KR101601912B1 - 신규 박테리오파아지 ΦＥｐ14 - Google Patents

Abstract

본 발명자들은 배나무에 가지검은마름병을 일으키는 병원성 박테리아 에르위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae)를 감염시키는 박테리오파아지를 병든 배나무 조직, 나무 주변의 흙, 그리고 물로부터 분리하였다.
분리된 9개의 박테리오파아지는 투과전자현미경, 기주 범위, 게놈 한정 (genome restriction), DNA-DNA 혼성화 (hybridization) 기법을 이용하여 분석하였다. 전자현미경분석을 통해 박테리오파아지 ΦEp14는 포도비리대 패밀리 (Podoviridae family)에 속하는 것으로 확인되었다. ΦEp14는 넓은 기주 범위를 나타내었으며, E. pyrifoliae를 포함한 E. amylovora, E. persicina, E. pisidii, Erwinia sp., 그리고 Pantoea stewartii subsp. stewartii 균주들을 용해시켰다.
게놈 서열결정을 통해 ΦEp14는 6,0714 bp 크기의 원형을 띠는 이중나선 게놈을 가졌고 64개의 ORF (Open Reading Frame)를 가지는 것으로 확인되었다. 64개 중의 20개의 ORF가 기능을 가질 것으로 분석되었다. 20개의 ORF는 DNA 패킹, 구조적 요소, 기주 세포 용균 시스템, 그리고 파아지 DNA의 조절, 복제, 변형과 관련된 단백질들을 암호화는 것으로 분석되었다.

Description

신규 박테리오파아지 ΦＥｐ14 {New bacteriophage φEp14}

본 발명은 배나무 가지검은마름병을 일으키는 병원성 박테리아 에르위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae)를 감염시키는 박테리오파아지 φEp14 및 이의 응용에 관한 것이다.

배나무 가지검은마름병과 이의 원인균인 에르위니아 피리폴리애( Erwinia pyrifoliae )

에르위니아 피리폴리애(E. pyrifoliae)는 새로이 기술된 병원균이며, 가지검은마름병 병원균인 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 밀접한 관련이 있다. 에르위니아 피리폴리애는 아시아 배나무 {피러스 피리폴리아(Pyrus pyrifolia)에 심각한 괴사병을 일으킨다. 1995년 춘천 인근 과수원에서 아시아 배 수종인 신고 잎의 중앙맥에 검거나 갈색의 줄무늬와 잎꼭지 괴사가 관찰되었다. 이러한 증상은 가지 전체로 확산되었고 꽃과 작은 과실들에게도 영향을 주어 과실 생산량이 현저히 감소하였다. 남한에서 가지검은마름병은 보고되지 않았다. 그 병원균은 95년부터 98년까지 지속적으로 분리되었다 (1995-1998; Rhim et al., 1999). 이 병원균을 분리해낸 배나무의 증상은 E. 아밀로보라에 의한 가지검은마름병과 유사하였지만, 미생물학적 및 생화학적 특징은 E. 아밀로보라와 구별되었다 (Rhim et al., 1999; Shrestha et al., 2003). 아시아 배 병원균 E. 피리폴리애는 16S 및 23S rDNA 사이의 유전자간 스페이서 부분의 뉴클레오타이드 서열 분석, DNA-DNA 혼성화(hybridization) 동력학 및 G+C 함량과 같은 분자 특징에 의해 새로운 종으로 분류되었다 (Kim et al., 1999).

E. 피리폴리애의 기주 범위는 아시아 배와 몇몇 유럽 배로 한정되지만 (Kim et al., 2001b), E. 아밀로보라는 사과, 배뿐만 아니라 섬개야광나무 (cotoneaster), 산사나무 (hawthorn), 마르멜로 (quince), 라즈베리 (raspberry) 및 관상수도 감염시킨다 (van der Zwet and Keil, 1979). 1983년에 일본에서 에르위니아 (Erwinia) 종이 보고되었고, 일본 홋카이도의 과수원에서 아시아 배에 가지 시들음병을 유발하였으며, 이 병원물질은 임시로 E. amylovora pv. pyri (Tanii, 1983), E. amylovora biovar 4 (Mizuno et al., 2000)로 부르다가 후에 가지마름병 병원균 E. amylovora (Beer et al., 1996; Kim et al., 1996)로 정해졌다. 그러나, 그 분자적 성질과 미생물학적 특성은 E. amylovora보다는 E. pyrifoliae에 더 가깝다. 펄스 필드 젤 전기영동(pulsed-field gel electrophoresis; PFGE)으로 분석된 유전자 DNA, 엑소폴리사카라이드 합성을 위한 유전자 클러스터 부위 뉴클레오타이드 서열 분석, 총 단백질 패턴은 일본 에르위니아 종이 E. 아밀로보라보다는 E. 피 리폴리애와 좀더 가까운 연관관계임을 나타낸다 (Kim et al .,2001a). E. 피리폴리애로부터 얻은 세 가지 플라스미드 pEP36, pEJ30 및 pEA29와 일본 에르위니아 종 및 E. 아밀로보라 각각의 서열 또한 일본 에르위니아 종이 E. 피리폴리애와 좀더 가까운 연관관계임을 나타낸다 (McGhee et al., 2002; Maxson-Stein et al., 2003). 최근의 연구도 일본 에르위니아 종이 E. 아밀로보라보다는 E. 피리폴리애와 좀더 가까움을 보여주고 있다 (Matsuura et al ., 2007; Waleron et al ., 2008; Thapa et al ., 2010a).

