DK171258B1 - Antigent præparat indeholdende en determinant fra et adhesin-polypeptid, fremgangsmåder til fremstilling af deteminanten og adhesin-polypeptidet, anvendelser af determinanten og adhesin-polypeptidet, vaccine indeholdende determinanten, fremgangsmåde til fremstilling af vaccinen, antistof rettet mod determinanten, fremgangsmåde til fremstilling af antistoffet, præparatet til passiv immunisering - Google Patents
Antigent præparat indeholdende en determinant fra et adhesin-polypeptid, fremgangsmåder til fremstilling af deteminanten og adhesin-polypeptidet, anvendelser af determinanten og adhesin-polypeptidet, vaccine indeholdende determinanten, fremgangsmåde til fremstilling af vaccinen, antistof rettet mod determinanten, fremgangsmåde til fremstilling af antistoffet, præparatet til passiv immunisering Download PDFInfo
- Publication number
- DK171258B1 DK171258B1 DK609985A DK609985A DK171258B1 DK 171258 B1 DK171258 B1 DK 171258B1 DK 609985 A DK609985 A DK 609985A DK 609985 A DK609985 A DK 609985A DK 171258 B1 DK171258 B1 DK 171258B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- gly
- asn
- leu
- thr
- ser
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 155
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 152
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 149
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 title claims abstract description 109
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 122
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 92
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 30
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 28
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 title claims description 16
- 238000002649 immunization Methods 0.000 title claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 122
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 56
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 53
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 53
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 26
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 104
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 53
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 42
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 31
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 28
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 26
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 25
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 23
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 22
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 16
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 claims description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 13
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 claims description 11
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 11
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 10
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 10
- 230000000369 enteropathogenic effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 claims description 8
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 claims description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 8
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 claims description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 5
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 claims description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- AIJAPFVDBFYNKN-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Asp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)CN)C(=O)N AIJAPFVDBFYNKN-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims 1
- XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N Leu-Leu-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- MDSUKZSLOATHMH-UHFFFAOYSA-N N-L-leucyl-L-valine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(O)=O MDSUKZSLOATHMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 claims 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 claims 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 claims 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 96
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 45
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 45
- 101150090348 atpC gene Proteins 0.000 description 43
- 101100436860 Escherichia coli (strain K12) atpF gene Proteins 0.000 description 40
- 101100242760 Escherichia coli papF gene Proteins 0.000 description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 40
- 101100084009 Pediococcus acidilactici pedA gene Proteins 0.000 description 36
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 33
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 32
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 29
- 239000000463 material Substances 0.000 description 25
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 24
- 101150070717 papA gene Proteins 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- 230000006870 function Effects 0.000 description 22
- 101100325209 Escherichia coli (strain K12) atpH gene Proteins 0.000 description 21
- 101100242759 Escherichia coli papE gene Proteins 0.000 description 21
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 20
- 101150061305 papC gene Proteins 0.000 description 20
- 101100057358 Escherichia coli (strain K12) atpA gene Proteins 0.000 description 19
- 101150070197 F7-2 gene Proteins 0.000 description 19
- 101100226151 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) estA gene Proteins 0.000 description 19
- 101100185373 Streptococcus pneumoniae psaA gene Proteins 0.000 description 19
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 19
- 241001442654 Percnon planissimum Species 0.000 description 18
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 18
- 101100218161 Escherichia coli (strain K12) atpG gene Proteins 0.000 description 17
- 101100082836 Pediococcus acidilactici pedC gene Proteins 0.000 description 17
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 16
- 101000735419 Escherichia coli Pap fimbrial major pilin protein Proteins 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 108010000916 Fimbriae Proteins Proteins 0.000 description 10
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 8
- 150000002298 globosides Chemical class 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 7
- 101100110385 Escherichia coli (strain K12) atpB gene Proteins 0.000 description 7
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 7
- 101100242758 Escherichia coli papD gene Proteins 0.000 description 7
- 241000588622 Moraxella bovis Species 0.000 description 7
- 101100029151 Pediococcus acidilactici pedD gene Proteins 0.000 description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 101100271586 Escherichia coli (strain K12) atpD gene Proteins 0.000 description 6
- 241000588621 Moraxella Species 0.000 description 6
- 206010033733 Papule Diseases 0.000 description 6
- 101100082835 Pediococcus acidilactici pedB gene Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 101150014077 papB gene Proteins 0.000 description 6
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 241000605721 Dichelobacter nodosus Species 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 4
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol Substances OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 4
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 101150024448 papF gene Proteins 0.000 description 4
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 101800001076 17 kDa core protein A12L Proteins 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 241000991014 Escherichia coli J96 Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001290564 Fimbristylis Species 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 3
- 206010037596 Pyelonephritis Diseases 0.000 description 3
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 3
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 239000010408 film Substances 0.000 description 3
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 101150066214 papE gene Proteins 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 2
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 2
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 2
- 230000015861 cell surface binding Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 2
- FJEKYHHLGZLYAT-FKUIBCNASA-N galp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)N)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CNC=N1 FJEKYHHLGZLYAT-FKUIBCNASA-N 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 101150004521 papD gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004538 Bacteriuria Diseases 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710112164 Cytochrome b6-f complex subunit 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 101100396916 Drosophila funebris PapD gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 101100242765 Escherichia coli papH gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241001076388 Fimbria Species 0.000 description 1
- 101000946191 Galerina sp Laccase-1 Proteins 0.000 description 1
- KRGZZKWSBGPLKL-IUCAKERBSA-N Glu-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N KRGZZKWSBGPLKL-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101100462972 Mus musculus Pcdh8 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101100082596 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PDC5 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 101000582398 Staphylococcus aureus Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 description 1
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 1
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 101150099875 atpE gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940052491 bordetella pertussis Drugs 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- -1 e.g. Proteins 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 230000001492 haemagglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000055647 human CSF2RB Human genes 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 239000000677 immunologic agent Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000012247 phenotypical assay Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012206 semi-quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000006150 trypticase soy agar Substances 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
- A61K39/0258—Escherichia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/82—Subcellular parts of microorganisms
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
DK 171258 B1
Den foreliggende opfindelse angår et antigent præparat, der indeholder en determinant fra et adhesin-polypeptid, fremgangsmåder til fremstilling af determinanten og adhesin-polypeptidet samt anvendelser af determinanten og adhesin-5 polypeptidet i fremstillingen af et farmaceutisk præparat og af en vaccine. Ligeledes angår opfindelsen en vaccine, der indeholder determinanten samt en fremgangsmåde til fremstilling af denne vaccine. Opfindelsen angår også et antistof rettet mod determinanten, en fremgangsmåde til fremstilling 10 af antistoffet samt et præparat til passiv immunisering og et diagnostisk middel indeholdende antistoffet. Endelig angår opfindelsen et DNA-fragment, der koder for determinanten.
Antigener bestående af flere proteiner, der tilsammen udgør en distinkt fænotype i en patogen bakteriestamme eller -art, 15 og som derfor må antages at indeholde et stort antal immunogene determinanter, er velkendte. Imidlertid har sådanne antigener - og vacciner, som er fremstillet ud fra disse -flere ulemper: de har navnlig en tendens til at være for selektive, idet der ved immunisering dannes antistoffer mod 20 hver af disse immunogene determinanter, der tilsammen identificerer den ene særlige bakteriestamme, hvorfra antigenet stammer, men ikke andre bakteriestammer fra samme art, således at immunisering kun foretages mod denne bestemte stamme, men ikke andre nært beslægtede stammer fra samme art.
25 Den foreliggende opfindelse er et forsøg på at overvinde disse ulemper ved at tilvejebringe et antigent præparat, der i det væsentlige kun omfatter den eller de immunogene determinanter, der medfører den ønskede immunitet, og som ydermere ikke er begrænset til én bestemt stamme af den pågældende 30 patogene bakterie.
Det er efterhånden blevet klart, at mange patogene bakteriers evne til at adhærere til cellers overflade er af største vigtighed for mange infektionssygdommes opståen (Beachey, J. Infect. Dis. 143, 1981, s. 325-345). Denne adhæsionsevne er 35 forårsaget af tilstedeværelsen af receptorer på pattedyrvævs- DK 171258 B1 2 celler såsom epitelceller eller på pattedyrserythrocytter, hvilke receptorer danner bindinger med adhesin-polypeptider som følge af deres konfiguration. (I nærværende sammenhæng betegner udtrykket "adhesin-polypeptid" både et polypeptid, 5 der specifikt kræves for adhæsionsfænotypen, og mere generelt et polypeptid, i hvis fravær adhæsion ikke finder sted (ligegyldigt af hvilken grund)). Hver receptor formodes at binde til en forskellig adhesinstruktur. Receptoren kan være en peptidreceptor såsom en aminosyre, som er til stede på et 10 sukkerstof, eller oftere et carbonhydrat såsom neuraminsyre-(2-*3) -galactose, mannose - a- (l-*2) -mannose eller digalactosid (α-D-Galp- (l-*4) -jS-D-Galp-delen, som er til stede i glycoli-piders globoserie, hvilket i nærværende sammenhæng af og til betegnes globosidet).
15 I mange patogene bakterier formodes det egentlige adhesin-polypeptid kun at udgøre en del af en større sekvens af polypeptider, der alle på en eller anden måde er forbundet med adhæsionsfunktionen (fx polypeptider, der medierer transporten af adhesinet gennem cellevæggen eller forankrer det 20 til cellevæggens ydre overflade osv.), og i overensstemmelse med nærværende opfindelses formål identificeres et specifikt adhesin-polypeptid blandt de andre polypeptider i sekvensen og anvendes som antigen. Dette antages at udgøre en mindre selektiv identifikationsmarkør, således at antistoffer ikke 25 alene vil blive dannet mod den stamme, hvorfra antigenet stammer, men også mod de andre patogene stammer fra samme bakterieart.
Den foreliggende opfindelse angår således et antigent præparat, der som sin immuniserende hovedbestanddel omfatter en 30 determinant fra et adhesinpolypeptid, som er en mindre bestanddel af pilus fra en pilusdannende bakterie, der er i stand til at adhærere til pattedyrvæv, i hvis fravær adhæsion af bakterierne ikke finder sted, og DK 171258 B1 3 som er forskellig fra pilus' strukturelle hovedbestanddel, idet antistoffer mod determinanten reagerer med adhesin-polypeptidet. Determinanten kan omfatte en aminosyresekvens 5 på mindst 5 aminosyrer og op til adhesin-polypeptidets hele aminosyresekvens.
Adhesin-polypeptidet kan hensigtsmæssigt stamme fra adhesin-dannende bakterier. Denne gruppe bakterier omfatter både grampositive og gramnegative bakterier, og de bakteriearter, 10 som har størst interesse i nærværende sammenhæng, og hvorfra det ville være en fordel at aflede ét eller flere specifikke adhesin-polypeptider, er uropatogene eller enteropatogene stammer af Escherichia coli eller andre enterobakterier eller orale bakterier, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningidi-15 tis, Neisseria catarrhalis, Yersinia spp., Pseudomonas aeruginosa eller andre Pseudomonas spp., Moraxella bovis eller andre Moraxella spp., Bacteroides nodosus, Staphylococcus spp., Streptococcus spp. eller Bordetella spp. såsom Borde-tella pertussis.
20 Alternativt kan adhesin-polypeptidet fremstilles syntetisk som beskrevet nedenfor.
For visse patogene bakterier i denne gruppe er det påvist, at filamentøse strukturer, der betegnes pili (fimbrier), og som rager frem fra cellevæggen, på en eller anden måde er for-25 bundet med adhæsion, og derfor og fordi pili let kan oprenses, er helpili-præparater blevet anvendt som antigener i vacciner, fx gonococcus pili-antigen (testet i De Forenede Staters hær).
Forskere, der tidligere har arbejdet med pili-præparater, er 30 gået vidt i deres forsøg på at fremstille "rent" piliprotein til proteinkarakterisering og immunisering, og deres anstrengelser har tilsyneladende været kronet med held, idet deres præparater kun viste ét bånd i SDS-geler (USA-patent- DK 171258 B1 4 skrift nr. 4.443.431 (Buchanan T.M. et al.); I.E. Saliet & E.C. Gottlisch, J. Exp. Med. 146, 1977, s. 1169; P. Klemm, I. Orskov & F. Orskov, Infect, and Immunity 36, 1982, s. 462; Schoolnik G.K. et al., J. Exp. Med. 159, 1984, s. 1351; 5 Svanborg E.C., Prog. Allergy 33, 1983, s. 189). De vundne piliproteinpræparater udviser mindst tre funktioner. Den første funktion er evnen til at danne polymerer, antageligvis ved hjælp af hydrofobe bindingsprocesser, hvilket er en egenskab, der er essentiel for dannelsen af et pilusfilament 10 fra monomere underenheder. Den anden egenskab er evnen til at provokere dannelsen af antistoffer, hvilket er en egenskab, som er essentiel for ethvert forsøg på at anvende proteinet som vaccine. Den tredje egenskab er evnen til at adhærere til celleoverfladereceptorer. Da forskerne ikke har været i stand 15 til at identificere mere end ét protein i deres piliproteinpræparater eller i selve pili, har man konkluderet, at pili var polymere aggregater af identiske monomere proteinunderen-heder, idet hver underenhed udøver alle tre ovenfor beskrevne funktioner (USA-patentskrift nr. 4.443.431 (Buchanan T.M. et 20 al.); Rothbard J.B., PNAS 82, 1985, s. 915). Imidlertid har de intakte helpili fra en enkelt art som ovenfor nævnt en stor antigen-forskelligartethed. Endvidere er det blevet påvist, at intakte helpili af en enkelt antigentype primært danner antistoffer over for denne enkelte antigentype og ikke 25 over for fælles piliantigener, når de anvendes som vaccine. Forskere har tidligere kemisk spaltet den oprensede pilus-underenhed til fragmenter med de foreslåede funktioner: Polymerisationsfunktion, fælles antigenfunktion og bindings-funktion. Hver individuel funktion er blevet identificeret 30 med et separat fragment af den oprensede pilusunderenhed. Det har således været formodet, at oprensede piliprotein-præpara-ter indeholder et enkelt protein - pilin-monomeren. Denne pilin-monomer er blevet kemisk spaltet og er blevet antaget at indeholde bindingsfunktionen og den væsentligste antigen-35 icitet - den samme som det polymeriserede rene pilusprotein.
Fra Mol. Gen. Genet. (1984), 194: 528-533 (van Die et al.) er det kendt, at mindst 5 gener (A-E) er involveret i ekspres- DK 171258 B1 5 aionen af F72 fimbrier fra E. coli AD110 (06:K2:H1:F7). Ét af disse gener (gen A) koder for et polypeptid, som antages at udgøre et 17 kDa polypeptid, som er en underenhed af fimbrier. Der nævnes imidlertid intet om tilstedeværelsen af 5 fimbrie-proteiner med forskellige selvstændige funktioner og således heller ikke om tilstedeværelsen af et polypeptid, der er ansvarligt for bakteriens bindingsevne (se i øvrigt Eksempel 6) .
I J. Bacteriol. (1984), 157: 330-333 (Båga et al.) beskrives 10 nukleotidsekvensen af papA-genet, der koder for Pap-pilus' strukturprotein. Det nævnes, at mindst 7 gener i E. coli K-12 er omfattet af pap-operonet, men heller ikke i dette skrift nævnes der noget om, at forskellige proteiner i pilus skulle have forskellig selvstændige funktioner.
15 I Inf. and Immun. (1983), 42: 900-906 (Clegg og Pierce) beskrives kortlægningen af genetiske elementer i plasmidet pDC5, som beskrives at indeholde kodende materiale for mindst 4 polypeptider, der er involveret i dannelse af MR-fimbrier. Det ene af disse polypeptider identificeredes som fimbrie-20 strukturproteinet. De tre øvrige proteiner foreslås at indgå i polymerisering, sekretion eller forankring af fimbrier, men der nævnes intet om tilstedeværelsen af et fimbrie-protein, der har en selvstændig funktion som adhesin.
Omfattende undersøgelser, der er udført af nærværende op-25 findere, viser imidlertid, at det formodede rene piliprotein faktisk består af flere proteinfraktioner med separate funktioner. Pilusfilamentet er faktisk ikke ansvarligt for celleoverfladebindingen, men en mindre bestanddel, der anses for at være en kontaminant, der højst sandsynligt er forbundet 30 med filamentet, er den bestanddel, der er ansvarlig for celleoverfladebinding. Denne enestående iagttagelse kan kun tilskrives det forhold, at den strukturelle dannelse af pili og evnen til at adhærere til digalactosidreceptorer kan adskilles genetisk. Andre muterede organismer, der bevarer 35 genkendelige pilistrukturer, men som ikke er i stand til at DK 171258 B1 6 adhærere, har yderligere bekræftet denne iagttagelse. Af iagttagelsen kan det endvidere sluttes, at pilusproteinet, der hidtil var blevet antaget at være rent, må indeholde mindst to fraktioner, hvoraf den ene er et strukturelement, 5 som er involveret i den faktiske dannelse af pili, og den anden er en fraktion, der er ansvarlig for adhæsionsegenskaben. Det forhold, at begge fraktioner har antigene egenskaber, har gjort det muligt at danne antistoffer mod alene den for adhæsion ansvarlige fraktion.
10 Også i tilfælde af pilusbærende bakterier er det en fordel at fremstille et antigen med mindre stammeselektivitet, om nogen overhovedet, og et sådant antigen tilvejebringes ved at identificere og fremstille én eller flere bestanddele, som udgør en del af hele pilusstrukturen, og som specifikt me-15 dierer adhæsionsevnen. I nærværende sammenhæng betegnes en sådan bestanddel et pilusadhesin-polypeptid. Som anført ovenfor omfatter pilusadhesin-polypeptidet sædvanligvis en mindre bestanddel af hele pilusaminosyresekvensen fra pili, der stammer fra patogene pilusdannende bakterier, og adskil-20 ler sig fra pilin (underenheden af den oprensede pilus, der udgør hovedbestanddelen af pilusfibren). Eksempler på pilusdannende bakterier, der egner sig til dette formål, er uropatogene eller enteropatogene stammer af Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningiditis, Neisseria 25 catarrhalis, Moraxella bovis eller andre Moraxella spp. og Bordetella pertussis.
Til formål for den foreliggende opfindelse har de her beskrevne undersøgelser primært drejet sig om en uropatogen stamme af E. coli, der forårsager pyelonephritis. Det er 30 imidlertid klart, at de forskellige E. coli genetiske systemer, der koder for pilusadhesiner, ligner hinanden meget, og at det derfor er meget sandsynligt, at sådanne mindre pilusbestanddele, der medierer adhæsion, eksisterer for alle typer pilus, dvs. også for pili fra andre bakterier end E.
35 coli. Den receptor, der er ansvarlig for bindingen af de patogene pilusdannende bakterier som følge af den sammen DK 171258 B1 7 knyttede struktur af receptoren eller en del af receptoren og adhesinmolekylerne, er for uropatogene E. coli's vedkommende blevet identificeret til at være digalactosidet, a-D-Galp-(l-*4) -/3-D-Galp-delen, som findes i glycolipiders globoserie, 5 hvortil bakterierne kan fastgøre sig i uroepiteliet, og som også findes på humane erythrocytter som en del af P-blod-gruppeantigeneme.
Under den forskning, der har ført til den foreliggende opfindelse, har opfinderne identificeret den region på chromo-10 somet fra en uropatogen E. coli-stamme, der indkoder Pap-pili (pili forbundet med pyelonephritis), som er en 8,5 kb lang region, der har vist sig at kode for mindst otte forskellige polypeptider. Nærværende opfindere har også etableret de polypeptider, hvis fravær forårsager ikke-adhæsion af E.
15 coli-cellerne. Disse polypeptider antages derfor at være ansvarlige for uropatogene E. coli's adhæsionsfænotype. Den foreliggende opfindelse angår derfor også et antigent præparat, der indeholder et polypeptid med følgende aminosyrese-kvens: 20 Met-Lys-Lys-Ile-Arg-Gly-Leu-Cys-Leu- Pro-Val-Met-Leu-Gly-Ala-Val-Leu-Met-Ser-Gln-His-Val-His-Ala-Val-Asp-Asn-Leu-Thr-Phe-Arg-Gly-Lys-Leu-Ile-Ile-Pro-Ala-Cys-Thr-Val-Ser-Asn-Thr-Thr-Val-Asp-Trp-Gln-Asp-Val-Glu-Ile-Gln-Thr-Leu-Ser-Gln-Asn-Gly-Asn-His-Glu-Lys-Glu-Phe-Thr-Val-Asn-Met-Arg-Cys-Pro-Tyr-Asn-25 Leu-Gly-Thr-Met-Lys-Val-Thr-Ile-Thr-Ala-Thr-Asn-Thr-Tyr-Asn-Asn-Ala-Ile-Leu-Val-Gln-Asn-Thr-Ser-Asn-Thr-Ser-Ser-Asp-Gly-Leu-Leu-Val-Tyr-Leu-Tyr-Asn-Ser-Asn-Ala-Gly-Asn-Ile-Gly-Thr-Ala-Ile-Thr-Leu-Gly-Thr-Pro-Phe-Thr-Pro-Gly-Lys-Ile-Thr-Gly-Asn-Asn-Ala-Asp-Lys-Thr-Ile-Ser-Leu-His-Ala-Lys-Leu-Gly-Tyr-30 Lys-Gly-Asn-Met-Gln-Asn-Leu-Ile-Ala-Gly-Pro-Phe-Ser-Ala-Thr-Ala-Thr-Leu-Val-Ala-Ser-Tyr-Ser, eller
Met-Ile-Arg-Leu-Ser-Leu-Phe-Ile-Ser-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Val-Ala-Val-Leu-Ala-Asp-Val-Gin-Ile-Asn-Ile-Arg-Gly-Asn-Val-Tyr-Ile-Pro-Pro-Cys-Thr-Ile-Asn-Asn-Gly-Gin-Asn-Ile-Val-Val-Asp-35 Phe-Gly-Asn-Ile-Asn-Pro-Glu-His-Val-Asp-Asn-Ser-Arg-Gly-Glu- DK 171258 B1 8
Val-Thr-Lys-Thr-Ile-Ser-Ile-Ser-Cys-Pro-Tyr-Lys-Ser-Gly-Ser-Leu-Trp-Ile-Lys-Val-Thr-Gly-Asn-Thr-Met-Gly-Gly-Gly-Gln-Asn-Asn-Val-Leu-Ala-Thr-Asn-Ile-Thr-His-Phe-Gly-Ile-Ala-Leu-Tyr-Gln-Gly-Lys-Gly-Met-Ser-Thr-Pro-Leu-Ile-Leu-Gly-Asn-Gly-Ser-5 Gly-Asn-Gly-Tyr-Gly-Val-Thr-Ala-Gly-Leu-Asp-Thr-Ala-Arg-Ser-Thr-Phe-Thr-Phe-Thr-Ser-Val-Pro-Phe-Arg-Asn-Gly-Ser-Gly-Ile-Leu-Asn-Gly-Gly-Asp-Phe-Gin-Thr-Thr-Ala-Ser-Met-Ser-Met-Ile-Tyr-Asn, eller
Met-Lys-Lys-Trp-Phe-Pro-Ala-Phe-Leu-Phe-Leu-Ser-Leu-Ser-Gly-10 Gly-Asn-Asp-Ala-Leu-Ala-Gly-Trp-His-Asn-Val-Met-Phe-Tyr-Ala-Phe-Asn-Asp-Tyr-Leu-Thr-Thr-Asn-Ala-Gly-Asn-Val-Lys-Val-Ile-Asp-Gln-Pro-Gln-Leu-Tyr-Ile-Pro-Trp-Asn-Thr-Gly-Ser-Ala-Thr-Ala-Thr-Tyr-Tyr-Ser-Cys-Ser-Gly-Pro-Glu-Phe-Ala-Ser-Gly-Val-Tyr-Phe-Gln-Glu-Tyr-Leu-Ala-Trp-Met-Val-Val-Pro-Lys-His-Val-15 Tyr-Thr-Asn-Glu-Gly-Phe-Asn-lle-Phe-Leu-Asp-Val-Gln-Ser-Lys-Tyr-Gly-Trp-Ser-Met-Glu-Asn-Glu-Asn-Asp-Lys-Asp-Phe-Tyr-Phe-Phe-Val-Asn-Gly-Tyr-Glu-Trp-Asp-Thr-Trp-Thr-Asn-Asn-Gly-Ala-Arg-Ile-Cys-Phe-Tyr-Pro-Gly-Asn-Met-Lys-Gln-Leu-Asn-Asn-Lys-Phe-Asn-Asp-Leu-Val-Phe-Arg-Val-Leu-Leu- Pro-Val-Asp-Leu-Pro-20 Lys-Gly-His-Tyr-Asn-Phe-Pro-Val-Arg-Tyr-Ile-Arg-Gly-Ile-Gin-His- His -Tyr -Tyr -Asp -Leu -Trp-Gln- Asp- His -Tyr- Lys -Met -Pro -Tyr-Asp-Gin-Ile-Lys-Gln-Leu-Pro-Ala-Thr-Asn-Thr-Leu-Met-Leu-Ser-Phe-Asp-Asn-Val-Gly-Gly-Cys-Gln-Pro-Ser-Thr-Gln-Val-Leu-Asn-Ile-Asp-His-Gly-Ser-Ile-Val-Ile-Asp-Arg-Ala-Asn-Gly-Asn-Ile-25 Ala-Ser-Gln-Thr-Leu-Ser-Ile-Tyr-Cys-Asp-Val-Pro-Val-Ser-Val-Lys-Ile-Ser-Leu-Leu-Arg-Asn-Thr-Pro-Pro-Ile-Tyr-Asn-Asn-Asn-Lys-Phe-Ser-Val-Gly-Leu-Gly-Asn-Gly-Trp-Asp-Ser-Ile-Ile-Ser-Leu-Asp-Gly-Val-Glu-Gln-Ser-Glu-Glu-Ile-Leu-Arg-Trp-Tyr-Thr-Ala-Gly-Ser-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Glu-Ser-Arg-Leu-Tyr-Gly-Glu-30 Glu-Gly-Lys-Arg-Lys-Pro-Gly-Glu-Leu-Ser-Gly-Ser-Met-Thr-Met-Val-Leu-Ser-Phe-Pro.
