PT1370284E

PT1370284E - Imunização mediada por bacteriófagos

Info

Publication number: PT1370284E
Application number: PT02720122T
Authority: PT
Inventors: John Bernard March
Original assignee: Bigdna Ltd
Priority date: 2001-03-23
Filing date: 2002-03-25
Publication date: 2010-08-03
Also published as: CA2441601C; DE60236579D1; JP4653934B2; DK1370284T3; JP2004525931A; ATE469655T1; GB0107319D0; ES2345434T3; US7128916B2; EP1370284A2; CA2441601A1; CY1111286T1; WO2002076498A2; EP1370284B1; AU2002251192B2; US20040121974A1; WO2002076498A3

Description

1

DESCRIÇÃO "IMUNIZAÇÃO MEDIADA POR BACTERIÓFAGOS" A presente invenção refere-se a formulações compreendendo um bacteriófago manipulado para expressar uma proteina/peptideo imunogénicos, bem como utilizações do bacteriófago modificado. A vacinação genética é uma tecnologia nova e excitante, em que o ácido nucleico é utilizado como material de vacina (sobre este assunto consultar Leitner et al. 2000. Vaccine 18: 765-777). Em contraste, as vacinas tradicionais exigem a utilização de micróbios patogénicos ou respectivos componentes antigénicos. Existem três classes de vacinas "tradicionais": Atenuadas, mortas/subunidade e recombinantes. As vacinas atenuadas são microrganismos vivos com patogenicidade reduzida e são geralmente as vacinas mais eficazes. Contudo, podem produzir complicações se o agente da vacina se desenvolve sem controlo ou reverte para a forma mais patogénica. As vacinas de subunidades exigem múltiplas injecções, aumentando assim o custo e criando problemas logísticos e podem conter micróbios que não estão completamente mortos. As vacinas recombinantes, em que o antigénio de um organismo patogénico é manipulado num vector não-patogénico, podem ser eficazes, mas as dificuldades em atingir a expressão do antigénio numa conformação nativa limitam frequentemente a eficácia.

Para ser eficaz, as vacinas têm de proporcionar uma dose suficiente de antigénio por períodos de tempo 2 suficientemente longos para induzir uma resposta secundária (memória). Isto levanta um problema para vacinas tradicionais; vacinas de ADN/ARN, contudo, podem produzir com eficácia cópias de antigénios patogénicos por longos períodos de tempo, induzindo assim respostas MHC tanto de classe I como II, como observado em vacinas vivas. Contudo, apesar das promessas, as vacinas de ADN ainda têm de atingir todo o seu potencial. Apesar de desencadearem uma resposta imunitária humoral (anticorpo) mensurável, muitas vacinas de ADN exibem uma fraca eficácia quando desafiadas com o organismo infeccioso (Beard, CW & Mason, PW. 1998. Nature Biotech. 16: 1325). 0 mecanismo de entrada do ácido nucleico nas células hospedeiras e indução de uma resposta imunitária não é, de momento, evidente. A técnica mais simples consiste na administração do ADN como injecção solúvel, normalmente por via intramuscular. Duas outras técnicas vulgarmente utilizadas são a tecnologia "pistola de genes", em que o ADN é precipitado sobre minúsculas partículas de ouro, as quais são forçadas para o interior das células com um impulso de hélio, ou transfecção mediada por lipossomas, em que o ADN é revestido com um lípido com carga positiva para formar um complexo que se funde à membrana da célula hospedeira. Acredita-se que as células em torno do local da imunização incorporam o ADN, expressam o(s) antigénio(s) revestido(s) e são identificadas como "estranhas" pelas células apresentadoras de antigénios (AP) do sistema imunitário, que depois prossegue para activar as células T e B para desencadear uma resposta imunitária contra o antigénio. 3

Aparentemente, as limitações seriam: (1) A expressão é relativamente ineficaz e inespecífica, sendo a maioria do ADN expressa em células não-AP; (2) A expressão de antigénios estranhos em células não-AP irá eventualmente conduzir à morte dessa célula devido à identificação desta pelo sistema imunitário do hospedeiro como estando "infectada", reduzindo assim a resposta imunitária potencial e (3) ADN/ARN nu é muito sensível à acção das nucleases. É provável que a maioria dos ácidos nucleicos utilizados para a imunização se degrade pouco tempo depois da imunização. A W098/05344 descreve um método de administração de genes exógenos utilizando um vector bacteriófago, em que o vector bacteriófago foi modificado para incluir à sua superfície um ligando que liga a um receptor numa célula alvo. Os vectores descritos são geralmente destinados a serem utilizados para aplicações de terapia genética em que os vectores são orientados para tipos específicos de células. Mencionou-se também a utilização de vectores bacteriófagos modificados para aplicar peptídeos antigénicos. A US 5 736 388 descreve bacteriófagos lambdóides modificados para aplicação de moléculas ácido nucleico em células eucariotas, em que o bacteriófago foi modificado mediante incorporação de proteínas fibrosas da cauda ou incorporando ligandos para receptores de células eucariotas. A US 6 054 312 refere-se a partículas de fagos filamentosas apresentando um ligando à superfície, sendo o ligando uma proteína de fusão com uma proteína de capsídeo 4 de fago conjugada de modo covalente com partículas do fago ou complexada com partículas de fago modificadas. A W099/55720 descreve também fagos gue foram modificados para exibir externamente uma proteína-alvo heteróloga para utilização na aplicação orientada de genes.

No entanto, patentes/pedidos de patente anteriormente mencionados descrevem todos a modificação da superfície do fago de modo a permitir a aplicação orientada de ácido nucleico em células específicas, geralmente para terapia genética.

De Berardinis et al. (Nature Biotechnology 2000, vol. 18, p.873) mostra a indução de uma resposta intensa de células T por bacteriófagos ADN com epítopos HIV incorporados na proteína principal da cápside. Vários documentos (Ishiura, M. et al, Molec. And Cell. Biol., p 607-616, 1982; Aujame, L. et al, Biotechigues, 28 p 1202-1213, 2000; Horst, J. et al, Proc. Natl. Acad. Sei., 72, p 3531-3535, 1975; Jkayama and Dery, Molec. and Cell.

Biol. 5, pll36-1142, 1985; e Srivatsan, E. et al, 38, p 227-234, 1984) referem-se à utilização de fagos para transfectar células de mamífero cultivadas e expressar nestas proteínas. No entanto, não há qualquer sugestão da possibilidade de aplicação destes in vivo ou utilização no desenvolvimento de vacinas.