엑소폴리사카라이드는 아시아 배 병원균 E. 피리폴리애의 주요 병원성 인자이다 (Kim et al., 2002). 이는 이온, 양분 및 물과의 결합, 식물 방어 메카니즘에 의한 병원균 인식으로부터 병원균 보호와 같은 다양한 역할을 수행한다. 캡슐이 씌워진 다당류 생산은 많은 그램 음성세균의 공통적인 특징이며 (Sutherland, 1985), 특히 식물 병원균의 특징이다 (Leigh et al., 1992). E. 피리폴리애에서, 엑소폴리사카라이드 생산 부위는 E. 아밀로보라 내의 ams와 같은 캡슐 다당류 (capsular polysaccharide; cps)로 나타낸다. E. 피리폴리애에서 얻은 엑소폴리사카라이드의 구조는 E. 아밀로보라에서 얻은 엑소폴리사카라이드 아밀로보란 (amylovoran)의 구조와 유사하다 (Kim et al., 2002). E. 피리폴리애에서 얻은 엑소폴리사카라이드의 반복 단위는 아밀로보란의 반복 단위와 동일하다. 그러나, 중요한 차이점은 E. 아밀로보라의 엑소폴리사카라이드는 글루코스 잔기를 포함하는데 반해 E. 피리폴리애의 엑소폴리사카라이드는 그렇지 않다는 점이다. 양쪽 균의 엑소폴리사카라이드 결여 변이체는 모두 비병원성이다 (Bellemann and Geider, 1992; Bernhard et al., 1993; Kim et al., 2002; Steinberger and Beer, 1988).

위의 A는 E. 피리폴리애, B는 E. 아밀로보라 유래 엑소폴리사카라이드의 반복 단위의 구조를 나타낸다.

몇몇 박테리오파아지는 세균 다당류를 분해할 수 있는 디폴리머레이즈 효소를 방출한다. 이 효소는 일부는 자유롭게 확산 가능한 단백질로 존재하고, 일부는 파아지 입자에 단단히 부착된 형태로 존재한다 (Adam and Park, 1956). 바이러스의 엑소폴리사카라이드-디폴리머레이즈는 엔테로박터 아에로게네스 (Yurewicz et al., 1971), E. 아밀로보라 (Hartung et al., 1988, Vandenbergh et al., 1986), 클렙시엘라 아에로게네스 (Klebsiella aerogenes) (Sutherland, 1976), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) (Bartel et al., 1968), 및 리조비움 트리폴리 (Rhizobium trifolii) (Higashi and Abe, 1978)를 포함하여 다양한 파아지에 감염된 그램 음성균에서 이미 밝혀진 바 있다. 디폴리머레이즈는 캡슐 엑소폴리사카라이드 (2차 수용체)에 결합하여 파아지가 세포 표면에 도달할 때까지 폴리머를 분해하고, 외부 막 수용체 (1차 수용체)에 결합하여 세균을 감염시키고 용혈 상태 (lytic state) 또는 용원 상태 (lysogenic state)로 존재한다 (Lindberg, 1977). E. 아밀로보라를 배양한 론 상에서 EPS 분해로 바퀴모양을 형성하는 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli; 이하 E. Coli와 혼용함) 세포를 스크리닝하여 E. 아밀로보라 파아지 ΦEa1h로부터 EPS-디폴리머레이즈를 발현하는 3.3 kb DNA 조각을 분리하였고 (Hartung et al., 1988), 서열 결정하였다 (Kim and Geider, 2000). 그 아미노산 서열은 몇몇 관련 있는 박테리오파아지에서 매우 보존적이었다. ΦEa1h 유래 EPS-디폴리머레이즈 유전자를 클론하여 세균에서 발현시켰다. 효소는 E. 피리폴리애의 엑소폴리사카라이드(EPS)를 분해하였다 (Kim and Geider, 2000; Kim et al., 2002).

박테리오파아지

박테리오파아지는 세균 세포를 감염시키는 바이러스이다. 이들은 전형적으로 매우 특이적이며, 종종 단일 세균 종에 속하는 특정 균주를 감염시키는 것으로 한정된다. 그러나, 어떤 박테리오파아지는 비교적 기주 범위가 넓어서 같은 속에 해당하는 다양한 종을 감염시키거나 심지어는 정상 기주와 밀접하게 관련 있는 다른 속의 세균을 감염시킬 수도 있다. 파아지는 세균의 기생생물이다 (Monk et al. 2010). 바이러스와 마찬가지로, 파아지는 자신의 물질대사 체계를 갖고 있지 않으며, 라이프 사이클을 완성하기 위해 기주의 메타볼리즘에 의존해야 한다. 파아지는 단백질 외피로 싸인 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA로 이루어진 게놈으로 구성된다.

