KR102066850B1

KR102066850B1 - 세균 고스트의 제조 방법 및 세균 고스트 제조용 벡터

Info

Publication number: KR102066850B1
Application number: KR1020170122192A
Authority: KR
Inventors: 이존화; 원가연
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2017-09-22
Filing date: 2017-09-22
Publication date: 2020-01-16
Also published as: KR20190033708A

Abstract

본원은, 박테리오파지의 홀린(holin) 유전자, 엔도라이신(endolysin) 유전자 및 Rz 유전자를 포함하는 카제트(cassette)를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 고스트 백신 균주, 이의 제조를 위한 벡터, 이를 포함하는 조성물 및 세균 고스트 제조 방법에 관한 것이다.

Description

세균 고스트의 제조 방법 및 세균 고스트 제조용 벡터 {METHOD FOR PRODUCING BACTERIAL GHOST AND VECTOR FOR PRODUCING BACTERIAL GHOST}

세균 고스트(Bacterial ghost, BG) 제조 기술은 광범위한 감염성 질병에 대한 안전하고 효과적인 불활화 백신 생산에 대한 혁신적인 접근방식이다. G(-) 박테리아에서의 PhiX174 용해 유전자 E의 발현은 세포질을 관통하는 막투과성 터널의 형성을 이끌고, 이를 통해 세포질이 빠져나가 외막, 주변 세포질 공간(periplasmic space) 및 내막만이 남는다. 그 결과 형성되는 세균 고스트는 병원성을 가지지 않으면서도 세포 표면의 모든 기능적, 형질적 그리고 면역적인 결정인자를 포함하고, 효과적인 면역 방어로 이어지는 세포성, 체액성 면역을 유도할 수 있다. 이러한 세균 고스트에는 필리(pili)와 같은 고도로 민감하고 약한 구조물들은 보존되어 있고, 용해 터널의 형성은 오직 전체 세포 표면 중 극히 일부분으로 제한된다. 용해 유전자 E에 의한 용해는 화학적 또는 물리적으로 박테리아 표면 구조를 훼손시키지 않고, 그 결과 제조된 고스트는 그들의 기생상대의 표면상 기능적, 항원적 결정인자를 공유함으로써 향상된 면역력을 유도할 수 있다.

이와 같이 PhiX174 용해 유전자 E를 조절하여 병원성 그람음성 세균을 불활성화하는 방식은 전염성 질병에 대한 유망한 새로운 백신기술로 주목되고 있으나, 고스트 카세트를 가지는 살모넬라 균주는 용해 유전자 E를 이용한 고스트화시 대부분의 세포가 생존하는 문제가 있었다. 따라서, 이와 같은 문제점을 해결하여 효율적으로 안전한 고스트화 백신을 제조하기 위한 신규한 방법의 개발이 요구되었다.

대한민국 공개특허 제2014-0117787호

종래 PhiX174 용해 유전자 E를 포함하는 플라스미드를 이용해 살모넬라 고스트를 제조하는 방법들이 발표된 바 있으나, E 유전자의 용해능에 편차가 있었으며 특히 고스트 카제트를 유지하는 살모넬라 균주는 고스트화를 유도시 많은 세포들이 생존하는 결과가 나타났다. 이에, 신규한 고스트 백신 제조 시스템의 개발을 위해, λ(람다) 박테리오파지에서 유래한 홀린-엔도라이신 시스템을 이용한 고스트 카제트를 제공하고자 하였다.

그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본원의 제 1 측면은, 프로모터; 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 박테리오파지의 홀린(holin) 유전자, 엔도라이신(endolysin) 유전자 및 Rz 유전자를 포함하는 카제트(cassette)를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 고스트 백신 균주를 제공할 수 있다.

본원의 제 2 측면은, 프로모터; 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 박테리오파지의 홀린 유전자, 엔도라이신 유전자 및 Rz 유전자를 포함하는 카제트를 포함하는 세균 고스트 제조용 벡터를 제공할 수 있다.

본원의 제 3 측면은, 본원의 제 2 측면의 벡터를 포함하는 세균 고스트 제조용 조성물을 제공할 수 있다.

본원의 제 4 측면은, 본원의 제 1 측면의 고스트 백신 균주를 상기 프로모터를 작동시키는 조건하에서 배양하여 균주의 고스트화를 유도하는 것을 포함하는 세균 고스트 제조 방법을 제공할 수 있다.

상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 구현예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 기재된 추가적인 구현예 및 실시예가 존재할 수 있다.

본원발명에 따르면, 종래 사용되어온 용해 유전자 E 대신에 또는 추가적으로 박테리오파지 유래의 고스트 카제트를 세균에 형질전환함으로써, 기존의 고스트 백신보다 향상된 면역원성을 유도할 수 있고 접종 대상에게도 안전한 신규 고스트 백신 균주를 제공할 수 있다. 상기 고스트 카제트는 그람 음성 및 그람 양성 세균 모두에 적용이 가능하며, 또한 종래의 용해 유전자 E를 사용하는 경우에 비해 보다 효율적이고 안정적으로 세균을 고스트화하는 것이 가능하다.

도 1은 본원의 일 구현예에 따른 세균 고스트 제조용 플라스미드의 구조를 나타낸 개략도이다.
도 2는 본원의 일 구현예에 따른 세균 고스트 제조용 플라스미드의 제작 방법을 나타낸 개략도이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 살모넬라 고스트 백신 균주의 주사전자현미경 이미지이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 살모넬라 고스트 백신 균주의 고스트화 속도를 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 살모넬라 고스트 백신 균주에서의 용해유전자 발현을 확인할 수 있는 SDS-PAGE (왼쪽) 및 면역블롯 (오른쪽) 이미지이다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 살모넬라 고스트 백신을 이용해 면역화된 생쥐에서의 면역글로불린 역가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 살모넬라 고스트 백신을 이용해 면역화된 생쥐에서의 면역글로불린을 정량하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 살모넬라 고스트 백신을 이용해 면역화된 생쥐에서의 IL-4 사이토카인 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 살모넬라 고스트 백신을 이용해 면역화된 생쥐에서의 세포매개성 면역 지표를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 10은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 살모넬라 고스트 백신을 이용해 면역화된 생쥐에서의 도전 감염후의 생존율을 나타낸 그래프이다.

아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.

이하, 본원의 고스트 백신 균주, 세균 고스트 제조용 벡터, 이를 포함하는 세균 고스트 제조용 조성물 및 세균 고스트 제조 방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.

본원의 제 1 측면은, 프로모터; 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 박테리오파지의 홀린(holin) 유전자, 엔도라이신(endolysin) 유전자 및 Rz 유전자를 포함하는 카제트(cassette)를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 고스트 백신 균주에 관한 것이다.