Disse aminosyresekvenser er blevet etableret ved velkendte metoder som beskrevet i eksempel 5.
Det er positivt blevet påvist, at fraværelsen af de to sidst-35 nævnte antigener i alle tilfælde forårsager en mangel på DK 171258 B1 9 binding til globosidreceptoren (jfr. eksempel 3 nedenfor), og begge disse antigener formodes derfor at være et egentligt adhesin-polypeptid, hvorimod det førstnævnte antigen kun i visse tilfælde har vist sig at forårsage mangel på binding 5 (jfr. eksempel 3 nedenfor) og derfor formodes at være påkrævet til forankring af det dannede adhesin-polypeptid til cellevæggens ydre overflade.
Det skal bemærkes, at de ovenfor viste aminosyresekvenser er precursorformerne for pilusadhesin-polypeptiderne, der inde-10 holder N-terminale signalpeptidlignende sekvenser, der fraspaltes, når polypeptidet udskilles gennem bakteriens inder-membran.
I overensstemmelse med opfindelsens principper foretrækkes det, at det antigene præparat ifølge opfindelsen i det væ-15 sentlige er fri for andre bestanddele, der er forbundet med adhæsionsfunktionen såsom andre pilusbestanddele for at undgå dannelsen af en lang række antistoffer, når præparatet anvendes til immunisering med de ovenfor beskrevne deraf følgende ulemper. Præparatet indeholder fortrinsvis determinanten 20 i i det væsentlige ren form, dvs. også fri for andre determinanter, som ikke på nogen måde er forbundet med adhesindan-nelse, men som kunne give anledning til uønskede immunologiske reaktioner.
I et andet aspekt angår opfindelsen et antistof, som er 25 dannet mod eller i det væsentlige kun rettet mod en determinant som beskrevet ovenfor, og som er i stand til at passivt immunisere et pattedyr mod sygdomme, der skyldes patogene bakterier, der adhærerer til pattedyrvæv.
Et sådant antistof kan ifølge opfindelsen fås ved immuni-30 sering af et immuniserbart dyr med et præparat som ovenfor beskrevet og udvinding af antiserum såsom immunoglobuliner fra dyret på i og for sig kendt måde. Immuniseringen udføres fortrinsvis ved hjælp af en stabiliseret vandig opløsning af antigenet; stabiliseringsmidlet kan være en puffer såsom DK 171258 B1 10 phosphatpufret saltopløsning eller en adjuvans (for yderligere at forøge antigeniciteten), og en hensigtsmæssig adjuvans er Freund's adjuvans eller aluminiumhydroxid. Til immuniseringsformål er mus, kaniner, geder og får de foretrukne 5 dyr, selv om svine-immunoglobuliner også kan anvendes som antistoffer. Åreladningen af dyrene og isoleringen af antiserum udføres i henhold til velkendte metoder.
Antistoffet ifølge opfindelsen er fortrinsvis også i i det væsentlige ren form, hvilket gør det nyttigt til diagnostiske 10 formål som beskrevet nedenfor.
Ifølge opfindelsen kan antistoffet også alternativt fremstilles ved en hybridomteknik, som er en velkendt metode til fremstilling af antistoffer. I hybridomteknikken, i hvilken der fx anvendes mus som de immuniserede dyr, immuniseres mus 15 med det pågældende antigen, og miltceller fra de immuniserede mus fusioneres med myelomceller, hvorefter de fusionerede hybridomceller klones, antistofdannende celler dyrkes i et hensigtsmæssigt vækstmedium, og antistofferne udvindes fra kulturen. De antistoffer, som vindes ved hybridomteknikken, 20 har den fordel, at de har større specificitet og derfor fx større diagnosenøjagtighed. I et eventuelt yderligere trin overføres det eller de gener, som indkoder antistoffet, under anvendelse af rekombinant DNA-teknik fra hybridomcelleklonen til en hensigtsmæssig vektor, hybridvektoren transformeres 25 til en hensigtsmæssig bakterievært, værten dyrkes i et hensigtsmæssigt medium, og det resulterende antistof udvindes fra kulturen. Herved kan der opnås et forøget udbytte af antistof. Værten kan være en vært, der sædvanligvis anvendes inden for rekombinant DNA-teknologiområdet såsom Escherichia 30 coli eller Bacillus subtilis.
I et særdeles vigtigt aspekt angår den foreliggende opfindelse en vaccine til immunisering af et pattedyr mod sygdomme, der forårsages af patogene pilus-dannende bakterier, som adhærerer til pattedyrvæv, hvilken vaccine som en immunogen 35 hovedbestanddel indeholder en determinant som beskrevet DK 171258 B1 11 ovenfor, der eventuelt er bundet til et hensigtsmæssigt bæremateriale, sammen med en immunologisk acceptabel bærer. Denne bærer kan være en hvilken som helst bærer, der sædvanligvis anvendes til fremstilling af vacciner, såsom et for-5 tyndingsmiddel, suspensionsmiddel, adjuvans, etc.
I visse tilfælde vil det ikke være nødvendigt at anvende et bæremateriale, da determinanten har en tendens til at poly-merisere med sig selv, men når dette ikke er tilfældet, kan det være en fordel at binde determinanten covalent med et 10 bæremateriale. Dette bæremateriale er sædvanligvis et polymert bæremateriale, og især når vaccinen skal anvendes til immunisering af mennesker, er det vigtigt, at det er fysiologisk acceptabelt. Syntetiske ikke-toxiske og/eller ikke-allergene bærematerialer til immobilisering af antigener er 15 kendte fra fx Arnon, J. Immunological Methods 61, 1983, s.
261-273. Bærematerialer af denne type, der for tiden påtænkes anvendt til dette formål, er fx poly-L-lysin og poly-D,L-alanin. Et naturligt bæremateriale kan også anvendes under den forudsætning, at det er ikke-toxisk og ikke-allergent.
20 Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af en sådan vaccine ved, at en immunogent virksom mængde af en determinant som defineret ovenfor, eventuelt bundet til et hensigtsmæssigt bæremateriale, kombineres, fx blandes, med en immunologisk acceptabel bærer i en mængde, som giver den 25 ønskede koncentration af antigenet i vaccinepræparatet.
I en særlig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen bindes en immunogent aktiv aminosyresekvens, der omfatter mindst 5 aminosyrer, covalent til det fysiologisk acceptable bæremateriale såsom et af de ovenfor nævnte.
30 Teknikkerne til fremstilling af fusionerede polypeptider er kendte fx fra Casabadan et al., Methods in Enzymology 100, 1983, s. 293-308.
I en anden udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen fusioneres den nueleotidsekvens, som indkoder et antigen DK 171258 B1 12 som ovenfor defineret, til den nucleotidsekvens, der indkoder et fysiologisk acceptabelt bærer-polypeptid, den fusionerede DNA-sekvens indsættes i en hensigtsmæssig vektor, hybridvektoren transformeres til en hensigtsmæssig bakterievært, 5 værten dyrkes i et hensigtsmæssigt medium, og det fusionerede polypeptid udvindes fra kulturen og oprenses eventuelt.
I et yderligere aspekt angår opfindelsen et DNA-fragment, der i det mindste omfatter den nucleotidsekvens, som indkoder en determinant som ovenfor defineret. Det foretrækkes, at DNA-10 fragmentet er et fragment, der i det væsentlige ikke indkoder noget andet antigen. Denne nucleotidsekvens kan være en sekvens, der indkoder hele adhesinpolypeptidet, eller som indkoder en precursor for et adhesin-polypeptid, som kan omdannes til en immunogent aktiv form, eller som indkoder en 15 immunogent aktiv undersekvens af et adhesin-polypeptid. For at kode for en aminosyresekvens med immunogen aktivitet, bør DNA-fragmentet have en længde på mindst 5 codoner (tripletter) . Dette DNA kan udgøre en del af den genetiske information, som findes på chromosomet eller på et plasmid fra 20 patogene adhesindannende bakterier, og repræsentative eksempler herpå er uropatogene eller enteropatogene stammer af Escherichia coli eller andre enteriske eller orale bakterier, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningiditis, Neisseria catarrhalis, Yersinia spp., Pseudomonas aeruginosa eller 25 andre Pseudomonas spp., Moraxella bovis eller andre Moraxella spp., Bacteroides nodosus, Staphylococcus spp., Streptococcus spp. eller Bordetella spp. såsom Bordetella pertussis.
DNA-fragmentet kan således være DNA-sekvensen eller en del af DNA-sekvensen, der koder for et pilusadhesin-polypeptid, som 30 kan stamme fra en patogen pilusdannende bakterie såsom en uropatogen eller enteropatogen stamme af Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningiditis, Neisseria catarrhalis, Moraxella bovis eller andre Moraxella spp. eller Bordetella pertussis.
DK 171258 B1 13
Fx kan DNA-fragmentet være et fragment, der helt eller delvis omfatter DNA-sekvensen, som koder for ét eller flere af adhesin-polypeptiderne fra en uropatogen stamme af E. coli.
Den foreliggende opfindelse angår således et DNA-fragment, 5 der som sin hovedbestanddel består af følgende DNA-sekvens: ATGAAAAAGATAAGAGGTTTGTGTCTTCCGGTAATGCTGGGGGCAGTGT-TAATGTCTCAGCATGTACATGCAGTTGATAATCTGACCTTCAGAGGAAA-ACTGATTATTCCTGCCTGTACTGTAAGCAACACAACTGTTGACTGGCAG-GATGTAGAGATTCAGACCCTGAGTCAAAATGGAAATCACGAAAAAGAGT-10 TTACTGTGAATATGCGGTGTCCCTATAATCTGGGAACAATGAAGGTTAC - GATAACGGCAACAAACACTTATAACAATGCTATTTTAGTTCAGAATACA-TCAAACACATCTTCTGATGGGTTACTCGTTTATCTTTATAACAGTAATG-CAGGAAATATTGGGACTGCGATAACTTTAGGGACTCCATTTACGCCCGG-AAAAATCACAGGTAATAATGCAGATAAAACTATATCACTTCATGCCAAA-15 CTTGGATATAAAGGGAATATGCAGAATTTGATAGCCGGTCCTTTCTCTG- CAACAGCAACGCTGGTTGCATCATATTCGTAA, eller ATGATTCGTTTATCATTATTTATATCGTTGCTTCTGACATCGGTCGCTG-TACTGGCTGATGTGCAGATTAACATCAGGGGGAATGTTTATATCCCCCC-ATGCACCATTAATAACGGGCAGAATATTGTTGTTGATTTTGGGAATATT-20 AATCCTGAGCACGTGGACAACTCACGTGGTGAAGTCACAAAAACCATAA - GCATATCCTGTCCGTATAAGAGTGGCTCTCTCTGGATAAAAGTTACGGG-AAATACTATGGGAGGAGGTCAGAATAATGTACTGGCAACAAATATAACT-CATTTTGGTATAGCGCTGTATCAGGGAAAAGGAATGTCAACACCTCTTA-TATTAGGTAATGGTTCAGGAAATGGTTACGGAGTGACAGCAGGTCTGGA- 2 5 CACAGCACGTTCAACGTTCACCTTTACTTCAGTGCCCTTTCGTAATGGC - AGCGGGATACTGAATGGCGGGGATTTCCAGACCACGGCCAGTATGAGCA-TGATTTATAACIXSA, eller ATGAAAAAATGGTTCCCTGCTTTTTTATTTTTATCCCTGTCAGGCGGTA- ATGATGCTTTAGCTGGATGGCACAATGTCATGTTTTATGCTTTTAACGA- 3 0 CTATTTAACTACAAATGCTGGTAATGTTAAGGTTATTGACCAACCTCAG - CTATATATACCCTGGAATACAGGCTCTGCTACAGCAACTTATTATTCGT-GCTCAGGTCCGGAATTTGCGAGTGGAGTGTATTTTCAGGAGTATCTGGC-CTGGATGGTTGTTCCTAAACATGTCTATACTAATGAGGGGTTTAATATA-TTTCTTGATGTTCAGAGCAAATATGGTTGGTCTATGGAGAATGAAAATG-35 ACAAAGATTTTTACTTCTTTGTTAATGGTTATGAATGGGATACATGGAC - DK 171258 B1 14 AAATAATGGTGC C CGTATATGTTTCTATCCTGGAAATATGAAGCAGTTG-AACAATAAATTTAATGATTTAGTATTCAGGGTTCTTTTGCCAGTAGATC-TCCCCAAGGGACATTATAATTTTCCTGTGAGATATATACGTGGAATACA-GCACCATTACTATGATCTCTGGCAGGATCATTATAAAATGCCTTACGAT-5 CAGATTAAGCAGCTACCTGCCACTAATACATTGATGTTATCATTCGATA - ATGTTGGGGGATGCCAGCCGTCAACACAAGTACTTAATATAGACCATGG-GAGTATTGTGATTGATCGTGCTAACGGAAATATTAGCAAGTCAGACGCT-TTCAATTTATTGCGATGTACCAGTTAGTGTAAAATATCTCTGCTCAGAA-ATACACCACCAATATACAATAATAATAAATTTTCGGTTGGGTTAGGTAA-10 TGGCTGGGATTCGATAATATCTCTTGATGGGGTTGAACAGAGTGAGGAA -
ATATTACGCTGGTACACAGCCGGCTCAAAAACAGTAAAGATTGAGAGCA-GGTTGTATGGTGAAGAGGGAAAGAGAAAACCCGGGGAGCTATCTGGTTC -TATGACTATGGTTCTGAGTTTCCCCTGA
eller en hvilken som helst undersekvens deraf, der, når den 15 udtrykkes, udgør en determinant fra en mindre pilus-komponent, der kodes af hele DNA-sekvensen.
De respektive DNA-fragmenters sekvens er blevet etableret ved velkendte metoder som beskrevet i eksempel 4.
I et yderligere vigtigt aspekt angår opfindelsen en frem-20 gangsmåde til fremstilling af et adhesin-polypeptid eller en determinant derfra, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en bakterievært, der indeholder en hybridvektor, som omfatter et indsat DNA-fragment, der i det mindste omfatter den nucleotidsekvens, som indkoder en determinant som ovenfor 25 beskrevet, idet DNA-fragmentet i det væsentlige ikke indkoder noget andet antigen, dyrkes, og det produkt, der udtrykkes fra DNA-fragmentet, udvindes, eventuelt efterfulgt af oprensning.
Det DNA-fragment, som indkoder et adhesin-polypeptid eller en 30 immunogent aktiv undersekvens deraf eller en precursor derfor, der kan omdannes til en immunologisk aktiv form, kan fx fås ved at udskære fragmentet fra det bakterie-DNA, i hvilket det forekommer i naturen, ved rekombinant DNA-teknik, fx som følger: DK 171258 B1 15
Chromosomalt DNA fra en adhesin-polypeptiddannende bakterie spaltes under anvendelse af restriktionsendonuclease, og de enkelte DNA-fragmenter genligeres med hensigtsmæssige vektorer, som derefter transformeres til hensigtsmæssige bak-5 terieværter. Bakteriekloner, der har modtaget vektoren, undersøges derefter med hensyn til deres adhesinfunktion bedømt ved deres evne til at binde til en hvilken som helst fast overflade, der indeholder den specifikke receptor, fx ved agglutineringstest med erythrocytter ved standardmetoder.
10 DNA-fragmenterne fra de kloner, der har bevaret adhesinfunk-tionen, subklones derefter i en hensigtsmæssig vektor og underkastes transposonmutagenese og/eller delvis spaltning og religering, hvorved der etableres subkloner, som indeholder de mindste DNA-fragmenter, som har bevaret evnen til at 15 indkode adhesinfunktionen i bakterieværten. Herved fås det mindste nødvendige stykke DNA-operon til udtrykkelse af celleoverfladeadhesinfunktionen. Endvidere udføres manipulationer ved enten transposonmutagenese eller sletning under anvendelse af rekombinant DNA-teknik til at identificere 20 enkelte gener i operonet, der enten har eller ikke har bevaret evnen til at udtrykke adhesinpolypeptidet. Det eller de gener, der udtrykker adhesin-polypeptidet, indsættes derefter i en hensigtsmæssig vektor, eventuelt sammen med hensigtsmæssige promotorer til forøgelse af ekspressionen af adhesin-25 polypeptidet eller -polypeptiderne. Derefter transformeres vektoren til en hensigtsmæssig værtsorganisme såsom en bakterie, fx E. coli eller B. subtilis. En anden strategi i det sidste trin er selektivt at blokere eller eliminere gener, der ikke er essentielle for adhesin-polypeptiddannelsen, i 30 tilfælde af E. coli papA- og papC-generne i det ovennævnte mindste nødvendige stykke DNA-operon.
Da oprensning af det mindre pilusadhesin-polypeptid ved klassiske kemiske metoder ud fra et præparat, hvor det findes i blanding med den strukturelle pilushovedbestanddel (som 35 normalt dannes af samme operon), er særdeles vanskelig, om ikke umulig, som følge af, at den strukturelle bestanddel, der i sig selv er immunogen, er til stede i en meget større DK 171258 B1 16 mængde, er denne rekombinante DNA-teknik til fremstilling af det mindre pilusadhesin-polypeptid af overordentlig stor vigtighed til opnåelse af et immunogent virksomt og tilstrækkeligt rent antigen til nærværende opfindelses formål, da den 5 rekombinante DNA-teknik muliggør den selektive fjernelse af gener, som indkoder uønskede antigener, eller udtrykt på en anden måde muliggør udvælgelse af det eller de gener, som indkoder de ønskede mindre adhesin-polypeptider. Ved indsætning af dette eller disse gener i hensigtsmæssige vek-10 torer, eventuelt fusioneret sammen med andre gener som ovenfor beskrevet, er det muligt at opnå store mængder af de mindre pilusadhesin-polypeptider, der ellers kun forefindes i immunogent i det væsentlige uvirksomme og hidtil upåagtede små mængder i de kendte piluspræparater.
15 I henhold til en særlig udførelsesform kan flere gener, der indkoder ét eller flere af de ønskede adhesin-polypeptider, indsættes i samme vektor, således at det resulterende produkt, der dannes af mikroorganismen, er et produkt med gentagne determinanter af det pågældende antigen, hvilket for-20 øger immunogeniciteten eller den receptorbindende effektivi tet.
Alle disse operationer udføres i henhold til metoder, som er velkendte inden for rekombinant DNA-teknik-området, og som er yderligere forklaret i eksempel 1-3 nedenfor. Den vektor, som 25 anvendes i denne metode, kan være en hvilken som helst vektor, som sædvanligvis anvendes til formålet, såsom pBR322-derivater, lacL7V5-promotorvektorer, promiskuøse vektorer såsom Tac-promotorvektorer, shuttle-vektorer, runaway-plas-mid-derivater, etc. Det vækstmedium, i hvilket bakterieværten 30 dyrkes, kan være et hvilket som helst vækstmedium, der sædvanligvis anvendes til fermenteringsprocesser, såsom fx L-væske eller M9-glycerolmedium. Bakterieværten vælges hensigtsmæssigt blandt værter, hvis opførsel under fermenteringsbetingelser er kendt, såsom Escherichia coli eller 35 Bacillus subtilis.
DK 171258 B1 17
Oprensning, der som anført ovenfor kan være en fordel i mange tilfælde, da dannelsen af irrelevante antistoffer, dvs. antistoffer, der ikke deltager i immuniseringen mod det pågældende antigen, og som oven i købet kan forårsage uønske-5 de reaktioner hos det dyr, i hvilket de dannes, undgås, hvilket også er tilfældet med administrationen sammen med antigenet for mulige toxiske substanser, der dannes af værts-bakterien, fx lipopolysaccharider, har imidlertid vist sig at være problematisk. For at lette oprensning er der udviklet en 10 fremgangsmåde, som omfatter anvendelsen af fusionerede poly-peptider. I denne fremgangsmåde fusioneres et DNA-fragment, som indkoder et første polypeptid, der omfatter adhesin-polypeptidet eller en determinant deraf som beskrevet ovenfor, til en DNA-sekvens, der indkoder et andet polypeptid, 15 den fusionerede DNA-sekvens indsættes i en hensigtsmæssig bakterievært, værten dyrkes i et hensigtsmæssigt medium, det fusionerede polypeptid udvindes fra kulturen og oprenses under anvendelse af et assay, der omfatter antistoffer, som er dannet mod det andet polypeptid, og det andet polypeptid 20 fraspaltes eventuelt ved hjælp af en hensigtsmæssig protease efterfulgt af adskillelse af de to polypeptider.