Constitui um objecto da presente invenção obviar e/ou mitigar pelo menos uma das desvantagens mencionadas.

Num primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma formulação tal como definido na reivindicação 1. 5

Ao contrário das divulgações anteriores, ver, por exemplo, W098/05344, US 5 736 388, US 6 054 312 e W099/55720 é evidente que o bacteriófago de superfície utilizado de acordo com a presente invenção não foi modificado para compreender peptídeos/proteínas exógenos (isto é, peptideos/proteinas não se encontram normalmente presentes) na superfície do fago concebido para orientar o fago para receptores da superfície de tipos de células específicas. Pressupõe-se, assim, que a superfície do bacteriófago pode ser modificada de forma a compreender peptídeos/proteínas exógenos que não foram concebidos para orientar o fago para receptores na superfície de tipos de células específicos.

Os autores da presente invenção observaram que os bacteriófagos que não foram modificados de forma a incluir peptídeos ou ligandos de marcação na superfície da partícula bacteriófaga são tomadas por células AP. Assim, pensa-se que os bacteriófagos utilizados de acordo com a presente invenção são reconhecidos como "estranhos" e são processados do modo normal pelo sistema imunitário do hospedeiro. Além disso, ao modificar o genoma do bacteriófago de modo a incluir ácidos nucleicos exógenos, capazes de codificar um peptídeo/proteína estranhos, isto é um peptídeo/proteína que não se encontra normalmente presente num hospedeiro mamífero escolhido, é desencadeada uma resposta imunitária a esta proteína estranha. Deste modo, o ácido nucleico codificador do peptídeo/proteína estranhos é expresso (numa célula apresentadora de antigénio ou outra) e apresentado na superfície da célula AP. Convém ter em atenção que a resposta imunitária pode 6 ser uma resposta imunitária humoral (isto é anticorpos) e/ou celular. 0 ácido nucleico exógeno refere-se a um polinucleótido não-natural que é capaz de ser expresso como peptídeo heterólogo ou proteína heteróloga, isto é um peptídeo ou uma proteína que não é normalmente expressa ou é expressa a níveis biologicamente insignificantes num bacteriófago natural. 0 peptídeo ou proteína expressos são expressos a um nível suficiente para desencadear uma resposta imunitária num hospedeiro a quem foi apresentada a vacina.

Deve-se ter em atenção que a presente invenção é aplicável à preparação de uma vacina para praticamente qualquer doença infecciosa, desde que possa ser provocada uma resposta imunoprotectora contra uma proteína ou proteínas de um agente infeccioso. Exemplos de doenças adequadas incluem vacinação directamente contra o agente causador da doença ou, em alternativa, vacinação contra o vector que transporta a doença. Estes agentes ou vectores infecciosos incluem vírus, bactérias, fungos, leveduras, protozoários, helmintas, insectos e encefalopatias espongiformes transmissíveis. A presente invenção seria aplicável no caso de doenças infecciosas em seres humanos e animais. As listas das doenças adequadas são bem conhecidas dos peritos na técnica e encontram-se exemplos em O.I.E. Manual of Standards and Diagnostic Tests 3a Ed., OIE, Paris 1996, Topley & Wilson's Principies of Bacteriology, Virology and Immunity 8 a Ed., Eds. Parker M.T. e Collier L.H., Vol IV (Index), Edward Arnold, Londres 1990, The Zoonoses: Infections Transmitted from Animais to Man. Bell J.C. et al., Edward Arnold, Londres 1988 e Parasitology: The Biology of Animal Parasites 6a Ed. Noble E.R. et al., 7

Lea & Febiger, Filadélfia, 1989. Além disso, a presente invenção poderia ser utilizada para desencadear uma resposta imunitária contra células cancerígenas mediante a expressão de um antigénio especifico da célula cancerígena como proteína da vacina. A presente invenção descreve assim uma forma de encapsulamento de ácido nucleico exógeno, por exemplo, ADN no interior de uma matriz estável para o proteger, por exemplo, de nucleases presentes por exemplo em células. As proteínas "estranhas" na superfície do bacteriófago permitem uma incorporação directa das células apresentadoras (AP) de ácido nucleico especificamente ao antigénio. Sem nos limitarmos a uma teoria prevê-se que a partícula bacteriófago seja reconhecida como um antigénio estranho. Toda a partícula é assim incorporada directamente pelas células apresentadoras de antigénio do sistema imunitário hospedeiro, sendo removido o revestimento proteico, libertando o ADN que pode então mover-se para o núcleo e ser expresso. Pensa-se que este procedimento seja eficiente uma vez que a expressão de ADN de vacina e posterior produção de polipeptídeo só deve ter lugar em células AP, a via ideal de indução de uma resposta imunitária.

Em geral, o termo "polipeptídeo" refere-se a uma cadeia ou sequência de aminoácidos que apresentam uma actividade antigénica e não se refere a um troço específico do produto em si. 0 polipeptídeo pode ser modificado, se necessário, in vivo e/ou in vitro, por exemplo por glicosilação, amidação, carboxilação, fosforilação e/ou clivagem pós-translaccional, englobando assim, entre outros, peptídeos, oligopeptídeos, proteínas e proteínas de fusão.

Naturalmente, para um perito na especialidade será evidente que um polipeptideo modificado deve manter a função fisiológica, isto é, ser capaz de desencadear uma resposta imunitária. 0 bacteriófago para utilização de acordo com a presente invenção compreende um promotor eucariota e de preferência outros reguladores da transcrição/tradução apropriados, tal como intensificadores, terminadores e/ou semelhantes. Tipicamente, o promotor eucariota pode ser o promotor CMV, SV40, timidina quinase, RSV ou semelhantes. Convenientemente, o promotor pode ser um promotor constitutivo. Contudo, podem também ser utilizados promotores controláveis conhecidos dos peritos na especialidade. Por exemplo, podem ser concebidas construções que compreendem o ácido nucleico exógeno sob controlo de um promotor constitutivo e um promotor controlável. Deste modo, pode ser possível provocar a expressão do ácido nucleico exógeno inicialmente, através do promotor constitutivo e num segundo momento mediante expressão a partir do promotor controlável. Poderá resultar numa resposta imunitária mais intensa.