박테리오파아지는 각각 1915년 및 1917년에 Fredirick Twork 및 Felix d'Herelle에 의해 독립적으로 발견되었다. 파아지는 주로 세균 기주가 실험실 내에서 잘 성장하고 파아지에 의해 쉽게 감염되기 때문에 세균 유전학과 세포 조절 메카니즘 연구에 자주 이용되어 왔다. 파아지는 또한 거의 한 세기 동안 세균에 의한 질병을 구제하기 위한 항미생물제로 이용되어 왔지만, 항생제가 도입되면서 파아지 사용은 감소해왔다. 항생제 내성 세균의 출현으로 인해 파아지 치료법은 의약, 식품 및 농업 분야에서 다시 주목받고 있다 (Balogh et al., 2010; Mahony et al., 2011; Maura and Debarbieus, 2011; Thiel, 2004).

지구상에는 약 10³¹개의 파아지가 있는 것으로 추정되며, 지난 세기말까지 약 5,100개의 파아지가 확인되고 보고되었다 (Ackermann, 2001). 파아지는 핵산 타입, 형태학적 특징 및 외피 또는 지방의 존재 유무에 따라 13개의 패밀리로 분류된다. 대부분의 박테리오파아지 (약 96%)는 카우도바이랄스 (Caudovirales)로 분류되는데, 이 파아지는 대칭 캡시드와 이중사슬 DNA를 가지는 꼬리 달린 파아지이며, 꼬리의 형태학적 특징에 따라 세 가지 패밀리로 분류된다: 미오비리대 (Myoviridae)는 수축성 꼬리를 가지며, 시포비리대 (Siphoviridae)는 종종 유연한 긴 비수축성 꼬리를 가지고, 포도비리대 (Podoviridae)는 매우 짧은 꼬리가 특징이다. 나머지 파아지들은 정방형, 필라멘트형 또는 다형태성이며, 몇몇 타입은 외피에 지방이 함유되어 있다.

박테리오파아지가 기주 세포에 접합하면 바이러스 게놈이 세포 내로 들어가 단백질과 결합하며, 바이러스 게놈은 새로운 후손 비리온 생산을 조절한다. 일반적으로 박테리오파아지에는 바이러스성 파아지와 잠재성 파아지의 두 종류 타입이 있다. 바이러스성 파아지는 용균 라이프 사이클에서만 번식할 수 있고, 이때 기주 세포는 파괴된다. 잠재성 파아지는 부가적으로 용원성 라이프 사이클(lysogenic life cycle)로 스위치를 돌릴 수 있고, 이때 파아지 게놈은 기주 게놈에 통합되어 복제된다.

가지검은마름병 병원균 E. 아밀로보라 의 박테리오파아지

E. 아밀로보라의 첫 번째 박테리오파아지는 1970년대에 밝혀졌다 (Erskine, 1973; Ritchie and Klos, 1979). 이후 계속하여 E. 아밀로보라 감염성 파아지들이 분리되고 플라크 형성, 기주 범위 분석, 전자 현미경, 제한효소 분해조각 길이 다형성 (restriction fragment length polymorphism; RFLP) 및 PCR에 기반하여 다른 서브타입으로 분류되었다 (Gill et al., 2003; Schnabel and Jones, 2001). E. 아밀로보라로부터 최근 박테리오파아지들이 분리되었지만 (Born et al., 2011; Muller et al., 2011), E. 피리폴리애로부터 분리된 파아지는 없었다. E. 아밀로보라 파아지들의 몇몇 게놈 서열들이 알려졌지만, 서열이 알려진 E. 피리폴리애 파아지는 없었다.

아시아 배나무는 한국에서 경제적으로 가장 중요한 수종 중 하나이다. E. 피리폴리애는 아시아 배나무에 가지시들음병(shoot blight)을 일으킨다. 이 병증은 과실 생산 손실로 이어진다. 이러한 질병의 제어를 위해 스트렙토마이신 및 옥시테트라사이클린 같은 항생제가 사용되어 왔다. 가지검은마름병 병원균인 E. 아밀로보라를 제어하기 위해 박테리오파아지가 최근 평가되고 있다. 그러나, E. 피리폴리애를 감염시키는 파아지는 병증이 있는 배나무에서 분리된 적이 없었다.

따라서, 본 발명은 가지검은마름병에 감염된 아시아 배나무에 조직, 주변의 흙, 물로부터 병원균인 E. 피리폴리애를 감염시키는 파아지를 분리하여 배나무의 가지검은마름병 치료제로 이용하려는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 배나무에 가지검은마름병을 일으키는 병원성 박테리아 에르위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae)를 감염시키는 박테리오파아지를 병든 배나무 조직, 나무 주변의 흙, 그리고 물로부터 분리하였다.