Som eksempel på en DNA-sekvens, der med fordel kan anvendes til dette formål, er lacZ-genet, som indkoder β-galactosida-se, da udtrykkeisen af dette genprodukt og følgelig adhesin-25 polypeptidet eller en undersekvens deraf eller en precursor derfor er let at detektere, fx ved at dyrke bakterieværten på lactoseindikatorplader og selektere for de positive (Lac+)-kolonier.
Efter oprensning kan det andet polypeptid fraspaltes ved 30 hjælp af en protease såsom trypsin eller chymotrypsin. Ønskede peptidfragmenter, der kun stammer fra det DNA-fragment, som indkoder det første polypeptid, hvortil genet, der koder for det andet polypeptid, er fusioneret, udvælges på basis af deres immunogene aktivitet, fx som testet in vitro. Adskil-35 lelse af de to polypeptider kan udføres ved standardmetoder såsom ved ionbytningschromatografi, HPLC-revers-fasechromato- DK 171258 Bl 18 grafi eller affinitetschromatografi såsom immunaffinitets-chromatografi eller receptoraffinitetschromatografi. I tilfælde af immunaffinitetschromatografi kan der enten anvendes antistoffer, som er dannet mod antigenerne ifølge opfindelsen 5 (omfattende det første polypeptid), eller antistoffer, der er dannet mod det andet polypeptid, som de antistoffer, som er immobiliseret i søjlen. I receptoraffinitetschromatografi kan receptoren for det dannede adhesin tilsvarende anvendes. Det DNA-fragment, der anvendes til fusionen med den DNA-sekvens, 10 der indkoder det andet polypeptid, kan være et hvilket som helst af de ovenfor viste DNA-fragmenter.
I en alternativ fremgangsmåde til fremstilling af adhesin-polypeptidet eller determinanten derfra fremstilles disse ved peptidsyntese i henhold til velkendte metoder såsom ved 15 flydende fase-peptidsyntese eller fastfase-peptidsyntese (jfr. fx Stewart og Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman & Co., San Francisco, USA, 1969). Fastfase-peptidsyntese er den foretrukne metode. X fastfasepeptidsyntese bygges aminosyresekvensen ved kobling af en indledende amino-20 syre til et bæremateriale efterfulgt af sekventiel tilføjelse af de øvrige aminosyrer i sekvensen ved peptidbinding, i dette tilfælde til en længde på mindst 5 aminosyrer. Ved fremstilling af adhesinpolypeptidet eller en undersekvens deraf ved fastfase-peptidsyntese kan det derfor være en 25 fordel at anvende den fysiologisk acceptable polymer, der er nyttig som bæremateriale for antigenet, i vaccinen som det bæremateriale, hvortil den indledende aminosyre i sekvensen kobles. Fremstillingen af syntetiske peptider til anvendelse som vacciner kan i øvrigt udføres i det væsentlige som be-30 skrevet i Shinnick, "Synthetic peptides, immunogens and vaccines", Ann. J?ev. Microbiol. 37, 1983, s. 425-446.
Ifølge opfindelsen kan det antistof, der er dannet mod eller i det væsentlige er rettet mod et antigen, som omfatter en determinant af et adhesin-polypeptid eller en immunogent 35 aktiv undersekvens deraf eller en precursor derfor, som kan omdannes til en immunologisk aktiv form, anvendes i et præ- DK 171258 B1 19 parat til passiv immunisering af et pattedyr mod sygdomme, som forårsages af patogene bakterier, der adhærerer til pattedyrvæv, hvilket præparat omfatter en immunologisk virksom mængde af et antistof som ovenfor defineret, eventuelt 5 bundet til et hensigtsmæssigt bæremateriale, sammen med en immunologisk acceptabel bærer. Dette præparat kan fremstilles ved en fremgangsmåde, som omfatter kombination af en immuno-gent virksom mængde af antistoffet med den immunologisk acceptable bærer, fx ved at blande bestanddelene.
10 Det bæremateriale, hvortil antistoffet eventuelt er covalent bundet, kan være et hvilket som helst af de ovenfor i forbindelse med beskrivelsen af vaccinen nævnte bærematerialer. Den bærer, hvormed antistoffet blandes, kan være en hvilken som helst bærer, der sædvanligvis anvendes til dette formål 15 såsom et fortyndingsmiddel, suspensionsmiddel, adjuvans, etc., tilsat i en mængde, der giver den ønskede koncentration af antistof i præparatet.
Selv om antistoffet er mindre effektivt til immunisering end det ovenfor beskrevne antigen, kan antistoffet således an-20 vendes til immuniseringsformål, men dets primære anvendelse er som diagnostisk middel til diagnose af infektionssygdomme, som forårsages af patogene adhesindannende bakterier, der adhærerer til pattedyrvæv, fx humant væv, eksempler på hvilke er uropatogene eller enteropatogene stammer af Escherichia 25 coli eller andre enteriske eller orale bakterier, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningiditis, Neisseria catarrhalis, Yersinia spp., Pseudomonas aeruginosa eller andre Pseudomonas spp., Moraxella bovis eller andre Moraxella spp., Bacteroides nodosus, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., eller 30 Bordetella spp. såsom Bordetella pertussis. Opfindelsen angår derfor også et diagnostisk middel, som omfatter et antistof som ovenfor beskrevet, såsom et antistof, der er dannet mod en immunogen determinant af et pilusadhesin-polypeptid, eller et antistof, der er dannet mod en immunogen determinant af et 35 antigen, der ikke er et adhesin-polypeptid eller en under- sekvens deraf eller en precursor derfor. Dette antigen kan fx DK 171258 B1 20 være et andet polypeptid, der indkodes af en adhesin-gen-klynge (en sekvens af gener, der på en eller anden måde er indblandet i mediering af adhæsionsevnen hos de bakterier, der bærer dem), fx ét af de andre polypeptider, der er in-5 volveret i dannelsen af pili, i tilfælde af pilus-polypeptid-erne fra uropatogene E. coli, fx genprodukterne af generne papB, papC eller papD (som vist i fig. 1 og/eller fig. 2), der indkoder polypeptider på henholdsvis 13 kd, 81 kd og 28,5 kd. papC- og papD-genprodukterne formodes i øjeblikket at 10 mediere samlingen og/eller forankringen af pilin-underenheder (indkodet af genet papA) under pilin-sekretionen og polymerisationsprocessen (til dannelse af pili).
Til anvendelse som diagnostiske midler kan antistofferne fx mærkes med et farvestof, således at bakterier, der indeholder 15 det antigen, der skal detekteres, fremtræder som farvede agglomerater i den diagnostiske test. Andre standardmetoder såsom enzymbundet immunosorbentassay (ELISA; jfr. Materialer og metoder) eller radioimmunoassay (RIA) under anvendelse af radiomærkede antistoffer kan også anvendes. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Alternativt kan det diagnostiske middel omfatte en stabil, 2 mærket DNA-sekvens, der er i det mindste ca. 60% homolog med 3 en DNA-sekvens i bakterien, hvis tilstedeværelse eller fra 4 værelse skal etableres ved den diagnostiske test. I nærvær 5 ende sammenhæng betegner udtrykket "stabil", at nucleotids- 6 ekvensen er relativt konstant, dvs. at baseparsubstitutioner, 7 hvor ét basepar erstattes med et andet, er forholdsvis sjæld 8 ne. I mange gener er sådanne baseparsubstitutioner relativt 9 almindelige uden nødvendigvis at påvirke aminosyresammensæt- 10 ningen af de genprodukter, der udtrykkes fra dem, men base- 11 parsubstitutioneme påvirker den diagnostiske proces, som 12 beror på en rimelig høj grad af homologi mellem DNA'et fra 13 proben og det bakterielle DNA, der anvendes som den prøve, 14 der skal testes, da DNA-(under)sekvensen i proben genkender 15 den samme sekvens eller en sekvens, der ligner den temmelig 16 meget i det bakterielle DNA. I den diagnostiske proces mærkes probe-DNA'et, og DNA'et denatureres for at adskille strengene DK 171258 B1 21 i både proben og det bakterielle DNA; efter blanding af DNA'erne lades strengene gendanne dobbeltspiralstrukturen, men i tilfælde af homologi (DNA-sekvensgenkendelse) vil noget af probe-DNA'et være blevet indført i det bakterielle DNA.
5 Denne teknik er kendt som hybridisering og er fx beskrevet i Southern, Methods in Enzymology 68, 1980, s. 151-176. For at have tilstrækkelig specificitet som diagnostisk middel bør det DNA, der anvendes som probe, omfatte en unik nucleotidsekvens og bør derfor have en længde på mindst 12 nucleotid-10 er. Probe-DNA'et kan med fordel mærkes med en radioaktiv isotop såsom 3H eller 14C på i og for sig kendt måde.
Den DNA-sekvens, der anvendes som probe-DNA, kan være en sekvens, der omfatter et gen, som er en del af en adhesin-genklynge, men som ikke indkoder selve adhesin-polypeptidet, 15 eller en diagnostisk effektiv undersekvens deraf. Dette gen kan fx være et gen, der koder for et pilus-polypeptid, som dannes af en patogen pilusdannende bakterie, som ikke er et pilusadhesin-polypeptid, eller en diagnostisk effektiv undersekvens deraf. I det her beskrevne system stammer den DNA-20 sekvens, der indkoder piluspolypeptidet eller en undersekvens deraf, fra en uropatogen stamme af Escherichia coli. Særlig fordelagtige diagnostiske midler i dette system har vist sig at være generne papB, papC og papD som følge af deres ovenfor beskrevne genetiske stabilitet eller en diagnostisk effektiv 25 undersekvens af et hvilket som helst af disse gener.
Som beskrevet ovenfor kan den ovenfor beskrevne determinant anvendes som en bestanddel af en vaccine til immunisering af et pattedyr såsom et menneske mod sygdomme, der er forårsaget af patogene bakterier, der adhærerer til pattedyrvæv, fx 30 humant væv. Vaccinen, som indeholder en immunogent virksom mængde af en determinant som beskrevet ovenfor, eventuelt bundet til et hensigtsmæssigt bæremateriale, eller præparatet til passiv immunisering, der indeholder et antistof som beskrevet ovenfor, også eventuelt bundet til et hensigts-35 mæssigt bæremateriale, og en immunologisk acceptabel bærer, kan administreres på i og for sig kendt måde såsom ved in- DK 171258 Bl 22 jektion af antigenet eller antistoffet blandet med en hensigtsmæssig injektionsbærer såsom isotonisk saltopløsning.
Disse patogene bakterier kan være alle bakterier, der danner adhesiner eller adhesinlignende polypeptider, idet eksempler 5 herpå er uropatogene eller enteropatogene stammer af Escherichia coli eller andre enteriske bakterier eller orale bakterier, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningiditis, Neisseria catarrhalis, Yersinia spp., Pseudomonas aeruginosa eller andre Pseudomonas spp., Moraxella bovis eller andre 10 Moraxella spp., Bacteroides nodosus, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., eller Bordetella spp. såsom Bordetella pertussis. En interessant klasse af sådanne bakterier udgøres af pilusdannende bakterier, og vigtige eksempler herpå er uropatogene eller enteropatogene stammer af Escherichia coli, 15 Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningiditis, Neisseria catarrhalis, Moraxella bovis eller andre Moraxella spp., eller Bordetella pertussis.
Sluttelig formodes det, at den ovenfor omtalte determinant kan anvendes til bestemmelse af tilstedeværelsen af recep-20 toren for det bestemte adhesin-polypeptid eller en aktiv del deraf på pattedyrvævsceller såsom epitelceller. Dette er af potentiel betydning til identifikation af personer, som tilhører højrisikogrupper, dvs. personer, som tilsyneladende er prædisponerede for visse typer infektion, da sådanne 25 personer danner store mængder receptor, hvortil de patogene bakterier, der forårsager den pågældende infektion, binder ved hjælp af de adhesiner, som de danner. Når sådanne personer er blevet identificeret, kan profylaktisk behandling, dvs. fortrinsvis immunisering/vaccination, foretages. Fremgangs-30 måden til bestemmelse af tilstedeværelsen af adhesinrecep-toren og de tilstedeværende mængder adhesinreceptor kan omfatte inkubation af en prøve, der omfatter vævsprøver eller celleskrab, med adhesinet efterfulgt af vask. Et antistof, der er dannet mod adhesinet og fx mærket med fluorescens 35 eller en radioaktiv isotop såsom 1-125, kan inkuberes med prøven, eller alternativt kan det således mærkede adhesin DK 171258 B1 23 anvendes direkte i testen. Mængden af adhesinreceptor i prøven kan derefter bestemmes ved at måle mængden af radioaktivitet eller fluorescens i prøven på i og for sig kendt måde.
5 Specifikt formodes det, at adhesin-polypeptideme fra en uropatogen stamme af B. coli, hvis aminosyresekvenser er vist ovenfor, kan anvendes til således at identificere kvinder, som danner større mængder af globosidreceptoren i deres urinveje, og som derfor antages at være prædisponerede for 10 urinvejsinfektioner.
Dette kan generelt udtrykkes som en fremgangsmåde til bestemmelse af receptortæthed eller -fordeling i et værtspattedyr såsom et menneske, ved hvilken en vævsprøve fra værten behandles med et receptorspecifikt polypeptid, ubundet recep-15 torspecifikt polypeptid fjernes, og mængden af bundet receptorspecifikt polypeptid bestemmes. Bestemmelsen af mængden af bundet polypeptid kan enten foretages ved mærkning af poly-peptidet eller ved inkubation af prøven med et mærket antistof som beskrevet ovenfor.
20 Denne fremgangsmåde er særdeles fordelagtig sammenlignet med tidligere fremgangsmåder, hvor receptortætheden eller receptorfordelingen blev bestemt ved hjælp af et antistof, der var rettet mod de specifikke receptorer, fordi det receptorspeci-fikke polypeptid, fx adhesin-polypeptidet, kan binde til den 25 specifikke receptor, hvad enten selve receptoren, der sædvanligvis er én eller to sukkere, er lokaliseret for enden af en sukkerkæde, eller systemet med to sukkere befinder sig et sted i midten af kæden, hvorimod antistoffet kun vil genkende to sukkere i slutningen af kæden, men ikke sukkerne i midten. 30 Derfor er antistoffets bindingsrepertoire begrænset sammenlignet med adhesin-polypeptidet, og et hvilket som helst forsøg på at kvantificere en receptortæthed vil altid blive undervurderet, når man anvender antistof til direkte kombination med receptorerne.
DK 171258 B1 24
De ovenfor beskrevne adhesin-polypeptider kan også anvendes i en fremgangsmåde til forebyggelse eller nedsættelse af risikoen for infektion hos et menneske eller andet pattedyr med en patogen adhesinbindende mikroorganisme, ved hvilken menne-5 sket eller det andet pattedyr behandles med ét eller flere adhesin-polypeptider ved en hensigtsmæssig fremgangsmåde til fordeling af polypeptiderne over de celleoverflader, hvor infektion med en specifik patogen bakterie skal forebygges, idet det anvendte adhesin-polypeptid er et adhesin-polypep-10 tid, der binder til de receptorer, hvortil det adhesin, som dannes af de patogene bakterier, binder. I dette tilfælde anvendes adhesin-polypeptidet ikke som et antigen, men som et direkte præventivt terapeutisk middel til optagelse af receptorerne, hvorved det bliver umuligt for de patogene bakterier 15 at binde til receptoren. I de fleste topiske infektioner er det første trin en specifik binding af adhesin-polypeptid fra den specifikke bakterie til den specifikke celleoverflade, hvilket vil sige, at når receptorerne allerede er optaget, kan det første trin i en proces til udvikling af en infektion 20 ikke finde sted. Når bakterierne ikke er i stand til at binde, opstår infektionen ikke.
Opfindelsen belyses nærmere under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 er et kort, der viser den genetiske opbygning af Pap 25 DNA i pRHU845. Den øverste linje viser størrelsen (i kilobasepar) af det EcoRI-fragment, der er indsat i plasmidet pACYC184. Positionerne af de forskellige Tn5- indsætninger er angivet ovenfor. Restriktions-kortet over pRHU845 og positionerne for de identifi-30 cerede pap-gener er anført. Den tykke lodrette streg betegner det område, der koder for signalpeptidet. Betegnelserne under stregerne angiver de modne poly-peptiders molekylvægt (x 103 daltonenheder).
Fig. 2 viser restriktionskort og genetisk opbygning af pap-35 hybridplasmider, der anvendes til in vitro mutagene- DK 171258 B1 25 se. Plasmidet pPAP5 bærer hele EcoRI-BamHI-fragmen-tet, der er nødvendigt for ekspression af Pap-pili og digalactosidspecifik agglutinering af humane erythro-cytter. Plasmidet pPAP16 bærer kun Smalχ-BamHI-frag-5 mentet under transkriptionskontrol fra lacUV5-pro- motoren. Plasmidet pPAP9 er identisk med pPAP16 med undtagelse af, at det ikke bærer lacUVS-promotoren. Under den horisontale linje betegner ApR ampicillin-resistens (100 ^g/ml).
10 Fig. 3 viser hele pap-området, som det findes i pPAP5 eller pPAP22 (øverste halvdel). pPAP22 er identisk med pPAP5 med undtagelse af, at det mangler BamHI-PvuII-delen af vektor-DNA'et. Dette plasmid er stamplasmid til papAl-derivatet pPAP23. Positionen for papAl- 15 mutationen er også vist. Den nederste del af figuren viser det fysiske kort over Smalj^-BamHI-området. Positionerne for Tn5-indsætningerne i dette område er vist. Alle ødelægger evnen til at mediere hæmaggluti-nation. Nedenunder dette er positionerne for papE-, 20 papF- og papG-generne vist. Det skraverede område betegner de formodede signalpeptider, der antages at blive indkodet af disse gener. Også positionerne for papEl-, papFl- og papGl-mutationerne er vist. De er blevet indført separat i både pPAP5 og pPAP16.
25 Konstruktionen og karakteriseringen af de på tegningen viste plasmider er beskrevet under Materialer og metoder samt i eksempel 1-3.
Generelle materialer og metoder Kemikalier og enzymer 30 Restriktionsenzymer og T4 DNA-ligase blev erhvervet fra
Boehringer Mannheim GmbH eller New England BioLabs og anvendt som foreskrevet af fabrikanten. Udfyldning af 3'-recessive DK 171258 B1 26 ender blev udført under anvendelse af Klenow-fragmentet (New England BioLabs) i ligeringspuffer, hvortil der var sat 200 μΜ af hver af de nødvendige dNTP'er. Xhol-linkeren (5'-CCTCG-AGG-3') og BairiHI-linkeren (5'-CGGATCCG-3') fik man fra Colla-5 borative Research, og de blev 5'-phosphoryleret som beskrevet af fabrikanten under anvendelse af polynucleotidkinase fra New England BioLabs. Alle kemikalier var af den højeste renhed, som findes i handelen. p-Erythrocytter fik man fra dr. B. Cedergren, Blodbanken, Universitetshospitalet i Umeå, 10 Sverige.
Oprensning af pili
Pili blev oprenset i henhold til en modifikation af den af Brinton et al., Immunobiology of Neisseria gonorrhoeae, Washington DC, USA, 1978, s. 155-178, beskrevne metode.
15 Celler blev dyrket i 22 timer ved 37°C på fem bakker (400 x 250 mm), der indeholdt L-agar uden glucose. Cellerne blev skrabet af bakkerne, suspenderet i 340 ml iskoldt 5 mM Tris-HC1 (pH-værdi 8,0) og blandet i 10 minutter på is i en Sor-vall Omnimixer på hastighed 4. Efter pelletering af cellerne 20 og cellerester (to gange i 30 minutter ved 20.000 x g) sattes ammoniumsulfat til supernatanten til 55%'s mætning, og pili lodes udfælde på is natten over. Bundfaldet blev indsamlet ved centrifugering og resuspenderet i 5 mM Tris (pH-værdi 8,0). Efter dialyse natten over mod samme puffer ved 4°C blev 25 uopløst materiale fjernet ved centrifugering i 30 minutter ved 40.000 x g. Udfældnings/dialyseproceduren blev gentaget yderligere tre gange (udfældning i 3 timer), hvorefter pili blev udfældet ved tilsætning af 0,2 volumen 1 M MgCl2-l,5 M NaCl-100 mM Tris-HCl (pH-værdi 7,5). Bundfaldet blev opløst 30 til en proteinkoncentration på 2 mg/ml målt i henhold til
Lowry et al., J. Biol. Chem. 193, 1951, s. 920-929. Udbyttet var ca. 15 mg for vildtypen og 2-30 mg for mutanterne.
DK 171258 B1 27
Receptorbindinga.38a.y8
Til pladeagglutinering blev bakterieceller, der var dyrket i 22 timer på glucosefri L-agar, suspenderet til ca. 1010 celler/ml i agglutineringspuffer (150 mM NaCl 10 mM Tris-HCl, 5 pH-værdi 7,5) indeholdende 3% hepariniserede og vaskede humane erythrocytter. Reaktionen var, når den var positiv, sædvanligvis synlig inden for 60 sekunder. Den positive reaktion var en makroskopisk synlig aggregering af erythrocytter. I det semikvantitative assay blev celler, der var 10 dyrket som ovenfor beskrevet, resuspenderet til en Ag00 = 20. De blev derefter seriefortyndet 2 gange i 50 μΐ agglutineringspuffer under anvendelse af mikrotiterplader med brønde med en konisk bund (Linbro/Titertek, katalog nr. 76-321-05, CT, USA). Hertil sattes 10 μΐ af en 3%'s erythrocytsuspension 15 i samme puffer. Den fortynding i den sidste brønd, som giver en positiv agglutinering efter 2 timer ved 4°C, blev sat som agglutineringstiteret. Celletallet i den oprindelige suspension blev anvendt sammen med titeret for at beregne den minimale bakteriekoncentration, som var nødvendig for agglu-20 tinering.