Um exemplo de um bacteriófago adequado é o lambda (λ). Actualmente, o bacteriófago λ é utilizado como vector de clonagem durante procedimento de manipulação de ADN de rotina. Nestes casos, o ADN é purificado afastado da estrutura do fago. No entanto, uma partícula de fago λ intacta preenche os critérios enumerados anteriormente; o ADN encontra-se contido numa matriz proteica protectora que é identificada como um antigénio estranho pelo sistema imunitário do hospedeiro. 0 fago λ infecta normalmente as bactérias E. coli e pensa-se que o respectivo ADN seja 9 "inerte" numa célula eucariota (isto é, não será expresso). Contudo, se estiver incorporado um promotor eucariota a montante do gene da vacina (ou estranho) de interesse, então a expressão desse gene para proporcionar um antigénio, isto é, proteina/peptideo deve ocorrer se o ADN for incorporado por uma célula de mamífero. Devido à extensa utilização como vector de clonagem de rotina, existem muitas variantes de λ, incluindo algumas com fortes promotores eucariotas, concebidos para orientar a expressão em células de mamífero. Normalmente, a secção relevante do vector λ é removida como ADN plasmídico antes de se proceder a mais gualquer outra manipulação genética: utiliza-se então ADN plasmídico muito purificado de um hospedeiro E. coli para imunização genética. Contudo, se for utilizada uma partícula de fago λ intacta contendo um promotor eucariota e o gene de vacina (isto é exógeno) de interesse para imunização, serão incorporados por células AP. Na sequência da remoção do revestimento proteico, pensa-se que a produção de antigénios directamente dentro da célula AP ocorra e antigénios apresentados na superfície das células AP de forma a induzir uma resposta imunitária. Neste caso, é necessário apenas o procedimento de purificação mais básico para produzir partículas de fago prontas para a imunização. Uma vantagem adicional da utilização de λ em comparação com vectores de clonagem de plasmídeo consiste na possibilidade de acomodação de tamanhos de inserção muito maiores.

Outros bacteriófagos adequados são fago pl, fagos T (eq. Tl - T7), Mu, fd ou M13 bem como fagos filamentosos.

Bacteriófagos preferidos para utilização de acordo com a presente invenção têm a capacidade de incorporar ácidos 10 nucleicos exógenos e promotores associados, intensificadores, terminadores e/ou semelhantes com entre cerca de 0,5 e 100 quilobases. Por exemplo, fagos lambda conhecidos podem acomodar entre 9 e 50 quilobases. Deste modo é possível expressar cópias simples ou múltiplas de um peptídeo/proteína ou uma pluralidade de peptídeos/proteínas.

Tipicamente, o bacteriófago para utilização de acordo com a presente invenção é abortivo do desenvolvimento lítico na flora bacteriana natural do hospedeiro mamífero escolhido. São conhecidas muitas estirpes "laboratório" do fago por exemplo capazes de infectar apenas estirpes bacterianas de "laboratório" de tipo não-selvagem. Adicionalmente ou em alternativa, o bacteriófago pode ser abortivo do desenvolvimento lítico da estirpe bacteriana hospedeiros in vitro ou implicar um fago auxiliar para se desenvolver in vitro. Assim, o bacteriófago pode conter, por exemplo, uma mutação amber, uma mutação termicamente sensível ou semelhante. São geralmente apresentados meios para intensificar a expressão do ácido nucleico exógeno nas células AP. Estes meios incluem métodos para ajudar a minimizar a degradação do ácido nucleico e/ou marcação para o núcleo. Exemplos destes meios incluem a utilização de cloroquina ou outros inibidores do catabolismo enzimático lisossomal/endossomal para minimizar a degradação do ácido nucleico e/ou utilização dos sinais de localização nuclear para orientar o ácido nucleico para o núcleo. A formulação pode ainda incluir uma fonte da proteína que deverá ser expressa pelo bacteriófago. Deste modo, um 11 hospedeiro pode desencadear uma resposta imunitária primária para a proteina e posteriormente desencadear uma resposta imunitária adicional ou sustentada devido ao facto de a proteina ser expressa e apresentada na superfície da célula AP.

Numa outra forma de realização, o fago pôde ser modificado para expressar também a proteína antigénica na superfície das partículas de fago, desde que a proteína não oriente o bacteriófago para os receptores na superfície dos tipos de célula eucariota específicos. Por exemplo, é possível utilizar partículas M13 de bacteriófago intactas como veículo do vector. Tamanhos de inserções para M13 são consideravelmente menores do que λ, mas a utilização da tecnologia "Phage Display" (Hawkins, RE et al. 1992, J. Mol. Biol. 226: 889) significa que a partícula de fago pode transportar uma porção de antigénio estranho fundido à respectiva proteína do revestimento. Assim, pode ser elaborada uma construção em que o gene de vacina se encontra sob o controlo de um promotor tanto procariota (por exemplo promotor Lac Z) como eucariota (por exemplo, promotor CMV) : quando desenvolvido num hospedeiro E. coli, o promotor procariota irá dirigir a expressão do antigénio da vacina e permitir a respectiva incorporação no revestimento M13 como um conjugado proteico que deveria desencadear uma resposta primária forte na sequência da vacinação. Seguidamente, após a incorporação pelas células AP, o ADN será libertado e o promotor eucariota irá dirigir uma expressão duradoura do antigénio de vacina do interior da célula AP, mantendo uma forte resposta secundária. 0 ácido nucleico exógeno pode codificar pelo menos mais um polipeptídeo(s), tal como um polipeptídeo capaz de 12 aumentar a resposta imunitária. 0 polipeptídeo adicional pode ser uma proteína adjuvante ou polipeptídeo, tal como uma citoquina codificadora de, por exemplo, um interferão, tal como um interferão γ (ylFN), IL-2, IL-6, IL-7, IL-12, CM- CSF e/ou outras citoquinas/quimioquinas. Além disso, "epítopos auxiliares", tal como o antigénio central da HepB, podem ser utilizados para activar células B e desencadear respostas das células T intensas. Em alternativa ou adicionalmente, podem ser utilizados sinais imunoestimulantes, tal como os oligonucleótidos CpG. 0 bacteriófago pode ser administrado por qualquer via adequada, por exemplo por injecção e pode ser preparado em formas farmacêuticas unidose em, por exemplo, ampolas ou em recipientes multidose. 0 bacteriófago pode encontrar-se nestas formas como suspensão, solução ou emulsão em veículos oleoso ou de preferência aquosos. Em alternativa, o bacteriófago pode encontrar-se sob forma liofilizada para reconstituição no momento da administração com um veículo adequado, tal como água apirogénica estéril. Deste modo, podem ser adicionados agentes estabilizantes, tal como proteínas, açúcares, etc. durante a liofilização das partículas do fago. Tanto a forma líquida como a forma liofilizada que serão reconstituídas incluirão agentes, de preferência tampões, nas quantidades necessárias para ajustar adequadamente o pH da solução injectada. Para qualquer uso parentérico, particularmente se a formulação se destinar a ser administrada por via intravenosa, a concentração total dos solutos deve ser controlada para tornar a preparação isotónica, hipotónica ou ligeiramente hipertónica. São preferidos materiais não-iónicos, tal como açúcares, para ajustar a tonicidade, sendo particularmente 13 preferida a sucrose. Qualquer uma destas formas pode ainda incluir agentes adequados de formulação, tal como amido ou açúcar, glicerol ou soro fisiológico. As composições por unidose, sejam liquidas ou sólidas, podem conter entre 0,1% e 99% de material bacteriófago.