상기 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 생성물을 의미한다. 상기 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직할 수 있으며, 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점 (복제 원점, replication origin), (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 선별 표지 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 포함할 수 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

PhiX174 용해 유전자 E를 이용한 그람 음성 세균의 고스트화 방법은 전염성 질병에 대한 유망한 새로운 백신기술로 주목받았으나, 살모넬라 균주에 사용될 경우 세포의 고스트화 효율이 높지 않아 많은 세포가 생존하는 문제가 있었다. 이에 본원에서는, 용해 유전자 E의 용해 기능을 대체하거나 도와줄 수 있는 홀린-엔도라이신 시스템(Holin-Endolysin system)을 이용한 고스트 카제트를 이용하였다.

상기 홀린-엔도라이신 시스템에 사용되는 고스트 카제트를 포함하는 플라스미드의 구조가 도 1에 나타나 있다. R 유전자로부터 발현되는 엔도라이신은 박테리오파지(Lambda phage)의 용균 생활사의 마지막 단계에서 숙주의 세포벽을 분해하기 위해 박테리오파지에 의해 만들어지는 효소이다. 박테리오파지 SPN1S의 유전자 서열로부터 박테리오파지의 용해 단백질인 홀린, 엔도라이신 및 보조 단백질 Rz/Rz1와 유사한 유전자를 발견하였다. 이들 유전자는 홀린 단백질을 발현하여 세균의 내막(inner membrane)에 통로를 형성하고 그 사이로 빠져나간 엔도라이신은 세포벽의 펩티도글리칸 층에 작용하는 용해요소인 트랜스글리코실라제(transglycosylase)를 발현시켜 세포벽을 용해한다. Rz 유전자는 그 기능이 아직 정확히 밝혀지지는 않았지만 이 단백질들의 숙주 세균 용해능을 측정한 결과 일반적인 용해 단백질의 특성과 달리 홀린과 엔도라이신의 발현만으로는 숙주가 용해되지 않고 세 개의 단백질 모두 (S+R+Rz)가 발현되거나 엔도라이신과 보조 단백질 Rz/Rz1가 함께 발현될 때에만 숙주의 성장이 저해되었다. 세 개의 단백질 모두 알려진 단백질과는 상동성이 없으며, 엔도라이신은 S 유전자에 의해 발현되는 홀린과 함께 작용할 때에 강한 용해 활성을 보였다. 이와 같이 S+R+Rz 유전자로 구성된 용해 유전자들을 기존의 고스트 카제트(Ghost cassette)에 도입하고, 이와 같은 신규 용해 유전자들을 통칭하여 R 카제트라 명명하였다.

프로모터로는 기존의 PhiX174 용해 유전자 E 조절자인 집중 프로모터 시스템(convergent promoter system)을 그대로 사용할 수 있다. 종래의 용해 유전자 E는 센스 λPR 및 안티센스 ParaBAD 프로모터 사이에 배치시켰는데, 이는 L-아라비노스 존재하에서 λPR 프로모터가 28℃에서 용해 유전자의 전사가 ParaBAD 프로모터로부터 발현된 안티센스 RNA에 의해 억제되는 원리이다. R 카제트와 기존의 용해 유전자 E를 함께 포함하고 있는 RE 플라스미드 및/또는 R 카제트만 포함하는 R 플라스미드 모두가 본원의 고스트 백신 균주의 제조에 사용될 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결된 용해 유전자 E를 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 "용해 유전자 E"는 세포 용해 유전자 또는 유전자 E라고도 지칭되며, 세균(예를 들어, 대장균)의 외막에 터널을 구성하여 구멍을 내서 세포 내 핵산성분을 빼내어 용해(lysis)시키는 역할이 있다는 사실이 알려져 있으며, 용해 유전자 E에 의한 세포 용해의 결과 핵산 성분을 포함한 모든 세포 내용물이 세포 외부로 유출되고, 외막(outer membrane), 주변 세포질 공간(periplasmic space) 및 내막(inner membrane)만이 남게 된다. 이는 세균 고스트 백신으로 사용될 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 균주는 asd(aspartate-semialdehyde dehydrogenase) 유전자가 결실된 균주이고, 상기 벡터가 asd 유전자를 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 asd 유전자는 세포벽 합성에 있어서 펩티도글리칸의 크로스연결에 관여하는 DAP(diaminopimellic acid) 합성의 개시지점에 관련된 효소로, DAP가 결핍된 배지에서 asd 유전자 결핍주에 asd 유전자의 도입 여부를 확인할 수 있어 유용한 플라스미드의 선택표지로 사용될 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 균주는 그람 음성 세균 또는 그람 양성 세균일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

용해 유전자 E는 세포벽의 구성 성분인 펩티도글리칸 층을 공격하여 붕괴시켜 세포를 불활성화시키는데, 그람 음성균은 그람 양성균에 비해 펩티도글리칸 층이 얇기 때문에 용해 유전자 E에 의해 분해되기 용이하나, 펩티도글리칸 층이 두꺼운 그람 양성균은 용해 유전자 E에 의해 분해되기 어려웠다. 반면 본원발명에 따라 홀린-엔도라이신 시스템을 이용할 경우 용해 단백질의 크기가 클 뿐더러 두 가지 용해 단백질이 연속으로 발현하여 펩티도글리칸 층을 분해하기 때문에 용해 유전자 E에 비해 더욱 효율적으로 펩티도글리칸층을 용해시킬 수 있고, 따라서 상대적으로 두꺼운 펩티도글리칸 층을 지닌 그람 양성균까지 고스트화시킬 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 균주는 살모넬라 종 (Salmonella spp.)일 수 있고, 예를 들어 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 타이피뮤리움 및 살모넬라 갈리나룸으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 제 2 측면은, 프로모터; 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 박테리오파지의 홀린 유전자, 엔도라이신 유전자 및 Rz 유전자를 포함하는 카제트를 포함하는 세균 고스트 제조용 벡터에 관한 것이다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결된 용해 유전자 E를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 용해 유전자 E는 상기 카제트와 동일한 프로모터에 의해 조절될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원발명의 세균 고스트 제조용 벡터는 임의의 세균, 즉 그람 양성 세균 또는 그람 음성 세균 내로 형질전환됨으로써 고스트 백신 균주를 생성할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 벡터는 asd 유전자를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 제 3 측면은, 본원의 제 2 측면의 벡터를 포함하는 세균 고스트 제조용 조성물에 관한 것이다.

본원의 제 4 측면은, 본원의 제 1 측면의 고스트 백신 균주를, 상기 프로모터를 작동시키는 조건하에서 배양하여 균주의 고스트화를 유도하는 것을 포함하는 세균 고스트 제조 방법에 관한 것이다.

예를 들어, 벡터가 CI857 프로모터와　pARABAD 프로모터를 포함한 경우 약 0.2% 아라비노스를 첨가한 배지에서 약 42℃에서 균주를 배양함으로써 고스트 카제트를 작동시켜 균주의 고스트화를 유도할 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 사용되는 프로모터, 인핸서 및/또는 리프레서와 같은 요소들의 작동 조건에 따라 통상의 기술자가 세균 배양 조건을 설정할 수 있다.