Agglutineringstiteret for oprensede pili blev bestemt i det væsentlige på samme måde som beskrevet for helceller. Når der anvendtes agglutineringspuffer, var den piluskoncentration, som var nødvendig for agglutinering, imidlertid meget høj, og 25 der blev gjort forskellige forsøg på at forøge assayets følsomhed. Da pili er negativt ladede ved fysiologisk pH og aggregerer i nærværelse af 167 mM MgCl2 (jfr. Op rensning af pili), blev et vildtypepiluspræparat titreret ved stigende MgCl2-koncentrationer under anvendelse af Ρχ-erythrocytter, 30 som indeholdt giobosidreceptoren (herunder digalactosidet), og p-erythrocytter, der mangler dette carbonhydrat. Agglutineringstiteret viste sig at forøges 128 gange, når MgCl2-koncentrationen blev forøget til 100 mM. Dette var parallelt med en forøgelse af A40Q af en 200 μg/ml pilusopløsning i 35 samme puffere. Med CaCl2 og 10 gange højere koncentrationer af NH4C1 fås de samme resultater, hvilket tyder på, at effek- DK 171258 B1 28 ten er på pilus-pilusinteraktion og ikke på specifik receptorbinding. Endvidere bliver agglutineringstiteret for pilierede helceller ikke væsentligt påvirket ved tilsætning af MgCl2 op til 200 mM. Også forøgelsen i agglutineringstiter 5 under anvendelse af p-erythrocytter viser, at uspecifik pilus/erythrocytaggregering fremmes ved tilsætning af Mg2+-ioner, selv om assayets specificitet (Pj-titer over p-titer) synes at være upåvirket. Alle titreringer af piluspræparater blev derfor udført i agglutineringspuffer med 100 mM MgCl2, 10 hvilket giver en semikvantitativ værdi for specifik agglutinering .
Antistofdannelse
Præimmune sera vandtes fra to sunde 1,8 kg tunge hvide New Zealand hunkaniner ved hjertepunktur, filtersteriliseredes og 15 lagredes ved -20°C. 75 /xg oprensede Pap-pili i 1,0 ml isoto-nisk saltopløsning blev emulgeret med et lige volumen Freund's komplette adjuvans og injiceret i mængder på 0,5 ml fire steder, nemlig subskapulært på to steder og intramusku-lært i de to bagben. Efter 6 uger gav man en "booster"-in-20 jektion med Freund's komplette adjuvans. Ti dage efter den anden immunisering blev blodet tappet fra dyrene ved hjertepunktur, og serummet blev filtersteriliseret og lagret med 0,02%'s natriumazid ved -20°C.
Pilusantigenassay 25 Til pladeagglutinering blev bakterier dyrket og præpareret som beskrevet for hæmagglutineringsassays. Agglutinerings-tests af helceller blev udført med 500 gange fortyndet (PBS pH-værdi 7,5) antiserum dannet mod oprensede Pap-pili (se ovenfor). Den positive reaktion blev bestemt som en makrosko-30 pisk synlig aggregering af bakterier, der opstod inden for 60 sekunder.
DK 171258 B1 29
Proteinekspression i miniceller
Plasmidet pPAP5 og derivater deraf blev transformeret til den minicelledannende stamme P678-54 (Adler et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 57, 1967, s. 321-326). Præparering og mærkning 35 5 af plasmidholdige miniceller med [ Slmethionin blev udført som beskrevet af Thompson og Achtman, Mol. Gen. Genet. 165, 1978, s. 295-304. De radioaktive prøver blev underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese (se nedenfor). Gelerne blev derefter fikseret, farvet, fremkaldt (Enhance, New England 10 Nuclear) og autoradiograferet. Molekylvægtstandarder (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) og oprenset pilin blev underkastet elektroforese parallelt hermed.
SDS - polya c ryl ami dgel el ek trof ore se
Radioaktive prøver blev suspenderet i 100 μΐ prøvepuffer 15 indeholdende 62,5 mM Tris-HCl (pH-værdi 6,8), 1% natrium- dodecylsulfat (SDS), 0,5% β-mercaptoethanol og 10% glycerol. Efter 5 minutters kogning blev ekstrakterne underkastet elektroforese i 15%'s polyacrylamidpladegeler indeholdende 0,1% SDS (Laemmli, Nature 227, 1970, s. 680-685). Protein-20 standarder med molekylvægte i området 3.000-94.000 blev kørt parallelt hermed. Efter fiksering, farvning og affarvning (Grundstrom et al., J. Bacteriol. 143, 1980, s. 1127-1134) blev gelen fluorograferet under anvendelse af En3Hance (New England Nuclear Corp., Boston, Massachusetts, USA).
25 Transposonmu tagenese
Transposonmutagenese med Tn5 blev i det væsentlige udført som beskrevet af Bj6rk og Olsen, Acta Chem. Scan. Ser. B 33, 1979, s. 591-593, med phagen y clg57b221 rex::Tn5.
Celleekstrakter 30 Celler fra stamme P678-54 indeholdende forskellige hybrid- plasmider blev dyrket på tryptisk sojaagar i nærværelse af DK 171258 B1 30 hensigtsmæssige antibiotika. Bakterier blev høstet efter vækst natten over ved 37°C suspenderet i PBS (pH-værdi 7,2)-Brij®-35 til en celledensitet på 1,5 absorbansenheder ved 560 nm og indsamlet ved centrifugering (12.000 x g i 10 minut-5 ter). Cellepelleten blev derefter suspenderet i 400 μΐ 1% Nonidet P-40-1% natriumdeoxycholat-0,1% SDS-0,15 M NaCl-0,01 M Tris-HCl (pH-værdi 7,2) indeholdende lysozym i en mængde på 1 mg/ml og blev inkuberet i 10 minutter ved 4°C. En 400 μΐ'8 prøve af en 1/15.000 fortynding af Pap-antisera sattes til 10 celleekstrakten. Efter inkubation ved 4°C i 16 timer blev celleekstrakt/antistofblandingen klaret ved centrifugering (12.000 x g i 10 minutter).
Kompeti tivt enzymbundet immunosorbentassay (ELISA)
Mikrotiterhæmagglutinerings-engangsplader (Cooke polystyren, 15 96 U brønde) udsattes for 100 μΐ af en l μg/ml opløsning af oprensede Pap-pili pr. brønd i 0,1 M natriumcarbonatpuffer (pH 9,6) i 16 timer ved 25°C. Brøndene blev vasket tre gange med 0,15 M NaCl indeholdende 0,05% (vol/vol) Brij®-35 (Sigma) for at fjerne ubundne pili. Anti-Pap-pilus-kaninantiserum 20 blev fortyndet i PBS (pH 7,2) med 0,05% (vol/vol) Brij®-35 til en koncentration, der medførte 50% maksimal binding (1/30.000 fortynding) og blev derefter blandet med seriefortyndinger i PBS-Brij®-lysater af hele bakterier, cellefri ekstrakter eller Pap-pili (positiv kontrol) eller uden til-25 satte pili (negativ kontrol). Efter inkubation i 16 timer ved 4°C blev 100 μΐ's prøver overført til de sensitiserede mikro-titerbrønde. Pladerne blev inkuberet i 3 timer ved 37°C og blev derefter vasket tre gange med NaCl-Brij®. Alkalisk phosphatase-konjugeret gede-antikanin-immunoglobulin G for-30 tyndet 1/1.000 i PBS-Brij® sattes til alle brøndene og blev inkuberet i 1 time ved 37°C. Pladerne blev vasket tre gange med PBS-Brij®, og til hver brønd sattes 1 mg p-nitrophenyl-phosphat (Sigma) pr. ml i 1,0 M diethanolaminpuffer (pH 9,8) og inkuberet i 20 minutter ved 37°C. Reaktionen blev standset 35 ved tilsætning af 2 N NaOH, og absorbans ved 405 nm blev bestemt med et MR 580 MicroELISA automatisk aflæsningsudstyr DK 171258 B1 31 (Dynatech 011-960-0000; Dynatech Laboratories, Alexandria, Virginia, USA).
Immunudfæl dning 35
Immunudfældning af [ S]methionin-mærkede, plasmidindkodede 5 proteiner blev udført i det væsentlige som beskrevet af
Dallas og Falkow, Nature 277, 1979, s. 406-407, med undtagelse af, at der anvendtes rent Staphylococcus aureus Protein A bundet til Sepharose® i stedet for Staphylococcus aureus-celler.
10 Western-blotting
Western-blotting efter SDS-polyacrylamidgelelektroforese af oprensede pili blev udført som beskrevet af Swanson et al., Infect. Immun. 38, 1982, s. 668-672. Fortyndet Pap-antiserum dannet mod pili, der var oprenset fra stamme P678-54, som 15 indeholdt plasmidet pRHU845 (enzymbundet immunosorbentassay-titer 1:1.000) anvendtes.
Konstruktion af plasmidderivater
Det 9,6 kb lange EcoRI-BamHI-fragment af pRHU30, der indeholder alle de gener, som er nødvendige for ekspressionen af 20 Pap-pili og digalactosidspecifik binding, blev klonet ind i EcoRI- og BamHI-spaltet pBR322 (Bolivar et al., Gene 2, 1977, s. 95-113), hvilket gav pPAP5 (jfr. fig. 2). Til konstruktion af et derivat, der mangler PvuII-stedet i pBR322-delen af molekylet, blev vektoren spaltet med PvuII og ligeret til et 25 20 ganges overskud af BamHI-linker. Dette DNA blev derefter spaltet med EcoRI og BairiHI, og det største fragment, som bar nucleotiderne 2065-4360 fra pBR322 (Sutcliffe, DNA: Replication and Recombination 43, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1978, s. 77-90), blev isoleret fra en 0,7%'s 30 agarosegel. Dette fragment, der blev ligeret til EcoRI-BamHI-fragmentet fra pRHU30, blev transformeret (Mandel og Higa, «7. Mol. Biol. 53, 1970, S. 159-162) til E. coli stamme HB101 DK 171258 B1 32 (Boyer og Roulland-Dussoix, «7. Mol. Biol. 41, 1969, s. 459-472). Den isolerede klon blev benævnt pPAP22 og er identisk med pPAP5 med undtagelse af, at klonen mangler BamHI-PvuII-segmentet. Et derivat, pPAP23, som har en rammeskiftemutation 5 ved det enkelte PvuII-sted i papA, blev konstrueret ved
linearisering af pPAP22 med PvuII og ligering deraf til et 20 ganges overskud af .Xhol-linker. Efter spaltning i 3 timer under anvendelse af 20 enheder Xhol/^g DNA blev fragmentet oprenset på en Sephadex® G150-søjle (Pharmacia Fine Chemi-10 cals, Uppsala, Sverige), ækvilibreret med 10 mM Tris-HCl, pH
8,0, og 1 mM EDTA. Efter ligering og transformation til E. coli stamme HB101 blev DNA fra seks kloner isoleret (Bim-boim og Doly, Nucleic Acids Res. 7, 1979, s. 1513-1523) og analyseret. Fem af klonerne havde et nyt Xhol-sted i det 15 tidligere PvuII-sted, og én af disse blev kaldt pPAP23 og anvendt til yderligere undersøgelser.
Følgende manipulationer blev foretaget for at konstruere plasmidet pPAP16 (fig. 2) og derivater af både dette plasmid og pPAP5 med mutationer i Smal^BairiKI-området. Plasmidet 20 pPAPl blev konstrueret ved at linearisere 2 μg pBR322 med Clal, og stumpe ender blev dannet under anvendelse af 5 enheder Klenow-fragment og 200 μΜ hver af dGTP og dCTP (15 minutter ved 30°C i ligeringspuffer). Dette DNA blev efter varmeinaktivering af enzymet ligeret til det geloprensede 25 Smali-Sma^-fragment fra pPAP5 (fig. 2) , og ved screening af plasmidpræparater i lille målestok blev et plasmid, som bar fragmentet i samme orientering i forhold til vektoren som på pPAP5, isoleret. Klonen pPAPl udtrykte det sidste polypeptid (35 kd) i let afkortet form. Således strækker genet for dette 30 polypeptid sig ud over Smal2-stedet og foreligger i afkortet form i pPAPl. Denne mutation blev isoleret på et JCpnl-BamHI-fragment, som blev ligeret til pPAP5, der var spaltet med disse enzymer. Derivatet pPAP7, der var vundet på denne måde, indeholder således pap DNA op til Smal2-stedet. Plasmidet 35 pPAP9, der indeholder hele Smalj^-BamHI-området, blev konstrueret ved ligering af JCpnl-BamHI- fragmentet fra pPAP5 i et overskud i forhold til JCpnI-BamHI-spaltet pPAPl. Til frem- * DK 171258 B1 33 stilling af rairaneskiftemutationer i indsætningen af pPAP9 blev dette plasmid delvis spaltet med Hindi i nærværelse af 150 /xg/ml ethidiumbromid (Greenfield et al., Biochim. Bio-phys. Acta 407, 1975, s. 365-375). Lineariseret plasmid blev 5 derefter isoleret fra en 0,7%'s agarosegel og ligeret til et overskud af Xhol-linker. Efter Xhol- spaltning, Sephadex® G150-gelchromatografi og ligering blev DNA'et transformeret til E. coli stamme HB101 under udvælgelse for ampicillin-resistens. Oprenset DNA fra 23 kloner blev analyseret ved 10 spaltning med Xhol og Sall. Ud af 15 mutanter i indsætningen var de 13 linker indsætninger ved ifincll2-stedet og 2 ved Hindis stedet. Der vandtes ingen mutanter ved HincII3-sted- et. pPAP5-derivater med disse mutationer blev konstrueret analogt med pPAP7. Disse plasmider blev benævnt pPAP15 15 {HindIjJ og pPAP14 (KincII2) . pPAP19 blev konstrueret ved at slette Xhol-Sall-fragmentet af pPAP14 ved genligering af en Xhol-Sall-spaltning af sidstnævnte plasmid. Konstruktionen af pPAP20 ud fra pPAP15 blev udført på samme måde. Til fremstilling af plasmidet pPAP26 (papAl, papEl dobbeltmutant) 20 blev det store KpnI-BamHI-fragment fra pPAP23 (papAl) ligeret til det lille Kpnl - BairiHI - fragment på pPAPlO (papEl).
Plasmidet pPAP9 komplementerede ikke Tn5- indsætningerne i Smalj^-BamHI-området. Dette formodedes at skyldes utilstrækkelig transkription hen over indsætningen. Derfor blev EcoRI-25 fragmentet indeholdende lacUV5-promotoren isoleret fra pSKS106 (Casabadan et al., Methods Enzymol. 100, 1983, s. 293-308) og ligeret i overskud til med BcoRI lineariseret pPAP9. En klon med fragmentet i den korrekte orientering, pPAP16, blev derefter isoleret ved screening af DNA-præpara-30 ter under anvendelse af Pstl-spaltning, da promotorfragmentet bærer et asymmetrisk placeret sted for dette enzym. Den samme procedure blev anvendt på de andre pPAP9-derivater, hvilket medførte pPAP4 (Smal2-BamHI-sletning), pPAP18 (Hind^-mutation) og pPAPl7 (HincII2-mutation) .
DK 171258 B1 34 EKSEMPEL 1
Kloning og identifikation af genet for hovedpi lusunderenheden Højmolekylært chromosomalt DNA fra et spontant Lac’derivat af et uropatogent isolat af E. coli J96 (jfr. R. Hull et al., 5 Infect. Immun. 33, 1981, s. 933-938; mannoseresistent hæm-agglutinering (MHRA+) og digalactosidspecifik binding) blev isoleret i henhold til standardmetoder. Dette DNA blev derefter delvis spaltet med restriktionsendonucleasen Sau3A. Restriktionsfragmenterne blev ligeret til plasmidvektoren 10 pHC79 (Collins, Methods Enzymol. 68, 1979, s. 309-326), der forinden var blevet lineariseret med restriktionsendonucleasen BamHI. Dette DNA blev in vitro pakket i 7-phagpartikler i henhold til den af B. Holm, Methods in Enzymology 68, 1979, s. 1127-1134, beskrevne metode. Disse partikler blev anvendt 15 til infektion af E. coli stamme P678-54 (Adler et al., op. cit.). Bakterierne blev derefter spredt ud på plader, der indeholdt ampicillin, hvilket førte til dannelsen af kolonier, der indeholdt det rekombinante plasmid, som er ampicil-linresistent.
20 Individuelle kolonier blev screenet for agglutinering af humane erythrocytter i nærværelse af 1% mannose, og klonen (pRHU807), der forårsagede mannoseresistent hæmagglutinering, blev udvalgt. Subkloner (pRHU30 og pRHU845) af pRHU807 blev konstrueret, idet de bevarede MRHA+' som beskrevet af R· Hul1 25 et al., op. cit. Tilstedeværelsen af begge disse subkloner i E. coli stamme HB101 fører også til dannelse af pili. Den hæmagglutinering, der blev forårsaget af E. coli stamme HB101, der indeholdt pRHU845, blev fuldstændigt inhiberet ved tilstedeværelsen af opløseligt digalactosid både i nærværelse 30 og i fraværelse af mannose, hvilket viste, at MHRA+-fænotypen, som udtrykkes af denne stamme, i dette tilfælde er identisk med digalactosidspecifik binding.
Strukturgenet for hovedpolypeptidet, der danner Pap (pili forbundet med pyelonephritis) pilus (papA), blev identifi-35 ceret ved Western-blotting og immunudfældning fra subkloner DK 171258 B1 35 og kortlagt til ca. 2,2 kb som vist i fig. 1. Positionen af papA-genet blev bekræftet ved identiteten mellem genproduktets aminosyresekvens, der blev udledt fra DNA-sekvensen (M. Båga et al., J. Bacteriol. 157, januar 1984, s. 330-333), 5 sammenlignet med hoved-Pap-pilusunderenhedens N-terminale sekvens (jfr. O'Hanley et al., J. Exp. Med. 158, november 1983, s. 1713-1719).
EKSEMPEL 2
Identifikation af pilus-DNA-sekvensen 10 For at karakterisere de gener, der kræves til Pap-pilusdan-nelse og digalactosidspecifik agglutinering, blev subkloner af pRHU845 og transposon Tn5- indsætningsmutanter konstrueret og analyseret som beskrevet i Normark et al., Infect. Immun. 41, september 1983, s. 942-949. Ved yderligere analyse af 15 Tn5- indsætningsmutanterne og subklonerne viste det sig, at kun det DNA, som befandt sig mellem stilling ca. 1,0 og ca.
9,4 kb fra det venstre EcoRI-sted (se fig. 1), var nødvendigt for at indkode Pap-pilusdannelse og digalactosidspecifik binding. Indsætningsmutanter mellem 7,9 og 9,2 kb fra EcoRI-20 stedet (se fig. 1) ophævede digalactosidspecifik binding uden at inhibere dannelsen af Pap-pili.
EKSEMPEL 3
Genetisk karakterisering af pilusadhesin-DNA
Det i eksempel 2 identificerede område, der er nødvendigt for 25 Pap-pilusdannelse og digalactosidspecifik binding, blev genklonet som et 9,6 kb langt EcoRI-BamHI-fragment af pRHU30 i pBR322, hvilket gav plasmiderne pPAP5 (jfr. fig. 2) og pPAP22 som beskrevet under Materialer og metoder. Både pPAP5 og pPAP22 bærer hele EcoRI-BamHI-indsætningen, selv om pPAP22 30 som følge af en sletning i vektor-DNA'et har et unikt PvuII- DK 171258 B1 36 sted i papA-strukturgenet. Plasmidet pPAP23 med en rammeskif-temutation, papAl, blev konstrueret ved indsætning af en 8 bp lang Xhol-linker i det unikke PvuII-sted i pPAP22 (jfr. fig. 3). IB. coli stamme HB101 blev denne rammeskiftemutant 5 til forskel fra vildtypen ikke agglutineret af antiserum dannet mod oprensede Pap-pili.
E. coli HB101 indeholdende pPAP23 agglutinerer humane Ρ^ erythrocytter samt digalatosidovertrukne latexkugler. Derfor synes pPAP23/HB10l at udtrykke den samme receptorbindings-10 specificitet som HB101, som bærer vildtypens pap-operon på pPAP22 eller pPAP5. Inaktivering af pilingenet papA formindskede således ikke graden af digalactosidspecifik agglutinering i det anvendte assay.
Tn5- indsætninger i den dis tale del af pap DNA'et ophæver 15 hæmagglutinering, men tillader Pap-pili at dannes. Det blev derfor antaget, at generne, der medierer agglutinering, er lokaliseret i denne region. For yderligere at undersøge vigtigheden af de her indkodede polypeptider blev Smal BatriHI-fragmentet, der er vist i fig. 2, subklonet i pBR322 20 (se Materialer og metoder). Eftersom det resulterende plasmid ikke komplementerede Tn5 - indsætninger i Smal^BamHI-området, blev det klonede fragment sat under transkriptionskontrol fra lacUV5-promotoren (for at sikre tilstrækkelig transkription af generne på fragmentet), der var indsat i plasmidet som et 25 BcoRI-fragment fra pSKS106 (se Materialer og metoder). Dette plasmid, pPAP16 (se fig. 2), komplementerede de fire ikke-hæmagglutinerende Tn5-mutanter med indsætningspunkter i Smalj^-BamHI-fragmentet. Lokaliseringen af disse mutanter er vist i fig. 3. 1 2 3 4 5 6
For yderligere at definere generne på Smalj^-BamHI-fragmentet 2 blev der konstrueret et detaljeret restriktionskort over 3 pPAP16-indsætningen med en nøjagtig lokalisering af relevante 4
Tn5-indsætninger (jfr. fig. 3). Tre rammeskiftemutationsde 5 rivater af pPAP5, der indeholdt læsioner i dette område (jfr.
6 fig. 3 og Materialer og metoder), blev også konstrueret. To DK 171258 B1 37 mutantplasmider, pPAP14 og pPAP15, bærer Xhol-linkere i henholdsvis Hincll2- og Hindi! - stederne. I en tredje mutant, pPAP7, var pap DNA fra Smal2 til BairiRI (jfr. fig. 3) blevet slettet.
5 De polypeptider, der udtrykkes fra pPAP5, og dets tre mutant-derivater blev [ S]methioninmærket i E. coli-miniceller, og de udtrykte polypeptider blev analyseret på en SDS-polyacryl-amidgel. Sammenlignet med pPAP5 udtrykte plasmidet pPAP7 ikke det 35 kd store polypeptid. I stedet fremkom et nyt polypep-10 tid på 34 kd. Da mutationen i pPAP7 har afkortet pap-området ved Smal2-stedet, kortlægger dette 3'-enden af genet, der koder for det 35 kd store polypeptid, papG, mellem Smal2- og BairiRI-stederne (jfr. fig. 3). Dette er det sidste gen i papområdet .
15 HincII2-mutationen i pPAPl4 ophævede ekspression af det 15 kd store polypeptid, hvilket også er tilfældet med Tn5-indsætningerne 002 og 021, der nøjagtigt kortlægger genet papF som kodende for dette polypeptid (jfr. fig. 3). Ingen andre polypeptider blev påvirket af Hindl2-mutationen (papF) i 20 pPAP14. Minicellepræparationen af Hindi!-linker-indsætnings -mutanten, pPAP15, danner ikke det 16,5 kd store polypeptid. Genet for dette polypeptid betegnes papE, og rammeskiftemuta-tionen betegnes som papEl. Afkortningen af papG-genprodukterne på grund af SjnaI2-BairiHI-sletningen viser, at dette gen 25 transkriberes fra venstre til højre i fig. 3. Polaritetsvirkninger, som udøves af Tn5 - indsætningerne i papE og papF på papG, viser, at transkriptionen af alle tre gener er i denne retning.
