尾噬 菌体目(Caudovirales)。F391/08噬菌体呈现出二十面体的头部，尾部细长、 不可收缩，通常是柔性的。这些特征及其基因组特性使我们能够将该噬菌体 归类为长尾噬菌体(Siphoviridae)科的成员。将Kle_F17/19和Kle_F58/19噬 菌体归类为肌尾噬菌体(Myoviridae)科的成员，它们呈现出可收缩的尾部和 二十面体的头部(衣壳)，并具有基板结构和尾丝(图1)。
6.3.3噬菌体宿主范围
在从里斯本地区的医院收集和鉴定的人类临床样品中分离出的36 种临床菌株中测试克雷伯氏肺炎菌选定的噬菌体。在这组多种多样的临床上 重要的克雷伯氏肺炎菌分离物中，53.8％被组成混合物的至少一种噬菌体感 染(表4)。
表4.每种克雷伯氏肺炎菌噬菌体在宿主范围内感染菌株的百分比和总覆盖 率。
Figure BDA0003671342020000351
事实上，克雷伯氏肺炎菌是一种影响人类的重要MDR病原体，也 是医院感染的主要来源，由于治疗选择有限与高发病率和死亡率相关。这些 菌株实际上可能对所有可用的抗生素类别都产生抗性，由于可用的治疗选择 有限，这给临床医师带来了巨大挑战(Brink,A.J.,2019.Epidemiology of carbapenem-resistant Gram-negativeinfections globally.Curr Opin Infect Dis 32, 609-616；Navon-Venezia,S.,Kondratyeva,K.,Carattoli,A.,2017.Klebsiella pneumoniae:a major worldwidesource and shuttle for antibiotic resistance. FEMS Microbiol Rev 41,252-275)。
自从产碳青霉烯酶克雷伯氏肺炎菌首次出现以来，已报告了近100 起由高危克隆导致的国际疾病暴发。最严重的暴发是由克隆组258造成的， 占所有暴发的68％，由三种ST组成：ST258、ST11和ST512。第二个最流 行的克隆组是克隆组15，由ST14和ST15组成，占所有暴发的约20％。其 他重要的ST在较小程度上导致暴发和临床上重要的感染(ST147、ST37、 ST101、ST17)(Navon-Venezia,S.,Kondratyeva,K.,Carattoli,A.,2017.Klebsiella pneumoniae:a major worldwide source and shuttle for antibioticresistance.FEMS Microbiol Rev 41,252-275)。
总体而言，由碳青霉烯类抗性克雷伯氏肺炎菌高危克隆造成的感染 是一个主要的健康问题，并且在全世界范围内许多次造成高死亡率。克雷伯 氏肺炎菌噬菌体能够有效地清除这样的分离物，即不仅表现出由获得性碳青 霉烯酶导致的碳青霉烯类抗性，而且属于上述九个显示出全球流行的高危克 隆中的五个(ST11、ST14、ST15、ST258和ST147)的分离物。
6.3.4基因组分析
对克雷伯氏肺炎菌F391/08、Kle_F17/19和Kle_F58/19噬菌体的基 因组DNA进行了全基因组测序。注释之后，绘制了每个基因组的圆形图谱， 显示了预测的编码假定蛋白的ORF和它们的推定功能(图2-4)。对所选噬菌 体的全基因组序列进行了初步的NCBI核苷酸blast分析(blastn)。克雷伯氏 肺炎菌噬菌体F391/08显示出与克雷伯氏菌噬菌体vB_Kpn_IME260(NCBI 参考序列：KX845404.2)存在高度显著的同源性。Kle_F17/19噬菌体显示出 与克雷伯氏菌噬菌体KOX1(NCBI参考序列：KY780482.1)的相似性最高。 噬菌体Kle_F58/19基因组序列与NCBI数据库中的其他序列具有高度同源 性。发现与克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Potts1(NCBI参考序列： MN013081.1)的相似性最高。
噬菌体F391/08的基因组大小为113073bp(图2)，在96％的基因组 覆盖率下其与克雷伯氏菌噬菌体vB_Kpn_IME260具有高达95％的序列同一 性。预测了173个ORF，解析了28％的推定功能，其中25个是tRNA基因。 预测的ORF的其中之一与来自NCBI非冗余蛋白序列数据库的任何序列均 不具有明显同源性。预测的ORF中的90个与来自NCBI非冗余蛋白序列数 据库的蛋白质具有同源性，但无法解析推定功能。对Kle_F17/19噬菌体的基 因组分析显示，在94％的基因组序列中45423bp序列(图3)表现出与肌尾噬 菌体科克雷伯氏菌噬菌体KOX1存在高达96％的同一性(Brown TL,Petrovski S,Hoyle D,Chan HT,Lock P,Tucci J.2017.Characterization and formulation into solid dosage forms of anovel bacteriophage lytic against Klebsiella oxytoca. PLoS ONE 12(8):e0183510)。64个预测的ORF中有50％呈现出解析的推定 功能。在32个ORF中无法解析推定功能。具有169725bp基因组(图4)的噬 菌体Kle_F58/19与肌尾噬菌体科克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Potts1具有高 度相似性。在98％的基因组序列中序列同一性高达97.5％。预测了292个 ORF，解析了45.9％的推定功能，其中7个是tRNA基因。大约45％的预测 ORF与来自NCBI非冗余蛋白序列数据库的序列具有同源性，但是没有解析 功能。只有一个ORF与来自NCBI非冗余蛋白序列数据库的任何序列均不 具有明显同源性。
在这些噬菌体的序列中，未发现与已知毒力或毒素蛋白或者与通常 与溶原性相关的元件(整合酶、阻遏子和抗阻遏子)存在明显相似性。
6.3.5噬菌体混合物的裂解活性
为了表征噬菌体混合物，评估了新型克雷伯氏肺炎菌F391/08、 Kle_F17/19和Kle_F58/19噬菌体对浮游生物培养物的裂解活性。
使用预先确定的细菌接种物在受控条件下绘制常规裂解曲线。用大 约2x106个cfu/mL的接种物制备培养物。使用了两种不同的克雷伯氏肺炎菌 菌株57/17和237/14，因为在我们的细菌收集物中无法找到同时被3种噬菌 体感染的高毒力株。对每种噬菌体进行单独(图5和图6)和组合(图7)测试， 其中MOI近似等于10。在8小时内每隔1小时监测一次活细菌计数，并在 噬菌体接种后(ppi)24h时再次监测。
在MOI近似等于10的情况下对噬菌体F391/08进行单独测试(图 5)，并且在噬菌体接种后(ppi)1h时，该培养物的细菌载量与细菌对照培养 物(8.4x106个cfu/mL)相比降低了约3个对数级(2.3x103个cfu/mL)。在最初的 4小时内，F391/08能够将活细菌计数保持在低于104个cfu/mL。培养物中的 细菌载量开始增加，并且在ppi 8h时，培养物超过了最初的细菌载量(3.8x107个cfu/mL)。然而，在ppi 24h时，活菌计数为8.8x107个cfu/mL，与对照培养物(1.2x1011个cfu/mL)相比出现极其显著降低，这表明F391/08即使在稳定 期仍保留感染KLE57/17的能力。
在MOI约为10的情况下测试了噬菌体Kle_F17/19对抗克雷伯氏肺 炎菌237/14，并且在1小时内，与细菌的对照培养物(1.0x107个cfu/mL)相比， 将细菌的活菌计数降低了约5个对数单位(5.0x102个cfu/mL)。直到ppi 4h 时，Kle_F17/19噬菌体能够将培养物中的细菌载量维持在低于104个cfu/mL， 正如F391/08在其宿主中观察到的一样。在ppi 8h时，活细菌计数迅速增加 到1.1x108个cfu/mL，并持续到培养物孵育结束(ppi 24h)，此时的活细菌计 数为3.1x1010个cfu/mL，几乎比对照培养物的测定值高出1个对数级。
Kle_F58/19噬菌体(图6)对菌株57/17的作用比噬菌体F391/08更 快。在ppi 1h时，与细菌的对照培养物相比活细菌计数降低了大约4个对数 单位，达到2.0×102个cfu/mL。到ppi 8h时，活细菌增加，该时间点的计数 为1.8x107个cfu/mL。在ppi 24h时，噬菌体Kle_F58/19对抗宿主(例如F391/08) 不再那么有效，但仍然能够实现96％的活细胞降低，与细菌的对照培养物相 比这是非常显著的减少。
分别的情况下，虽然3种噬菌体具有高度裂解能力，但随着时间的 推移它们在各自宿主中的效力略有差异，这可能反映了它们在吸附率、潜伏 期和裂解量方面的差异(数据未显示)。
图7描绘了在克雷伯氏肺炎菌57/17中近似MOI为10的情况下， 噬菌体F391/08和Kle_F58/19的联合裂解曲线。在ppi 1h时(1.0x101个cfu/mL)，观察到噬菌体的活性明显下降。在接下来的8小时内，噬菌体的联 合作用虽然出现一些变化，但仍将活细胞计数保持在低于104个cfu/mL，从 而延长了单独情况下观察到的每种噬菌体的作用时间。尽管细菌重新生长， 但在ppi 24h时细胞计数为5.1x107个cfu/mL，与对照培养物的细菌载量(4.2x1010个cfu/mL)相比，有了显著降低(约3个对数单位)。
除了F391/08和Kle_F58/19的裂解曲线外，还用3种噬菌体 F391/08、Kle_F58/19和Kle_F17/19制备了第二种联合培养物(MOI约为10)， 旨在观察Kle_F17/19对F391/08和Kle_F58/19有效性的任何作用。尽管克 雷伯氏肺炎菌57/17不容易受噬菌体Kle_F17/19感染，但当在培养的前6小 时联合使用时，该噬菌体的存在似乎诱导了对噬菌体F391/08和Kle_F58/19 效力的稳定效应(图9)。在ppi 1h时，与F391/08和Kle_F58/19的曲线相比， 细胞计数的减少并不明显，但是随后几个小时内的行为表明了与Kle_F17/19 的相互作用。在ppi 8h时，与对照培养物的5.3×109个cfu/mL相比，细菌载 量较低，为5.3×103个cfu/mL。在培养物孵育结束时，测定的细胞计数为 4.7×107个cfu/mL，该浓度接近于培养开始时投入的细菌浓度。