본원발명에 따른 세균 고스트를 이용하여 백신 조성물을 제조할 수 있다. 이 경우, 세포 용해 과정을 수행한 상기 세균 고스트를 완충용액에 현탁하여 사용할 수 있다. 상기 세균이 살모넬라인 경우, 상기 백신 조성물은 고스트살모넬라증에 감수성이 있는 가축의 예방 백신으로서 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 백신 조성물의 투여량은 일반적으로 개체당 고스트화 세포 약 1x10² cfu 내지 약 1x10¹⁰ cfu, 예를 들어 약 1x10⁵ cfu 내지 약 1x10¹⁰ cfu가 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 면역 복용량은 투여 경로에 따라 변화하며 바람직하게는 경구, 비내 또는 비경구 경로를 통해 투여될 수 있다.

본원발명의 백신 조성물은 수의학 종들, 구체적으로는 가축들을 면역화시키기에 더욱 적합할 수 있다.

상기 세균이 살모넬라인 경우, 살모넬라증에 대항하여 면역화되어야 할 수의학 종들의 예는 가금, 작은 가축 또는 육중한 가축, 예를 들면 닭, 칠면조, 오리, 메추라기, 뿔닭(guinea fowl), 돼지, 양, 어린 송아지, 소 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않을 수 있다. 면역량은 이 동물들에게, 예를 들어 경구, 비내 또는 비경구적 경로를 통해 투여될 수 있다.

상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 서브바이랄 (subviral) 입자 보조제, 콜레라독소, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 애쥬번트를 추가로 함유할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

또한, 상기 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기에서 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 드립 (drip) 또는 스프레이 등의 비강용 제형 그리고 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들어 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 비강내 투여를 위한 제제에 적합한 침투제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 적합한 제형물은 안정성과 순응도를 위해 바람직하게 무균, 등장 및 완충되도록 제형화된다. 비강내 투여를 위한 제제는 또한 정상적인 섬모 작용을 유지시키기 위해 점액 분비를 여러 측면에서 자극하도록 제조되며, 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(1990))에 기술된 바와 같이, 적합한 제형이 바람직하게 등장성의, pH 5.5 내지 6.5를 유지하는 약간 완충된 제형이며, 가장 바람직하게 항미생물 방부제 및 적합한 약물 안정화제를 포함할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

1. 실험 방법

1.1. 고스트 플라스미드 제작 및 세균 배양 조건

본 실시예에서 사용된 균주와 플라스미드는 아래의 표 1에 나타나 있다.

또한, 플라스미드 제조에 사용한 홀린-엔도라이신 시스템 서열 (서열목록 1) 및 용해 유전자 E의 서열 (서열목록 2)이 아래의 표 2에 나타나 있다.

전체 nt 45186에서 nt 46541까지 총 1433 bp의 R 고스트 카제트가 합성되었다. 카제트의 5'에는 XbaI (TCTAGA)가, 3'에는 BamHI 제한효소 서열이 함께 합성되었다. 우선 R 고스트 카제트만 발현하여 세균을 용해시키는 백신 균주를 제조하기 위하여, pJHL172 에서 기존에 사용하던 용해 유전자 (E 유전자) 고스트 카제트 자리에 새로 합성된 R 고스트 백신을 치환하였다. pJHL172가 가지고 있던 857-PR-E 유전자-araBAD-araC 의 고스트 카제트 시스템(ghost cassette system)에서 E 유전자를 제거하고, S-R-Rz 유전자의 R 고스트 카제트 (Ncol-BamHI cut)를 삽입하였다. 합성된 R 고스트 카제트 5’ 부분에 NcoI 제한 효소를 합성하기 위하여 프라이머 세트: Rs-F (5'-CCGCCCATGGTGTTCTATCAGTAATCGACC-3') 와 Rs-R (5'-CCTGCGGATCCTGCCTGACGGTTTTTGCCGCG-3')를 제조후 pfu 폴리머라제를 이용한 PCR을 이용하여 R 고스트 카제트를 증폭하였다 (도 2의 A). 증폭된 R 고스트 카제트는 각각의 제한 효소로 소화한 후, 동일한 제한 효소로 소화된 pJHL172 부분에 라이게이션하여 완성되었다. R 고스트 카제트와 E 유전자를 함께 발현하는 고스트 백신 균주는 857-PR-E 유전자-araBAD-araC 의 고스트 카제트 시스템이 클로닝 되어있는 pMMP319 T-이지 벡터에 합성된 R 고스트 카제트를 제한효소 자리에 맞춰 클로닝 하여 집중 프로모터 시스템(convergent promoter system) 사이에 E 유전자와 R 유전자가 같이 있는 형태의 새로운 고스트 카제트를 조성하였다 (도 2의 B).

홀린-엔도라이신 카제트가 도입된 고스트 카제트를 pMMP172로 클로닝을 수행하고, 제한효소 및 뉴클레오티드 서열분석을 통해 확인하였다. 고스트 카제트의 토대가 되는 플라스미드는 비항생제선별 마크로 asd (aspartate semialdehyde dehydrogenase) 유전자를 가지는 pMMP172 혹은 pMMP167 및 이와 유사한 특성을 가지는 플라스미드를 사용하였으며, 그 결과로 형성된 플라스미드를 REH 플라스미드 pMMP210과 RH 플라스미드 pMMP220으로 명명하였다. 또한 pMMP172는 고반복 원점(high copy origin) 인 pBR 원점을 가지는데, 이를 저반복 원점(low copy origin)인 p15A 원점으로 교체시 용해능과 백신균주의 면역원성에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. asd 유전자 및 p15A 원점을 포함하는 pMMP187에서 XbaI-BglII 제한 효소를 사용하여 소화된 p15A 원점을 R+E 고스트 카제트와 R 고스트 카제트를 지니고 있는 변형된 pMMP172를 같은 제한 효소로 소화하여 클로닝하였다. 이렇게 형성된 플라스미드를 각각 REL 플라스미드 pJHL205 와 RL 플라스미드 pJHL215 로 명명하였다. 이렇게 조성된 총 4 개의 플라스미드 pJHL205, pJHL210, pJHL215, pJHL220는 asd 유전자가 결실된 대장균 균주인 JOL232에 먼저 형질전환 되어 플라스미드의 안정성을 획득한 다음, asd 유전자가 결실된 최종 목표 균주 S. 타이피뮤리움(S. Typhimurium) JOL1311에 형질전환하여 네 개의 후보균주 JOL1954, JOL1958, JOL1962, JOL1964를 조성하였다. 모든 조성된 균주는 20% 글리세롤을 포함한 LB 아가에서 -80℃에서 보관되었다. PBS(Phosphate buffered saline, pH = 7.4)는 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) 고스트 백신과 공격 균주를 재부유 시키는데 사용되었다.