Numa apresentação preferida, a formulação para utilização como vacina pode ainda compreender um adjuvante. Os adjuvantes em geral compreendem substâncias que reforçam a resposta imunitária do hospedeiro de uma forma não-especifica. Vários adjuvantes diferentes são conhecidos na técnica. Exemplos de adjuvantes podem incluir o adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, lipossomas e niossomas como descrito, por exemplo na WO 90/11092, adjuvantes de emulsão água em óleo minerais e não-minerais à base de óleo, citoquinas, sequências curtas de polinucleótidos imunoestimulantes, por exemplo, em ADN plasmidico contendo dinucleótidos CpG, tal como os descritos por Sato Y. et al. (1996) Science Vol. 273 pp. 352 - 354; Krieg A.M. (1996) Trends in Microbiol. 4 pp. 73 - 77. O bacteriófago pode ainda ser associado aos chamados "veículos". Um veículo é um composto ou substrato ao qual o bacteriófago pode aderir sem ficar ligado covalentemente. Os compostos "veículo" típicos incluem partículas de ouro, partículas de sílica tal como vidro e semelhantes. Deste modo, o bacteriófago para utilização de acordo com a presente invenção pode ser introduzido num organismo utilizando métodos biolísticos, tal como o método de bombardeamento de alta-velocidade, utilizando partículas de ouro revestidas, como descrito na técnica (Williams R.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 pp. 2726 - 2730; 14

Fynan E.F. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA Vol. 90 pp. 11478 - 11482) .

Além disso, a vacina pode incluir um ou vários compostos tensioactivos adequados. O modo de administração da vacina para utilização de acordo com a invenção pode ser qualquer via adequada de administração de uma quantidade imunoprotectora do virus da invenção ao sujeito. No entanto, a vacina é preferivelmente administrada por via parentérica, pelas vias intramuscular ou subcutânea profunda. Outros modos de administração podem também ser empregues quando desejado, tal como vias mucosais (por exemplo, administração rectal, oral, nasal ou vaginal) ou por outras vias parentéricas, isto é intradérmicas, intranasais ou intravenosas. Podem ser desenvolvidas formulações para administração nasal e podem incluir, por exemplo quitosano como adjuvante (Nat. Medicine 5(4) 387-92, 1999).

Subentende-se, contudo, que o nivel especifico da dose para qualquer organismo receptor especifico irá depender de uma variedade de factores incluindo a idade, estado geral de saúde e sexo, tempo de administração, via de administração, efeitos sinergéticos com quaisquer outros fármacos administrados e o grau de protecção pretendido. Evidentemente, a administração pode ser repetida a intervalos adequados se necessário. A presente invenção proporciona ainda a utilização de uma partícula bacteriófaga lambda, Pl, T, Mu, fd, M13 ou filamentosa, cuja superfície não foi modificada para compreender peptídeos/proteínas exógenos na superfície do fago concebido para orientar o fago para receptores na 15 superfície de tipos de células eucariotas específicos, compreendendo a partícula bacteriófaga uma molécula de ácido nucleico exógena codificadora de um polipeptídeo gue é capaz de expressar e apresentar na superfície de uma célula apresentadora de antigénio de um organismo sob o controlo de um promotor eucariota, para a preparação de um fármaco para desencadear uma resposta imunitária profiláctica e/ou terapêutica contra o polipeptídeo exógeno expresso num organismo. A presente invenção proporciona ainda a utilização de uma partícula bacteriófaga lambda, Pl, T, Mu, fd, M13 ou filamentosa, cuja superfície não foi modificada para compreender peptídeos/proteínas exógenos na superfície do fago concebido para orientar o fago para receptores na superfície de tipos de células eucariotas específicos, compreendendo a partícula bacteriófaga uma molécula de ácido nucleico exógena codificadora de um polipeptídeo que é capaz de expressar e apresentar na superfície de uma célula apresentadora de antigénio de um organismo sob o controlo de um promotor eucariota para desencadear uma resposta imunitária profiláctica e/ou terapêutica contra o polipeptídeo exógeno expresso num organismo. A presente invenção passará agora a ser descrita mais detalhadamente, a título de exemplo e com referência às figuras seguintes que mostram: A figura 1 mostra a resposta dos anticorpos em ratinhos vacinados com a vacina à base de bacteriófagos da presente invenção em comparação com vacinação com ADN intramuscular convencional e um controlo; 16 A figura 2 mostra as quantidades relativas de IgG e IgM produzido pelos ratinhos vacinados;

A figura 3 mostra a incorporação e expressão de ADN estranho por macrófagos in vitro; A figura 4 mostra as respostas de anticorpos contra antigénio MmmSC integral em ratinhos vacinados com biblioteca λ-MmmSC. Respostas totais de anticorpos contra extractos de células integrais MmmSC de ratinhos vacinados com biblioteca de expressão lambda MmmSC (ÀMmmSC). As respostas foram medidas com ELISA. As respostas de quatro ratinhos vacinados com ÀMmmSC são apresentadas como linhas ininterruptas. A linha ponteada mostra uma resposta representativa de um rato de controlo.