如先前Loc-Carrillo和Abedon在2011年所报道的那样(Loc-Carrillo C,AbedonST.2011.Pros and cons of phage therapy.Bacteriophage 1(2):111-114)，可以将不同的噬菌体混合在混合物中以增强其效率，通常会 产生总体上更大的抗菌活性谱。本研究恰恰证明了这一点。
6.3.6结论
在本研究中表征和测试的噬菌体混合物由三种克雷伯氏肺炎菌噬 菌体F391/08、Kle_F17/19和Kle_F58/19组成。基因组序列分析没有鉴定出 与整合、毒素或抗生素抗性相关的任何已知基因，这些都是关于噬菌体安全 使用的重要特征。比较基因组学分析显示，克雷伯氏肺炎菌噬菌体F391/08、 Kle_F17/19和Kle_F58/19分别与克雷伯氏菌噬菌体vB_Kpn_IME260、KOX1 和vB_KpnM_Potts1具有很大的相似性。
克雷伯氏肺炎菌噬菌体vB_Kpn_IME260是一种T5样病毒(Xing S, Pan X,Sun Q,Pei G,An X,Mi Z,Huang Y,Zhao B,Tong Y.2017.Complete genome sequence of anovel multidrug-resistant Klebsiella pneumonia phage, vB_Kpn_IME260.GenomeAnnounc 5:e00055-170)。产酸克雷伯氏菌(K. oxytoca)噬菌体KOX1与Kle_F17/19的同源性最高，Brown等人(Brown TL, Petrovski S,Hoyle D,Chan HT,Lock P,TucciJ.2017.Characterization and formulation into solid dosage forms of a novelbacteriophage lytic against Klebsiella oxytoca.PLoS ONE 12(8):e0183510)将KOX1描述为肌尾噬菌体 科。除了形态学外，文献中没有关于vB_KpnM_Potts1噬菌体的信息。透射 电子显微术分析证实，噬菌体Kle_F58/19和Kle_F17/19属于肌尾噬菌体科。
噬菌体的另一个重要选择标准是它们的宿主范围，应该尽可能广 泛，特别是包括临床上流行的细菌种类(Gill JJ,Hyman P.2010.Phage choice, isolation,andpreparation for phage therapy.Curr Pharm Biotechnol 11(1):2-14)。 对过去几年中在里斯本都市区的医院中分离出来的具有高度基因组多样性 的36种临床菌株，测试了克雷伯氏肺炎菌噬菌体F391/08、Kle_F17/19和 Kle_F58/19的裂解活性程度。
在体内功效研究之前，通常使用时间-杀伤曲线来研究单一和组合 药物化合物的抗菌效果和给药方案(NCCLS.1999.Methods for determining bactericidal activityof antimicrobial agents:approved guideline.940West Valley Road,Suite 1400,Wayne,Pennsylvania 19087USA:NCCLS)。在当前的 研究中，绘制了裂解曲线以呈现细菌培养物受到噬菌体裂解能力(单独和联 合情况下)的影响。使用了单一细菌接种物。该值是根据以前的证据精心选 择的(Mendes JJ,Leandro C,Motolla C,Barbosa R,Silva F,Oliveira M,Vilela C, Melo-Cristino J,Gorski A,Pimentel M,
Figure BDA0003671342020000391
C,Cavaco-Silva P,Garcia M. 2014.In vitro design of a novel lytic bacteriophagecocktail with therapeutic potential against organisms causing diabetic footinfections.J Med Microbiol 63:1055-1065)。在噬菌体接种后的第一和第二小时之间，所有培养物都出现 最初的细菌减少，随后在6小时后有明显的重新生长，在24小时后甚至更 明显。在单独情况下，所有三种噬菌体都显示出对浮游生物细胞的高度裂解 效力。在24h培养时95％至99％的细菌减少表明，它们各自控制克雷伯氏 肺炎菌载量的能力提高(除了Kle_F17/19之外)。组成混合物的3种噬菌体中 的两种的组合活性呈现出对细菌菌株的协同溶菌作用。选定的MOI是基于 “10的复数规则”来选择的，该规则指出如果目标是显著降低细菌密度，那么 应该争取在平均每个细菌上吸附大约10的倍数个噬菌体(AbedonST.2009. Kinetics of phage-mediated biocontrol of bacteria.Foodborne PathogDis 6:807-815；Kasman LM,Kasman A,Westwater C,Dolan J,Schmidt MG,NorrisJS.2002.Overcoming the phage replication threshold:a mathematical model withimplications for phage therapy.J Virol 76:5557-5564)。在暴露于噬菌体的 浮游生物细胞中观察到重新生长。
6.3.7实施例4-铜绿假单胞菌噬菌体混合物与抗生素的体外相互作用
采用体外技术来评估F99/10、F27/12和F95/13的噬菌体混合物与 选择的经常用作医院肺炎经验性疗法的抗生素之间的潜在相互作用。虽然该 混合物针对革兰氏阴性菌，但经验性抗生素治疗通常包括用于治疗由革兰氏 阳性病原体导致的肺炎的药物；因此，还涉及了针对治疗金黄色葡萄球菌的 分子。
简言之，使用培养液微稀释法来测定在不同MOI(0.1、1和10)， 在存在或不存在单一和组合噬菌体的情况下，对β-内酰胺类(哌拉西林与他 唑巴坦、头孢他啶和美罗培南)、氨基糖苷类(阿米卡星)、糖肽类(万古霉素) 和恶唑烷酮类(利奈唑胺)的最低抑制浓度(MIC)。使用由所有三种噬菌体感染 的单一菌株(PSA_1992/05；NCIMB保藏号为42914)，对该方法进行开发和 优化，作为铜绿假单胞菌的概念验证。选定的MIC范围为0.016至32mg/L， 允许包括和检测所有七种抗生素的易感性和抗性折点(breakpoint)。使用不同 的时间点(4h、6h、12h和18h)来优化该技术，但最终读数在18h时确定。 所有实验均重复进行。本研究对单一噬菌体进行了优化，并在此处提供了最 终测定法，其中包含完整混合物的数据。
简言之，用混合物(噬菌体Psa_F99/10、Psa_F27/12和Psa_F95/13) 进行的最终测试证实了对每种分别的噬菌体获得的结果(数据未显示)。对于 所有测试的抗生素以及本研究期间测试的所有三种MOI(0.1、1和10)，混 合物的效力足以使PSA_1992/05的MIC从高得多的MIC值转变为≤0.016 mg/L(表5)。
表5.在噬菌体混合物存在的情况下，MOI为0.1、1和10时，对铜绿假单胞 菌PSA_1992/05的MIC。
Figure BDA0003671342020000401
Figure BDA0003671342020000411
用噬菌体混合物(混合物活性对照读数)感染PSA_1992/05，在18h时未显示 出对细菌生长的抑制作用。TZP，哌拉西林与他唑巴坦；CZP，头孢他啶； MEM，美罗培南；AK，阿米卡星；VA，万古霉素；LZD，利奈唑胺；CS， 粘菌素。NA，不适用。
这一数据表明，在这些抗生素存在的情况下，F99/10、F27/12和 F95/13的混合物的联合效力增加。未观察到添加噬菌体混合物产生的负面效 应。
总体而言，虽然万古霉素和利奈唑胺是对革兰氏阴性菌不会表现出 任何活性的抗生素，但它们的存在并没有抑制混合物的活性。用于治疗医院 肺炎的主要抗生素类别已经与单独的噬菌体进行了联合评估，以进行概念验 证和优化目的，并与混合物形式的噬菌体进行了联合评估。总体而言，未检 测到可能导致噬菌体抑制或抗生素活性显著降低的相互作用。
6.3.8实施例5-吸入性噬菌体应用的可行性研究
雾化已陆续用于吸入疗法，即通过粉状配制品在动物模型中使用噬 菌体(Chang,R.Y.K.,Chen,K.,Wang,J.,Wallin,M.,Britton,W.,Morales,S., Kutter,E.,Li,J.,Chan,H.K.,2018.Proof-of-Principle Study in a Murine Lung Infection Model ofAntipseudomonal Activity of Phage PEV20 in a Dry-PowderFormulation.Antimicrob Agents Chemother 62,2)。在这里，利用液体配制品， 使用振动筛网式雾化器的不同选项，开展了吸入性噬菌体应用的可行性研 究。这些由医疗级雾化器组成，不仅用于医院病房，还用于重症监护室，它 们可以充分连接到任何标准呼吸设备管路。
为了比较三种振动筛网式雾化器装置(Aeroneb、Nebutec 4、Nebutec 6)，使用噬菌体悬浮液和作为稀释剂的DPBS(第一个实验)或0.9％NaCl溶 液(第二个实验)，制备了含有109pfu/ml的每种噬菌体F99/10、F27/12和 F95/13的混合物。对于每种稀释剂，使用所有三种装置进行了三次独立的雾 化实验。每次雾化时，在1分钟的时间范围内雾化1ml噬菌体混合物，随 后沉降60分钟。将噬菌体收集在含有15ml相应收集缓冲液的培养皿中。 分别使用每种噬菌体的特异性检测(滴定)菌株来确定噬菌体的滴度。每种装 置的液滴大小是通过雾化和激光衍射以实验方式确定的，并且与生产商信息 一致。而且，以实验方式确定气雾剂递送率，并根据实测数据计算出肺部沉 积概率，表明Aeroneb和Nebutec 4二者实现了类似的沉积，且优于Nebutec 6(数据未显示)。值得注意的是，由于液滴粘附在雾化园筒上，仅有75％±8.6％ 的雾化液体成功沉积在培养皿上。总体而言，与DPBS相比，以NaCl作为稀释剂的噬菌体回收率更高。此外，对于所有三种噬菌体，Aeroneb装置产 生了最一致的回收率(数据未显示)。