분리된 9개의 박테리오파아지는 투과전자현미경, 기주 범위, 게놈 한정 (genome restriction), DNA-DNA 혼성화 (hybridization) 기법을 이용하여 분석하였다.

전자현미경분석을 통해 박테리오파아지 ΦEp14는 포도비리대 패밀리 (Podoviridae family)에 속하는 것으로 확인되었다. ΦEp14는 넓은 기주 범위를 나타내었으며, E. pyrifoliae를 포함한 E. amylovora, E. persicina, E. pisidii, Erwinia sp., 그리고 Pantoea stewartii subsp. stewartii 균주들을 용해시켰다.

게놈 서열결정을 통해 ΦEp14는 6,0714 bp 크기의 원형을 띠는 이중나선 게놈을 가졌고 64개의 ORF (Open Reading Frame)를 가지는 것으로 확인되었다. 64개 중의 20개의 ORF가 기능을 가질 것으로 분석되었다. 20개의 ORF는 DNA 패킹, 구조적 요소, 기주 세포 용균 시스템, 그리고 파아지 DNA의 조절, 복제, 변형과 관련된 단백질들을 암호화는 것으로 분석되었다.

E. pyrifoliae와 P. stewartii subsp. stewartii 균주 내에서 박테리오파아지 ΦEp14 디폴리머레이즈 (ORF16) 유전자의 발현은 두 균주의 엑소폴리사카라이드의 생성을 억제하였다. 박테리오파아지 ΦEp14의 용균 카세트는 엔도라이신, 홀린, Rz, 그리고 Rz1 단백질을 암호화한다. 엔도라이신 (ORF28)은 E. pyrifoliae, Bacillus polyfermenticus, Micrococcus lysodeikticus의 세포벽을 분해하였지만, 살아있는 E. pyrifoliae에는 활성을 보이지 않았다. 홀린 (Holin; ORF29)은 하나의 트랜스멤브레인 도메인 (transmembrane domain; TMD)을 가지고 있고, 대장균에서 발현시 대장균의 성장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. Rz1 단백질 (ORF31)은 하나의 TMD와 C-말단에 고하전된 친수성 부분 (highly charged hydrophilic region)을 가지고 있다. 대장균에서 Rz 유전자의 발현은 대장균의 성장을 억제하였다. 활성을 지니는 Rz 단백질의 생산을 위해서는 카나마이신 저항성 유전자와 카나마이신이 반드시 필요한 것으로 확인되었다. 자연상태 (Native)와 변성된 상태 (denatured) Rz 단백질은 대부분의 세균에 대해 활성 (성장억제)을 보이는 것으로 나타났지만, 카나마이신 저항성 유전자를 지니는 세균에 대해서는 활성을 나타내지 않았다. 대장균에서 Rz1 유전자의 발현은 대장균의 성장에 영향을 미치지 않았다. 뜻밖에, Rz1 단백질 (ORF32)도 Rz 단백질과 거의 동일한 특성을 보였다.

본 발명은 에르위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae), 에르위니아 아밀로보라 (E. amylovora), 에르위니아 페르시치나 (E. persicina), 에르위니아 피시디 (E. pisidii), 에르위니아 속 (Erwinia sp.), 그리고 판토에아 스튜아티 아속 스튜아티 (Pantoea stewartii subsp. stewartii)에 대하여 용해능을 갖는 기탁번호 KACC 97010P(2011.11.29. 기탁)의 박테리오파아지(Bacteriophage) ΦEp14에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파아지가 서열번호 1의 유전자 서열로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 기탁번호 KACC 97010P의 박테리오파아지(Bacteriophage) ΦEp14을 에르위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae), 에르위니아 아밀로보라 (E. amylovora), 에르위니아 페르시치나 (E. persicina), 에르위니아 피시디 (E. pisidii), 에르위니아 속 (Erwinia sp.) 또는 판토에아 스튜아티 아속 스튜아티 (Pantoea stewartii subsp. stewartii)의 세균과 함께 배양하여 세균을 용균하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 박테리오파아지 ΦEp14를 유효성분으로 포함하는, 아시아 배나무 가지검은마름병 (Asian pear blight) 또는 화상병 (fire blight)의 예방 또는 치료용 농약 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 농약 조성물이 수간주사 조성물, 생물제제 조성물, 비료 조성물, 영양 조성물, 식물 강화 조성물, 식물 보호 조성물, 토양 개량 조성물(soil conditioner composition) 또는 생산량 증가 조성물(yield enhancer composition)임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 세균의 세포벽을 분해하여 용균하는 활성을 갖는 박테리오파아지 ΦEp14 엔도라이신과 트랜스멤브레인 도메인을 가지는 박테리오파아지 ΦEp14 홀린을 함께 처리하여 그램 양성균 또는 그램 음성균을 용균하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 엔도라이신이 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시됨을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 홀린이 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시됨을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 세균의 세포벽을 분해하여 용균하는 활성을 갖는 박테리오파아지 ΦEp14 엔도라이신과 트랜스멤브레인 도메인을 가지는 박테리오파아지 ΦEp14 홀린을 함유하는 아시아 배나무 가지검은마름병 (Asian pear blight) 또는 화상병 (fire blight)의 예방 또는 치료용 농약 조성물에 관한 것이다.