Til bekræftelse af positionen af Tn5-mutationerne i forhold 30 til papF- og papG-generne blev Tn5-mutationerne 002, 021, 026 og 042 (jfr. fig. 3) komplementeret med det muterede Smal^^-BairiR I - område. Til dette formål blev der konstrueret papEl-, papFl- og papGl-derivater af pPAPl6, som indeholdt Smal-L-BairiHI- området under 2acUV5-promotorkontrol, som beskrevet 35 under Materialer og metoder. Disse blev derefter transfor- DK 171258 B1 38 meret til F. coli stamme HB101, som indeholdt Tn5-derivaterne af pRHU845 (Normark et al., op. cit.), og analyseret for globosidspecif ik haemagg lu tinering under anvendelse af og p-erythrocytter. papEl-derivatet komplementerede alle Tn5-5 mutationer, hvilket også var tilfældet med stamplasmidet pPAP16. papFl-plasmidet komplementerede Tn5-mutationerne 026 og 042, hvorimod plasmidet, der indeholdt papGl, komplementerede mutationerne 002 og 021. Dette definerer 002- og 021-Tn5- indsætningerne som mutationer i papF og viser, at Tn5-10 indsætningerne 026 og 042 er anbragt i papG-genet. Det viser også tydeligt, at papF og papG er separate, uafhængige trans -komplementerbare gener. Det genetiske kort over dette område (vist i fig. 3) blev konstrueret på grundlag af disse data.
Som vist ovenfor ophæver Tn5- indsætninger i papF og papG 15 fuldstændigt hæmagglutinering, selv om der dannes pili. For at bedømme den individuelle vigtighed for hæmagglutinering af papF-, papF- og papG-genprodukterne blev de ikke-polære linkerindsætningsmutantderivater af pPAP5 underkastet hæm-agglutineringstests. Det viste sig, at hverken papFl- eller 20 papGl-derivatet udviste nogen agglutinering af P1-erythrocyt-ter, hvilket viste, at både papF- og papG-genprodukterne er nødvendige for agglutinering. papFl-mutanten påvirkede ikke i sig selv hæmagglutineringstiteret, men overraskende nok agglutinerede en papAl,papEl-dobbeltmutant, pPAP26, ikke Ρχ-25 erythrocytter, når den blev transformeret til E. coli stamme HB101.
Pilusantigendannelsen og den digalactosidspecifikke binding hos de forskellige mutantderivater af pPAP5 eller pPAP22 i F. coli stamme HB101 er opsummeret i tabel 1.
DK 171258 B1 39
Tabel 1
Egenskaber hos plasmider anvendt til kortlægning og funktionel analyse af papA, papE, papF og papC
Fænotype
Plåsmid Relevant genotype Pilus-antigen Hæmagglutinering pSN002 papF: :Tn5-002 ♦ pSN021 papF: :Tn5-021 ♦ pSN026 papC: :Tn5-026 ♦ pSN042 papC: :Tn5-042 ♦ pPAP5 vildtype + + pPAP15 papE1 * * pPAP14 papFJ * pPAP7 papCI * pPAP20 papE1, LpapF-C * pPAP19 papF1, LpapC ♦ pPAP22 vildtype ♦ ♦ pPAP23 pap Al - * pPAP26 pap Al, papE1
pPAP9 LpapB-D
pPAPl LpapB-D, papCI
pPAP16 LpapB-D, /ocPjjy^ pPAP18 åpapB-D, /ocP^y^, papEl
pPAPl7 LpapB-D, lacPypapFI
pPAP4 SpapB-D, /ocPyy^, papCI
pSN-plasmider er pACYC184-derivater (der bærer EcoRI-fragmen-tet fra pRHU845; hvert plasmid indeholder en forskellig Tn5-indsætning som vist i fig. 1), hvorimod pPAP-plasmider er derivater af pBR322. Pilusantigen blev bestemt ved plade-5 agglutinering af en cellesuspension med antisera mod Pap-pili.
Det fremgår af tabellen, at mutationen papAl i pPAP23 fuldstændigt ophævede dannelsen af hoved-Pap-pilusunderenheden DK 171258 B1 40 (papA-genproduktet) uden at påvirke digalactosidspecifik binding. Modsat ophævede mutationen papFl i pPAP14 og papGl i pPAP7 digalactosidspecifik binding uden at inhibere dannelsen af Pap-pili.
5 Mutationerne i generne papC og papD ophævede både pilusdannelse og digalactosidspecifik binding. Kun mutationer i papF og papG medfører ophævelse af den digalactosidspecifikke binding uden at forhindre dannelsen af Pap-pili. Den eneste undtagelse er dobbeltmutanten papAl-papEl, som er negativ for 10 agglutinering som beskrevet ovenfor. Mutationer i papA eller papE alene adhærerer. Denne effekt antages at kunne tilskrives det forhold, at papA- eller papE-polypeptiderne (sandsynligvis) kræves til forankring af adhesinet til cellevæggen.
Det kan derfor konkluderes, at papF- og/eller papG-generne 15 indkoder den digalactosidspecifikke adhæsion.
EKSEMPEL 4
EtéOolering af pilusadhesin-DNA'ets DNA-sekvens 100 /ig pPAP9 (konstrueret som beskrevet under Materialer og metoder og vist i fig. 2) blev spaltet med EcoRI og BamHI og 20 underkastet præparativ agarosegelelektroforese for at isolere EcoRI - BamHI - f ragment et indeholdende Smal·^ - BamHI - området (jfr. fig. 3).
Alikvoter af dette fragment blev spaltet med endonucleaserne Haelll, RsaI, Alul, Hpall, Sau3A, Tagl, Hindi og Bglll hver 25 for sig eller i kombination. De vundne fragmenter blev enten klonet direkte eller efter præparativ agarosegelelektroforese, og fragmentisolering blev foretaget i phag M13-vektorer (M13mp8 og M13mp9; Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 1981, s. 309-321). Indsætningerne blev sekventeret ved den af 30 Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 1977, s. 5463-5467, beskrevne metode (dideoxysekventering), indtil man fik DK 171258 B1 41 utvetydige overlappende aflæsninger af DNA-sekvensen fra Smal-L-BairiHl-fragmentet for begge strenge.
EKSEMPEL 5
Aminosyresekventering af pilusadhesineme 5 Blandt de mulige læserammer blev generne papE, papF og papG identificeret ud fra den kendte position af generne etableret ved hjælp af linker- og transposon Tn5-indsætninger (jfr. fig. 3) og den kendte størrelse af deres respektive genprodukter, henholdsvis 16,5 kd, 15 kd og 35 kd. De N-terminale 10 ender af disse gener blev identificeret. Aminosyresekvensen blev afledt af DNA-sekvensen under anvendelse af den for E. coli etablerede genetiske kode. Da alle genprodukter dannes som precursorer, som indeholder signalpeptider, an-toges genets 5'-ende at være et methionin efterfulgt af en 15 signalpeptidlignende sekvens (G. von Heijne, European Journal of Biochemistry 133, 1983, s. 17-21).
EKSEMPEL 6
Homolog i med andre uropatogene E. coli DNA
Flere fragmenter fra SmaI1-BamHI-området blev isoleret og 32 20 P-mærket ved "nick"-translatering. Fragmenterne blev således udvalgt, at de dækkede hele området i små segmenter.
Disse blev derefter anvendt som prober i Southern-blots af udskæringer af plasmiderne pDC5 (Clegg og Pierce, Infect. Immun. 42, 1983, s. 900-906) og pPIL110-35 (van Die et al., 25 FEMS Microbiol. Letters 19, 1983, s. 77-82) under stringente betingelser. Man fik stærke hybridiseringssignaler med prober fra papE- og papF-generne, hvorimod man ikke fik signaler fra papG-genområdet. Kraftig hybridisering under stringente betingelser blev også opnået fra en probe af papC-genet DK 171258 B1 42 mellem fipal-stederne ca. 3,2-3,4 kb fra EcoRI-stedet (jfr. fig. 1).
Detaljerede restriktionskort over pDC5 og pPILHO-35 blev konstrueret og viste sig at være næsten identiske med re-5 striktionskortet over pPAP5 med hensyn til papC- og papD-områderne. En mindre, omend stadig høj grad af lighed blev observeret for papE- og papF-generne. Det kan derfor konkluderes, at det DNA, som indkoder MRHA+ i andre uropatogene stammer af E. coli, svarer meget godt til det, som klones i 10 pPAP5 (stammer fra E. coli stamme J96), og at de resultater, som er opnået i Pap-systemet, kan generaliseres til de fleste pyelonephritogene stammer. Hvad angår pPIL110-35, har det også vist sig, at MRHA udtrykt fra dets DNA er digalactosid-specifikt. Tilsvarende resultater blev opnået af nærværende 15 opfindere samt andre forskere (jfr. Low et al., Infect.
Immun. 43, 1984, s. 353-358) med chromosomalt DNA fra kliniske isolater.
EKSEMPEL 7
Konstruktion af en fusion mellem papG-genet og lacZ-genet 20 Plasmidet pPAP9 blev spaltet med Bglll og Sall (lokaliseret ca. 375 bp til højre for BamHI-stedet i pPAP9). Det resulterende fragment blev ligeret til plasmidet pMC874 (Casabadan et al., J. Bacteriol. 143, 1980, s. 971-980), der forinden var blevet spaltet med BamHI og Sall. Efter transformation 25 til pMC1061 (Casabadan et al., op. cit.) og udpladning på plader, der indeholdt 100 ^g/ml ampicillin, blev rekombi-nanter analyseret. Et plasmid, pHMGSl, der bestod af pPAP9, i hvilket Bglll-Sall-fragmentet var blevet erstattet med lac-kassetten fra pMC874 (BamHI-Sall-fragmentet), blev isoleret 30 og viste sig ved minicelleanalyse som beskrevet under Materialer og metoder at kode for et papG-lacZ-fusionspeptid. Dette resultat var også forventet ud fra den kendte sekvens af papG-genet og lacZ-genet, som det foreligger i pMC874.
DK 171258 B1 43
INSTRUKTIONER
A. Fremstilling af andre fusionerede gener I en alternativ fremgangsmåde til den, der er beskrevet i eksempel 7, fås N-terminale DNA-fragmenter, der omfatter 5 papF-genet, ved linearisering af pPAP9 med Bglll. Dette DNA inkuberes derefter i stadig stigende tidsrum med exonucleasen EfcoIII og behandles derefter med nuclease SI, hvilket medfører større og større sletninger fra Bglll- stedet. Der fastgøres Hindlll-linkere. Dette DNA genspaltes derefter med 10 Smal og HindIII, og det underkastes præparativ agarosegel-elektroforese. Fragmenter i størrelsesordenen 1.400-1.000 bp (jfr. fig. 3) isoleres og ligeres i en hensigtsmæssig fusionsvektor, der forinden er blevet spaltet med Smal og HindIII som beskrevet nedenfor.
15 Fragmenter, som indeholder papG-genet, konstrueres ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde, men ved at spalte med BamHI i stedet for Bglll. Fragmenter i området 2.400-1.500 bp på gelen (jfr. fig. 3) udvælges. Fragmenter, som indeholder papE-genet, konstrueres på samme måde, idet der udvælges 20 fragmenter i området 800-400 bp (jfr. fig. 3).
DNA-fragmenter, som indkoder den N-terminale del af papF-genet, klones ind i en fusionsvektor såsom pSKS104, pSKS105 eller pSKSl06 (Casabadan et al., Methods in Enzymology 100, 1983, s. 293-308), således at der dannes genfusioner med 25 lacZ-genet. Det fusionerede gen i disse konstruktioner tran-skriberes af lacXJVS-promotoren.
Denne konstruktion transformeres til en stamme, der indeholder Lacl^-genet, fx E. coli stamme JM103 (Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 1981, s. 309-321), idet der udvælges 30 for ampicillinresistens. Denne stamme dyrkes derefter i et hensigtsmæssigt medium såsom LB-væske (G. Bertani, J. Bac-teriol. 62, 1951, s. 293-300) til en optisk densitet på ODg00 DK 171258 B1 44 = 0,4. Transkription af det fusionerede gen induceres derefter ved tilsætning af IPTG (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1972). Inkubation fortsætter, indtil der er opnået maksimal eks-5 pression af det fusionerede genprodukt. Cellerne høstes derefter, og det fusionerede genprodukt oprenses ved standardmetoder under anvendelse af et assay for /3-galactosidase-aktivitet (jfr. J. Miller, op. cit.). Det oprensede fusionsprodukt kan derefter anvendes direkte i vaccinetests i fx 10 gnavere, aber eller svin.
B. Fremstilling af en vaccine
Hele papE-, papF- eller papG-genprodukterne eller hensigtsmæssige fragmenter deraf til anvendelse som vaccine fremstilles på én af de følgende måder: 15 l. De oprensede fusionsproteiner af lacZ-genet og papE-, papF- eller papG-generne spaltes med en hensigtsmæssig protease, fx trypsin eller chymotrypsin, eller et kemisk reagens såsom cyanogenbromid eller hydroxylamin. Det ønskede peptid isoleres fra den resulterende peptidblanding ved standardtek-20 nikker, fx ionbytningschromatografi eller HPLC-reversfase-chromatografi.
2. Alternativt dannes der antistoffer mod fusionsproteinerne ved at injicere disse i kaniner. De resulterende antistoffer kan anvendes til oprensning af de ikke-fusionerede, rene 25 papE-, papF- eller papG-genprodukter fra en lacZ"-bakterie, som indeholder et plasmid, der bærer disse gener. Dette plasmid kan være et pBR322-derivat såsom pPAP5 eller pPAP16 eller et runaway-plasmidderivat såsom pBEU28 (Uhlin et al., Gene 22, 1983, s. 255-265).
30 Oprensningen udføres enten ved immunoaffinitetsgelchromato-grafi, eller antistoffet anvendes til at udvikle et ELISA-assay, der anvendes til detektering af polypeptiderne, når DK 171258 B1 45 der udvikles en oprensningsprocedure (jfr. Materialer og metoder).
Fragmenter af disse oprensede polypeptider kan om ønsket fås ved spaltning med protease, etc., som beskrevet under 1.
5 3. Fragmenter bestående af 5-30 aminosyrer eller mere af papE-, papF- og papG-genprodukterne syntetiseres ved fast-fasepeptidsyntese (Stewart og Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman & Co., San Francisco, USA, 1969). De kan derefter anvendes til vaccination som sådanne eller kobles 10 til et bærermolekyle af et fysiologisk acceptabelt bæremateriale såsom poly-L-lysin eller poly-D,L-alanin med eller uden en adjuvans i det væsentlige som beskrevet i Arnon, J. Immunological Methods 61, 1983, s. 261-273.
C. Pseudomonas - systemet 15 Under forudsætning af, at pilusdannelse og adhæsion er forbundet i Pseudomonas-arter, spaltes chromosomalt DNA fra en adhærerende stamme af Pseudomonas med en restriktionsendo-nuclease til dannelse af fragmenter, som klones ind i et pBR322-derivat, en Pseudomonas/ E. col i-shuttlevektor, en 20 plasmidvektor eller en phagvektor, og transformeres/trans- ficeres til E. coli. De bakterier, som indeholder den hybride vektor, screenes for dannelse af Pseudomonas-pili-hovedunder-enheden under anvendelse af antistoffer mod de oprensede Pseudomonas-pili. (Dette er blevet gjort for N. gonorrhea 25 under anvendelse af pBR322 som vektor, jfr. Meyer et al.,
Cell 30, 1982, s. 45-52).
Denne klon anvendes derefter direkte eller som probe til opnåelse af et større DNA-fragment, som indeholder pilingenet. Dette fragment klones derefter ind i en Pseudomo-30 nas/E. coli-shuttle-vektor, der overføres til en ikke-pili-eret, ikke-adhærerende stamme af Pseudomonas, som derefter analyseres for adhæsion og pilusdannelse. Mutagenese af dette fragment udføres i det væsentlige på samme måde som beskrevet DK 171258 ΒΊ 46 i eksempel 2 med hensyn til uropatogene E. coli med undtagelse af, at de fænotypiske assays udføres i Pseudomonas i stedet.
Alternativt kan klonerne, hvis det chromosomale DNA klones 5 direkte ind i en Pseudomonas-vektor eller en Pseudomo-nas/E. coli-shuttle-vektor og transformeres til en ikke-adhærerende stamme af Pseudomonas, screenes direkte for adhæsion. Der kan anvendes andre assays, fx binding af den opløselige receptor.
10 Fusionsproteiner og proteinproduktion i E. coli udføres på lignende måde som beskrevet ovenfor, selv om transkriptions-og translationsindledningssignalerne eventuelt skal ændres syntetisk. Alternativt kan proteindannelse udføres i et homologt system i Pseudomonas under anvendelse af fx de 15 promiskuøse Tac-promotorvektorer, som er beskrevet af Bag-dasarian et al., Gene 26, 1983, s. 273-282. DNA-sekventering og aminosyreanalyse udføres i det væsentlige som beskrevet i eksempel 4 og 5 ovenfor, og på grundlag af sekvensanalysen kan der fremstilles syntetiske peptider som beskrevet oven-20 for.
Metoder svarende til dem, der er beskrevet i eksempel 1-5, og dem, der er angivet for Pseudomonas, kan anvendes til at identificere og fremstille mulige adhesin-polypeptider fra andre adhærerende bakterier såsom Neisseria-arter, etc.
25 I princippet kan alle undersøgelser udføres under anvendelse af proteinkemi. Adhesin-polypeptiderne kan beriges/oprenses ved hjælp af receptor-, fx digalactosid-, affinitetschromato-grafi eller en hvilken som helst anden hensigtsmæssig metode (såsom antistofaffinitetschromatografi). Proteinets renhed 30 kan analyseres ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese som beskrevet under Materialer og metoder. For at sikre, at adhesinerne udgør en stor del af præparationen, kan lige-vægtsdialyseforsøg med den radioaktivt mærkede receptor anvendes for at beregne antallet af bindingssteder pr. mole- DK 171258 B1 47 kyle tilstedeværende protein. Dette forventes at være mellem 0. 1 og 10 ligander pr. proteinmolekyle.
EKSEMPEL 8
MATERIALER OG METODER, DER ANVENDES I DETTE EKSEMPEL
5 Bakteriestammer, plasmider og vækstbetingelser
Alle bakteriestammer er E. coli K12-derivater med undtagelse af de i tabel 2 viste kliniske isolater. Til proteinekspressionsanalyser anvendtes et recA-derivat af P678-54 (1), AA10. M13-kloning og phagpropagering blev udført i JM103. HB101 var 10 værten i alle andre forsøg.
Plasmidet pPAP5 (jfr. Generelle materialer og metoder ovenfor) er et pBR322-derivat, som bærer et 9,5 kb langt EcoRI-BarnHI-chromosomalt fragment isoleret fra E. coli J96. Denne klon udtrykker et F"CI34.3"-pilusantigen, der er serologisk 15 beslægtet med FI2. Genkortet over pap-klyngen er vist i fig.
1. Plasmidet pDC5 er et pACYC184-derivat, der bærer et 8,0 kb langt Clal-BamHI-fragment fra E. coli IA2, hvorimod pPILHO-35 er et pACYC184-derivat, som indeholder et 16 kb langt EcoRI-fragment isoleret fra E. coli AD110, som er ansvarligt 20 for dannelsen af F72-pilusantigen.
Følgende koncentrationer af antibiotika blev anvendt til udvælgelse: carbenicillin 100 μg/ml, tetracyclin 15 μg/ml, kanamycin 20 μg/ml og chloramphenicol 20 μg/ml. Bakterier blev dyrket ved 37°C i Luria-væske eller på Luria-agar.
25 Generelle procedurer
CaCl2-proceduren blev anvendt til transformation. Plasmid DNA blev isoleret ved en modifikation af den alkaliske klarede lysat-procedure beskrevet af H.C. Birnboim og J. Doly ("A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant DK 171258 Bl 48 plasmid DNA", Nucleic Acids Res. 7, 1979, s. 1513-1523) og Grosveld et al. ("Isolation of β-globin-related genes from a human cosmid library", Gene 13, 1981, s. 227-237) efterfulgt af to på hinanden følgende ethidiumbromid/CsCl-ligevægtscen-5 trifugeringer. Restriktionsendonucleaser blev anvendt under de af fabrikanten anbefalede betingelser (New England Bio-Labs, USA, Boehringer Mannheim GmbH eller Bethesda Research Laboratories). Spaltet DNA blev adskilt på 0,5-1,5%'s (vægt/volumen) agarosegeler. Phag y-DNA og ΦΧ174ΌΝΑ spaltet 10 med henholdsvis Hindlll og Haelll (New England BioLabs) blev anvendt som molekylvægtstandarder. DNA-fragmenter vandtes i ren form ved elektroeluering fra 5%'s (vægt/volumen) poly-acrylamidgeler.
Blotting- og hybridi seringsprocedurer 32 15 [ P]-mærkede DNA-prober blev fremstillet ved "nick"-trans latering eller ved primning af DNA-syntese af klonede M13- enkeltstrengede DNA-skabeloner med en M13-hybridiseringspro- 32 be-primer (New England BioLabs). [a PjdGTP (Amersham, England) blev inkorporeret til en specifik aktivitet på ca.
Q
20 1x10 c^pm/μg. Plasmid DNA, der var størrelsesfraktioneret på agarosegeler, blev overført til nitrocellulosefiltre (Schleicher og Schull, BA85) i henhold til Southern, E.M., "Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis", «7. Mol. Biol. 98, 1975, s.
25 503-517. De blotting-behandlede filtre blev præhybridiseret i 2 timer ved 68°C i en hybridiseringsopløsning bestående af 4x SSC (lx SSC er 150 mM NaCl; 15 mM Na-citrat pH 7,0), lOx Denhardt's opløsning, 0,1% SDS, 2 mM EDTA og sonikeret kalve-thymus-DNA i en mængde på 50 μg/ml. Radioaktivt mærket probe g 30 i frisk hybridiseringsopløsning (1x10 cpm/ml) sattes derefter til filtrene, der blev inkuberet i 18 timer i plastposer. For stringente betingelser blev hybridisering udført ved 68°C, og vask blev udført ved samme temperatur i saltkoncentrationer fra 2x SSC; 0,1% SDS ned til 0,lx SSC; 0,1% SDS.
35 Ikke-stringent hybridisering blev udført under tilsvarende betingelser med undtagelse af, at hybridiseringstemperaturen DK 171258 B1 49 var 55°C, og at vaskningen blev udført i 2x SSC. Filtre blev eksponeret natten over på en Dupont Cronex 4-røntgenfilm med en forstærkningsskærm.
Analyse af proteinekspression i miniceller 5 Plasmiderne pPAP5, pPAP502, pDC5 og pPIL110-35 blev transformeret til den minicelledannende stamme AA10. Præparering og 35 mærkning af miniceller med [ S] -methionin (Amersham) blev udført som beskrevet af R. Thompson og M. Achtman, "The control region of the F sex factor DNA transfer cistrons: 10 restriction mapping and DNA cloning", Mol. Gen. Genet. 165, 1978, s. 295-304. De radioaktive prøver blev adskilt på lineære 15%'s (vægt/volumen) SDS-polyacrylamidgeler. Gelerne blev derefter fikseret, farvet, affarvet, forstærket (Enhance, New England Nuclear) og eksponeret på røntgenfilm i 1-15 6 dage. Molekylvægtstandarder var fra Pharmacia Fine Chemi cals, Sverige.