1.2. 새로운 용해 유전자 카제트를 발현하는 살모넬라 타이피뮤리움 고스트 의 제조

JOL1954, JOL1958, JOL1962 및 JOL1964 균주 각각은 0.2% 아라비노스를 포함하는 20 mL LB 브로스에 접종되었다. 600 nm에서의 광학 밀도 (OD)가 0.8이 될 때까지 80-100 rpm의 속도로 천천히 부유시키면서 27℃에서 배양하였다. 각각의 용해 유전자를 유도하기 위해 아라비노스를 제거하고 42℃까지 온도를 높였다. 27℃에서 42℃까지의 가온 과정 및 이에 따른 용해에서, 각각 다른 시간대 (6, 12, 18, 24 시간)에서의 생존 세포수를 모니터링하였다. R 유전자 카제트를 사용한 RH 와 RL 플라스미드가 형질전환된 살모넬라 균주에서 각각 고반복 원점인 pBR ori 와 저반복 원점인 p15A ori를 사용시 용해 속도의 차이를 관찰하였다. R 유전자와 E 유전자를 동시에 사용한 고스트 균주에서도 같은 방식으로 용해의 속도가 측정되었다. 또한, E 유전자만 사용된 기존의 고스트 균주와 비교하여 R 고스트 카제트와 E 유전자가 동시에 사용된 고스트 균주가의 용해속도의 증가 혹은 감소가 측정되었다. 용해가 완료된 이후, 세균 고스트는 원심분리 (10 분 동안 4,000 × g)를 통해 배양되었으며, PBS로 세척, 부유되고 20℃에 저장되었다.

1.3. 웨스턴 블롯 분석

살모넬라 타이피뮤리움 균주를 고스트 백신으로 만드는 R 용해 카제트 단독, 또는 E 용해 유전자를 추가적으로 가진 두개 혹은 하나만 지니고 있는 새로운 고스트 유전자 카제트를 지니고 있는　REH, REL, RH 및 RL 플라스미드가 조성된 후 S. 타이피뮤리움 (△asd) JOL1311 균주에 형질전환(electrophoration) 하여 각각 JOL1954, JOL1958, JOL1962 및 JOL1964로 명명되었다. 각 균주에서 박테리오파지 유래 E 유전자 및 R 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 분석이 실시되었다. 항혈청을 얻기 위하여, E 유전자와 R 고스트 카제트중 홀린을 발현하는 R 유전자를 각각 단백질 발현 플라스미드인 pET32a에 EcoRI-HindIII의 제한 효소를 이용하여 클로닝하고, 이를 DH5-alpha 균주에 형질전환시켜 플라스미드의 안정성을 획득한 후, 최종 단백질 발현 균주인 BL21에 다시 형질전환시켜 최종 단백질 발현 균주를 확보하였다. 요소를 이용한 변성(denaturation) 방식으로 E 단백질과 R 단백질을 분리하여 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 각각의 분리된 단백질 크기 (E 단백질 = 8 kDa, R 단백질 = 17 kDa)가 확인되었다. 각각의 단백질은 항혈청 (polyclonal hyper-immune sera)을 제작하기 위하여 뉴질랜드산 흰토끼에 접종되었다. 100 ng의 단백질과 Freund' 애쥬번트 (incomplete)를 1:1의 비율로 혼합하여 0 주차에 피하주사 하였다. 그 후 2 주차와 4 주차에 각각 Freund' 애쥬번트 (complete)로 부스팅 후 6 주차에 혈액을 채취하여 분리된 혈청을 웨스턴 블롯시 2차 항체로 사용하였다.

각 백신 후보균주를 아라비노스를 첨가한 100 ml의 LB 브로스에서 27℃에서 하룻밤 배양하고, LB 브로스로 2 회 세척 후에 42℃로 옮겨 고스트화를 진행하였다. 고스트화를 진행하지 않은 각각의 균주는 음성 대조군으로 사용되었다. 고스트화 48 시간 후에 12,000 rpm에서 원심분리하여 펠렛을 준비하였다. 각 샘플 펠렛은 초음파처리(sonication)를 하여 분태 후 원심분리하고 상층액은 버리고, 펠렛을 SDS-PAGE용 샘플 버퍼로 재부유시켜 실험에 사용하였다. 94℃에서 5 분간 끓인 후 3 분동안 13,000 rpm에서 원심분리하고, 그 상층액을 SDS-PAGE한 다음 PVDF 멤브레인으로 옮겨 블로킹 버퍼 (PBST 내의 3% 탈지유)로 하룻밤 반응시켰다. 다음날 준비한 각 단백질에 대한 토끼 하이퍼-면역 혈청(rabbit hyper-immune sera)을 1:300으로 희석하여 1 시간 반응시킨 후, 1:300으로 희석된 2 차 항체 (Horse radish peroxidase)로 1 시간 반응시켰다. WEST-oneTM Western Blotting System (Intron Biotechnology, Korea)으로 발색 후 음성 대조군과 샘플에서 각각 용해 유전자들의 크기를 확인하였다.

1.4. 주사전자현미경 (Scanning electron microscopy, SEM )

살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) 고스트 (JOL1954, JOL1958, JOL1962 및 JOL1964)와 표준균주로서의 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) 야생형 균주 (JOL990)의 형태학적 특징은 주사전자현미경(SEM)으로 관찰되었다. 세포는 원심분리 (4000 × g에서 10 분)되었고 PBS (pH 7.4)에서 2.5% 글루타르알데히드로 고정되었다. 이후, 1% 수성 사산화 오스뮴(aqueous osmium tetroxide)로 후고정되었고 아세톤으로 탈수되었다. 시료는 건조된 후 금-팔라듐 합금으로 코팅되어, SEM (JSM-5200, JEOL, Japan)으로의 관찰을 용이하게 하였다.

1.5. 세균 감염에 대한 살모넬라 타이피뮤리움 고스트 백신의 보호효과

이 연구에서 모든 동물 실험은 동물 보호와 관련된 한국의회의 지침하에 있는 전북대학교 동물 윤리 위원회(CBU 2011-0017)의 승인 하에 수행되었다. 모든 실험 과정에서는 5 주령 암컷 BALB/C 생쥐가 사용되었다. 생쥐는 네 그룹으로 나뉘었고 (그룹당 n=7), 10⁸세균 고스트가 0 주차에 근육주사로 투여되었다. 그룹 B, C 및 D의 실험동물은 각각 REH 플라스미드를 지닌 JOL1954, RH 플라스미드를 지닌 JOL1958, 그리고 E 플라스미드를 지닌 JOL1754 가 각각 접종되었고 그룹 A는 대조군으로 PBS가 근육주사로 투여되었다. 면역 후 6 주까지 실험동물들의 상태가 관찰되었다. 사망률과 식욕부진, 우울, 설사와 같은 실험동물의 살모넬라증 임상증상이 모니터링 되었다. 식욕감소, 사료 잔여물의 존재, 외부자극에 대한 반응성 감소는 식욕부진과 우울을 확인하기 위해 모니터링되었다. 혈장 면역글로불린 G (IgG) 항체와 분비 IgA 항체의 형성을 확인하기 위해 0 주차부터 2 주 간격으로 안와 하정맥으로부터 혈액을 그리고 PBS를 이용한 질세척액을 각각 채취하였다. 도전 감염을 위하여 돼지에서 분리된 야생형 살모넬라 타이피뮤리움 균주의 도전 감염 용량을 결정하였다. 도전 감염 이전에 각각 비접종 실험동물 12 마리를 세 그룹으로 나누어 5 x 10⁵, 1 x 10⁶, 5 x 10⁶의 균주가 각각의 실험동물 그룹에 접종되었고, 그 후 10 일 동안 경과를 관찰하였다. 세 그룹 모두에서 100% 치사율이 관찰되었으며, 최종적으로 높은 용량으로 도전 감염시 백신 균주의 효과를 관찰하기 위하여 1 x 10⁶의 복강 접종으로 도전 감염이 실시되었다. 모든 그룹의 실험동물들은 1 x 10⁶CFU 살모넬라 타이피뮤리움 JOL990 야생형 균주를 함유한 PBS 100 μL로 복강 접종으로 마지막 면역 후 6 주차에 도전 감염 되었다. 생존율을 관찰하기 위해 도전 감염 10 일차까지 관찰되었다.