상기 농약 조성물은 수간주사 조성물, 생물제제 조성물, 비료 조성물, 영양 조성물, 식물 강화 조성물, 식물 보호 조성물, 토양 개량 조성물(soil conditioner composition) 또는 생산량 증가 조성물(yield enhancer composition)임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 세균의 세포벽을 분해하여 용균하는 활성을 갖는 박테리오파아지 ΦEp14 엔도라이신과 트랜스멤브레인 도메인을 가지는 박테리오파아지 ΦEp14 홀린, 박테리오파아지 ΦEp14 Rz 및 박테리오파아지 ΦEp14 Rz1을 함유하는 항균제에 관한 것이다. 항균제 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 알려져 있는 조성에 위의 네 가지 단백질을 가하여 제조한다.

일 구체예에 따르면, 농약 조성물은 비료 조성물, 영양 조성물, 식물 강화 조성물, 식물 보호 조성물, 토양 개량 조성물(soil conditioner composition) 및 생산량 증가 조성물(yield enhancer composition) 중 하나 이상으로 사용된다.

일 구체예에 따르면, 농약 조성물은 수화제(wettable powder), 입상 수화제(water dispersible granule), 분제(dusting powder), 액상 수화제(suspension concentrate), 유제(emulsifiable concentrate), 정제(tablet), 액제(liquid) 및 오일 현탁제(oil suspension) 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택되는 제형으로 제제화된다. 일 구체예에 따르면, 농약 조성물은 입상 수화제 조성물이다.

일 구체예에 따르면, 본 발명은 또한 주로 식물의 기부(basal) 및 또한 식물의 잎 부분에 농약 조성물을 시용함으로써 식물을 처리하는 방법에 관한 것이다.

일 구체예에 따르면, 하나 이상의 분산제는 w/w(dry weight by weight basis)로 약 2% 내지 약 60%의 범위로 있을 수 있다. Rhone Poulenc, Witco, Westvaco, International Speciality products, Croda chemicals,Borregaard, BASF, Rhodia, 등에서 판매되는 분산제와 같은, 다양한 분산제가 농약 조성물에 사용하기 위해 상업적으로 입수가능하다. 일 구체예에 따르면, 농약 조성물에 사용될 수 있는 분산제는 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 리그노술포네이트, 페닐 나프탈렌 술포네이트, 에톡시화(ethoxylated) 알킬 페놀, 에톡시화지방산, 알콕시화 선형 알코올, 환방향족(polyaromatic) 술포네이트, 소듐 알킬 아릴 술포네이트, 글리세릴에스테르, 말레산 무수물 공중합체, 포스페이트 에스테르, 아릴 술폰산과 포름알데히드의 축합반응 생성물, 알킬아릴 술폰산과 포름알데히드의 축합반응 생성물, 에틸렌 옥시드와 지방산 에스테르의 첨가 반응 생성물, 에틸렌 옥시드와 지방산 에스테르의 첨가 반응 생성물의 염, 축합된(condensed) 나프탈렌의 술포네이트, 에틸렌 옥시드와 지방산 에스테르의 첨가 반응 생성물, 에틸렌 옥시드와 지방산 에스테르의 첨가 반응 생성물의 염, 리그닌 유도체, 나프탈렌 포름알데히드 축합물, 이소데실술포숙신산 하프 에스테르(half ester)의 소듐 염, 폴리카르복실레이트, 소듐 알킬벤젠술포네이트, 술폰화 나프탈렌의 소듐 염, 술폰화 나프탈렌의 암모늄 염, 폴리아크릴산의 염, 페놀술폰산의 염, 및 나프탈렌 술폰산의 염을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 그러나, 당해 분야의 당업자는 본 발명 청구항의 범위를 벗어나지 않는다면 당해 분야에서 알려진 다른 분산제를 사용하는 것이 가능하다는 점을 이해할 것이다.

일 구체예에 따르면, 본 발명의 박테리오파아지 φEp14와 하나 이상의 분산제의 퍼센트 부(percent part)의 총 수는 건조 (w/w)에 기초할 때 100을 초과하지 않는다.