Os tempos de vacinação são indicados pelas setas (dia 0 e dia 28) ; A figura 5 mostra (A) immunoblot de GFP purificado, sondado com sangramentos finais de ratinhos imunizados com λ-GFP (esquerda; 8 pistas, 1 por ratinho), pEGFP-Cl plasmidico (meio); 6 pistas, 1 por ratinho) e controlo positivo (coelho anti-GFP). Os dois ratinhos restantes, vacinados com pEGFP-Cl foram testados num immunoblot diferente e não revelaram ma resposta contra GFP puro. (B) immunoblot contra proteínas λ com soros do decurso temporal de 3 animais representativos vacinados com λ-GFP (esquerda) ou pEGFP-Cl (direita);

As figuras 6A e 6B mostram macrófagos peritoneais de rato incubados com vacinas de ADN e sondados com anti-soros específicos : A, amplificação ΙΟχ; B, amplificação 40x: i) sem vacina. Sondado com anti-GFP; ii) incubado com ÀBl (gene MmmSC pdh) e sondado com IgG anti-MmmSC; iii) 17

incubado com λ-GFP e sondado com anti-GFP; e iv) incubado com plasmideo pEGFP e sondado com anti-EGFP; E

Figura 7 medição com ELISA de sinal anti-GFP de macrófagos incubados com XEGFP, pEGFP-CI ou um controlo X não expressor (XCI857) . Foram executados três testes em separado para macrófagos incubados com XEGFP (1) ou pEGFP-C1 (2) e são apresentados os valores médios e desvios padrão dos sinais anti-GFP. Foram executados dois testes separados para controlos negativos, estes encontram-se registados individualmente em gráfico. Teste (3) mostra o sinal secundário de apenas anticorpo contra XEGFP, teste esse (4) que mostra o sinal inespecifico dos anticorpos tanto primários como secundários contra as proteínas do bacteriófago 1.

Exemplo 1

Foi construída uma biblioteca de expressão do fago clonando-se fragmentos semi-aleatórios (Tsp5091: cortes em AATT) do genoma da cadeia F38 capripneumoniae (Mccp)da subespécie Mycoplasma capricolum no local EcoRI do vector de expressão que expressa o lambda ZAP (da Stratagene). Este fago contém uma sequência promotora citomegalovírus e um promotor LacZ o que permite que as inserções sejam expressas tanto em células procariotas como em células eucariotas. É provável que a "biblioteca" de ensaio utilizada, baseado no ADN micoplásmico, apresente resultados mais pobres comparativamente com construções mais adequadas, sendo que os resultados obtidos deverão ser interpretados de acordo com este aspecto. É muito possível que uma construção de biblioteca mais adequada faculte respostas 18 muito melhores. 0 ADN micoplásmico é bastante rico em AT (Mccp ADN é 75% AT) . Deste modo, é possível que ocorra uma expressão aberrante a partir de "sequências promotoras do tipo Mccp ricas em AT com uma frequência elevada. Mais ainda, a utilização do codão do ADN micoplásmico não é comum; o codão para triptofano é UGA, o qual é um codão de "paragem" para a maioria dos outros organismos procariotas e eucariotas. Assim, qualquer proteína que contenha triptofano não será expressa devidamente. Para além disso, o exemplo actual é baseado numa biblioteca integral não fraccionada. Esta inclui regiões não codificadoras intergénicas. Mais ainda, apenas 1/6 das inserções apresentarão uma orientação correcta que resultará numa expressão. Por todas estas razões, torna-se claro que a grande maioria das construções na biblioteca resultarão numa expressão não proteica (antigénio) após a vacina "ADN".

Foram desenvolvidas culturas em grande escala do fago em placas de agar, foram colhidas e as partículas do fago purificadas e concentradas por meio de uma combinação de precipitação com polietilenoglicol e ultracentrifugação (Sambrook J, et al. 1989, Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.I.). Metade da suspensão do fago foi directamente utilizada para inocular um grupo de ratinhos (vacina ADN de "Fago"). 0 ADN foi extraído da outra metade da suspensão de fago e utilizada para inocular um segundo grupo de ratinhos (vacina ADN sem histona).

Dezasseis ratinhos foram injectados por via intramuscular com 25 μΐ de fago contendo a biblioteca F38 clonada em 4xlOn partículas/ml misturada com 25 μΐ de 19 adjuvante montanide ISA 206. Uma amostra deste imunogénio foi titulada e plateada numa camada de E.Coli para assegurar que a adição de montanide não danificou, de modo algum, as partículas do fago. Um segundo grupo de dezasseis ratinhos foi igualmente injectado com 0,5 pg do ADN extraído (equivalente à quantidade de ADN contido dentro da injecção total de fago) num volume total de 50 μΐ de tampão SM. O ADN foi purificado utilizando preparações de lambda Wizard (Promega). Um grupo de 8 ratinhos foi injectado com o fago C1857 purificado na forma descrita para a biblioteca fago. Este é igualmente um fago lambda e foi utilizado como um controlo negativo.

Os ratinhos foram pré-sangrados antes de serem inoculados no dia 0. No dia 34 foi administrada uma injecção de reforço idêntica. No dia 27, os ratinhos foram desafiados com miclopasma total antes de serem sangrados no dia 83. Foram realizados sangramentos de ensaio todas as duas semanas até se concluir a experiência. As amostras foram testadas com o teste ELISA em comparação com células integrais de estirpes F38 de Mycoplasma capricolum. Não se registou resposta significativa, tanto no grupo de controlo ADN sem histona como no grupo fago de controlo negativo (cl857), até se administrar a injecção final que continha as células totais. Por outro lado, os ratinhos inoculados com a biblioteca fago apresentaram uma resposta positiva significativa antes da administração da injecção final (Figura 1). Para além disso, a quantidade relativa de diferentes subtipos de imunoglobulina presentes no sangramanto final foi também examinada. Descobriu-se que nos ratinhos vacinados com a biblioteca fago, a concentração relativa de IgG para IgM era 20 significativamente superior (Figura 2). Níveis elevados de IgG são indicadores de uma resposta secundária enquanto IgM é indicador de uma resposta primária.