根据结果，选择了Aeroneb装置和NaCl作为媒介物。总体而言， 获得的结果允许选择Aeroneb振动筛网式雾化器装置，然后将其应用于在 PCLS离体模型中进行的剩余效力和毒性研究(参见实施例6)。两种配制品之 间、不同噬菌体之间的噬菌体滴度的回收和对数减少是一致的，并且也与整 个系统中预期的噬菌体损耗一致。
6.3.9实施例6-在精切肺切片(PCLS)离体模型中的效力和毒性研究
为了评估噬菌体F99/10、F27/12和F95/13的效力和毒性，在PCLS 铜绿假单胞菌感染模型中精心设计了全面的离体研究。该系统在大鼠PCLS 中进行了规划和优化，在存在和不存在抗生素共处理的情况下，通过浸没和 雾化的方式，用纯化的F99/10、F27/12和F95/13的混合物对大鼠PCLS进 行处理。然后将该系统转移到最终的人PCLS设置下。为了评价单独或与抗 生素联合情况下，将噬菌体吸入性应用于铜绿假单胞菌感染的人类肺组织后 的效力和毒性，使用人类PCLS铜绿假单胞菌进行了实验，并将雾化型噬菌 体混合物直接施加到气-液界面培养的组织上，而抗生素(以0.5μg/ml的亚抑 制浓度)是浸没式应用(即，进入培养基内)。此外，用雾化型噬菌体混合物处 理未感染的对照，以排除噬菌体对人类肺组织的细胞毒性作用。类似地，对 于大鼠PCLS获得的结果(数据未显示)，雾化型噬菌体处理和抗生素都以相 似的程度降低了受感染的人类PCLS的细菌载量，而它们的联合处理在减少细菌方面产生了强大的协同效应。
单独的噬菌体处理将细菌载量降低了超过1个对数级，而单独的抗 生素处理导致了约4个对数级的cfu降低。在联合情况下，观察到协同效应， 使细菌载量降低了超过5个对数(图8)。在分析组织活力时，未观察到纯化 的噬菌体对未感染组织的细胞毒性作用。用纯化的噬菌体处理受感染的PCLS可完全挽救由铜绿假单胞菌感染引起的活力丧失。单独的抗生素处理 或与噬菌体处理的联合将组织活力恢复到可比的程度(图9)。在未感染的人 类PCLS中，在处理后24h可以检测到与接种物数量相当的噬菌体。相反， 在受感染样品中观察到噬菌体复制，而在与抗生素共处理的受感染样品中未 观察到噬菌体复制，这与观察到的细菌载量差异一致(数据未显示)。
总体而言，在铜绿假单胞菌PCLS离体模型中进行的研究表明，用 F99/10、F27/12和F95/13的混合物处理受感染的大鼠/人类切片，不仅显示 出通过浸没和雾化处理的效力，而且还恢复了肺组织的活力，同时未显示出 毒性效应，即使在联合抗生素疗法(美罗培南、阿米卡星和万古霉素)的情况 下也是如此。在多重条件下(浸没式与雾化型；大鼠与人类；噬菌体裂解物 与纯化的噬菌体)，对用该混合物处理的未感染切片的分析表明，该混合物 处理对肺组织的活力没有负面效应，这进一步证实了在肺部没有由噬菌体处 理导致的可预测的毒性，特别是细胞毒性。这一证据也与以前的研究一致， 以前的研究也表明在其他感染模型和同情使用病例中，噬菌体处理无不良反 应(McCallin,S.,Sacher,J.C.,Zheng,J.,Chan,B.K.,2019.Current State of Compassionate Phage Therapy.Viruses11,343；Oliveira,A.,Sereno,R.,Nicolau, A.,Azeredo,J.,2009.In vivo toxicitystudy of phage lysate in chickens.Br Poult Sci 50,558-563)。
对于不同的施用途径，雾化型噬菌体处理成功降低了受感染PCLS 的细菌载量，因此显示出与浸没式处理相当的效力，尽管在喷雾器中出现了 预期的噬菌体损耗。观察到在接近24h时，噬菌体滴度有所增加。接种物中 噬菌体滴度的测定表明，有活无抗生素混合物的情况下样品中的噬菌体数量 相当，因此抗生素的存在未影响噬菌体滴度或活性。另一方面，也可以确认 该混合物不会干扰抗生素的活性。事实上，噬菌体/抗生素共处理完全恢复了 组织活力。总体而言，这种联合也得到在受感染和未感染的大鼠/人类肺切片 中所有安全性终点的支持。
6.3.10实施例7-精切肺切片(PCLS)研究
在精切肺切片(PCLS)的克雷伯氏肺炎菌感染离体模型中，研究了吸 入性应用克雷伯氏肺炎菌F391/08、Kle_F17/19和Kle_F58/19噬菌体对呼吸 系统细菌感染的效力。该研究包括确认雾化后噬菌体的生物学活性、克雷伯 氏肺炎菌感染模型的建立和在大鼠PCLS中雾化后噬菌体活性的评估。
实验在Fraunhofer ITEM临床前药理学系(Hannover,Germany)进行。 为制备PCLS而处死动物以摘取器官的行为已在主管部门登记(Lower Saxony Federal State Officefor Consumer Protection and Food Safety)，并按照 德国动物保护法的规定(2006年5月18日的德国动物保护法,BGBl.I S.1206, 1313；2014年7月28日通过,BGBl.I S.1308)以及欧洲议会和理事会关于用 于科学目的动物保护的准则2010/63/EU执行。
雌性大鼠(Wistar WU,实验时为8-21周龄)获自Charles River (Sulzfeld,Germany)。在用于制备PCLS之前，将动物保持在常规饲养条件 (22℃、55％的湿度和12-h昼/夜节律)下。通过过量的戊巴比妥钠(Narcoren, Merial GmbH,Hallbergmoos,Germany)并经由腔静脉放血处死大鼠。用37℃ 的温热低熔点琼脂糖/培养基溶液(终浓度为1.5％(v/v))填充大鼠全肺。填充 的肺叶在冰冷的PBS中冷却，以使琼脂糖聚合。从肺组织中钻取直径为10 mm的圆柱体，并使用Krumdieck切片机(Alabama Research and Development,Munford,AL,USA)切成约300μm厚的切片。将切片收集在4℃的冷EBSS 中，然后
转移到装有PCLS培养基的培养皿中，并在细胞培养条件下(37℃、 5％CO2)孵育约30分钟。随后，用PCLS培养基洗涤切片四次，持续30分 钟，最后在感染实验前在细胞培养条件下孵育过夜。克雷伯氏肺炎菌测试感 染和检测菌株(57/17、131/15、130/14和25/14)在37℃和150rpm条件下于 TSB培养基中生长过夜。将过夜培养物以1:30稀释，并在37℃和150rpm 下再培养1h，以产生处于指数生长期的培养物。使用OD600为0.3–0.5的 检测菌株进行空斑形成测定。将感染菌株57/17的培养物调整为2x106个 CFU/ml，并将接种物样品涂板以确认cfu浓度。
使用振动筛网式雾化器(AeroNeb)进行噬菌体雾化。简言之，在0.9％ NaCl中制备含有109个PFU/ml的每种噬菌体的混合物，每次雾化产生气雾 剂，在1分钟的时间范围内雾化1mL噬菌体混合物，随后是沉降60分钟。
对于雾化预测试(无PCLS)，制备噬菌体F391/08、Kle_F17/19和 Kle_F58/19的噬菌体混合物，将噬菌体雾化并收集在含有15ml媒介物作为 收集缓冲液(0.9％NaCl)的培养皿中。通过双层琼脂覆盖空斑测定法来测定噬 菌体的生物学活性。
在大鼠PCLS中执行雾化型噬菌体的效力，以评估在PCLS上的噬 菌体雾化在克雷伯氏肺炎菌感染模型中是否有效。因此，将大鼠PCLS在12 孔transwell板(500μl储液容积)中的气-液界面(ALI)处培养，并用克雷伯氏 肺炎菌菌株57/17感染(以1x105个CFU/PCLS直接施加到组织上)。感染后(p.i.) 1小时的时候，取出接种物，洗涤PCLS，并将transwell转移到新配套板的 孔上，其中在下隔室中含有500μl新鲜培养基。制备含有1x1010 PFU/mL的每种噬菌体的噬菌体混合物(稀释剂：0.9％NaCl)。使用Aeroneb装置和带有 用于4个transwell的定制适配器的暴露系统，将1ml噬菌体混合物或媒介 物(0.9％NaCl)雾化到PCLS上(雾化时间：1分钟，沉降时间：60分钟)。使 用分别的暴露染毒系统和适配器来雾化噬菌体或媒介物，以排除污染。将 PCLS在37℃、5％CO2条件下继续孵育过夜，并在p.i.24h时收获和分析样 品。此外，在此第一个实验中，在噬菌体雾化后直接收获分别的样品，以确定每孔实际沉积的PFU。
在确认了噬菌体雾化在克雷伯氏肺炎菌PCLS模型中的效力后，将 实验扩展到测试单独的噬菌体混合物以及与抗生素共处理联合的效力。如前 文所述进行大鼠PCLS的制备、培养和感染以及通过雾化进行噬菌体处理。 对于与抗生素的联合处理，向各PCLS的培养基中分别加入终浓度为8、8 或1μg/ml的美罗培南、万古霉素和阿米卡星。在p.i.1小时的时候，抗生素 处理与噬菌体处理同时进行。因此，将洗涤过的PCLS transwell转移到新配套板中，其基底外侧隔室包含培养基或含有抗生素混合物的培养基，并在顶 端暴露于如上所述的噬菌体或盐水气雾剂。
分析PCLS的cfu载量、组织活力和噬菌体复制。
为了分析细菌载量和噬菌体滴度，用1％Triton X-100/PBS在4℃裂 解PCLS 30分钟。去除组织残留物，并将裂解物在4℃以8000xg离心10分 钟以沉淀细菌。澄清的裂解物用于测定噬菌体滴度。将沉淀重悬于250μl PBS/Tween中并用于测定细菌载量。
通过空斑测定法来测定噬菌体滴度，其分别使用克雷伯氏肺炎菌菌 株131/15、130/14和25/14来特异性检测噬菌体F391/08、Kle_F17/19和 Kle_F58/19。用噬菌体混合物处理的每个样品都与每种检测菌株共涂板。通 过组织裂解从PCLS中释放噬菌体，并通过离心从细菌中分离出来(如上所 述)。在Eppendorf试管中制备用PBS/Tween连续1:10稀释的噬菌体样品， 并通过翻转混合，以避免机械干扰。将100μl每种噬菌体稀释液与100μl