Nuel eo tidsekvensbes teinmel se
Relevante fragmenter blev klonet ind i phag M13-klonings-vektorer M13mp8 og M13mp9 og transformeret til E. coli stamme 20 JM103. Enkeltstrenget skabelon-DNA blev isoleret fra phagen som beskrevet af Messing et al., "A system for shotgun DNA sequencing", Nucleic Acids Re3. 9, 1981, s. 309-321. DNA-sekvenserne blev bestemt ved dideoxy-kædetermineringsmetoden som beskrevet af Sanger et al., "DNA sequencing with chain-25 terminating inhibitors", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 1977, s. 5463-5467, under anvendelse af M13-pentadecamer-sekven-teringsprimeren (New England BioLabs).
Recep torbindingassays
Bindingsegenskaberne af de genprodukter, der indkodes af de i 30 tabel 1 og 2 anførte plasmider, blev bestemt ved pladeagglutinering som beskrevet under Generelle materialer og metoder ovenfor under anvendelse af P1-erythrocytter indeholdende DK 171258 B1 50 globosidreceptoren og p-erythrocytter, som mangler globo-sidet.
Pi 1usantigenassay
Pladeagglutinering under anvendelse af antisera, der er 5 dannet mod oprensede Pap-pili, blev udført som beskrevet under Generelle materialer og metoder ovenfor. Antiserum blev anvendt som en 500 ganges fortynding i PBS (pH-værdi 7,5).
Konstruktion af plasmidderivater til komplementeringsanalyser
Plasmidet pPAP43 er et derivat af pPAP5, som er vundet ved 10 Smal-spaltning efterfulgt af ligering ved lav DNA-koncentration. Dette plasmid mangler Smal!-Smal4-området af pPAP5 (fig. 1) og bærer derfor kun generne papB og papA. Til konstruktion af cutback-derivatet pPAP502 blev plasmidet pDC5 fuldstændigt spaltet med Bglll og delvis spaltet med BamHI 15 efterfulgt af religering og transformation til HB101. Plasmid DNA blev isoleret fra transformanterne og screenet for den beregnede størrelse. Én klon, pPAP502, med den korrekte størrelse blev yderligere analyseret, og som forventet var papG-genet fraværende (jfr. tabel 3). Plasmidet pPAP503 blev 20 konstrueret ved at ligere et EcoRI-Hindlll-fragment fra pSKS106, der bar lac-promotoren, og det yderste højre Hindlll-BamHI-fragment fra pDC5 til pBR322 spaltet med BcoRI og BamHI. Plasmidet pPAP504 blev vundet ved spaltning af pPAP503 med Bglll og BamHI efterfulgt af religering ved lav 25 DNA-koncentration. Plasmidet pPAP507 blev konstrueret ved kloning af HindIII-fragmentet fra pDC5, der bar generne svarende til papA, papH og papC, ind i det unikke Hindlll-sted på pPAP503 under udvælgelse for ampicillinresistens og screening for hæmagglutinering. Dette mellemprodukt (pPAP506) 30 blev derefter spaltet med Bglll og BamHI efterfulgt af religering, hvilket gav pPAP507 på analog måde som for konstruktionen af pPAP504 fra pPAP503.
DK 171258 B1 51
Elektronmikroskopi
Elektronmikroskopi blev udført under anvendelse af et JEOL 10OB-mikroskop med 150 μνα kobbernet overtrukket med tynde film af 2%'s formvar. Bakterier blev resuspenderet i 10 mM 5 Tris-HCl (pH 7,5); 10 mM MgCl2 og anbragt på nettet. Overskuddet blev omgående fjernet ved hjælp af filtrerpapir.
Nettene blev derefter vasket med puffer og negativt farvet i 5 sekunder med 3,55%'s ammoniummolybdat efterfulgt af vask med redestilleret vand.
10 RESULTATER
Strukturel sammenligning af pPAP5 med pDC5 og pPIL110-35
Alle tre plasmider viste sig at indkode globosidbindingsspecificitet (tabel 2). De chromosomale indsætninger på plasmiderne blev kortlagt med flere restriktionsendonucle-15 aser. Til at gøre detektion af selv små forskelle i fragmentstørrelse mulig blev restriktionsenzymspaltningerne af de forskellige plasmider analyseret i parallelle baner ved agarosegelelektroforese. Det centrale Smal^JCpnl-fragment har samme størrelse (4,6 kb) i alle tre plasmider. I pPAP5 koder 20 dette fragment for en del af et yderligere gen samt for papC-og papD-generne. Der viste sig ingen forskelle i de fysiske kort over dette centrale fragment. Endvidere hybridiserer et PstI-fragment, der har en størrelse på ca. 370 bp, og som stammer fra det kodende område af papC i pPAP5, til et Pstl-25 fragment med tilsvarende størrelse i pDC5 og pPIL110-35.
Endvidere hybridiserer et 128 bp langt HpaZ-fragment fra det N-terminale område af papC til Hpal- fragmenter fra pDC5 og pPIL110-35 med identisk størrelse. Disse iagttagelser viser, at det centrale område af de giobosidbindende genklynger, der 30 formodes at indkode udskillelses- og sammenføjningsfunktioner, i høj grad bevares.
Plasmidet pPILll0-35 bærer et 5,7 kb langt DNA-fragment, der udstrækker sig til venstre for det bevarede Smalj^-Kpnl-om- DK 171258 B1 52 råde. Dette område omfatter strukturgenet for F72-pilinet, som har en stilling ækvivalent til papA. Restriktionssted-homologien bevares ikke i dette område. En 221 nucleotider lang probe fra det centrale område af papA gav kun et svagt 5 hybridiseringssignal med pPIL110-35 selv ved lav stringens, selv om selve 5'-området af papA hybridiserede stærkt under stringente betingelser. Dette tyder på, at 5'-enderne på de to pilingener i høj grad bevares, hvorimod det centrale område synes at divergere betydeligt.
10 En DNA-probe, der på konventionel måde stammer fra den kodende del af papB, gav et stærkt hybridiseringssignal med det 6,0 kb lange HindIII-fragment på pPIL110-35, hvilket antyder, at dette gen konserveres og er til stede i ækvivalente stillinger i de to kloner.
15 Tre gener, papE, papF og papG, er blevet kortlagt til SmaI3-BamHI-fragmentet på pPAP5. Dette fragments restriktionsmønster er mindre konserveret i pDC5 og pPIL110-35 end det centrale Smal!-JCpnl-fragment. SmaI3-BglII-fragmentet på pPAP5 bærer papE, papF og 5'-halvdelen af papG. Under anvendelse af 20 dette fragment som probe i Southern-blottingsforsøg blev der detekteret signaler med lige stor styrke i alle tre analyserede plasmider. De fragmenter, som hybridiserer, har ækvivalente stillinger i det fysiske kort over de tre plasmider.
På den anden side hybridiserer en BglII-£mal4-probe, som 25 bærer 3'-halvdelen af papG, ikke til pDC5- eller pPIL110-35-DNA selv ved lav stringens, selv om den giver et stærkt signal med pPAP5-DNA. Det skal bemærkes, at disse to plasmider indkoder proteiner, som har en størrelse, der svarer til størrelsen af papG fra dette område. De har tilsyneladende 30 også et tilsvarende restriktionsmønster, som er forskelligt fra pPAP5, i papG-området. For mere præcist at definere grænsen mellem homologi og ikke-homologi anvendtes et stort antal M13-kloner, som bar definerede områder af papE, papF og papG. "Nick"-translaterede pDC5 og pPILH0-35 blev anvendt 35 som prober. Positive hybridiseringer blev detekteret med alle M13-prober, der indeholdt papE- og papF-DNA. Ingen af M13- DK 171258 B1 53 klonerne, som kun bar papG-DNA, gav et positivt signal.
Således konserveres papE og papF, hvorimod der er en kraftig nedgang i homologi nær enden af papF og begyndelsen af papG.
Proteinekspression i miniceller 5 Proteiner, som udtrykkes fra pPAP5, pDC5 og pPIL110-35, blev mærket med [ S]-methionin i E. coli-miniceller, og de radiomærkede genprodukter blev analyseret på 15%'s SDS-polyacryl-amidgeler. Proteiner med tilsvarende molekylvægt som papB og papA fra pPAP5 blev udtrykt fra pPIL110-35, men ikke fra 10 pDC5. Både pDC5 og pPIL110-35 har vist sig at udtrykke et protein, 71-75K (Clegg, S., og J.K. Pierce, "Organization of genes responsible for the production of mannose-resistant fimbriae of a uropathogenic Escherichia coli isolate". Infect. Immun. 42, 1983, s. 900-906, og van Die, I. et al., 15 "Molecular organisation of the genes involved in the production of F72fimbriae, causing mannose resistant haemagglutina-tion, of a ifropathogenic Escherichia coli 06:K2:H1:F7 strain", Mol. Gen. Genet. 194, 1984, s. 528-533), der er kortlagt til omtrent samme stilling som papC fra pPAP5. papC-20 genprodukterne fra pDC5 og pPIL110-35 forekom som svagt udtrykte proteiner med en lidt lavere molekylvægt end PapC-proteinet fra pPAP5, hvorimod både pDC5 og pPIL110-35 udtrykte et protein med samme molekylvægt som PapD-proteinet.
For pPILHO-35 er det gen, der indkoder dette protein, blevet 25 kortlagt til området svarende til papD (van Die, I. et al., "Molecular organisation of the genes involved in the production of F72fimbriae, causing mannose resistant haemagglutina-tion, of a uropathogenic Escherichia coli 06:K2:H1:F7 strain". Mol. Gen. Genet. 194, 1984, s. 528-533). PapE-pro-30 teinet fra pPAP5 har en tilsyneladende molekylvægt på 16,5K. Det var ikke muligt at detektere et protein med samme størrelse i pDC5 og pPILHO-35, idet det lidt mindre protein, som udtrykkes fra begge plasmider, imidlertid kunne være papE-genproduktet af disse genklynger. Alle tre plasmider udtrykte 35 et 15K stort protein, som vides at blive indkodet af papF, som er essentiel for globosidbinding. PapG-proteinet fra DK 171258 Bl 54 pPAP5 er et 35K stort polypeptid, og i både pDC5 og pPILHO-35 fandtes proteiner med en lidt højere molekylvægt. Bglll-BamHl-cutback-derivatet af pDC5, pPAP503, udtrykte ikke det 35K store polypeptid. Dette lokaliserer genet for dette 5 protein til samme område som papG i pPAP5.
Et i høj grad udtrykt 17K stort polypeptid fra pDC5 og pPIL110-35 er blevet tilskrevet det distale Smal-BamHI-fragment på disse plasmider (Clegg, S. og J.K. Pierce, "Organization of genes responsible for the production of mannose-10 resistant fimbriae of a uropathogenic Escherichia coli isolate", Infect. Immun. 42, 1983, s. 900-906 og van Die, I. et al., "Molecular organisation of the genes involved in the production of F72fimbriae, causing mannose resistant haem-agglutination, of a uropathogenic Escherichia coli 15 06:K2:H1:F7 strain". Mol. Gen. Genet. 194, 1984, s. 528-533).
pPAP5-konstruktionerne mangler DNA, som er ækvivalent med dette område, hvorfor 17K proteinet ikke udtrykkes fra disse plasmider eller fra pPAP502.
Komplementering mellem genklyngerne på pPAPB og pDC5 20 Da pDC5 indeholder DNA, som er stærkt homologt med papC, papD, papE og papF, rejser der sig det spørgsmål, om pDC5 kan komplementeres med papA i pPAP5 til dannelse af en papA-pilus. Derfor blev der konstrueret pPAP43, som kun bærer papB- og papA-generne og ikke kan overfladelokalisere papA-25 antigenet. Hverken HB101, der bærer dette plasmid, eller samme stamme med pDC5 blev agglutineret med antipilus-antiserum. Når begge disse kompatible plasmider var til stede i samme celle, blev papA-pilinet imidlertid overfladelokaliseret som vist ved antiserumagglutinering. Ved elektronmikro-30 skopi blev det bekræftet, at papA-pilinet blev samlet i form af pili. Hverken pPAP43 eller pDC5 alene udtrykte overfladelokaliserede pili, når de fandtes i HB101.
For at se, om adhesinfunktionen også kunne komplementeres mellem genklyngerne, blev der konstrueret pPAP502, der mang- DK 171258 B1 55 lede DNA'et fra Bglll-stedet til BamHI-stedet i den yderste højre ende af pDC5. Sammenlignet med pDC5 udtrykte dette derivat ikke et 36K og et 17K polypeptid i miniceller. I overensstemmelse med kortlægnings- og hybridiseringsdata 5 formodes det, at 36K proteinet svarer til 35K proteinet, der indkodes af papG i pap-genklyngen. Plasmidet pPAP502 medierer i modsætning til pDC5 ikke hæmagglutinering. Under anvendelse af pPAP16, som er et plasmid, der udtrykker papE, papF og papG i pPAP5, in trans var det muligt at komplementere slet-10 ningsderivatet pPAP502 til hæmagglutinering. Således kan også adhesinfunktionen trans-komplementeres fra én genklynge til en anden, hvilket er overraskende, da papG-området ikke er godt konserveret mellem klonerne. Plasmiderne ρΡΑΡΙΘ, pPAP17 og pPAP4, som er papEl-, papFl- og papGl-mutanter af pPAP16 15 (jfr. Generelle materialer og metoder ovenfor), komplementerede ikke sletningen på pPAP502. Plasmidet pPAP503, som indeholdt Hindlll-BairiHI-fragmentet fra pDC5 under lac-promotorkontrol , hæmagglutinerede heller ikke. Imidlertid kunne pPAP503 komplementere defekten i pPAP502 som vist ved den 20 positive hæmagglutineringsreaktion, der opnås med celler, som indeholder begge disse plasmider. Som forventet opnåede et BgrIII-BamHI-sletningsderivat af pPAP503 (pPAP504 i tabel 3) ikke denne komplementering. Disse plasmider anvendtes til komplementering af mutationer i pap-klonen. Det viste sig, at 25 pPAP503 komplementerede alle Tn5-indsætningsmutationer i papF og papG, hvorimod cutback-derivatet pPAP504 kun komplementerer mutationer i papF (tabel 3). pDC5-derivatet pPAP507, som indkoder papC-, papD-, papE- og papF-genækvivalenterne, komplementerede pSN021, som havde en Tn5-mutation i papF-30 genet. Disse resultater viser, at proteiner, der funktionelt svarer til papF- og papG-genprodukterne, indkodes af de tilsvarende områder på pDC5. Af forsøgene i ovenstående eksempel fremgår det, at papA-genet og til en vis grad papG-genet udviser variabilitet i de tre E. coli-stammer, hvorimod 35 papF-genet har meget lidt variabilitet. Det er ikke muligt at afgøre, om papG eller papF indkoder det specifikke bindings-protein.
DK 171258 B1 56
Tabel 2
Egenskaber hos E. coli UTI-stammer og plasmidkloner, som indkoder deres respektive adhesin I solat Isolatets Betegnelse Klonet pilus- Klonet bin-serotype for plasmid- antigens sero- dingsspecifi-klonen type citet J96 04: K6: H5 pPAP5 F."CI34.3" Globosid IA2 06: H- pDC5 N.D. Globosid AD110 06: K2: Hl pPIL110-35 F72 Globosid
Globosidbindingsspecificitet blev bestemt ved positiv plade-hæmagglutinering (HA) af P1-erythrocytter indeholdende globo-sidreceptoren og negativ HA af p-erythrocytter, som mangler globosidet. Assaybetingeiserne var som beskrevet under Ge-5 nerelle materialer og metoder ovenfor. N.D.: ikke bestemt.
Tabel 3
Overfladeekspression af globosidspecifikt adhesin ved komplementering mellem ρσρ-gener fra pPAP5 og pDC5
Plasmid - pSN021 pSN042 pPAP502
Mutation papF: :Tn5-021 papC: :Tn5-042 L[papC] pPAP16 wt - + + * ρΡΑΡΙδ papEl * ♦ pPAP17 papF1 - - + - pPAP4 papC1 * pPAP503 A[popS-D] ♦ * ♦ pPAP507 A[popG] + pPAP503 A[popB-D], + h[papG] DK 171258 B1 57
Komplementering af plasmidmutationer i HB101 blev overvåget ved pladehæmagglutinering af P^erythrocytter som beskrevet i Materialer og metoder ovenfor og i Generelle materialer og metoder ovenfor. papEl- og papFl-mutationerne er ikke-polære 5 mutationer konstrueret ved linkerindsætningsmutagenese (jfr. Generelle materialer og metoder ovenfor). papGl-mutationen er en sletning af SmaI4-BamHI-fragmentet, hvorved papG-proteinet afkortes med ca. 1K (jfr. Generelle materialer og metoder ovenfor). Tn5-mutationerne papF::Tn5-021 og papG::Tn5-042 er 10 blevet kortlagt til henholdsvis papF- og papG-generne. Plas-miderne pPAP16, pPAP18, pPAP17 og pPAP4 er pPAP5-derivater. Plasmiderne i venstre kolonne har et pBR322 (pMBl)-replikon, hvorimod plasmiderne i øverste kolonne har et pACYC184 (pl5A)-replikon. Gener i parentes, [], er pDC5-ækvivalenter 15 til de tilsvarende pap-gener i pPAP5.
EKSEMPEL 9
Hybridisering af kliniske isolater af E. coli MATERIALER OG METODER ANVENDT I DETTE EKSEMPEL Bakteriestammer og plasmider 20 Prøverne bestod af 66 isolater af E. coli indsamlet fra urin fra patienter med signifikant bakteriuri (>105 bakterier/ml) og 96 fækale E. coli-isolater fra sunde individer. Plasmidet pPAP5 bærer et 9,6 kb langt EcoRI-BajriHI-fragment fra E. coli J96 (0:4), som indeholder hele pap-genklyngen. Gensammensæt-25 ningen er vist i fig. 2. Plasmidet pDC5 koder for det globo-sidspecifikke adhesin fra den uropatogene E. coli stamme IA2(0:6) . Det har for nylig vist sig, at disse to plasmider udviser udstrakt homologi i hoveddelen af pap-genklyngen. Imidlertid hybridiserede DNA fra pPAP5 stammende fra papG-30 genet ikke til pDC5. DNA-sekventering har bekræftet betydelige forskelle mellem papG-generne i de to kloner.
DK 171258 B1 58
Medier og vækstbetingelser
Det komplette medium var Luria-væskemedium beskrevet af Bertani (op. cit.) beriget med E-medium og 0,2% glucose. Bakterierne blev dyrket ved 37°C under omrystning. Luria-5 væske-agarplader uden glucose blev anvendt til aggluti-neringsassay.
Receptorbindingsassay
Til identifikation af E. coli's digalactosidbinding blev bakterieceller, der var dyrket i 22 timer på glucosefri 10 Luria-væske-agar, resuspenderet i en opløsning af latexkugler overtrukket med digalactosidreceptoren. Cellerne blev anset for at udtrykke adhesinet, hvis de agglutinerede kuglerne inden for l minut.
Fremstilling af chromosomalt DNA
Q
15 Hvert bakterieisolat blev dyrket i 100 ml LB-medium til 4x10 celler/ml. Bakterierne blev indsamlet ved centrifugering, suspenderet i 40 ml PBS (100 mM K-phosphatpuffer, pH 7,2, 150 mM NaCl), recentrifugeret og suspenderet i 5 ml PBS + 0,1 mg/ml proteinase K, 5 mM EDTA og 0,5% SDS. Suspensionerne 20 blev inkuberet natten over ved stuetemperatur og sluttelig ekstraheret med phenol og udfældet med ethanol, hvilket blev gentaget to gange.
32
Fremstilling af P-radiomærkede DNA-fragmenter
Plasmiderne pPAP5 og pDC5 blev spaltet med de hensigtsmæssige 32 25 restriktionsenzymer, og DNA-fragmenter blev oprenset og P-mærket ved "nick"-translatering.
Blotting- og hybridiseringsprocedurer
Der anvendtes en punktbiottingsprocedure. 2 μg chromosomalt DNA blev opløst i 170 μΐ 0,1M Tris (pH 7,4). Efter tilsætning DK 171258 B1 59 af 30 μΐ 2M NaOH og 100 μΐ 3M NaCl-0,3M natriumcitrat blev blandingen inkuberet ved 80°C i 20 minutter. Det denaturerede DNA blev afkølet, neutraliseret med 40 μΐ 2M Tris (pH 7) og suget gennem et 7 mm stort område på et nitrocellulosefil-5 ter, lufttørret og derefter bagt i vakuum ved 65°C i 12 timer. Filtrene blev inkuberet i 2 timer i lOx Denhardt (Denhardt = 0,02% polyvinylpyrrolidon, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA). De blev på ny inkuberet i en opløsning indeholdende 4x SSC, 0,1% SDS, 2 fflM EDTA, lOx Denhardt og 50 Mg/ml kalvethy-10 mus-DNA (opvarmet i 3 minutter ved 95°C) og inkuberet i 1 time ved 65°C. Sluttelig blev de inkuberet med en radioaktivt mærket probe i samme opløsning som beskrevet ovenfor i 16 timer ved 60°C og derefter vasket i 4x SSC i 2x 5 minutter og 2x SSC i 2x 20 minutter ved 60°C og derefter lufttørret.
15 Filtrene blev eksponeret på Dupont Cronex 4 røntgenfilm sammen med en forstærkningsskærm ved -70°C og derefter fremkaldt .