Exemplo 2 A absorção de partículas fago directamente por células apresentadoras de antigénio foi também examinada. Neste exemplo, não foi utilizada toda a biblioteca λ Mccp. Em vez disso, foi colhido um clone fago, o qual apresentou uma boa resposta positiva contra anti-soro Mccp policlonal do coelho quando plateado em E. Coli (expressão de proteína foi induzida utilizando IPTG). O clone foi amplificado e purificado. O ADN foi igualmente extraído deste fago como anteriormente descrito. As amostras de ADN e partículas totais de fago deste clone foram adicionadas a culturas de macrófagos peritoniais de ratinho. Para extracção do macrófago, foram injectados 2 ratinhos por via intraperitoneal com 2 ml de um meio tioglicolato. 5 dias depois os ratinhos foram mortos e a cavidade peritoneal lavada com 2 ml de solução salina de magnésio/cálcio livre tamponada de Hanks (HB-SS). Estas células extraídas foram peletizadas e lavadas duas vezes em HBSS e foi efectuada uma contagem viável na presença de azul de tripano. Foram incubados 106 macrófagos a 37°C em 1 ml de RPMI contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) durante 2 horas em placas de microtitulação de 24 poços, de modo a permitir a sua aderência. O sobrenadante que continha células não aderentes foi removido e foi adicionado meio fresco. Foram adicionadas 108 partículas de fago deste clone particular a um poço e 50 ng de ADN foi extraído deste clone e adicionado a um meio fresco e colocado em cultura de um dia 21 para o outro a 37°C. Os fagos que não continham inserção e extracção de ADN destes fagos "sem inserção" foram utilizados como controlo negativo.

Após incubação, os macrófagos foram colocados a 4°C para se separarem da placa de microtitulação, antes de serem colhidos e lavados em HBSS. 105 células foram, posteriormente, centrifugadas numa lamela de vidro e foi produzida um cytostain utilizando anti-soro Mccp ploclonal de coelho. Foi utilizada a fracção IgG purificada. Este anti-soro não foi mais purificado (isto é, foi um soro polivalente desenvolvido contra o Mccp, pelo que reconhece uma vasta série de proteínas Mccp e de outros contaminantes. Como tal, é provável que o sinal que assinala a variação seja bastante inferior ao esperado para um soro monovalente ou para um anticorpo monoclonal desenvolvido contra um clone particular sob investigação). Foi utilizado um anticorpo biotinilado secundário (imunoglobulina total de cabra ou coelho) em conjunto com um sistema baseado em DAB avidina/biotina/peroxidase DAB para se visualizar a proteína expressa.

Embora se tenham observado grandes antecedentes (provavelmente devido ao uso de um anticorpo primário policlonal não específico e ao uso de um anticorpo secundário desenvolvido contra a imunoglobulina total de coelho em vez da fracção IgG), foi observada uma coloração específica mais intensa nas culturas celulares adicionadas com o fago que contém a inserção comparativamente aos controlos negativos (Figura 3).

Exemplo 3 22

Foi testada uma biblioteca de expressão diferente e foram examinadas condições de vacinação modificadas. Foi construída uma biblioteca de expressão de fago clonando-se fragmentos semi-aleatórios (Tsp5091: cortes em AATT) do genoma de Mycoplasma mycoides da subespécie mycoides, biotipo small colony (MmmSC), estirpe T144 no local EcoRI do vector de expressão de lambda ZAP. 0 sistema vector, procedimento de clonagem e purificação do fago seguido foi semelhante ao descrito no exemplo 1 embora tenham ocorrido algumas diferenças no procedimento durante a fase de vacinação (via de administração, presença de adjuvante, programa de imunização). Foram testados dez ratinhos por grupo (estirpe BALB/C, especificamente isentos de agentes patogénicos, idade 10 a 12 semanas). Ratinhos foram injectados por via subcutânea (sem adjuvante) com 50 μΐ de fago contendo a biblioteca MmmSC a 1,7 x 1011 partículas por ml. Os ratinhos de controlo não foram injectados. Os ratinhos foram pré-sangrados antes de serem vacinados no dia 0. No dia 28 foi administrada uma injecção de reforço idêntica. Os sangramentos experimentais foram realizados nos dias 0, 21 e 42. As amostras foram testadas com o teste ELISA contra s de células integrais sonicadas da estirpe MmmSC T144. 0 em 10 ratinhos de controlo (não imunizados) revelaram uma resposta imunitária. Dois em 10 ratinhos imunizados com a biblioteca de expressão MmmSC integral revelaram uma resposta imunitária significativa, enquanto dois outros revelaram uma resposta inferior (figura 4).

Exemplo 4

Uma construção de ADN expressora de um antigénio específico (proteína fluorescente verde [GFP] foi utilizada para vacinar ratinhos e mediu-se a resposta imunitária. O 23 antigénio de vacina foi apresentado ao sistema imunitário como ADN plasmidico purificado pEGFP-Cl (ADN sem histona) ou vacina GFP bacteriófago (λ-GFP). Foi construído X-GFP a partir do plasmídeo pEGFP-Cl (Clonetech, refa. Catálogo 6084-1) e NM459 (obtido junto de Noreen Murray). NM459 é um derivado cl857 nin da construção do fago XII de: Murray e Murray (1974) . A manipulação e a restrição marcam no fago λ para orientar cromossomas receptores para fragmentos de ADN. Nature, 251 p476-481.

Foi digerido ADN pEGFP-Cl com EcoRI e a enzima foi termicamente inactivada antes da extracção com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico e precipitação com etanol. 0 ADN NM459 foi também extraído e digerido com EcoRI. A enzima de restrição foi então inactivada termicamente e o fragmento foi desfosforilado (com fosfatase alcalina intestinal de vitela) para prevenir a auto-ligação durante as fases seguintes. Esta enzima foi igualmente termicamente inactivada e o ADN foi extraído com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico e precipitação com etanol. Estes fragmentos foram então ligados e o ADN clonado foi disposto in vitro utilizando um sistema de disposição de ADN Promega Packagene Lambda (N° Cat. K3154).

Depois da disposição 6 clones foram tomados das placas de LB-agar. Estes foram amplificados, o ADN foi extraído e digerido com EcoRI para confirmar a presença da inserção. Um destes clones foi depois amplificado a uma escala mais ampla e foram preparados caldos concentrados para vacinação de ratinhos.