일 구체예에 따르면, 농약 조성물은 습윤제, 결합제, 충진제(filler) 및 유기 첨가제 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 습윤제는 약 0.1% 내지 약 5% 범위에 있을 수 있다. 일 구체예에 따르면, 농약 조성물에 사용될 수 있는 습윤제는 페닐 나프탈렌 술포네이트, 알킬 나프탈렌 술포네이트, 소듐 알킬 나프탈렌 술포네이트, 술폰화 알킬카르복실레이트의 소듐 염, 폴리옥시알킬화 에틸 페놀, 폴리옥시에톡시화(polyoxyethoylated) 지방성 알코올, 폴리옥시에톡시화 지방성 아민, 리그닌 유도체, 알칸 술포네이트, 알킬벤젠 술포네이트, 폴리카르복시산의 염, 술포숙신산의 에스테르의 염, 알킬나프탈렌술포네이트, 알킬벤젠술포네이트, 알킬폴리글리콜 에테르 술포네이트, 알킬 에테르 포스페이트, 알킬 에테르 술페이트 및 알킬 술포숙신산 모노에스테르를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 그러나, 당해 분야의 당업자는 본 발명의 청구항의 범위를 벗어나지 않는다면 당해 분야에서 알려진 다른 습윤제를 사용하는 것이 가능하다는 점을 이해할 것이다.

일 구체예에 따르면, 결합제는 약 0.1% 내지 약 7%의 범위에 있을 수 있다. 일 구체예에 따르면, 농약 조성물에 사용될 수 있는 결합제는 폴리비닐 알코올, 페닐 나프탈렌 술포네이트, 리그닌 유도체, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리알킬피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로오스, 크산탄 검, 폴리에톡시화 지방산, 폴리에톡시화 지방성 알코올, 에틸렌 옥시드 공중합체, 프로필렌 옥시드 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 옥시드를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 그러나, 당해 분야의 당업자는 본 발명의 청구항의 범위를 벗어나지 않는다면 당해 분야에서 알려진 다른 결합제를 사용하는 것이 가능하다는 점을 이해할 것이다.

일 구체예에 따르면, 충진제는 약 0.1% 내지 약 10%의 범위에 있을 수 있다. 일 구체예에 따르면, 충진제는 벤토나이트, 서브-벤토나이트(sub-bentonite), 아타풀자이트(attapulgite), 카올리나이트(kaolinite), 몬모릴로나이트, 보크사이트, 수화된 알루미나(hydrated alumina), 하소된(calcined) 알루미나, 규조토(diatomaceous earth), 백악(chalk), 백토(fuller's earth), 돌로마이트, 규조토(kieselguhr), 황토(loess), 프로필리트(prophyllite), 탈크(talc), 버미큘라이트(vermiculite), 석회암(limestone), 천연 및 합성 실리케이트(silicate), 실리카(silica) 및 고령토(china clay)를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 그러나, 당해 분야의 당업자는 본 발명의 청구항의 범위를 벗어나지 않는다면 당해 분야에서 알려진 다른 충진제를 사용하는 것이 가능하다는 점을 이해할 것이다.

일 구체예에 따르면, 농업 용도 조성물에 사용되는 유기 첨가제는 약 0.01% 내지 약 50%의 범위에 있을 수 있다. 일 구체예에 따르면, 유기 첨가제는 다량 영양소(macronutrient), 미량 영양소 퇴비 비료(micronutrient compost fertilizer), 천연 원소(natural element), 천연 유기체(natural organism), 트리코데르마(trichoderma), 부식산(humic acid) 추출물, 바실러스 투린지엔시스(bacillus thuringiensis), 바이러스, 천연 곰팡이, 식물 추출물, 제충국, 생물학적 제어 산물(biological control product), 천연 오일, 천연 추출물, 광물 및 요소 군을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 미량 영양소는 아연, 철, 망간, 구리, 보론, 코발트, 바나듐, 셀레늄, 실리콘 및 니켈로부터 선택될 수 있다. 대량 영양소는 질소, 인, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 그러나, 당해 분야의 당업자는 본 발명의 청구항의 범위를 벗어나지 않는다면 당해 분야에서 알려진 다른 유기 첨가제를 사용하는 것이 가능하다는 점을 이해할 것이다.

일 구체예에 따르면, 농약 조성물은 수화제, 분제, 입상 수화제, 액상 수화제, 유제, 정제, 펠렛, 액제 및 오일 현탁제를 포함하는 군으로부터 선택되는 제형으로 제제화될 수 있다. 일 구체예에 따르면, 농약 조성물은 입상 수화제로 제제화될 수 있다. 일 구체예에 따르면, 입상 수화제는 약 0.1mm 내지 약 2.5mm의 크기 범위에 있다. 입상 수화제는 입자를 포함할 수 있다. 입자는 약 1 미크론 내지 약 12 미크론의 크기 범위에 있을 수 있다. 그러나, 당해 분야의 당업자는 본 발명의 청구항의 범위를 벗어나지 않는다면 당해 분야에서 알려진 다른 제형으로 농약 조성물을 제제화하는 것이 가능하다는 점을 이해할 것이다.

일 구체예에 따르면, 농약 조성물은 비료 조성물, 영양 조성물, 식물 강화 조성물, 식물 보호 조성물, 토양 개량 조성물 및 생산량 증가 조성물 중 하나 이상으로 사용될 수 있다. 그러나, 당해 분야의 당업자는 본 발명의 청구항의 범위를 벗어나지 않는다면 당해 분야에서 알려진 다른 제형으로 농약 조성물을 제제화하는 것이 가능하다는 점을 이해할 것이다.