检测菌株培养物一起添加到3ml调温至48℃的软琼脂中，并将混 合物涂布到一个TSA平板上。在每个PFU实验结束时，将所有检测菌株都 进行涂板以排除细菌培养物中噬菌体的污染。琼脂平板在37℃孵育过夜后， 对噬菌体空斑进行计数。为了计算每个PCLS的PFU，空斑计数乘以各自的 稀释系数，再乘以反映噬菌体样品总体积(250μl)与涂板体积(100μl)之比的 系数2.5。
为了定量PCLS裂解物中的细菌载量，制备了用PBS/Tween连续 1:10稀释的各样品，并将50μl的每种稀释液涂布到一半TSA平板上。琼脂 平板在37℃孵育过夜后，对菌落进行计数。为了计算每个PCLS的CFU， 菌落计数乘以各自的稀释系数，再乘以反映细菌悬液总体积(250μl)与涂板体 积(50μl)之比的系数5。
通过钙黄绿素染色评估未感染和受感染组织的活力。钙黄绿素AM 渗透入完整细胞并在细胞内水解生成钙黄绿素，这是一种保留在细胞质中的 荧光化合物。PCLS内死亡或受损细胞的增加会导致钙黄绿素染色强度的降 低。将在70％乙醇中室温孵育15分钟的PCLS用作参照(“死亡对照”)。所有 PCLS均用温热培养基洗涤一次，并在黑暗中与钙黄绿素AM染色溶液(4 μM，溶于DMEM/F12中)在37℃和150rpm下一起孵育45分钟。用PBS洗 涤3次后，在4℃下的黑暗中，用1％Triton-X100裂解PCLS 30分钟。随后， 将50μl组织裂解物转移到黑壁96孔板中，并使用微孔板检测仪测量荧光(激 发波长：485nm，发射波长：535nm)。所有样品均是一式两份测量。
6.3.11实施例8 PCLS克雷伯氏肺炎菌感染模型的雾化研究
在第一雾化测试之前，测定了雾化后噬菌体的生物学活性。
在0.9％NaCl中制备了1x106个PFU/ml的噬菌体混合物。雾化后， 回收的噬菌体滴度表明在沉积过程中损耗较高，因此用1×109个PFU/ml的 每种噬菌体制备新的混合物。还进行了其它的雾化测试以评估雾化后的预期 噬菌体滴度。详细结果见表3。
表6.用Aeroneb雾化器雾化后的噬菌体回收。
Figure BDA0003671342020000471
综上所述，在初始噬菌体混合物为1x109个PFU/ml时，雾化后可 以预计剩余活性大约低1.5至2.5个对数级(噬菌体391/08约2个对数级、噬 菌体Kle_F17/19约1.5个对数级、噬菌体Kle_F58/19约2.5个对数级)。为 了适应这种降低，决定以每种噬菌体1x1010个PFU/ml的更高噬菌体混合物 滴度进行效力实验。
基于这些结果，可以得出结论，尽管雾化后噬菌体滴度的活性部分 丧失，但由于雾化后的噬菌体活性得到确认，这应该足以在PCLS感染模型 中显示效力。
对于用雾化型噬菌体的处理，在transwell中的气-液界面处培养大 鼠PCLS，并将细菌接种物以及雾化型噬菌体(或作为媒介物处理的NaCl)直 接沉积到组织上。如前所述进行雾化。
雾化含有1x1010个PFU/ml的每种噬菌体的噬菌体混合物紧接雾化 后(p.i.1h时)导致噬菌体391/08和Kle_F17/19的沉积滴度约为每孔(每个 PCLS)1x107个PFU，而噬菌体Kle_F58/19的沉积滴度约为1x104个 PFU/PCLS。噬菌体391/08和Kle_F58/19在克雷伯氏肺炎菌57/17感染的 PCLS中强力复制，分别达到约3x108个PFU和2x107个pfu的滴度，而噬 菌体Kle_F17/19的滴度(2x106个PFU)甚至略有下降(图10)。这是预料之中 的，因为噬菌体Kle_F17/19不能感染克雷伯氏肺炎菌57/17。尽管如此，还 是决定在该菌株中测试3种噬菌体的混合物，以收集由该噬菌体处理可能引 起的任何毒性效应的结果。
用1×105个CFU克雷伯氏肺炎菌的接种物感染PCLS 1小时，然后 移出接种物，洗涤并转移到新孔中，以避免非组织附着的浮游细菌过度生长。 采用这种程序，紧接暴露于媒介物(NaCl)后的实际细菌载量约为104个CFU/PCLS。如果暴露于雾化型噬菌体混合物1小时，CFU载量已经降到102个CFU/PCLS，表明细菌被噬菌体快速裂解(图8)。在媒介物处理的PCLS中， 在p.i.24h时，强力的细菌生长产生了大约4×108个CFU的细菌载量。在p.i. 24h时，用雾化型噬菌体混合物处理导致细菌载量降低约2个对数级。因此， 雾化型噬菌体处理成功降低了克雷伯氏肺炎菌感染的PCLS的细菌载量(图 11)。
为了实现单独或与抗生素联合吸入性应用后噬菌体效力的概念验 证，用克雷伯氏肺炎菌菌株57/17感染在气-液界面处培养的大鼠PCLS，并 用噬菌体混合物直接雾化到气-液界面培养的组织上。对于共处理，在噬菌 体处理时，以浸没方式(即，进入transwell基底外侧隔室的培养基内)施加抗 生素(以亚抑制浓度)。每种条件使用了具有4个重复孔的1个平板。其中2 个孔用于测定CFU/PFU，而另外2个孔用于测定组织活力(钙黄绿素染色)。 雾化噬菌体混合物在紧接雾化后(p.i.1h时)导致对于噬菌体391/08和 Kle_F17/19的沉积约为107个PFU，而对于噬菌体Kle_F58/19的沉积约为 105个PFU(图12)。
随后，噬菌体391/08和Kle_F58/19在克雷伯氏肺炎菌感染的PCLS 中复制，导致在p.i.24h时噬菌体滴度增加2-3个对数级，而噬菌体 Kle_F17/19的滴度保持稳定。抗生素共处理的样品显示出相似的噬菌体滴 度，由于观察到细菌载量未受影响这是可以预期的。
雾化型噬菌体处理成功地将受感染PCLS的CFU载量降低了约1.5 个对数级(图13)，而使用亚抑制剂量的抗生素(浸没式)处理并没有降低CFU。 值得注意的是，抗生素与雾化型噬菌体混合物的联合处理显示出强大的协同 效应，因为它将CFU载量降低了约4个对数级(图13)。
用克雷伯氏肺炎菌感染在p.i.24h时导致PCLS的组织活力显著丧 失(图14)。用雾化型噬菌体混合物处理显著抑制了这种感染诱导的组织活力 丧失(图14)。用亚抑制剂量的抗生素处理对组织活力没有影响，正如根据未 改变的CFU所预期的那样。在噬菌体/抗生素共处理中，对细菌载量的协同 效应没有反映在组织活力的进一步提高中，因为噬菌体单独处理已经显著提 高了组织活力。
精切肺切片(PCLS)是新鲜的肺组织切片，作为器官型模型，包含肺 中存在的所有细胞类型，并可以详细研究肺组织的响应。高度的复杂性提供 了生理上相关的模型。从PCLS研究中获得的数据表明，雾化型噬菌体治疗 克雷伯氏肺炎菌感染的肺组织切片具有明确效力。噬菌体混合物施用降低了 细菌载量并恢复了组织活力。在与亚抑制剂量的抗生素共处理中，观察到对 所测试的抗生素抗性克雷伯氏肺炎菌菌株的CFU降低的额外的协同效应。
在阅读了前面的描述后，本领域技术人员将会想到某些修改和改 进。应该理解的是，为了简明和可读性，本文中已经删除了所有这些修改和 改进，但是它们都适当地处于以下权利要求的范围内。
序列表
<110> TECHNOPHAGE, INVESTIGAÇÃO E DESENVOLVIMENTO EM BIOTECNOLOGIA, SA
<120> 包含呼吸系统抗菌噬菌体的鸡尾酒式组合物及其使用方法
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<400> 1
attatgcaaa ctaaacgaaa tcatacactc cactaattaa aggttgacaa catgaaacgc 60
tttgtaatat catctaaacc ggcggcaaaa ttgaacaaaa tggcaagctc ggaactggtc 120
aaaatgcagc gcgatatggc gcggcgttac cgctcttatc agcgcggagg tcagcaaggc 180
ttaccgatga tttgggataa catgatgcgt tatctaaaat ctttacaaaa taacgtttga 240
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tgtgcgcgtt ctcactcagc acgccattgc tgacggcctg attgatgatg ccgatggtct 1320
ggcaagtctg gaacaaatga agctcgacca actggacgtt atcgcccgta tggttggcgt 1380
tcaggatgaa gtaaaagaat cagcagaata attataatgc gcctccctag cggggcgcat 1440
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ttattaaatt aacgggaacc gttgtggatg aattaatcca aacggggtat caggataata 1560
aggttatgac gcccccaagc gttaaagtac ctgaatatat tgttttgtgg gttaaccctg 1620
atgcggatac tttcgggatg gctattaacc gcgaagtctt taagccggaa atgctggaat 1680
tatcttcccg cgaaatttac cttctcaatt acgctttcag cgtagaagaa aaggaggttg 1740
taaaatgatc tttttcccta ctgaatcctt aattcttatc gctggctttt tcgccgccgc 1800
ttgtctctat ggttactata atttcatgga aataggcagc gaacaaacgg atttattacg 1860
ccgtgacttc tggttcaaga aagcgagtat ttgccgccgc tggtcaataa tctttattat 1920
tctagcggta actttcggaa tatcagcaag cattatcccg gcaatagttt agagtcgcaa 1980