DK 171258 B1 60 TABEL 4
Fordeling af MR-adhesiner og hybridisering til papE-, papF- and papC-DNA
Stamme ADHESINER DNA hyb. probe nr. 1 urinvejs- Human Svin Får Ko Galgal Pap E,F Pap G Pap G isola- PI p J96 ter J 96 ♦ + + + + ♦ ♦ 3163u 001 + + + + ♦ 12007 002 12014 003 12061 004 ♦ ♦ + + + + 12081 005 + + + 12088 006 12118 007 12121 008 12144 009 + + + + + ♦ + 12154 010 12159 011 + 12257 012 12268 013 + + + + 12295 014 + + 12297 015 12335 016 + + 12340 017 ♦ + 12382 018 12383 019 + + * ♦ + 12389 020 + + + + + 12390 021 12392 022 12409 023 + + + + 12418 024 12444 025 12459 026 12483 027 + + ♦ + + 12496 028 + 12497 029 12501 030 + + ♦
Stamme ADHESINER DNA hyb. probe
Tabel 4 fortsat DK 171258 B1 61 nr. 1 urinvejs- Human Svin Får Ko Galgal Pap E,F Pap G Pap G isola- PI p J96 ter 12516 031 ♦ + ♦ 12564 032 12568 033 12230 034 + * ♦ 12571 035 ♦ ♦ ♦ 12620 036 + + ♦ ♦ + 12627 037 12640 038 12654 039 12672 041 12708 042 ♦ + ♦ 12724 043 12725 044 ♦ 12722 045 12727 046 + + + 12755 047 12756 048 + ♦ 12767 049 12782 050 + 12908 051 12933 052 12970 053 13047 054 ♦ 13058 055 13060 056 13122 057 ♦ + 13131 058 ♦ + ♦ 13147 059 13176 060 13177 061 13236 062 + + 13341 063 + + 13347 064 13388 065 13389 066 + 13781 067
Stamme ADHESINER DNA hyb. probe DK 171258 B1 62 nr. 1 Tarm- isola- Human Svin Far Ko Galgal Pap E,F Pap G Pap G ter PI p J96 pDC5 2103 001F ♦ ♦ ♦ ♦
2104 002F
2109 003F
2110 004F
2111 005F ♦ ♦ ♦ *
2112 006F
2113 007F
2124 008F
2130 009F
2133 010F
2134 011F
2138 012F
2139 013F
2140 014F
2145 015F
2146 016F + + -
2155 017F
2157 018F
2162 019F
2171 020F
2172 021F
2173 022 F ♦ ♦ 2174 023F + - -
2177 024F
2179 025F
2182 026F
2186 027F
2187 028F
2188 029F
2189 030F
2190 031F
2191 032F
2195 033F
2196 034F
2197 035F
2198 036F
2200 037F
2201 038F
2204 039F
2205 040F
Stamme ADHESINER DNA hyb. probe
Tabel 4 fortsat DK 171258 B1 63 nr. 1 Tarm- isola- Human Svin Får Ko Galgal Pap E,F Pap G Pap G ter PI p J96 pDC5
2212 041F
2213 042 F
2214 043F
2216 044F
2218 045F
2219 046F */-
2224 047F
2225 048F ♦ ♦ ♦ ♦
2226 049F
2227 050F V- 2229 051F ♦/-
052 F
053 F 054F
2234 055 F + ♦ V-
056 F
057 F
2240 058F ♦ ♦ ♦ ♦ V-
059 F 060F
061F
062 F
063 F 064F 065F
2249 066 F ♦
067 F 068F 069 F 070F
071F
072 F
073 F 074F 075 F
Tabel 4 fortsat DK 171258 B1 64
Stamme ADHESIIMER DNA hyb. probe nr. 1 -
Tarm- isola- Human Svin Får Ko Galgal Pap E,F Pap G Pap G ter PI p J96 pDC5
076F
2265 077F - +/-
078F 079 F 080F
081F
082 F
083 F 084F 085F
086F 087 F
22286 088F ♦/-
089F 090F
091F
22290 092 F ♦
093F 094F 095F
096F
Hybridiseringshæmagglutineringsresultater med E. coli-isola-ter anvendt i denne undersøgelse ISOLATER Urin Tarm 5 P-spec MRHA 17 4 p-spec MRHA 7 3 Z-spec MRHA 10 3
Total MRHA 34 10
Ikke MRHA 32 86 DK 171258 B1 65
Urinstammer Tarmstammer (66 st) (96 st)
Hybridiserings resultater Pap E,F Pap G Pap E,F Pap G
pPAP5 PDC5 pPAP5 pDC5 pos neg pos neg pos neg pos neg P-spec MRHA 16 1 16 1 4 0 3 1 p-spec MRHA 3 4 4 3 3 0 2 1 Z-spec MRHA 8 2 7 3 1 2 1 2
Total MRHA 27 7 27 7 8 2 6 4
Ikke MRHA 0 32 3 29 2 84 9 77
Totalt antal stammer 27 39 30 36 10 86 15 81
Latex kugle-positiv 26 0 24 2 5
Latex kugle-negativ 1 39 6 34 5
Totalt antal stammer 27 39 30 36 10 P-spec MRHA: herunder stammer, som også agglutinerer dyre-eryth- rocyter.
p-spec MRHA: erythrocyter, der agglutinerer humant p-blod.
Z-spec MRHA: ingen hæmagglutinering til humane erythrocyter, men til en hvilken som helst af følgende dyre-erythrocy-ter: Svin, får, ko.
De i dette eksempel vundne resultater viser, at et stort antal af de kliniske isolater fra E. coli-stammer, der binder til digalactosid, har E-, F- og G-områder i deres pap-operon-er, og at stammer, der ikke binder til digalactosid, ikke har 5 E-, F- og G-områderne fra pap-operonet, selv om de har de andre områder i operonet.
Claims (31)
1. Antigent præparat, kendetegnet ved, at det som en immuniserende hovedbestanddel omfatter en determinant fra et adhesin-poly-5 peptid, som er en mindre bestanddel af pilus fra en pilusdannende bakterie, der er i stand til at adhærere til pattedyrvæv, i hvis fravær adhæsion af bakterierne ikke finder sted, og 10. som er forskellig fra pilus' strukturelle hovedbestand del , hvor antistoffer dannet mod determinanten reagerer med ad-hesin-polypeptidet.
2. CACAGCACGTTCAACGTTCACCTTTACTTCAGTGCCCTTTCGTAATGGC - AGCGGGATACTGAATGGCGGGGATTTCCAGACCACGGCCAGTATGAGCA- TGATTTATAACTGA eller en hvilken som helst undersekvens deraf, der, når den udtrykkes, udgør en determinant fra en mindre pilus-kompo-25 nent, der kodes af hele DNA-sekvensen.
2. Antigent præparat ifølge krav l, 15 kendetegnet ved, at adhesin-polypeptidet binder til carbonhydrat- eller proteinreceptorer på pattedyrvævsceller eller pattedyrerythrocytter.
3. CTATTTAACTACAAATGCTGGTAATGTTAAGGTTATTGACCAACCTCAG - CTATATATACCCTGGAATACAGGCTCTGCTACAGCAACTTATTATTCGT- GCTCAGGTCCGGAATTTGCGAGTGGAGTGTATTTTCAGGAGTATCTGGC- DK 171258 B1 72 CTGGATGGTTGTTCCTAAACATGTCTATACTAATGAGGGGTTTAATATA-TTTCTTGATGTTCAGAGCAAATATGGTTGGTCTATGGAGAATGAAAATG -ACAAAGATTTTTACTTCTTTGTTAATGGTTATGAATGGGATACATGGAC-AAATAATGGTGCCCGTATATGTTTCTATCCTGGAAATATGAAGCAGTTG-5 AACAATAAATTTAATGATTTAGTATTCAGGGTTCTTTTGCCAGTAGATC- TC C C GAAGGG ACATT AT AATTTTC CTGTGAGATATATACGTGGAATACA -GCACCATTACTATGATCTCTGGCAGGATCATTATAAAATGCCTTACGAT-CAGATTAAGCAGCTACCTGCCACTAATACATTGATGTTATCATTCGATA-ATGTTGGGGGATGCCAGCCGTCAACACAAGTACTTAATATAGACCATGG-10 GAGTATTGTGA1TGATCGTGCTAACGGAAATATTAGCAAGTCAGACGCT - TTCAATTTATTGCGATGTACCAGTTAGTGTAAAATATCTCTGCTCAGAA-ATACACCACCAATATACAATAATAATAAATTTTCGGTTGGGTTAGGTAA-TGGCTGGGATTCGATAATATCTCTTGATGGGGTTGAACAGAGTGAGGAA-ATATTACGCTGGTACACAGCCGGCTCAAAAACAGTAAAGATTGAGAGCA-15 GGTTGTATGGTGAAGAGGGAAAGAGAAAACCCGGGGAGCTATCTGGTTC- TATGACTATGGTTCTGAGTTTCCCCTGA eller en hvilken som helst undersekvens deraf, der, når den udtrykkes, udgør en determinant fra en mindre pilus-kompo-nent, der kodes af hele DNA-sekvensen.
3. Antigent præparat ifølge krav 2, kendetegnet ved, at carbonhydratreceptoren er et 20 digalactosidholdigt glycolipid eller glycoprotein.
4. Antigent præparat ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at den pilusdannende bakterie er en uropatogen eller enteropatogen stamme af Escherichia coli 25 eller er Neisseria gonorrhoeae.
5. Antigent præparat ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den pilusdannende bakterie er en uropatogen stamme af Escherichia coli.
6. Antigent præparat ifølge krav 5, DK 171258 Bl 67 kendetegnet ved, at en precursor for adhesin-polypeptidet har følgende aminosyresekvens: Met-Lys-Lys-Ile-Arg-Gly-Leu-Cys-Leu-Pro-Val-Met-Leu-Gly-Ala-Val-Leu-Met-Ser-Gln-His-Val-His-Ala-Val-Asp-Asn-Leu-Thr-Phe-5 Arg-Gly-Lys-Leu-Ile-Ile-Pro-Ala-Cys-Thr-Val-Ser-Asn-Thr-Thr-Val-Asp-Trp-Gln-Asp-Val-Glu-Ile-Gln-Thr-Leu-Ser-Gln-Asn-Gly-Asn-His-Glu-Lys-Glu-Phe-Thr-Val-Asn-Met-Arg-Cys-Pro-Tyr-Asn-Leu-Gly-Thr-Met-Lys-Val-Thr-Ile-Thr-Ala-Thr-Asn-Thr-Tyr-Asn-Asn-Ala-Ile-Leu-Val-Gln-Asn-Thr-Ser-Asn-Thr-Ser-Ser-Asp-Gly-10 Leu-Leu-Val-Tyr-Leu-Tyr-Asn-Ser-Asn-Ala-Gly-Asn-Ile-Gly-Thr-Ala-Ile-Thr-Leu-Gly-Thr-Pro-Phe-Thr-Pro-Gly-Lys-Ile-Thr-Gly-Asn-Asn-Ala-Asp-Lys-Thr-Ile-Ser-Leu-His-Ala-Lys-Leu-Gly-Tyr-Lys-Gly-Asn-Met-Gln-Asn-Leu-Ile-Ala-Gly-Pro-Phe-Ser-Ala-Thr-Ala-Thr-Leu-Val-Ala-Ser-Tyr-Ser 15 eller Met-Ile-Arg-Leu-Ser-Leu-Phe-Ile-Ser-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Val-Ala-Val-Leu-Ala-Asp-Val-Gln-Ile-Asn-Ile-Arg-Gly-Asn-Val-Tyr-Ile-Pro-Pro-Cys-Thr-Ile-Asn-Asn-Gly-Gln-Asn-Ile-Val-Val-Asp-Phe-Gly-Asn-Ile-Asn-Pro-Glu-His-Val-Asp-Asn-Ser-Arg-Gly-Glu-20 Val-Thr-Lys-Thr-Ile-Ser-Ile-Ser-Cys-Pro-Tyr-Lys-Ser-Gly-Ser-Leu-Trp-Ile-Lys-Val-Thr-Gly-Asn-Thr-Met-Gly-Gly-Gly-Gln-Asn-Asn-Val-Leu-Ala-Thr-Asn-Ile-Thr-His-Phe-Gly-Ile-Ala-Leu-Tyr-Gln-Gly-Lys-Gly-Met-Ser-Thr-Pro-Leu-Ile-Leu-Gly-Asn-Gly-Ser-Gly-Asn-Gly-iyr-Gly-Val-Thr-Ala-Gly-Leu-Asp-Thr-Ala-Arg-Ser-25 Thr-Phe-Thr-Phe-Thr-Ser-Val-Pro-Phe-Arg-Asn-Gly-Ser-Gly-Ile-Leu-Asn-Gly-Gly-Asp-Phe-Gln-Thr-Thr-Ala-Ser-Met-Ser-Met-Ile-lyr-Asn eller Met-Lys-Lys-Trp-Phe-Pro-Ala-Phe-Leu-Phe-Leu-Ser-Leu-Ser-Gly-30 Gly-Asn-Asp-Ala-Leu-Ala-Gly-Trp-His-Asn-Val-Met-Phe-Tyr-Ala-Phe-Asn-Asp-Tyr-Leu-Thr-Thr-Asn-Ala-Gly-Asn-Val-Lys-Val-Ile-Asp-Gln-Pro-Gln-Leu-Tyr-Ile-Pro-Trp-Asn-Thr-Gly-Ser-Ala-Thr-Ala-Thr-Tyr-Tyr-Ser-Cys-Ser-Gly-Pro-Glu-Phe-Ala-Ser-Gly-Val- DK 171258 B1 68 Tyr-Phe-Gin-Glu-Tyr-Leu-Ala-Trp-Met-Val-Val-Pro-Lys-His-Val-Tyr-Thr-Asn-Glu-Gly-Phe-Asn-Ile-Phe-Leu-Asp-Val-Gln-Ser-Lys-Tyr-Gly-Trp-Ser-Met-Glu-Asn-Glu-Asn-Asp-Lys-Asp-Phe-Tyr-Phe-Phe - Val - Asn - Gly - Ty r - Glu - Trp - Asp - Thr - Trp - Thr - Asn - Asn - Gly - Ala-5 Arg-Ile-Cys-Phe-Tyr-Pro-Gly-Asn-Met-Lys-Gln-Leu-Asn-Asn-Lys-Phe - Asn - Asp - Leu - Val - Phe - Arg - Val - Leu - Leu - Pro - Val - Asp - Leu - Pro -Lys-Gly-His-Tyr-Asn-Phe-Pro-Val-Arg-Tyr-Ile-Arg-Gly-Ile-Gin-His -His -Tyr -Tyr- Asp- Leu- Trp- Gin- Asp -His -Tyr- Lys -Met -Pro -Tyr-Asp-Gin-Ile-Lys-Gin-Leu-Pro-Ala-Thr-Asn-Thr-Leu-Met-Leu-Ser-10 Phe-Asp-Asn-Val-Gly-Gly-Cys-Gln-Pro-Ser-Thr-Gln-Val-Leu-Asn-Ile-Asp-His-Gly-Ser-Ile-Val-Ile-Asp-Arg-Ala-Asn-Gly-Asn-Ile-Ala-Ser-Gln-Thr-Leu-Ser-Ile-Tyr-Cys-Asp-Val-Pro-Val-Ser-Val-Lys-Ile-Ser-Leu-Leu-Arg-Asn-Thr-Pro-Pro-Ile-Tyr-Asn-Asn-Asn-Lys-Phe-Ser-Val-Gly-Leu-Gly-Asn-Gly-Trp-Asp-Ser-Ile-Ile-Ser-15 Leu-Asp-Gly-Val-Glu-Gln-Ser-Glu-Glu-Ile-Leu-Arg-Trp-Tyr-Thr-Ala-Gly-Ser-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Glu-Ser-Arg-Leu-Tyr-Gly-Glu-Glu-Gly-Lys-Arg-Lys-Pro-Gly-Glu-Leu-Ser-Gly-Ser-Met-Thr-Met-Val-Leu-Ser-Phe- Pro.
7. Antistof, 20 kendetegnet ved, at det er dannet mod eller i det væsentlige kun rettet mod en determinant fra et adhesin-polypeptid som defineret i et hvilket som helst af kravene 1-6, hvilket antistof er i stand til at passivt immunisere et pattedyr mod sygdomme, der skyldes patogene bakterier, der 25 adhærerer til pattedyrvæv.
8. Fremgangsmåde til fremstilling af et antistof, der er i stand til at reagere med et adhesin-polypeptid, kendetegnet ved, at et dyr immuniseres med et antigent præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, 30 og at der opnås antiserum fra dyret.
9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at antistofdannende celler fra dyret fusioneres med myelomceller, de resulterende antistof-dannende fusionerede celler dyrkes i et medium, og antistof-35 fer udvindes fra kulturen. DK 171258 B1 69
10· Præparat til passiv immunisering af et pattedyr imod sygdomme, som forårsages af patogene pilusdannende bakterier, der adhærerer til pattedyrvæv, kendetegnet ved, at præparatet omfatter en immuno-5 logisk virksom mængde af et antistof ifølge krav 7 eller fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 8 eller 9, eventuelt bundet til et bæremateriale, sammen med en immunologisk acceptabel bærer.
11. Et diagnostisk middel, 10 kendetegnet ved, at det omfatter et antistof ifølge krav 7 eller fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 8 eller 9.
12. Vaccine til immunisering af et pattedyr mod sygdomme, som forårsages af patogene pilus-dannende bakterier, der ad- 15 hærerer til pattedyrvæv, kendetegnet ved, at den som en immunogen hovedbestanddel indeholder en determinant fra et adhesin-polypeptid som defineret i et hvilket som helst af kravene 1-6, hvilken determinant eventuelt er bundet til et hensigtsmæssigt bære-20 materiale, fortrinsvis et fysiologisk acceptabelt bæremateriale, til hvilket determinanten er covalent bundet, sammen med en immunologisk acceptabel bærer.
13. Fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine til immunisering af et dyr mod sygdomme, som forårsages af patogene 25 pilus-dannende bakterier, der adhærerer til pattedyrvæv, kendetegnet ved, at en immunogent virksom mængde af en determinant fra et adhesin-antigen som defineret i et hvilket som helst af kravene 1-6, og som eventuelt er bundet til et hensigtsmæssigt bæremateriale, kombineres med en 30 immunologisk acceptabel bærer.
14. DNA-fragment, der koder for en determinant fra et adhesin-polypeptid som defineret i et hvilket som helst af kravene 1-6, DK 171258 B1 70 kendetegnet ved, at det i det væsentlige ikke koder for noget andet antigen.
15. DNA-fragment, der koder for det fuldstændige adhesin-polypeptid som defineret i et hvilket som helst af kravene 1- 5 6, kendetegnet ved, at det i det væsentlige ikke koder for noget andet antigen.
16. DNA-fragment, der koder for en precursor for et adhesin-polypeptid som defineret i et hvilket som helst af kravene Ι- ΙΟ 6, hvilken precursor kan omdannes til en immunologisk aktiv form, kendetegnet ved, at det i det væsentlige ikke koder for noget andet antigen.
17. DNA-fragment ifølge et hvilket som helst af kravene 14- 15 16, kendetegnet ved, at det stammer fra patogene pilus-dannende bakterier.
18. DNA-fragment ifølge krav 17, kendetegnet ved, at det stammer fra en uropatogen 20 eller enteropatogen stamme af Escherichia coli eller fra Neisseria gonorrhoeae.
19. DNA-fragment ifølge krav 18, kendetegnet ved, at den patogene stamme af E. coli er en uropatogen stamme.
20. DNA-fragment ifølge krav 19, kendetegnet ved, at det har følgende DNA-sekvens: ATGAAAAAGATAAGAGGTTTGTGTCTTCCGGTAATGCTGGGGGCAGTGT-TAATGTCTCAGCATGTACATGCAGTTGATAATCTGACCTTCAGAGGAAA-ACTGATTATTCCTGCCTGTACTGTAAGCAACACAACTGTTGACTGGCAG-3 0 GATGTAGAGATTCAGACCCTGAGTCAAAATGGAAATCACGAAAAAGAGT- TTACTGTGAATATGCGGTGTCCCTATAATCTGGGAACAATGAAGGTTAC- DK 171258 B1 71 GATAACGGCAACAAACACTTATAACAATGCTATTTTAGTTCAGAATACA-TCAAACACATCTTCTGATGGGTTACTCGTTTATCTTTATAACAGTAATG-CAGGAAATATTGGGACTGCGATAACTTTAGGGACTCCATTTACGCCCGG-AAAAATCACAGGTAATAATGCAGATAAAACTATATCACTTCATGCCAAA -5 CTTGGATATAAAGGGAATATGCAGAATTTGATAGCCGGTCCTTTCTCIG - CAACAGCAACGCTGGTTGCATCATATTCGTAA eller en hvilken som helst undersekvens deraf, der, når den udtrykkes, udgør en determinant fra en mindre pilus-komponent, der kodes af hele DNA-sekvensen.
21. DNA-fragment ifølge krav 19, kendetegnet ved, at det har følgende DNA-sekvens: ATGATTCGTTTATCATTATTTATATCGTTGCTTCTGACATCGGTCGCTG-TACTGGCTGATGTGCAGATTAACATCAGGGGGAATGTTTATATCCCCCC-ATGCACCATTAATAACGGGCAGAATATTGTTGTTGATTTTGGGAATATT-15 AATCCTGAGCACGTGGACAACTCACGTGGTGAAGTCACAAAAACCATAA- GCATATCCTGTCCGTATAAGAGTGGCTCTCTCTGGATAAAAGTTACGGG-AAATACTATGGGAGGAGGTCAGAATAATGTACTGGCAACAAATATAACT -CATTTTGGTATAGCGCTGTATCAGGGAAAAGGAATGTCAACACCTCTTA-TATTAGGTAATGGTTCAGGAAATGGTTACGGAGTGACAGCAGGTCTGGA-
22. DNA-fragment ifølge krav 19, kendetegnet ved, at det har følgende DNA-sekvens: ATGAAAAAATGGTTCCCTGCTTTTTTATTTTTATCCCTGTCAGGCGGTA- ATGATGCTTTAGCTGGAIGGCACAATGTCATGTTTTATGCTTTTAACGA-
23. Fremgangsmåde til fremstilling af et adhesin-polypeptid som defineret i et hvilket som helst af kravene 1-6 eller en determinant derfra, kendetegnet ved, at en bakterievært, der indeholder en hybridvektor med et indsat DNA-fragment, som koder 25 for polypeptidet eller determinanten, dyrkes, og det produkt, der udtrykkes fra DNA-fragmentet, udvindes, eventuelt efterfulgt af oprensning.
24. Fremgangsmåde ifølge krav 23, kendetegnet ved, at det indsatte DNA-fragment 30 omfatter flere gener, der koder for et eller flere adhesin-polypept ider.
25. Fremgangsmåde ifølge krav 23 eller 24, kendetegnet ved, at et DNA-fragment, der koder for et adhesin-polypeptid som defineret i et hvilket som helst af DK 171258 B1 73 kravene 1-6 eller en determinant derfra, fusioneres til en DNA-sekvens, som koder for et andet polypeptid, den fusionerede DNA-sekvens indsættes i en hensigtsmæssig bakterievært, værten dyrkes i et hensigtsmæssigt medium, det fusionerede 5 polypeptid udvindes fra kulturen og oprenses under anvendelse af et assay, der omfatter antistoffer, som er dannet mod det andet polypeptid, og det andet polypeptid fraspaltes eventuelt ved hjælp af en hensigtsmæssig protease efterfulgt af adskillelse af de to polypeptider.
26. Fremgangsmåde ifølge krav 25, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen, der koder for det andet polypeptid, er lacZ-genet, der koder for jli-galac-tosidase.
27. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 23- 15 26, kendetegnet ved, at DNA-fragmentet er som defineret i et hvilket som helst af kravene 14-22.
28. Fremgangsmåde til fremstilling af et adhesin-polypeptid som defineret i krav 1 eller en determinant derfra, 20 kendetegnet ved, at polypeptidet eller determinanten fremstilles ved peptidsyntese, fortrinsvis ved fastfase-syntese.
29. Fremgangsmåde ifølge krav 28, kendetegnet ved, at bærematerialet, til hvilket 25 den indledende aminosyre kobles under syntesen, er en fysiologisk acceptabel polymer, der er nyttig som et bæremateriale for determinanten i vaccinen ifølge krav 12.