Os ratinhos eram estirpe C57, 8 a 10 semanas de idade, 8 ratinhos por grupo. O grupo 1 foi injectado por via 24 intramuscular no dia 0 e dia 14 com 1 μg de ADN plasmidico (pEGFP-Cl) em 0,1 ml de tampão T.E. O grupo 2 foi injectado por via intramuscular no dia 0 e no dia 14 com 50 μΐ de λ-GFP a 1011 partículas por ml. Os ratinhos foram sangrados no dia 0 (antes da vacinação) , dia 14 (antes da segunda vacinação) e dia 28. As amostras foram testadas por immunoblot para detectar uma resposta imunitária específica do tamanho contra GFP recombinante, obtido junto da Clontech, No. Cat. 8360-2 (figura 5A) ou proteínas λ do bacteriófago (figura 5B). Dois em 8 ratinhos vacinados com λ-GFP revelaram uma forte resposta imunitária contra GFP no dia 28 (figura 5A) . Outro ratinho revelou uma resposta no dia 14 que tinha desaparecido no dia 28 (dados não apresentados), é possível que tenha havido mistura das amostras do dia 14 e do dia 28 deste ratinho. Do grupo vacinado com o plasmídeo pEGFP-Cl, apenas 1 animal revelou uma resposta contra GFP. O sinal era muito mais fraco do que o sinal observado nos dois animais positivos que tinham sido vacinados com λ-EGFP. Todos os ratinhos vacinados com λ-RGFP revelaram uma forte resposta imunitária contra as proteínas do bacteriófago λ nos dias 14 e 28, enquanto nenhum dos ratinhos vacinados com o plasmídeo pEGFP-Cl revelou uma resposta (figura 5B) . São apresentados apenas os sangramentos de alguns animais uma vez que foram observados resultados idênticos com todos os animais dos dois grupos).

Exemplo 5 A absorção de partículas fago directamente por células apresentadoras de antigénio foi também examinada. O plasmídeo pEGFP-Cl foi também testado como controlo. Para esta experiência testou-se λ-GFP (descrito no exemplo 3) e 25 outra construção, ABI. ÀBl foi isolado da biblioteca de expressão MmmSC λ descrita no exemplo 3. ÀBl continha gene piruvado desidrogenase (pdh) de MmmSC (codificador de uma proteína de 55 kD) e vários outros quadros de leitura aberta não-identifiçados. Quando este clone foi excisado como um plasmídeo e transformado em Escherichia coli, foram identificadas duas proteínas quando estes extractos de células foram aplicados em géis de SDS-PAGE, transferidos para nitrocelulose e sondados com anti-soro hiperimune de coelho contra MmmSC. Os pesos moleculares destas duas proteínas foram 55kD e 29 kD e não foram observados com a utilização de extractos de Escherichia coli de controlo (contendo apenas o plasmídeo sem a inserção pdh) ou quando os extractos contendo o plasmídeo pdh de Escherichia coli com anti-soro de coelho de controlo.

As amostras de ADN plasmídico e partículas totais de fago destes clones foram adicionadas a culturas de macrófagos peritoniais de ratinho. Para extracção dos macrófagos, foram injectados 2 ratinhos por via intraperitoneal com 2ml de um meio tioglicolato. Cinco dias depois os ratinhos foram mortos e a cavidade peritoneal lavada com 2ml de solução salina de magnésio/cálcio livre tamponada de Hanks (HBSS). Estas células extraídas foram peletizadas e lavadas duas vezes em HBSS e foi efectuada uma contagem viável na presença de azul de tripano. Foram incubados 106 macrófagos a 37°C em 1 ml de RPMI isento de soro durante 2 horas em placas de microtitulação de 24 poços, de modo a permitir a sua aderência. 0 sobrenadante que continha células não aderentes foi removido, as células aderentes foram lavadas por duas vezes em PBS a 37°C e adicionou-se 1 ml de RPMI contendo 10% de soro fetal de 26 bovino (FBS). 109 partículas de fago dos clones λ-GFP e λΒΙ foram adicionadas a poços individuais ou, em alternativa, foram adicionados 100 ng de plasmídeo purificado pEGFP-Cl em tampão T.E. As células foram cobertas com meio fresco e foram cultivadas de um dia para o outro a 37°C.

Após incubação, os macrófagos foram colocados a 4°C durante 1 h para permitir que se separassem da placa de microtitulação, antes de serem colhidos e lavados em HBSS. 5xl05 células foram, então, centrifugadas numa lamela de vidro e foi produzida um cytostain utilizando anti-soro MmmSC policlonal de coelho, diluição 1:1000 em PBS (IgG purificado fraccionado) ou anti-soro policlonal GFP de coelho, diluição 1:500 (obtido junto da InVitrogen, Cat. No. R970-01). Nenhum do anti-soro foi purificado por afinidade contra GFP ou o produto do gene pdh MmmSC e, por conseguinte, pode-se esperar que produza um fundo relativamente elevado. Foi utilizado um anticorpo biotinilado secundário (imunoglobulina total de cabra anti-coelho) em conjunto com um sistema à base de DAB avidina/biotina/peroxidase para se visualizar a proteína expressa.

Embora se tenham observado alguns sinais de fundo (provavelmente devido ao uso de um anticorpo primário policlonal não específico e ao uso de um anticorpo secundário desenvolvido contra a imunoglobulina total de coelho em vez da fracção IgG), foi observada uma coloração específica mais intensa nas culturas celulares adicionadas com o fago que contém a inserção (GFP e Bl) comparativamente aos controlos negativos (Figura 6A a amplificação lOx e figura 6B, amplificação 40x). A coloração foi mais evidente com placas de cor devido à 27 diferença de sinal entre a coloração castanha especifica do sistema peroxidase/DAB observada com um sinal positivo em comparação com a coloração violeta geral dos macrófagos. Para confirmar que a coloração não se ficou a dever à ligação do anti-soro às partículas bacteriófago lambda de ADN pEGFP-Cl que foram adicionadas ao macrófago antes da visualização realizou-se a experiência seguinte. Partículas de fago (109) ou ADN plamídico pEGFP-Cl (500 ng ng) foram coloridas sobre um filtro de nitrocelulose e incubadas com o mesmo anti-soro primário e secundário nas experiências reveladas nas figuras 6A e 6B. Depois de reveladas utilizando o mesmo procedimento não se observou qualquer coloração, indicando que qualquer sinal observado nas figuras não se ficou a dever a ligação não-específica do anti-soro seja para o bacteriófago λ como para o ADN plasmídico.

Exemplo 6 A absorção de partículas fago e expressão do antigénio vacina directamente por células apresentadoras de antigénio foi também examinada utilizando um sistema ELISA quantitativo. Para esta experiência testou-se h-GFP (descrito nos exemplo 4 e 5) e pEGFP-Cl plasmídico. Uma construção bacteriófaga λ não-expressora padrão foi também testada como controlo negativo (X-cl857). Macrófagos (como descrito no exemplo 4) foram removidos do azoto líquido, lavados por duas vezes em meio RPMI isento de soro/antibiótico, ressuspensos no mesmo meio e adicionaram-se 106 células por poço aos poços de uma placa de cultura de 96 poços. Os macrófagos foram depois incubados a 37 °C durante 2 horas para permitir as células aderirem antes de se remover o meio e adicionou-se 100 μΐ de RPMI fresco 28 (contendo 10% de soro fetal de bovino + antibióticos) a cada poço. Adicionaram-se 109 fagos (XEGFP ou controlo negativo X-cl857) ou 50 ng de ADN pEGFP-Cl por poço experimental. A placa experimental foi depois incubada a 37°C de um dia para o outro com 5% de C02.