attataacgc caccagcaac aaggcgttat atttggcaat tctgcctata tcccattaac 2040
tggagaattt agataatgat cattgcaatt gagaaacaaa aagctatttt aaccgctgct 2100
aacaacctca atttttgggg taaacgcctg cgcgctaaaa agctggagat ctgcgacgaa 2160
ttgagcaaag agcattacgg gacggcgaaa cactctagcg aaatttgcga ttggctggat 2220
agtaacaagc ctgttaaacc cgctgctgaa aaacgcgccc aacgtgttgc ggtggaagat 2280
tcccgccccg ttgccgctgg tcagcttaat tccagcgtcg aaagctggaa ggtaattccg 2340
ggccgccgtt ttctgctaac gtcgattcaa aataatacct tccctcatgc taatttctgg 2400
aaaactttac aggaggccgc gaaatatctc ggcgctactc tgttagtaag caaatacgcc 2460
tacaacaaaa aaggcttcca aaacgggcaa ggcaacgatg aactgaaata tgatgatgct 2520
ttctcagatt tcatttgtga tgaaaacgtg tttttgggca accgcgaaac cggattcgca 2580
ttcatggcgg aaattaatat tctgccaact gctgattttc cgctgtccgg ctttggcgag 2640
actgcgaccg cctacggcct gaaagggctg gctattggtc acgctaaaat caccgccgaa 2700
agtgtcccgg caatgaaggg cgacactgtg cgccgtatgt attcaactgg cacagcgacg 2760
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gacgaaagcg ggatgtttta cgatcttaat cataaattta ctgttaacgg tggcgaggag 2940
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gctgtcgcct ttgcttcatg ggggccgtgt gatgattctc tagtgaacgt cctgcgccct 3060
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caagacccgg cgaacgccca tctttattat cgcctgaatg ctgcgattta tgaagcaatc 3360
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ggttcccacg gtcacaacgg cattaacggc gctcgcggca acccgaaggg attccgcaag 3540
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ttctttgcat aacaaaaaag ccggggtaat tgccccggca ataaataacc cataaataaa 3780
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ccgattctat tctttatgag gctgatatct gcgagatcgt agagattgac gccgccgccg 4080
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ctacccggat taaaccggct gaattagccg atgccttaac tttattcttc tgataattaa 4260
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tgaaaaatgg cttttaataa actggcaatt aaggcaatta agttatggga tttagacgga 4380
actgttatta attcctttgc ccgcgtgttc ccgtgtatgg atgataaagg gaacttagat 4440
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ttggctgctg ctgctgctgc tggccttcaa acgatggacg ctaccgcaat taacgatatt 4860
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aatttataat aatattatat tataaaagtc acttgttagc aagtgagatt ttgaggtttt 6000
tatgggcttt tatgcaggaa ggataggcga caaaaaagtg ttgtctctta cctctggcaa 6060
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tgtcttaact gaagttgagt ttgaggatgg caccagacgt ttcatttatg gtacatccct 6300
gggtgtgggc gctaaagcgt ataacgctta ctttagtaat actgtcggtt cccaggcttc 6360
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tattagtttc tatttcgaag agacgccagg tactattaac gagaagctac gagacggtac 6480
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tattggtgtt gatgctatgc gccacccgtg gatgcgtact actggtgtta acagtatatg 6720
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tataaactac agcccaggta ataggcctga tatccgagtt attgcaacca acgtcgccag 7200
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tcgaccagat aatggtgctg agtttggaca aggtaacgtg agtgagatgc atgtaaccac 7320
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ttctaactat gaaaatggag gaactggatg aaactggaat gggttcagag atggatatta 8280
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atgagaaggt gaagcaagct aaagctccaa tacaccaaaa taatactcag atcaacctgg 8400
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aatggaaatc tcacgtagtt atattaatac gactgacgtg gtggattttg gtgttgataa 8520
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cgtatcacgt cgtgttggca agtcgttcat tgcgtatact ctaggcttcc ttaaactcct 8700
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cttcgtgtca accgttacta cggggttcac taaggccaac actcaggaga tcctagttca 16500
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gttctagttc cttagctaga ctaggattat tcttctggaa ctcttcgaag ttcttagaag 159600
ccttactaac agcattagca gcagactcca tacgctcggt attatcagcc cgcgtattct 159660
gagcatattc agaagttcgt tttaattcag cctgcatttt gccttgggct ttatacattt 159720
ctaaacgctg ctcccgggtt ttaccttcaa aagcagggtc tttagtatca gaatcagcta 159780
atttcatacg tttttcgtat tcagcatcat caatcttacc aagtaaatat ctatcgcccc 159840
aagcagtaat tttacgttca gttggagaat cttgctcttc tttcaagcgc tgattatctt 159900
tatatttagc tacgtaatct tggtcttctt cagaaagctc ggcaccagta cgatactgga 159960
aacgatctgc ggcagaaccg cgaatattat cagcggcatc gcccatacca ggaactttac 160020
taagaacagc agcaaccaat ttagaaagac caaacataat tgtttcgcct aaagtatcta 160080
aaacattaac caggccttta acaatagctt cagctaatcc agtccaagag ccttcattaa 160140