30. Anvendelse af et adhesin-polypeptid som defineret i et hvilket som helst af kravene 1-6 eller af en determinant 30 derfra i fremstillingen af et farmaceutisk præparat til forebyggelse eller nedsættelse af risikoen for infektion med pilus-dannende bakterier. DK 171258 B1 74
31. Anvendelse af et adhesin-polypeptid som defineret i et hvilket som helst af kravene 1-6 eller af en determinant derfra i fremstillingen af en vaccine mod pilus-dannende patogene bakterier.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK609985A DK171258B1 (da) | 1984-05-02 | 1985-12-30 | Antigent præparat indeholdende en determinant fra et adhesin-polypeptid, fremgangsmåder til fremstilling af deteminanten og adhesin-polypeptidet, anvendelser af determinanten og adhesin-polypeptidet, vaccine indeholdende determinanten, fremgangsmåde til fremstilling af vaccinen, antistof rettet mod determinanten, fremgangsmåde til fremstilling af antistoffet, præparatet til passiv immunisering |
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK219084 | 1984-05-02 | ||
| DK2190/84A DK219084D0 (da) | 1984-05-02 | 1984-05-02 | Antigen |
| DK8500045 | 1985-05-02 | ||
| PCT/DK1985/000045 WO1985005037A1 (en) | 1984-05-02 | 1985-05-02 | Adhesin antigens, antibodies and dna fragment encoding the antigen, methods and means for diagnosis and immunization etc. |
| DK609985 | 1985-12-30 | ||
| DK609985A DK171258B1 (da) | 1984-05-02 | 1985-12-30 | Antigent præparat indeholdende en determinant fra et adhesin-polypeptid, fremgangsmåder til fremstilling af deteminanten og adhesin-polypeptidet, anvendelser af determinanten og adhesin-polypeptidet, vaccine indeholdende determinanten, fremgangsmåde til fremstilling af vaccinen, antistof rettet mod determinanten, fremgangsmåde til fremstilling af antistoffet, præparatet til passiv immunisering |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK609985D0 DK609985D0 (da) | 1985-12-30 |
| DK609985A DK609985A (da) | 1985-12-30 |
| DK171258B1 true DK171258B1 (da) | 1996-08-12 |
Family
ID=8110676
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK2190/84A DK219084D0 (da) | 1984-02-02 | 1984-05-02 | Antigen |
| DK609985A DK171258B1 (da) | 1984-05-02 | 1985-12-30 | Antigent præparat indeholdende en determinant fra et adhesin-polypeptid, fremgangsmåder til fremstilling af deteminanten og adhesin-polypeptidet, anvendelser af determinanten og adhesin-polypeptidet, vaccine indeholdende determinanten, fremgangsmåde til fremstilling af vaccinen, antistof rettet mod determinanten, fremgangsmåde til fremstilling af antistoffet, præparatet til passiv immunisering |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK2190/84A DK219084D0 (da) | 1984-02-02 | 1984-05-02 | Antigen |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US4795803A (da) |
| EP (1) | EP0179887B1 (da) |
| JP (2) | JP2974028B2 (da) |
| KR (1) | KR950000688B1 (da) |
| AT (1) | ATE91629T1 (da) |
| AU (1) | AU593770B2 (da) |
| CA (1) | CA1340847C (da) |
| DE (1) | DE3587468T2 (da) |
| DK (2) | DK219084D0 (da) |
| FI (1) | FI93310C (da) |
| IE (1) | IE59826B1 (da) |
| RU (1) | RU1787165C (da) |
| WO (1) | WO1985005037A1 (da) |
Families Citing this family (57)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4736017A (en) * | 1984-04-30 | 1988-04-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chemically defined vaccine against urinary infections |
| US4584195A (en) * | 1984-06-21 | 1986-04-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Broad spectrum vaccine against gonorrhea |
| US4740585A (en) * | 1984-07-30 | 1988-04-26 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Synthetic vaccine against urinary infections |
| US5288617A (en) * | 1984-10-31 | 1994-02-22 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization | Method of producing an antigenic preparation |
| ZA858374B (en) * | 1984-10-31 | 1986-07-30 | Commw Scient Ind Res Org | Antigenic preparation |
| IL78775A (en) * | 1985-05-15 | 1992-06-21 | Biotech Australia Pty Ltd | Oral vaccines |
| EP0211352B1 (en) * | 1985-08-01 | 1994-03-16 | Miles Inc. | Protective antibodies to serotypic determinants of flagellar antigens |
| US4900659A (en) * | 1986-01-30 | 1990-02-13 | Enzo Biochem, Inc. | Nucleotide sequence composition and method for detection of Neisseria gonorrhoeae and method for screening for a nucleotide sequence that is specific for a genetically distinct group |
| US4801690A (en) * | 1986-03-24 | 1989-01-31 | Bactex, Inc. | Novel lectins derived from bacterial pili |
| SE8601940D0 (sv) * | 1986-04-25 | 1986-04-25 | Kabigen Ab | Preparation of fused proteins, antibodies and processes therefor |
| US4786592A (en) * | 1986-06-18 | 1988-11-22 | Scripps Clinic And Research Foundation | Neisseria gonorrhoeae lectin useful as a vaccine and diagnostic marker and means for producing this lectin |
| US7087742B1 (en) | 1986-11-24 | 2006-08-08 | Gen-Probe Incorporated | Oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms |
| US7138516B1 (en) | 1986-11-24 | 2006-11-21 | Gen-Probe Incorporated | Oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms |
| US5036003A (en) * | 1987-08-21 | 1991-07-30 | Monsanto Company | Antibodies to VPF |
| AU601510B2 (en) * | 1987-11-06 | 1990-09-13 | Immunomed Corporation | Preparation of bacterium pili subunits and vaccines containing pili subunits |
| SE8801894D0 (sv) * | 1988-05-20 | 1988-05-20 | Alfa Laval Agri Int | Fibronektinbindande protein |
| US5055455A (en) * | 1988-09-28 | 1991-10-08 | Brigham And Women's Hospital | Capsular polysaccharide adhesin antigen, preparation, purification and use |
| US7172863B1 (en) | 1988-12-09 | 2007-02-06 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes and methods for detecting Neisseria gonorrhoeae |
| CA1340530C (en) * | 1989-04-28 | 1999-05-04 | Kok Kheong Lee | Synthetic pseudomonas aeruginosa pilin peptide and related vaccines and diagnostics |
| SE8901687D0 (sv) * | 1989-05-11 | 1989-05-11 | Alfa Laval Agri Int | Fibronectin binding protein as well as its preparation |
| US5202113A (en) * | 1990-04-30 | 1993-04-13 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Plaque-inhibiting protein from bacteroides loeschei and methods for using the same |
| WO1992002817A1 (en) * | 1990-08-02 | 1992-02-20 | Biocarb, Inc. | Adhesion receptors for pathogenic or opportunistic microorganisms |
| US5440014A (en) * | 1990-08-10 | 1995-08-08 | H+E,Uml/Oo/ K; Magnus | Fibronectin binding peptide |
| US5843463A (en) * | 1990-12-21 | 1998-12-01 | Antexbiologics, Inc. | Adhesin-oligosaccharide conjugate vaccine for Haemophilus influenzae |
| WO1992011367A2 (en) * | 1990-12-21 | 1992-07-09 | Microcarb Inc. | Lipid receptors for microorganisms and corresponding adhesins, dna sequences encoding adhesins, and use thereof |
| US5834591A (en) * | 1991-01-31 | 1998-11-10 | Washington University | Polypeptides and antibodies useful for the diagnosis and treatment of pathogenic neisseria and other microorganisms having type 4 pilin |
| US5980908A (en) * | 1991-12-05 | 1999-11-09 | Alfa Laval Ab | Bacterial cell surface protein with fibronectin, fibrinogen, collagen and laminin binding ability, process for the manufacture of the protein and prophylactic treatment |
| AU662783B2 (en) * | 1992-01-08 | 1995-09-14 | De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezonheid En Cultuur | Whooping cough vaccine |
| EP0699076B1 (en) * | 1993-05-18 | 2002-10-30 | The Ohio State University Research Foundation | Otitis media vaccine |
| US5648240A (en) * | 1994-05-24 | 1997-07-15 | Texas A&M University | MHC II analog from Staphylococcus aureus |
| US5798260A (en) * | 1994-06-24 | 1998-08-25 | Children's Hospital And Medical Center | Escherichia coli O157:H7 epithelial adhesin |
| DE19534579C2 (de) * | 1995-09-18 | 2000-06-08 | Max Planck Gesellschaft | Nucleinsäure-Moleküle codierend Proteine, die die Adhäsion von Neisseria-Zellen an humane Zellen vermitteln |
| US6872398B2 (en) * | 1995-12-22 | 2005-03-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Conjugate vaccine against gram-negative bacterial infections |
| US6709656B1 (en) * | 1996-06-10 | 2004-03-23 | Thomas Boren | Helicobacter pylori adhesin binding group antigen |
| ATE446368T1 (de) * | 1998-01-14 | 2009-11-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Antigene aus neisseria meningitidis |
| US7252828B2 (en) | 1998-07-15 | 2007-08-07 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Polysaccharide vaccine for staphylococcal infections |
| CA2341177A1 (en) * | 1998-08-31 | 2000-03-09 | Inhibitex, Inc. | Staphylococcal immunotherapeutics via donor selection and donor stimulation |
| US6692739B1 (en) | 1998-08-31 | 2004-02-17 | Inhibitex, Inc. | Staphylococcal immunotherapeutics via donor selection and donor stimulation |
| US20040001863A1 (en) * | 1998-12-03 | 2004-01-01 | Shau-Chi Chi | Immortal cell line derived from grouper Epinephelus coioides and its applications therein |
| GB9924351D0 (en) | 1999-10-14 | 1999-12-15 | Brennan Frank | Immunomodulation methods and compositions |
| PT1248646E (pt) * | 1999-12-21 | 2008-03-19 | Merial Sas | Composições e vacinas contendo antigénio(s) de cryptosporidium parvum e de outro patógeno entérico |
| EP2189473A3 (en) * | 2000-10-27 | 2010-08-11 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Nucleic and proteins from streptococcus groups A & B |
| IL157041A0 (en) | 2001-01-26 | 2004-02-08 | Inhibitex Inc | Monoclonal antibodies to the clfa protein and method of use in treating and preventing infections |
| US20030194798A1 (en) | 2001-05-24 | 2003-10-16 | Surber Mark W. | Minicell compositions and methods |
| US7396822B2 (en) * | 2001-05-24 | 2008-07-08 | Vaxiion Therapeutics, Inc. | Immunogenic minicells and methods of use |
| US7132101B2 (en) * | 2002-02-27 | 2006-11-07 | Duquesne University Of The Holy Ghost | Compositions and methods for eliciting an immune response to gram-negative bacterial infections |
| WO2004003160A2 (en) * | 2002-06-27 | 2004-01-08 | University Of Washington | Use of adhesion molecules as bond stress-enhanced nanoscale binding switches |
| EP1583517B1 (en) | 2002-11-12 | 2019-06-12 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and products for treating staphylococcal infections |
| EP1565478B1 (en) | 2002-11-12 | 2017-08-02 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Polysaccharide vaccine for staphylococcal infections |
| WO2006055024A2 (en) * | 2004-04-05 | 2006-05-26 | Vaxiion Therapeutics, Inc. | Minicells as vaccines |
| DK1745075T3 (da) | 2004-04-21 | 2013-06-24 | Brigham & Womens Hospital | Poly-n-acetylglucosamin (pnag/dpnag)-bindende peptider og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
| US8251846B2 (en) * | 2006-08-02 | 2012-08-28 | Wilson Sporting Goods Co. | Game ball having optimally positioned grooves |
| US7585236B2 (en) * | 2006-08-02 | 2009-09-08 | Wilson Sporting Goods Co. | Game ball having optimally positioned grooves and/or ridges |
| US7686713B2 (en) * | 2007-04-11 | 2010-03-30 | Wilson Sporting Goods Co. | Racquet stringing machine |
| WO2009014782A2 (en) * | 2007-04-27 | 2009-01-29 | Dow Global Technologies Inc. | Improved production and in vivo assembly of soluble recombinant icosahedral virus-like particles |
| DK2315747T3 (da) | 2008-07-21 | 2018-02-26 | Brigham & Womens Hospital Inc | Fremgangsmåder og sammensætninger vedrørende syntetiske Beta-1,6 glucosamin-oligosaccharider |
| US10005820B2 (en) | 2011-02-15 | 2018-06-26 | Vaxiion Therapeutics, Llc | Therapeutic compositions and methods for antibody and Fc-containing targeting molecule-based targeted delivery of bioactive molecules by bacterial minicells |
Family Cites Families (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1472624A (en) * | 1974-09-02 | 1977-05-04 | Canadian Patents Dev | Enteric disease vaccine |
| US4461838A (en) * | 1975-04-25 | 1984-07-24 | Bactex, Inc. | Gonococcal Pili processes for the preparation thereof and the use thereof for the detection of and prevention of infections caused by Neisseria gonorrhoeae |
| ZA762438B (en) * | 1975-04-25 | 1978-03-29 | Bactex Inc | Gonococcal pili processes for the preparation thereof and the use thereof for the detection of and prevention of infections caused by neisseria gonorrhoeae |
| US4136167A (en) * | 1975-06-12 | 1979-01-23 | Internationale Octrooi Maatschappij "Octropa" B.V. | Process for reducing the incidence of neonatal diarrhoea in pigs |
| GB1553664A (en) * | 1975-06-12 | 1979-09-26 | Unilever Ltd | Antigenic compositions |
| US4237115A (en) * | 1977-11-23 | 1980-12-02 | Bactex, Inc. | Method of immunization against enterotoxogenic infection by Escherichia coli |
| US4336336A (en) * | 1979-01-12 | 1982-06-22 | President And Fellows Of Harvard College | Fused gene and method of making and using same |
| FR2466251B1 (fr) * | 1979-10-03 | 1983-03-18 | Agronomique Inst Nat Rech | Vaccin animal anticolibacillaire, obtention et application |
| US4311797A (en) * | 1979-09-18 | 1982-01-19 | University Of Saskatchewan | Anucleated live E. coli vaccine |
| SE8001748L (sv) * | 1980-03-05 | 1981-09-06 | Kaellenius Gunilla | Kompositioner for terapeutisk eller diagnostisk anvendning jemte forfarande for terapeutik |
| US4454117A (en) * | 1980-09-15 | 1984-06-12 | Bactex, Inc. | Immunization against infection by Escherichia coli |
| GB2094314A (en) * | 1981-02-05 | 1982-09-15 | Wellcome Found | Recombinant DNA |
| WO1982003088A1 (en) * | 1981-03-09 | 1982-09-16 | Corp Cetus | Vaccines |
| US4443431A (en) * | 1981-05-27 | 1984-04-17 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Neisseria gonorrhoeae vaccine |
| NZ202203A (en) * | 1981-10-19 | 1986-05-09 | Molecular Genetics Inc | Producing anti-adhesin antibodies |
| US4443549A (en) * | 1981-10-19 | 1984-04-17 | Molecular Genetics, Inc. | Production of monoclonal antibodies against bacterial adhesins |
| FR2516385A1 (fr) * | 1981-11-19 | 1983-05-20 | Merieux Inst | Vaccin anti-aphteux et anti-colibacillaire et son procede de preparation |
| JPS58502181A (ja) * | 1982-01-18 | 1983-12-22 | サンド・アクチエンゲゼルシヤフト | 新規プラスミドと細菌株並びにその製造法 |
| EP0089940A1 (en) * | 1982-03-23 | 1983-09-28 | BioCarp AB | Compositions for therapeutic or diagnostic use containing oligosaccharides |
| US4521334A (en) * | 1982-07-27 | 1985-06-04 | The University Of Tennesse Research Corporation | Synthetic polypeptide fragments |
| US4597967A (en) * | 1982-07-27 | 1986-07-01 | The University Of Tennessee Research Corp. | Synthetic polypeptide fragments |
| NZ205392A (en) * | 1982-09-02 | 1987-03-06 | Unilever Plc | Preparation of immunoglobulins against e.coli pili |
| US4652448A (en) * | 1982-10-07 | 1987-03-24 | Molecular Genetics, Inc. | Use of monoclonal antibodies against bacterial adhesins |
| US4736017A (en) * | 1984-04-30 | 1988-04-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chemically defined vaccine against urinary infections |
| US4801690A (en) * | 1986-03-24 | 1989-01-31 | Bactex, Inc. | Novel lectins derived from bacterial pili |
| US4786592A (en) * | 1986-06-18 | 1988-11-22 | Scripps Clinic And Research Foundation | Neisseria gonorrhoeae lectin useful as a vaccine and diagnostic marker and means for producing this lectin |
-
1984
- 1984-05-02 DK DK2190/84A patent/DK219084D0/da not_active Application Discontinuation
-
1985
- 1985-05-02 DE DE85902487T patent/DE3587468T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-02 JP JP60502188A patent/JP2974028B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-02 KR KR1019850700417A patent/KR950000688B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1985-05-02 CA CA000480663A patent/CA1340847C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-05-02 EP EP85902487A patent/EP0179887B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-02 AT AT85902487T patent/ATE91629T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-05-02 US US06/817,849 patent/US4795803A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-02 AU AU42994/85A patent/AU593770B2/en not_active Expired
- 1985-05-02 IE IE110285A patent/IE59826B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-05-02 WO PCT/DK1985/000045 patent/WO1985005037A1/en active IP Right Grant
- 1985-12-30 DK DK609985A patent/DK171258B1/da not_active IP Right Cessation
-
1986
- 1986-01-02 RU SU864001551A patent/RU1787165C/ru active
- 1986-01-02 FI FI860015A patent/FI93310C/fi not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-05-23 US US08/447,685 patent/US5804198A/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-06-21 JP JP8162018A patent/JPH09183791A/ja active Pending
-
1998
- 1998-05-11 US US09/075,396 patent/US6291649B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI860015A0 (fi) | 1986-01-02 |
| DK219084D0 (da) | 1984-05-02 |
| DE3587468D1 (de) | 1993-08-26 |
| US6291649B1 (en) | 2001-09-18 |
| DE3587468T2 (de) | 1993-12-02 |
| KR950000688B1 (ko) | 1995-01-27 |
| AU4299485A (en) | 1985-11-28 |
| US4795803A (en) | 1989-01-03 |
| US5804198A (en) | 1998-09-08 |
| JPH09183791A (ja) | 1997-07-15 |
| EP0179887B1 (en) | 1993-07-21 |
| CA1340847C (en) | 1999-12-14 |
| ATE91629T1 (de) | 1993-08-15 |
| FI860015A (fi) | 1986-01-02 |
| DK609985D0 (da) | 1985-12-30 |
| DK609985A (da) | 1985-12-30 |
| RU1787165C (ru) | 1993-01-07 |
| IE59826B1 (en) | 1994-04-06 |
| WO1985005037A1 (en) | 1985-11-21 |
| JPS62501355A (ja) | 1987-06-04 |
| IE851102L (en) | 1985-11-02 |
| FI93310C (fi) | 1995-03-27 |
| EP0179887A1 (en) | 1986-05-07 |
| AU593770B2 (en) | 1990-02-22 |
| JP2974028B2 (ja) | 1999-11-08 |
| KR860700090A (ko) | 1986-03-31 |
| FI93310B (fi) | 1994-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK171258B1 (da) | Antigent præparat indeholdende en determinant fra et adhesin-polypeptid, fremgangsmåder til fremstilling af deteminanten og adhesin-polypeptidet, anvendelser af determinanten og adhesin-polypeptidet, vaccine indeholdende determinanten, fremgangsmåde til fremstilling af vaccinen, antistof rettet mod determinanten, fremgangsmåde til fremstilling af antistoffet, præparatet til passiv immunisering | |
| Bilge et al. | Molecular characterization of a fimbrial adhesin, F1845, mediating diffuse adherence of diarrhea-associated Escherichia coli to HEp-2 cells | |
| Courtney et al. | Cloning, sequencing, and expression of a fibronectin/fibrinogen-binding protein from group A streptococci | |
| Leung et al. | The yopM gene of Yersinia pestis encodes a released protein having homology with the human platelet surface protein GPIb alpha | |
| Abraham et al. | Identification of two ancillary subunits of Escherichia coli type 1 fimbriae by using antibodies against synthetic oligopeptides of fim gene products | |
| Lund et al. | Globoside-specific adhesins of uropathogenic Escherichia coli are encoded by similar trans-complementable gene clusters | |
| Ott et al. | Gene clusters for S fimbrial adhesin (sfa) and F1C fimbriae (foc) of Escherichia coli: comparative aspects of structure and function | |
| Perez Melgosa et al. | Sequence analysis of the major outer membrane protein gene of Chlamydia pneumoniae | |
| JPH09224680A (ja) | 肺炎球菌タンパクの構造遺伝子 | |
| MX2007012057A (es) | Haemophilus influenzae tipo b. | |
| US5997882A (en) | Epitopic regions of pneumococcal surface protein A | |
| Westerlund et al. | Multifunctional nature of P fimbriae of uropathogenic Escherichia coli: mutations in fsoE and feoF influence fimbrial binding to renal tubuli and immobilized fibronectin | |
| US8114971B2 (en) | Nucleic acid molecules encoding proteins which impart the adhesion of Neisseria cells to human cells | |
| DK175831B1 (da) | Neisseria gonorrhoeae-relaterede nucleinsyrer, rekombinantvektorer, værtsorgaismer, encellede organismer, polypeptidfremstillingsmetoder, polypeptidsammensætninger, vaccinepræparater, DNA-sonder, påvisningsmetoder og diagnostiske prövesæt, ......... | |
| Purcell et al. | Molecular cloning and characterization of the 15-kilodalton major immunogen of Treponema pallidum | |
| CA2195090C (en) | Lkp pilin structural genes and operon of nontypable haemophilus influenzae | |
| Hansen et al. | Cloning of the gene encoding the major outer membrane protein of Haemophilus influenzae type b | |
| WO1996002648A9 (en) | Lkp pilin structural genes and operon of nontypable haemophilus influenzae | |
| Tennent et al. | Integrity of Escherichia coli P pili during biogenesis: properties and role of PapJ | |
| KR0170752B1 (ko) | 혈호균속 인플루엔자용 백신과 진단검사법 | |
| Pawelzik et al. | Cloning and characterization of a new type of fimbria (S/F1C-related fimbria) expressed by an Escherichia coli O75: K1: H7 blood culture isolate | |
| US6015889A (en) | Protein rib, a cell surface protein that confers immunity to many strains of the group B streptococcus: process for purification of the protein, reagent kit and pharmaceutical composition | |
| Palmer et al. | Expression of gonococcal protein II in Escherichia coli by translational fusion | |
| WO1994010330A9 (en) | Fibronectin binding protein as well as its preparation | |
| Lu et al. | Detection of EspB using reversed passive latex agglutination: application to determination of enteropathogenic Escherichia coli |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PUP | Patent expired |