1.6. 체액 면역 반응 평가

JOL990 살모넬라 타이피뮤리움으로부터 추출한 외막 단백질(OMP)을 이용하여 ELISA(indirect enzyme-linked immunosorbant assay)가 시행되었다. OMP에 대한 혈장 IgG와 분비 sIgA의 형성은 ELISA를 이용하여 측정되었다. 96 웰-Microlon^®ELISAplate(GreinerBio-OneGmbH,Frickenhausen, Germany)의 원천은 0.5 mg/mL 농도의 OMP 100 μL로 코팅된 후 4℃에서 16 시간 동안 보관되었다. 0.05%의 Tween 20가 포함된 PBST를 이용하여 3 번 세척 후 1:250로 희석된 혈장을 분주하여 1 시간동안 배양하였다. 역시 PBST를 이용한 세 번의 세척 후, 홀스래디쉬 페록시다제 (HRP)-접합된 염소 항-생쥐 IgG (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) 1:100,000 희석액에 1 시간 동안 배양하였다. 결합된 HRP 활동성은 o-페닐메틸설포닐 플루오라이드 (Sigma-Aldrich)를 이용하여 평가되었다. 50 μL 3M 황산으로 반응이 정지된 후, ELISA 리더(reader)로 492 nm에서 광학 밀도가 측정되었다. sIgA 농도는 혈장 대신 PBS와 1:4의 비율로 질세척액을 이용해 배양하는 방법으로 혈장IgG 농도를 측정하는 방법과 유사한 절차로 측정되었다. IgG 이소타입인 IgG1과 IgG2a도 같은 농도로 희석된 혈장에서 간접 ELISA의 방식으로 HRP-접합된 염소 항-생쥐 IgG1 (Southern biotechs)와 HRP-접합된 염소 항-생쥐 IgG2a (southern biotechs) 의 발현으로 측정되었다.

1.7. 면역화된 생쥐 비장 세포( splenocyte )의 항원-특이적 세포 활성화

림프구 활성 분석은 이전에 면역 그룹에서 세포매개성 면역을 평가한 방법과 같이 수행되었다. 용해가능한 세균의 외막 단백질 항원 (outer membrane protein) 은 살모넬라 타이피뮤리움 야생형 균주 JOL990에서 분비되었다. 즉 세균 용액은 2 분간 초음파 분쇄되었고 5000 x g 로 4℃에서 60 분간 원심분리 되었다. 초음파 분쇄된 세균 단백질 용액 (sbcp)을 포함하는 상층액은 용해 가능한 항원으로 사용되었다. 비장 세포는 면역 후 7 일차에 각 그룹의 7 마리의 실험동물에서 무균적으로 회수되어 분리되었다. MTT 분석 ((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)은 세포 생존능력을 평가하기 위해 시행되었다. MTT 분석은 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT 테트라졸리움(tetrazolium)을 청자색을 띠는 비수용성의 MTT 포마잔(formazan) (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법이다. MTT 포마잔의 흡광도는 540 nm의 파장에서 최대가 되며, 이 파장에서 측정된 흡광도는 살아있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다. 1 × 10⁶ cfu/mL를 포함하는 100 μL의 확인가능한 비장세포는 10% 우태혈청, 2 mM L-글루타민, 50 U/mL 페니실린, 50 μg/mL 스트렙토마이신, 2 μg/mL 훈기존(fungizone)이 추가된 RPMI-1640 배지에 첨가되었다. 분주된 비장세포를 포함하는 세포배양 배지 분주 용액은 50 μL 배지 (음성대조군)와 함께 포함하는 96-웰 조직 배양 플레이트에서 40℃, 5% CO₂상에서 72 시간 동안 3 배로 배양되었다. 림프구 세포에 의해 자극된 10 μg/mL 콘카나발린(Concanavalin) A (ConA, Sigma, St. Louis, MO, USA)은 양성 대조군으로 유지되고, 세포 용액의 활성이 측정되었다. 자극 72 시간 후에 MTT 용액을 각 웰당 총 배지 양의 10-20% 정도 넣어준 후 1-4시간 동안 포마잔의 파란색의 침전물이 생길 때 까지 기다린다. MTT 용액은 활성화된 세포에서 나타나는 아데노신 삼인산(ATP)와 결합하여 포마잔 침전물을 형성하여 미토콘드리아의 활성을 측정할 수 있으며, 생성된 침전물은 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 약 30 분 동안 37℃의 환경에서 녹인 후 그 색 변화를 광학 밀도 (470 nm)를 이용하여 측정하였다.

1.8. CD3 ⁺ ,CD4 ⁺ 및 CD8 ⁺ 서브셋들의 유세포 분석

CD3⁺,CD4⁺및 CD8⁺와 같은 T 세포 마커는 비장 세포를 면역 후 7 일령에 모든 그룹으로부터 채취하여 검사하였다. 1×10⁶세포/mL의 농도로 분주된 비장세포를 각각의 표면 마커로 염색 후 유세포 분석을 통하여 각 T 세포의 상대적인 증가 혹은 감소 폭을 조사하였다. RPMI 배지와 함께 배양되어 있던 세포들은 FACS 버퍼에서 3 번 정도 세척되었고, 0.1 mL의 적당히 희석된 FITC(fluorescein isothiocyanate)로 표지된 항-CD3, 비오틴 (BIOT)으로 표지된 항-CD4, PE(phycoerythrin)으로 표지된 항-CD8a (SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA) 단일클론 항체로 암실에서 4℃ 에서 30 분간 배양되었다. 차가운 PBS로 3 번 세척된 이후, 세포들은 0.1 mL의 적당히 희석된 APC(allophycocyanin)으로 표지된 스트렙타비딘 (SouthernBiotech, Birmingham, USA) 단일 클론 항체로 암실에서 4℃에서 30 분 간 배양되었다. 배양 이후, 모든 시료들은 차가운 PBS로 3 번 세척되었고, 0.5 mL PBS로 재부유된 후, 유세포 분석기 (BD Biosciences, NJ, USA)로 분석되었다. 10,000 건의 FACS 분석은 CellQuest 소프트웨어 (BD Biosciences)를 이용하여 수행되었다.