aggtatcttg aatactttgg gccatttcac taatcgatgt taatatagga gcccaggttc 160200
cagctaattt agtgaactct tcaaaatttg atttgaataa ttcggtccag tatttgaaat 160260
ggattttgat aatatcaata gccataatca aagctaatac catagcagct gttttagcca 160320
tattagcaac agcggtcacg gtataactaa agagcatacc agaaattctg tcagttagtg 160380
aaattgattt cttaaacccc gttttagtag tatctaaaag agctttaaga aggtccgtgt 160440
cggtcttctt gttcttttca tcatcgtctt tattttctgg gattactcta ggttcatcct 160500
gcggtaatac atcagaatcc ggacgtctat tttcatgcgg tggaataagg tcttgaagaa 160560
gatcgtctaa tggcggaatc tctggaactg ggtctgggat agaatcctgc actacctcaa 160620
cagatggaac atttgctgtt tgtggcgtgg cttgttctac ttttactccc agcttttcag 160680
ccaatttagt aattctgtca cttattaaag aggctgtgct attaagagca cttaattcat 160740
ccagctggag ttcaatacct gcattagtat cagataaaga atttcctaca ttagcaagac 160800
cgttctctgt tgcttcggcc cccatttcaa cagcagcttg aactccttca agagttccat 160860
taatagtgcc tagtgaggtg ttttgttctt cttgtagtgc ttcattgcgt ttttgtggtg 160920
ctgcgtcggc gattacccga cgcagagatt gtgttttacc atttactttt ctagccatta 160980
ttcaaagagc cctattatat tgccaattcc ttttataggc ccgttaggac caggaatagc 161040
tacagtgtta acgataccgt caacccattt aattacgaat gctggaagct tcataaaatc 161100
aggcttctct gttctgccat cgacagaaga aaaatacttg tcaagaattg cgtcagccga 161160
gccaaattta ctgaaccttt caggagcgtt aaatttatat tcttggccat ttaaacgatg 161220
ggttaatata cggcatccgt acacatccga taaacgataa gtgaatccat ccttttcaac 161280
ttcttcttta atcttaccgt taaaggccaa aagttgtaat agaacaatat cgctttgtac 161340
agcatccaga cctggtttaa tagaatctaa aagaattgcc agattttcat ccggcatttt 161400
tacttctttc attaaattgt ggtgcttaag tccaagctta ggtaatgaaa tttcaatacc 161460
atcaattgta attttcttaa taggcagaat cacgtttaag ttcatttttt accttcgcta 161520
tttgaactgg ttcaatagta gaaccgttag taaacatata gatgttggtg attgaatggt 161580
tattactgac ttcgtggata acttcgtcaa cgtagaaatc agtacggaat tgttctttag 161640
gatcgtagaa gtttaacttc attccaggag tcacttcaaa gttaccatat attttagcag 161700
acgcgtagcc atcgtactga gacatggtaa caatacggtt agcttcttca taaccgttac 161760
gataaatcat ttccgaataa ccaccacttc tattaatata gacactatta gaaccttcgc 161820
ctacggttat ttttgtgatt tctttatcga caaaactttg agcgtagaat gtagcatcct 161880
taaacggatt tcgagtatat gtattagctt ttacaagcca ttcaaagtcc caagctaaag 161940
ataccggcaa ttggtctacg aattgtccaa tagtctgagg cgcaccaaca acaaaagatg 162000
cggcgttctg agcaatcatc gcgttgtagt ccatcatgtt tataccggtt atatcttccc 162060
aagcaaaaac aaattggtca ctttctacag acagccctac atcacgaata tattgcatga 162120
attcctttat attagaagtc caaggaattc taggaacata agtgtttatt ccgtttattg 162180
gtggtgccaa cttagggtat ttttgataaa tcacacctat catttcaacc aatgtttcgt 162240
aggcagaact aaagaagcaa cggctgaact tcaaattcat tatatcatgg agcgaactaa 162300
gctggatagc tataatattg tcgcccttat catcgacacg gaccgtgaag tgttttatcc 162360
cataaattcg tgtctgggtt cttgatgtat tgctattaga aacggagatc tggataattt 162420
ggtctccatt cattttgttg tgaatgtttt tagaatcata gaactggagc ataccttcat 162480
taataccgga caaactatct ctcatggtca aggtagtaaa tgtggcacca agttcaatga 162540
aactgttatc aagccattta tcatagtttt gataaagctt aatactgata tttggaaatc 162600
cagggcgttg tgaaatcatt tttgtgctag ttccttttca atcagagata acgtgatgct 162660
tctctctata ggaatcatat tcataacgga agaaagatcg tagccttgtt taactatcaa 162720
gtgattgatt ttataaaacg taaatacttc atctgggttc agaagaagtt taaagatatc 162780
cataaaattt gtgtaatgga tctcatggga atcgcaacat gaatatttta gtacaaagtc 162840
aaatatgttc aattttttga ttataagttc taaggtttct atatcgatag cttcaacaac 162900
ttgaactttg ttttctgtag acaactcaga ccattgatat accccattag aatcttctac 162960
agacaaaatg ttttctgtta ttagaccagc tatattttct ttatagtttt tagatggatg 163020
tttaaattta agccgaagcc cggatacatc aattacagga agctcaacgg cttcttggtg 163080
gaaattaatc aacaccattt tagcctttcc acacttaggg cattcaacct taacaggaat 163140
tttagtctta cctatgctgg atagatagac ttttaagaat acaaacgccc tgtattcttt 163200
tgggatgtca ctgaagtagt cgttttggag ttcttcaata agtttttctt gatcttctgg 163260
agacttagtg ttcatgtcgt tccgtaccag aagaaaatct ctatagtcag agactgtgaa 163320
cggagagaat cgatgaacac cgtctggtaa ttcacatctt acgatattag ccatagggag 163380
tcctcttatt ttattgtatt tataaatacg tctagaggta acatatgaca acttataatt 163440
ttgacctaac tataaatggc aaaaatattt cttgccgtgc atttacacta gaagaatatt 163500
tgaatcttat aaaggctaaa gccgataagg ttcttgacaa aacaattaag cagctgatta 163560
aagattgtac taacgctaaa ggcttaacta aacatgagtc tgaacttctt ctagtcaatc 163620
tatgggccca ttcattaggt gaagttaacc atacagccac ctgggtgtgc gactgtggta 163680
atgaaataga cgtgcctatt aataccaatc gtatccaaat cgtgggctct agcgatctcc 163740