일 구체예에 따르면, 농약 조성물을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 혼합용 탱크에서 유효량의 물과 함께, 하나 이상의 분산제와 본 발명의 박테리오파아지 φEp14를 처음에 혼합하는 단계를 포함한다. 박테리오파아지 φEp14와 하나 이상의 분산제는 건조된 분말 제형으로 될 수 있다. 탱크에서 혼합하는 단계는 성질상 매우 균일한 슬러리를 제공한다. 통상적으로, 슬러리는 전체 슬러리 중 약 25% 내지 약 55%로 변화할 수 있는 물을 포함한다. 일 구체예에 따르면, 혼합하는 단계는 상기 혼합용 탱크에 건조 분말 형태의 습윤제, 결합제, 충진제 및 유기 첨가제 중 하나 이상을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 그런 다음, 슬러리는 적절한 습식 분쇄 장치에서 처리되고, 상기 분쇄 장치에서 입자 크기는 약 1 미크론 내지 약 12 미크론의 범위로 떨어지게 된다. 분쇄 이후에 생성된 슬러리는 필요하다면, 임의의 더 큰 입자를 위해 체로 걸러질 수 있다. 일 구체예에 따르면, 슬러리는 적절한 분무건조 장치에서 건조와 응집화 처리되어, 농약 조성물을 제공하게 된다.

일 구체예에 따르면, 식물을 처리하는 방법은 약 0.1% 내지 약 10%(w/w) 범위의 박테리오파아지 φEp14와 약 90% 내지 약 99.9% 범위의 하나 이상의 분산제를 포함할 수 있는 농약 조성물의 유효량을 식물의 기부 및 식물의 잎 부분에 시용하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 신규 박테리오파아지 ΦEp14를 이용하면 아시아 배나무에 가지검은마름병을 일으키는 에르위니아 피리폴리애를 용해시켜 가지검은마름병의 예방 또는 치료용으로 이용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면 신규 박테리오파아지 ΦEp14의 유전자 서열 중 ORF16 디폴리머레이즈 유전자를 발현하면 에르위니아 피리폴리애 및 판토에아 스튜아티 아속 스튜아티의 엑소폴리사카라이드 생성을 억제하여 이들의 병원성을 제어할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면 신규 박테리오파아지 ΦEp14의 유전자 서열 중 ORF28 엔도라이신 유전자를 발현하면 에르위니아 피리폴리애, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 및 마이크로코커스 라이소데익티커스의 세포벽을 분해시켜 이들 세균의 병원성을 제어할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면 신규 박테리오파아지 ΦEp14의 유전자 서열 중 ORF29 홀린 유전자를 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) 내에서 발현하면 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) 성장을 억제할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면 신규 박테리오파아지 ΦEp14의 유전자 서열 중 Rz 유전자를 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) 내에서 발현하면 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) 성장을 억제할 수 있다. 이때 Rz 유전자의 발현시에는 카나마이신 저항성 유전자와 카나마이신을 함께 처리한다.