1.9. 통계 분석

모든 데이터는 특별한 경우를 제외하고는 평균 ± 표준편차(SD)로 나타내어졌다. SPSS 버전 16.0 소프트웨어 (SPSS, Chicago, IL, USA)를 이용하여 분석이 이루어졌다. 면역되지 않은 대조군과 면역된 그룹 간의 면역반응의 통계적 차이점을 분석하기 위해 사후분석 본페로니 조정된 비-모수 ANOVA가 이용되었다. P-값이 ≤0.05 또는 0.01일 때 통계적으로 차이가 두드러졌다.

2. 결과

2.1. 고스트 카제트의 제작 및 향상된 살모넬라 타이피뮤리움 세균 고스트의 용해

살모넬라 타이피뮤리움 고스트의 형성은 SEM 촬영으로 관찰되었다. 전자 현미경 분석을 통해 (도 3상 화살표)상에서 용해 구멍의 형성을 관찰할 수 있었다. 유전자 E 터널 형성으로 인한 구멍은 극 영역(pole region) 또는 중앙 분할 영역(central division region)에서 관찰이 가능하였다 (도 3). 무작위로 선택된 JOL1954, JOL1958, JOL1962 및 JOL1964 균주의 콜로니를 25 ml 액체에서 배양한 살모넬라 타이피뮤리움 고스트의 생산은 42℃까지 온도를 상승시켜 용해 유전자를 활성화시킴으로써 수행되었다. 변형된 살모넬라 타이피뮤리움 배양의 OD를 분석한 결과 세포용해로 이어질 유전자 E 와 R 고스트 카제트의 발현 유도로 생존 세포수가 점차 줄어드는 양상을 보였다 (도 4). REH (JOL1954)와 REL (JOL1958)은 거의 비슷한 양식의 용해 속도가 관찰되었고 R 고스트 카제트로만 용해가 이루어지는 RH (JOL1962)와 RL (JOL1964)는 약 고스트화 시작 20 시간까지는 RH가 더 빠르게 용해되는 모습이 관찰되었으나 최종 용해 (더 이상 생존한 세포가 관찰 되지 않는 시점)는 시작한 이후 36 시간만에 동일하게 완료되었고, 이후에는 생존한 세포가 발견되지 않았다. 이는 R 고스트 카제트 단독으로 사용하는 것보다 E 유전자를 함께 사용할 때 최종 용해가 빠르다는 것을 보여주었다. E 유전자만 이용한 JOL1754 (EH)와 REH의 용해 속도를 비교한 그래프에서는 REH가 약 10 시간 정도 먼저 최종용해도에 도달하였다. 이는 E 유전자를 단독으로 사용하는 것보다 R 고스트 카제트를 함께 사용할 경우 용해 속도가 더 빨라진다는 것을 나타낸다.

2.2. 살모넬라 타이피뮤리움 내 용해 유전자의 인 비트로 발현

고스트화 된 균주 각각에서 E 유전자와 R 유전자가 각각 혹은 함께 발현되는지 여부를 확인하기 위하여 토끼에서 생성된 E 단백질 항혈청과 R 단백질 항혈청을 각각 2 차 항체로 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. 도 5의 우측 이미지에서 확인할 수 있듯이 고스트화 시키기 전인 대조군에 비해 고스트화된 백신 균주에서 R 단백질 (18kDa)의 확연한 발현이 관찰되었다. 이는 아라비노스가 없는 42℃에서의 용해 유전자 발현 조건에서 각각의 프로모터가 용해 유전자의 발현을 적절히 조절하고 있음을 나타낸다.

2.3. 생쥐에서 고스트 백신 후보의 안전성

살모넬라 타이피뮤리움 고스트 균주가 5 주령 BALB/C 생쥐에 접종되었다. 백신의 안전성을 평가하기 위해 임상증상과 사망률을 포함한 척도들이 면역 이후에 적용되었다. 그 결과, 고스트 균주 접종 이후 3 주 동안 식욕 부진, 설사 또는 무기력과 같은 어떠한 임상증상 없이 건강한 상태가 유지되었다. 항체 역가 측정을 위해 2 주 간격으로 백신 접종 후 6 주간 혈액과 질 세척액이 샘플링되었다.

2.4. 체액 면역 반응

야생형 살모넬라 타이피뮤리움 JOL990로부터 추출한 OMP 항원 특이 체액성 면역반응은 간접 ELISA를 의해 평가되었다. 전신 IgG와 점막 sIgA 수준은 면역 후 2 주마다 혈장과 질내 세척액 내의 농도로 측정되었다. 그룹 B (JOL1954), 그룹 C (JOL1962) 및 그룹 D (JOL1754)의 실험동물들은 그룹 A 대조군에 비해 면역 후 매주 훨씬 더 높은 혈장 IgG 수준을 보였다 (도 6 왼쪽 그래프). 특히 REH (JOL1954)로 면역된 생쥐 그룹에서의 IgG 역가가 가장 높게 관찰되었고 마지막 면역 후 한달 후까지도 높은 역가를 보였다. 이는 E 유전자 단독으로 사용된 JOL1754로 접종된 생쥐에서 관찰된 IgG 역가보다 증가한 것이다. R 고스트 카제트 단독으로 사용된 JOL1962 고스트로 접종한 생쥐에서도 컨트롤에 비해 증가한 IgG 의 함량이 관찰되었으나 다른 두 개의 백신 균주에 비해 IgG 항체 유도가는 낮은 편으로 나타났다. 질세척액에서 측정한 분비 IgA 항체가는 REH (JOL1954)를 접종한 면역군만 백신후 4 주차에 유의하게 증가함이 관찰되었다. 그룹 C 또는 D에서 sIgA의 유의한 증가는 보이지 않았다 (도 6 오른쪽 그래프). IgG 이소타입인 IgG1과 IgG2a도 각각 혈청에서 측정되었다. 마지막 백신 후 8 주차까지 항체의 역가가 측정되었으며, 4 주차부터 확연한 증가가 B, C, D 전 그룹에서 두 항체가 모두에서 관찰되었다 (도 7). 본 실험은 항체가 Th-1과 Th-2 세포 반응을 얼마나 유도하는지 관찰하기 위하여 수행되었으며, 그 결과는 B, C ,D 세 그룹에서 모두 균형잡힌 Th-1, Th-2 반응이 유도되었음을 시사한다. 즉, 본 실시예에 따라 제조된 세균 고스트에 의해 체액성 면역반응과 세포성 면역반응이 모두 유도되었음을 알려준다.

2.5. 사이토카인 측정

면역후 7 일째에 비장에서 분리된 세포를 인 비보 자극(in vivo stimulation)시켜 mRNA 레벨에서 사이토카인 발현을 분석하였다. 인터페론 감마와 IL-4의 생쥐 특이 프라이머를 이용하여 해당 유전자를 증폭시켰고 베타-액틴을 내부 대조군으로 사용하여 상대적인 배수 변화(fold change)를 계산하였다. 그룹 B와 C 즉 REH (JOL1954)와 RH (JOL1962)로 접종된 생쥐에서 IL-4의 증가가 관찰되었다 (도 8). IL-4는 나이브 T-세포의 Th-2 세포로의 분화를 돕는 면역조절 사이토카인이다.