tgtattcact agacggactt cgtatccagt tcaaataccc agagttattt gatgataatg 163800
atattgcttt aatgatagct aaatctatcg attatatcat tgtcaacggc gaacaaatct 163860
ttgtcgatga tttatcagac caagagatag acgatcttta ttctgctata actactgaag 163920
acgtcttgaa aataaaagat atgctgctga agccacaaat acagttggca gttcctattt 163980
cttgcaagtg tgggaagaat catgtgcacc aaatcaccgg actcaaagag ttctttaagg 164040
ttatccaatg aatatagaca atatgtattc ggatttagac ccagacctta gaatggcctg 164100
ggataaagac gttgcaagaa ctgtaggtgc aagagcagta aaaaatagca tcttaggaat 164160
tatcactaca agaaagggca gtcgcccttt taatccagat tttggatgca gcctttcgga 164220
cgagctgttc gaaaacatga ccccgttaac tgctgataca attcagcgta atattgtgtc 164280
ggctattcaa acatatgagc cacgggtaga acgtctgcgt gttgaggtct tagcgttata 164340
tgatgataat gctgtagtcg ttacagtgat gttttctatc gtcgacgacc cggatgtcct 164400
agaacgcatc aaaatcaagt tacgtgcttc tcgttagtga tgtgtataat ggcttaggtc 164460
ctttaaattg agattggtga ttaaatgaag ttggaagatt tacaagatga attagacaga 164520
gatttagtta ttgaccagac aaaacttcag tatgaagctg ccaataatcc tgttgtctac 164580
gggcggtggg tacgtaagca ctctatatgt cgtaaagaaa tgctgcgtat tgaagccatg 164640
aaaaaacaag ccctgaagaa aagacttgat tactacacgg gacgtgtaga gcctggtgaa 164700
gaagtgtgta tggattcgta tgagaagtct gaactaaaaa ctgtaatggc tgcagatgaa 164760
accatcttag gaactgaaac aaaacttcaa tactggggta ttttgcttga gttctgtagt 164820
gatgctatgg atgctattaa agctcgcggt ttcgcgataa aagcagttat tgaacttcgt 164880
aaatttgaag ctggcgaagc gtaataaata agtttattaa cagaggagac aaccatgtcg 164940
tgtatttgtg tcgtctgtaa gactccaatc gatgatgtat tggttgttca atcagacaaa 165000
ggtccggttc atcccggaca atgttataat catgcagttg agatgccagt tactgagaat 165060
acagaacagc aacttaacga agtgcagctt ttaatctagt gtgtaacctt attggttatt 165120
tttggctctc cttacggaga gccttttttg tatctagaga ttagaagttt tcttcttctt 165180
catcagaatc aatagattct aattcagtgc gtttaccggc caaagcatca cggatagtga 165240
tatcatcaga atctttcaaa tcggcttctt ttacacgctt tttgtaatat ttttccaatt 165300
cgctaagacc atcaagggtc tggcaagagt ttactttaga cataaaatct tcaatggcgg 165360
cttcgtataa aaattgttta aagtccataa taattcctta gagttcgaca agtttcatga 165420
cgtaatcgaa tttctcatca gcataacgct ggatacgttc taagccatgt ttgagcaaat 165480
agttaatgtg ggtgtaagtc tttttggcat tagcagattt aggtttaaca ccgcagtcat 165540
cgatgatgtc ccaaaccgtt gctacatctt tagagccatg cttacgaagt actcgaccga 165600
tagtctgaag tacgataatc tttgatttaa caccgtgcgc taaaataaca tggtgtaaat 165660
tcttaatact gattccggta gagaatacac cgtatgatgc gacaacaaca attccagttt 165720
cgttttctgc cattttttta agagcagtac gggtatctgt atcaatttcg ccggatacat 165780
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tgttcttgaa catcacaaag gcgttttgat ttttactagc taatttaaca gccagatttg 165900
caatccattt attacggcgt ttaactgaag tgatatattt aatctcttct tggtaagttt 165960
tacctttcaa agcaacagta acgttatctg gatatctaag tctgatagca ttaattttaa 166020
gctcagtaac agcgccttct tccatcaact gtgaagttga taccggttta aaaatatcac 166080
caaacagacc ttgatactgc atcaaattag ctttgccatc tttcaaagaa cctgaaaggc 166140
cgaatttgaa catacagtta tttagcccgg caataatagt agagatagat ttacctgtgg 166200
caagatggca ctcgtcattc atcataagac caaactgact gaaccattct ttaggctgtt 166260
taatagccgt ctgccaagta ctaacataaa ccaccgcaga agaatctttc ttagtaccac 166320
ttctgatacc gagcatatta tctcttttga acagacgata atcacagaag tcatcgatca 166380
tttggtcaac aagggcggta gtaggaacaa ttattagaat tttgccttca tagttctcta 166440
cgtaataacg actcaggagt gcctggatca atgatttacc tgctgatgta ggtaaattca 166500
acagagccct tctttcttta agacccttaa acacggcttc tttctgatac caatgaggtg 166560
taatcttagt cagcccagaa tagatttctt tggaatcgag ccacttatca aaagattctt 166620
gagtgatttc ttctttttca aaaatcatag ggtctgcgta gactttataa cccatattgc 166680
tggcgaattt ctgtacctgg ttcaccagac caaatggaag taatctgtca taacctaata 166740
gacgaatgcg cccatcccac tgcccgtaac gaaattttgg attaaactta tagccttctg 166800
cttcgaagga gaaaaagtct cttagttcat agaagatgcc ttcatcgcat tcaaccagaa 166860
cgtgactaaa atcatgaaat tttaatttga tgtccacagc gtgtagcctc agttataaat 166920
acatacatat ttatacacta gaaagagaga cactatggac aagcaatata tagatgacct 166980
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ccttatcgcc gccgatgatg aacttgaagg caagaacgac tttgtacttg gtgacgttga 167220
agctaagcct gaagctaaac tgttatttga ttctccagaa attcctgtat ctattcacga 167280
aatcaaagaa accgttcaaa aacaatcagt tgttgaagaa aaagctattc atattgaatc 167340
acctattggt aaattcgaca cgcctcaacc taaactttca gaaaatacct ttgaagaagc 167400
tgtagctaaa attatcagtg acgaaactac ttttgaatta ccggaaaact ttagccctca 167460
ttttattctg atggggcgta atcctggtta tacgacctta ccttggtgga tttacgagtg 167520