Após a incubação, os poços foram lavados quatro vezes em PBS e foi medida a produção de antigénios com ELISA utilizando um sistema de detecção biotina/avidina Vector labs ABC (Cat. No. PK-6200). O anti-soro primário foi coelho anti-GFP (InVitrogen). Quantificou-se anticorpo secundário ligado utilizando comprimidos de cloridrato de o-fenilenodiamina SIGMA (No. Cat. P-9187). Os resultados foram lidos nas placas de cultura a 492nm e encontram-se na figura 7. O valor de ELISA médio observado para macrófagos que receberam λ EGFP foi 2,03 ± 0,25, significativamente maior que o observado para macrófagos que receberam pEGFP-C1 (valor médio 1,54 ± 0,08, p <0,05). O valor observado com pEGFP-Cl não era evidentemente superior ao observado com os dois testes de controlo negativo, embora seja impossível uma comparação estatística uma vez que estes apenas foram realizados em duplicado. 29

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista das referências citadas pelo requerente serve apenas para conveniência do leitor. Não faz parte do documento da patente europeia. Apesar da compilação cuidadosa das referências, os erros ou as omissões não podem ser excluídos e o IEP rejeita toda a responsabilidade a este respeito.

Documentos de patente citados na descrição: WO 9805344 A [0006] [0015] US 5736388 A [0007] [0015] US 6054312 A [0008] [0015] WO 9955720 A [0009] [0015] WO 9011092 A [0031]

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Lisboa, 28/07/2010

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Formulação compreendendo uma partícula de bacteriófago lambda, Pl, T, Mu, fd, M13 ou filamentosa, cuja superfície não foi modificada para compreender peptídeos/proteínas exógenos na superfície do fago concebido para orientar o fago para receptores na superfície de tipos de células eucariotas específicos e um respectivo veículo farmaceuticamente aceitável, compreendendo a partícula de bacteriófago uma molécula de ácido nucleico exógena codificadora de um polipeptídeo que é capaz de expressar e apresentar na superfície de uma célula apresentadora de antigénio de um organismo sob o controlo de um promotor eucariota para utilização no desencadear de uma resposta imunitária profiláctica e/ou terapêutica contra o polipeptídeo exógeno codificado pela molécula de ácido nucleico exógena, num organismo.

2. Formulação de acordo com a reivindicação 1 para utilização como vacina.

3. Formulação de acordo com as reivindicações 1 ou 2, que é capaz de desencadear uma resposta imunitária humoral e/ou celular.

4. Formulação de acordo com a reivindicação 2 ou 3 para utilização em vacinação contra um vírus, bactéria, 2 fungo, levedura, protozoário, helminta, insecto ou encefalopatia espongiforme transmissível.

5. Formulação de acordo com gualguer uma das reivindicações 1 a 3 para utilização no desencadear de uma resposta imunitária contra uma célula cancerosa mediante a expressão de um antigénio específico de uma célula cancerosa.

6. Formulação de acordo com qualquer um das reivindicações precedentes, em que o bacteriófago compreende reguladores transcricionais e/ou traducionais para facilitar a expressão do polipeptídeo.

7. Formulação de acordo com a reivindicação 6 compreendendo um promotor eucariota, tal como o promotor CMV, SV40, timidina quinase ou RSV.

8. Formulação de acordo com a reivindicação 6, que compreende o ácido nucleico exógeno sob controlo de um promotor constitutivo e de um promotor controlável.

9. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o bacteriófago é capaz de expressar cópia única ou cópias múltiplas de um polipeptídeo ou uma pluralidade de polipeptídeos. 3

10. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o bacteriófago é abortivo em relação ao desenvolvimento lítico na flora bacteriana natural do hospedeiro mamífero escolhido.

11. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda inibidores do catabolismo enzimático lisossomai/endossomai e/ou sinais de localização nuclear. . Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes compreendendo ainda uma quantidade do bacteriófago. polipeptídeo a ser expresso pelo

13. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o bacteriófago foi modificado para expressar um polipeptídeo na superfície da partícula do fago, não sendo o polipeptídeo mencionado concebido para orientar o fago para receptores na superfície de tipos de célula eucariota específicos.

14. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o ácido nucleico exógeno codifica também um polipeptídeo capaz de aumentar a resposta imunitária. 4 . Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes compreendendo ainda um adjuvante. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o bacteriófago está associado a um veículo. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes para utilização na profilaxia e/ou tratamento de uma doença num ser humano ou animal.

18. Utilização de uma partícula de bacteriófago lambda, Pl, T, Mu, fd, M13 ou filamentosa, cuja superfície não foi modificada para compreender peptídeos/proteínas exógenos na superfície do fago concebido para orientar o fago para receptores na superfície de tipos de células eucariotas específicos, compreendendo a partícula de bacteriófago uma molécula de ácido nucleico exógena codificadora de um polipeptídeo que é capaz de expressar e apresentar na superfície de uma célula apresentadora de antigénio de um organismo sob o controlo de um promotor eucariota, para a preparação de um medicamento para desencadear uma resposta imunitária profiláctica e/ou terapêutica contra o polipeptídeo exógeno expresso num organismo.

19. Partícula de bacteriófago lambda, Pl, T, Mu, fd, M13 ou filamentosa, cuja superfície não foi modificada para 5 compreender peptídeos/proteínas exógenos na superfície do fago concebido para orientar o fago para receptores na superfície de tipos de células eucariotas específicos, compreendendo a partícula de bacteriófago uma molécula de ácido nucleico exógena codificadora de um polipeptídeo que é capaz de expressar e apresentar na superfície de uma célula apresentadora de antigénio de um organismo sob o controlo de um promotor eucariota, para a preparação de um medicamente para desencadear uma resposta imunitária profiláctica e/ou terapêutica contra o polipeptídeo exógeno expresso num organismo.

20. Utilização de partícula de bacteriófago de acordo com as reivindicações 18 ou 19, em que a resposta imunitária se destina à vacinação do organismo. Lisboa, 28/07/2010