2.6. 세포 면역 반응

2.6.1. MTT 분석

세포 매개성 면역을 평가하기 위해 용해 가능한 항원으로 자극 후의 림프구 활동성을, 3 wpi 에서의 면역, 비면역군의 실험동물들로부터 분리한 비장 세포의 분석을 통해 측정하였다. 96-웰 세포 배양 플레이트에 분주되어 항원 자극후 배양중인 비장 세포 (1 x 10⁶)를 자극한 후 72 시간 후에 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액을 넣어 활성화된 비장 세포와 결합하여 발생하는 파란색 침전물을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)로 녹인 후 그 색 변화를 광학 밀도 (470 nm)를 이용하여 측정하였다. REH (JOL1954) 와 RH (JOL1962)를 접종한 면역군은 대조군에 비해 강한 활동성을 보였다 (도 9 왼쪽 그래프). 특히 JOL1954로 면역된 생쥐는 JOL1962로 면역된 생쥐보다 증가된 림프구 활동성이 관찰되었다. 이는 항원 자극 후의 극적인 림프구 활성의 증가를 의미한다.

2.6.2. CD4 ⁺ 및 CD8 ⁺ T 세포의 유세포분석

면역 후 T 세포 수치의 변화는 비장세포 내의 T 림프구의 증가와 밀접한 관련이 있다. 따라서 유세포분석기로 면역군으로부터 CD4⁺및 CD8⁺림프구의 상대적인 개수의 변화를 측정함으로써 비장세포의 CD4⁺(도움 T 세포)와 CD8⁺(세포독성 R-세포) 수치를 측정하였다 (도 9 오른쪽 그래프). 전체 T 세포의 수를 의미하는 CD3⁺ 표지를 지닌 T 세포의 수는 REH (JOL1954)를 접종한 생쥐에서 평균 4.5%의 증가가 관찰되었으며 CD3⁺CD4⁺ T 세포와 CD3⁺CD8⁺ T 세포도 각각 3.1%, 2.2% 증가함이 관찰 되었다. 반면에 RH（JOL1962)에 의해 접종된 생쥐에서 분리된 비장 세포에서는 오히려 전체적으로 T 세포수의 감소가 관찰되었다. 이러한 결과는, 실험에 사용된 비장 세포는 백신 접종후 1 주차에 분리되어 사용되었으므로, 각각 용해관련 유전자에 따라 고스트 백신의 T 세포 자극 시기가 달라짐을 나타낸다.

3.6. 생쥐 악성 감염에 대한 세균 고스트의 보호 효과

접종 안전 용량 결정을 위한 예비실험에서 5 x 10⁵, 1 x 10⁶ 및 5 x 10⁵ 로 각각 면역된 실험동물에서 모두 100% 치사율을 보였다. 치사 용량 50을 초과하는 용량인 1 x 10⁶의 높은 용량으로 도전 감염시 실험동물에서의 R 고스트 카제트를 이용하여 새롭게 조성된 백신의 효능을 알아보기 위하여 도전 감염을 실시하였다. 도전 감염 이후 10 일간 생존율의 측정을 위해 실험동물들이 관찰되었다. 비접종 실험동물에서는 3 일 만에 100% 치사율을 보였고 이에 비해 면역군들은 강한 방어 능력을 보였다 (도 10). 가장 강한 방어능을 보여준 백신 균주는 JOL1954로서, 해당 균주로 면역한 실험동물은 72%의 생존율을 보였다. 이에 반해 E 유전자만 발현하는 JOL1754 균주로 면역한 실험동물은 접종 9 일째 100%의 치사율을 보였다. 이는 E 유전자만 사용시의 면역원성보다 R 유전자를 같이 사용할 경우 유도되는 면역원성이 더 높다는 것을 의미한다. 반면에 R 유전자만 사용되어 용해된 살모넬라 균주로 접종된 실험동물은 10 일차에 약 43%의 생존율을 보였다.

3. 결론

세균 고스트는 모든 세포질 구성물이 배제되어 있지만 높은 면역성의 지질다당(lipopolysaccharide) 구조를 포함하는 외막은 가지고 있다. 기존의 세균 고스트의 기능을 향상시키기 위해서 기존의 E 용해 유전자가 아닌 람다 박테리오파지에서 유래한 홀린-엔도라이신 시스템(Holin-Endolysin system)을 이용하였다. 본 시스템은 이중가닥DNA 박테리오파지에서 유래된 용해 유전자 카제트로서, 작은 막 단백질인 홀린과 엔도라이신이라고 불리는 muralytic 효소로 구성된 용해 경로를 지니고 있다. 홀린 단백질은 세균에 아무 피해를 끼치지 않는 상태로 내막에 축적되며 내막이 용해될 수준까지 축적되는 순간 엔도라이신이 빠져나갈 수 있는 구멍을 생성하여 엔도라이신이 세포벽을 공격할 수 있는 형태로 만든다. E 용해 단백질은 단독으로 작용하는데 반해, 본 홀린-엔도라이신 시스템은 홀린 단백질의 도움으로 용해 작용이 일어나는 엔도라이신 단백질이 작용함으로써 외부 항원이 손상을 입지 않고 더욱 빠르게 용해가 일어날 것으로 기대되었다. 또 하나의 특이점은 새로 도입하는 홀린-엔도라이신 시스템은 그람 음성 세균뿐만 아니라 세균 양성 세균에도 사용이 가능하다는 점이다. 본원에서는 R 고스트 유전자 카제트를 단독으로 포함하거나 또한 E 고스트 유전자와 함께 사용된 새로운 고스트 사균백신을 조성하는데 성공하였다. 만들어진 네 개의 백신균주 JOL1954, JOL1958, JOL1962 및 JOL1964 의 배양 용액은 SEM으로 관찰한 결과 용해 유도 48 시간 후 모두에서 막관통 터널의 형성과 그로 인해 모양이 변형된 세균세포의 변화가 관찰되었다 (도 3). 본 고스트 사균 백신에서 가장 중요한 부분은 용해유전자의 조절이다. 온도의 조절에 따라 발현을 조절 하는 CI-857 열 민감성 프로모터와 아라비노스의 첨가에 따라 조절되는 pARABAD 프로모터 사이에 클로닝된 고스트 유전자 카제트는 본 집중 프로모터의 조절 기전에 따라서 용해능이 유도되는 것이 확인되었다 (도 3). 새로 조성된 네 종류의 백신 균주 중 R 유전자 카제트와 E 유전자를 동시에 가지고 있는 고반복 원점을 지닌 JOL1954 균주의 경우 16시 간의 용해 후 생존 세포가 하나도 발견되지 않았으므로 가장 빠른 용해능을 가지는 것으로 생각되었다. 이는 E 유전자를 단독으로 사용한 균주인 JOL1754 보다도 빠른 용해를 보여주었으므로 확실히 향상된 성능이 확인되었다. 이러한 고스트 유전자의 발현은 48 시간 동안 용해된 고스트 백신 균주들의 면역 블롯 분석에서도 증명되었다. E 단백질과 엔도라이신 단백질 토끼 항혈청을 사용하여 진행된 분석에서 용해되지 않은 백신 균주에서는 발현되지 않았던 용해 단백질이 용해 균주에서는 확연히 나타남을 관찰할 수 있었다.