gattaaagac aatccagact ggaaatctag acctaccagt ttcccgcacc ctagcgcaca 167580
ccagacactg tttagtttaa tttattatat caaaagaaac ggatctatta tgattcgtga 167640
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ctattgctcc tttggctgct tcagcagtca ttggggccac aactaatttt acagcaacca 167760
cctctggtgc tacagttgaa ggcacagaaa catttgagtg gaccgtaaac ggtgtaaaac 167820
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ttaaagtagt tgctactgtt actccagctg aaggtgaccc tgaaacggct gaagcagaaa 167940
ctactctgac cgttaataac aaaactatgc cggccattac tttaactttg agtcctactt 168000
ctgtttctaa agaaattggc caatcccagg tagttacagc taacgttgct ggtgctccag 168060
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gtaaaacaat taccttatct gaatccgcgg aaaccagcta cacattgaat tgtgaagtaa 168180
cagtttctgc tccagattat aataatggaa ctgcaactaa aggtatcgct gtggccttta 168240
ctaaaaagac catgagcggt gttctgttat tttgactcct gagtctatta cgactgagca 168300
gggatccgaa gcatctttta aagcggatgt tattgggccc cagaaggcgc aaccggaact 168360
tattcatgga ctaaagacgg ttcttctatc gaaggttcca cgagtacttt ggcggttgac 168420
acttctacta tagggtcaca agtaattgga gtttctgttg aggtttcagc agaagattac 168480
aatccggtta cagttaccgc aactggcgat gtaaccatta ccaaaagagt agcccctgag 168540
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cttgacgtcg gaataatcta cgactatatc tactaaataa tggggcttcg gccccatagg 168840
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ctagagagcg ggccaaagcc cgtgagcgtg tggtttatcg taaaaggctt attacagacc 169080
atactaaatt aattgaaaaa atgaggtgtt ataatgcata attctgacgg tatcagatcc 169140
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aacgagcagc gtgtttctac attagtagaa cactatggcg ctctagcgga ctctgtagct 169260
actaccgaac tgaaaaaagc taaagatgaa gttgaactgg aatttaaagc acaagctctg 169320
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ctgattaaat ggatgcaaga tgatggtgta ctagttaatt ggaagcacga ccaacgtgat 169440
ggtgattggg tagaaattac cttctaatat gctttaaatt ttttcgtgat atatttggta 169500
taatggtttt aagctaagag tatcggcggt agaagtcttt actcttttat ttatgtttgt 169560
tctgatgttt aaaggtgaaa tatgtttgag aaatattcta gtcttgagaa ccactacaac 169620
aacaagttta ttgaaagaat ccgtcaccac ggatacgatg taactgaagg ttggtgtgca 169680
cgtgaaaaga ttcatggtac caacttttct attatcgttg aacgt 169725

Claims (27)

1.一种纯化的噬菌体，其具有的基因组包含与选自SEQ ID NO:2和3的至少一种核苷酸序列至少85％的序列同一性，并且对克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)的一种或多种菌株具有抗细菌活性。
2.一种包含权利要求1所述的噬菌体和药学上可接受的载剂的药物组合物。
3.权利要求2所述的药物组合物，其进一步包含具有的基因组包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列至少85％的序列同一性的纯化的噬菌体。
4.权利要求2所述的药物组合物，其包含具有的基因组包含SEQ ID NO:1、2和3的核苷酸序列的纯化的噬菌体。
5.权利要求2所述的药物组合物，其由具有的基因组包含与SEQ ID NO:1、2和3的核苷酸序列至少85％的序列同一性的纯化的噬菌体组成。
6.权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其还包含以登录号NCIMB 42915(F99/10)、NCIMB 42916(F27/12)和NCIMB 42917(F95/13)保藏的一种或多种纯化的噬菌体。
7.权利要求6所述的药物组合物，其还包含以登录号NCIMB 42915(F99/10)、NCIMB42916(F27/12)和NCIMB 42917(F95/13)保藏的纯化的噬菌体。
8.权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，其还包含对克雷伯氏肺炎菌具有抗细菌活性的一种或多种其它纯化的噬菌体。
9.权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，其还包含对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)具有抗细菌活性的一种或多种其它纯化的噬菌体。
10.权利要求1至9中任一项所述的药物组合物，其中将所述组合物配制成用于作为气雾剂施用。
11.权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，其中每种所述噬菌体以使得在向有此需要的受试者施用所述组合物时提供约1至约10的感染复数(MOI)的量存在。
12.权利要求1至11中任一项所述的药物组合物，其中每种所述噬菌体以约109pfu存在。
13.权利要求1至12中任一项所述的药物组合物，其中将所述组合物配制成用于作为气雾剂施用。
14.权利要求1至13中任一项所述的药物组合物，用于在有此需要的受试者中治疗细菌感染或减少细菌感染的发生。
15.根据权利要求14使用的药物组合物，其中将包含权利要求1所述的纯化的噬菌体的所述药物组合物与包含至少一种以登录号NCIMB 42915(F99/10)、NCIMB 42916(F27/12)和NCIMB 42917(F95/13)保藏的纯化的噬菌体的药物组合物联合施用。
16.根据权利要求14或15使用的药物组合物，其中所述细菌感染是由铜绿假单胞菌或克雷伯氏肺炎菌菌株造成的，
优选地，其中所述菌株表现出对一种或多种已知抗生素的抗性和/或形成生物膜。
17.根据权利要求16使用的药物组合物，其中所述细菌感染是呼吸系统感染，优选为医院获得性细菌性肺炎或与囊性纤维化相关的感染。
18.根据权利要求14至17使用的药物组合物，其中将所述组合物作为气雾剂施用至肺部。
19.根据权利要求19使用的药物组合物，其中将所述组合物以提供约1至约10的感染复数(MOI)的量施用至有此需要的受试者的肺部。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述组合物在首次施用所述组合物后约4-8小时再次施用。
21.根据权利要求20使用的药物组合物，其中所述受试者是哺乳动物，优选人类。
22.一种用于诊断细菌感染的致病因子的方法，包括
(i)培养来自患者的组织样品；
(ii)使步骤(i)的培养物与权利要求1所述的噬菌体进行接触；和
(iii)监测所述培养物生长或裂解的证据，
其中，所述培养物裂解的证据表明该培养物包含已知对步骤(ii)中使用的噬菌体或蛋白质易感的细菌菌株。
23.权利要求22所述的方法，其中所述组织样品是从所述患者呼吸道采集的组织活检或拭子。
24.一种用于减少或抑制细菌在表面上定殖或生长的体外方法，包括使所述表面与权利要求1所述的噬菌体或权利要求2至10中任一项所述的组合物进行接触。
25.权利要求24所述的方法，其中所述表面为非生物表面，优选为医疗器械或一部分医疗设备的表面，更优选为手术器械或一部分手术设备的表面。
26.权利要求1至13中任一项所述的药物组合物，用于减少或抑制细菌在与其接触的粘膜上的定殖或生长。
27.根据权利要求26使用的药物组合物，其中所述粘膜是哺乳动物的皮肤或粘膜，或者人类的皮肤或粘膜。
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