E 용해 유전자를 사용한 세균 고스트 백신을 이용한 면역이 동물 모델에서 고병원성 균주에 대해 효율적인 방어능을 제공한다는 것은 이전에 이미 증명되었다. 따라서 새롭게 조성된 고스트 백신 균주에서 기존의 고스트 백신보다 향상된 면역원성을 유도하는지의 여부도 관찰되었다. 백신의 안정성 면에서, 실험동물에 근육백신으로 접종시 어떠한 면역군에서도 눈에 띄는 부작용이 발견되지 않았다는 것은 실험동물에서 안전하게 적용됨을 시사하는 것이다. 면역원성의 차이를 확인하기 위해서 PBS를 접종한 음성 대조군 뿐만 아니라 기존에 사용되던 E 용해 유전자만 지닌 JOL1754 균주를 또다른 대조군으로 설정하여 새로운 고스트 균주의 면역원성을 확인한 결과 R 유전자와 E 유전자를 함께 사용한 JOL1954균주에서 IgG 와 IgA 둘다에서 가장 높은 항체 생성량이 관찰됨이 확인되었다. 세포성 면역 반응도　T 세포 반응의 증가에 의해 확인되었다. 야생형 균주로 도전감염시 비접종군과 기존의 E 유전자만 발현하는 JOL1754 균주로 면역한 실험동물은 접종 9 일째 100%의 치사율을 보였다. 반면, 가장 강한 방어능을 보여준 백신 균주는 JOL1954로써 이 균주로 면역한 실험동물은 72%의 생존율을 보였다. 이는 E 유전자만 사용할 경우에 비해 R 유전자를 같이 사용하는 경우 유도되는 면역원성이 더 높고, 이는 R 유전자를 포함하는 새로운 고스트 유도 균주의 가능성을 보여준다.

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> METHOD FOR PRODUCING BACTERIAL GHOST AND VECTOR FOR PRODUCING BACTERIAL GHOST <130> 1 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1260 <212> DNA <213> Bacteriophage lambda <400> 1 aagacatgaa gatgccagaa aaacatgacc tgttggccgc cattctcgcg gcaaaggaac 60 aaggcatcgg ggcaatcctt gcgtttgcaa tggcgtacct tcgcggcaga tataatggcg 120 gtgcgtttac aaaaacagta atcgacgcaa cgatgtgcgc cattatcgcc tggttcattc 180 gtgaccttct cgacttcgcc ggactaagta gcaatctcgc ttatataacg agcgtgttta 240 tcggctacat cggtactgac tcgattggtt cgcttatcaa acgcttcgct gctaaaaaag 300 ccggagtaga agatggtaga aatcaataat caacgtaagg cgttcctcga tatgctggcg 360 tggtcggagg gaactgataa cggacgtcag aaaaccagaa atcatggtta tgacgtcatt 420 gtaggcggag agctatttac tgattactcc gatcaccctc gcaaacttgt cacgctaaac 480 ccaaaactca aatcaacagg cgccggacgc taccagcttc tttcccgttg gtgggatgcc 540 taccgcaagc agcttggcct gaaagacttc tctccgaaaa gtcaggacgc tgtggcattg 600 cagcagatta aggagcgtgg cgctttacct atgattgatc gtggtgatat ccgtcaggca 660 atcgaccgtt gcagcaatat ctgggcttca ctgccgggcg ctggttatgg tcagttcgag 720 cataaggctg acagcctgat tgcaaaattc aaagaagcgg gcggaacggt cagagagatt 780 gatgtatgag cagagtcacc gcgattatct ccgctctggt tatctgcatc atcgtctgcc 840 tgtcatgggc tgttaatcat taccgtgata acgccattac ctacaaagcc cagcgcgaca 900 aaaatgccag agaactgaag ctggcgaacg cggcaattac tgacatgcag atgcgtcagc 960 gtgatgttgc tgcgctcgat gcaaaataca cgaaggagtt agctgatgct aaagctgaaa 1020 atgatgctct gcgtgatgat gttgccgctg gtcgtcgtcg gttgcacatc aaagcagtct 1080 gtcagtcagt gcgtgaagcc accaccgcct ccggcgtgga taatgcagcc tccccccgac 1140 tggcagacac cgctgaacgg gattatttca ccctcagaga gaggctgatc actatgcaaa 1200 aacaactgga aggaacccag aagtatatta atgagcagtg cagatagagt tgcccatatc 1260 1260 <210> 2 <211> 360 <212> DNA <213> Bacteriophage phi-X174 <400> 2 ctcgtcgctg cgttgaggct tgcgtttatg gtacgctgga ctttgtggga taccctcgct 60 ttcctgctcc tgttgagttt attgctgccg tcattgctta ttatgttcat cccgtcaaca 120 ttcaaacggc ctgtctcatc atggaaggcg ctgaatttac ggaaaacatt attaatggcg 180 tcgagcgtcc ggttaaagcc gctgaattgt tcgcgtttac cttgcgtgta cgcgcaggaa 240 acactgacgt tcttactgac gcagaagaaa acgtgcgtca aaaattacgt gcggaaggag 300 tgatgtaatg tctaaaggta aaaaacgttc tggcgctcgc cctggtcgtc cgcagccgtt 360 360

Claims

프로모터; 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 박테리오파지의 홀린(holin) 유전자, 엔도라이신(endolysin) 유전자 및 Rz 유전자를 포함하는 카제트(cassette)를 포함하는 벡터에 의해 형질전환되고,
상기 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결된 용해 유전자 E를 더 포함하는, 고스트 백신 균주.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 균주는 asd(aspartate-semialdehyde dehydrogenase) 유전자가 결실된 균주이고, 상기 벡터가 asd 유전자를 더 포함하는 것인, 고스트 백신 균주.
제 1 항에 있어서,
상기 균주는 그람 음성 세균 또는 그람 양성 세균인 것인, 고스트 백신 균주.
제 4 항에 있어서,
상기 균주는 살모넬라 종(Salmonella spp.)인, 고스트 백신 균주.
프로모터; 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 박테리오파지의 홀린 유전자, 엔도라이신 유전자 및 Rz 유전자를 포함하는 카제트를 포함하고,
상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 용해 유전자 E를 더 포함하는, 세균 고스트 제조용 벡터.
삭제
제 6 항에 있어서,
asd 유전자를 더 포함하는, 세균 고스트 제조용 벡터.
제 6 항 및 제 8 항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는, 세균 고스트 제조용 조성물.
제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 고스트 백신 균주를, 상기 프로모터를 작동시키는 조건하에서 배양하여 균주의 고스트화를 유도하는 것을 포함하는, 세균 고스트 제조 방법.