도 1은 E. 피리폴리애 균주 Ep16/96 론 상에 파아지에 의해 형성된 플라크이다. a, φEp3; b, φEp4; c, φEp5; d, φEp6; e, φEp10-1; f, φEp11; g, φEp12; h, φEp13; i, φEp14.
도 2는 E. 피리폴리애 균주 Ep16/96 론 상에 박테리오파아지의 스팟 시험결과이다. 1, φEp3; 2, φEp4; 3, φEp5; 4, φEp6; 5, φEp10-1; 6, φEp11; 7, φEp12; 8, φEp13; 9, φEp14.
도 3은 E. 피리폴리애 박테리오파아지의 전자현미경 사진이다. 1, φEp4; 2, φEp6; 3, φEp11; 4, φEp12; 5, φEp13; 6, φEp14.
^a 배율은 x 50,000이고 막대 길이는 150 ㎚이다.
^b 배율은 x 85,000이고 막대 길이는 90 ㎚이다.
도 4는 파아지 DNA의 KpnI 제한효소 프로파일을 비교한 것이다. 레인 M, 1 kb+ DNA ladder (Solgent).
도 5는 파아지 DNA의 제한효소 절단결과 및 서던 혼성화 분석결과이다.(A) KpnI으로 절단한 파아지 게놈 DNA를 함유하는 EtBr 염색 젤: 해당 파아지 DNA 탐침은 양측에서 지시된다. 레인 M, 1 kb+ DNA ladder (Solgent).
도 6은 φEp14 게놈을 제한효소 절단 분석한 결과이다. 레인 1, AscⅠ; 2, PflMⅠ; 3, AscⅠ과 PflMⅠ; 4, 절단 안함; M, 1 kb+ DNA ladder (Solgent).
도 7은 파아지 φEp14 게놈 지도이다. 전사 방향은 화살표로 표시하였다. 모듈은 다음과 같다: 파아지 패키징, 황색; 조절, 흑색; 구조, 청색; 복제 및 대사, 핑크; 세포 용해, 적색; 통합, 하늘색. 선택된 유전자는 다음을 지시한다; 셀룰레이즈, 갈색; 엑소폴리사카라이드-디폴리머레이즈, 녹색; 기타, 회색.
도 8 (A)는 TMpred 프로그램을 이용하여 예측한 φEp14 홀린 (ORF29)의 트랜스멤브레인 부분이다. i → o 및 o → i는 각각 안쪽 → 바깥쪽 나선 및 바깥쪽 → 안쪽 나선을 나타낸다. (B) 홀린의 아미노산 서열이다. 트랜스멤브레인 도메인은 밑줄로 표시되어 있다 (10-29). 하전된 아미노산은 양 및 음 기호로 각각 표시되어 있다.
도 9 (A)는 TMpred 프로그램을 이용하여 예측한 예상 φEp14 홀린1 (ORF30)의 트랜스멤브레인 부분이다. i → o 및 o → i는 각각 안쪽 → 바깥쪽 나선 및 바깥쪽 → 안쪽 나선을 나타낸다. (B) 예상 홀린1의 아미노산 서열. 트랜스멤브레인 도메인은 밑줄로 표시되어 있다 (22-40). 하전된 아미노산은 양 및 음 기호로 각각 표시되어 있다.
도 10 (A)는 Rz 단백질의 트랜스멤브레인 부분을 예측한 것이다. i → o 및 o → i는 각각 안쪽 → 바깥쪽 나선 및 바깥쪽 → 안쪽 나선을 나타낸다. (B) Rz 단백질의 아미노산 서열. 트랜스멤브레인 도메인은 밑줄로 표시되어 있다 (10-29). 하전된 아미노산은 양 및 음 기호로 각각 표시되어 있다.
도 11은 φEp14 Rz-Rz1 유전자 (ORF31 및 ORF32)의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이다. Rz1 유전자는 Rz 유전자에 완전히 포함되어 있고, 다른 리딩 프레임 (+1)이 있다. 두 유전자로부터 추론되는 아미노산 서열이 뉴클레오타이드 서열 아래 표시되어 있다.
도 12는 각각 (A) pUC18, (B) pCel15F1 및 (C) pCel15F1R가 하보링된 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) JM109에 대한 카복시메틸 셀룰로오스 플레이트 분석 결과이다. 세균 콜로니는 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유한 1% CMC 플레이트에서 24시간 동안 37 ℃로 배양하였다. 플레이트는 0.1% 콩고 레드로 염색한 후 1 M NaCl로 탈색하였다.
도 13a 내지 도 13c는 순서대로 연속되는 도면이며, 바이러스 엑소폴리사카라이드-디폴리머레이즈로 ORF16 (φEp14_dpo)의 아미노산 서열을 배열한 것이다. 동일한 아미노산 서열은 서열 아래에 작은 박스로 표시하였다. φEp14_dpo; φEB_EamP-L1_dpo, accession no. AEJ81510; φEIMElight_dpo, accession no. CBW54806; φEa1h_dpo, accession no. CAC17009; φEa100_dpo, accession no. CBX45113; φEra103_dpo, accession no. YP_001039683.
도 14는 E. 피리폴리애 균주 Ep16/96의 GFP 유전자를 발현시킨 사진이다. 형질변환된 세포는 형광현미경 하에서 잘 관찰되었다.
도 15는 E. 피리폴리애 균주 Ep16/96 (pUC18) (A), Ep16/96 (pUC18-Dpo16F) (B), 및 Ep16/96 (pUC19-Dpo16F)의 콜로니 형태이다. 각 균주는 4일간 1% 글루코스 함유 NA 플레이트 상에서 배양하였다.
도 16은 CPG 한천 플레이트 상에서 판토에아 스튜아티 아속 스튜아티 (Pantoea stewartii subsp. stewartii) KACC10085 균주 (pBGS18) 및 (pBGS18-Dpo16F)의 엑소폴리사카라이드 생산을 나타낸다. 플레이트는 4일간 28 ℃로 배양하였다.
도 17은 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) M15(pREP4) 내에서 발현된 φEp14 엔도라이신을 SDS-PAGE 한 것이다. 레인 1, 1 mM IPTG로 0 ~ 4시간 유도한 후 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) M15(pREP4, pQE30) 총 단백질 추출물; 2-6, 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) M15(pREP4, pLys28) 총 단백질 추출물; M, 단백질 크기 마커 (Elpisbio).
도 18은 파아지 φEp14 엔도라이신을 자이모그램 분석한 것이다. 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) M15(pREP4, pQE30)의 세포 용해물 (레인 1, 3, 5) 및 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) M15(pREP4, pLys28)의 세포 용해물 (레인 2, 4, 6)을 0.2% E. 피리폴리애 Ep16/96이 없는 상태 (레인 1, 2) 및 있는 상태 (레인 3, 4) 또는 0.2% B. polyfermenticus SCD가 있는 상태 (레인 5, 6)로 12% SDS-아크릴아마이드 젤 상에서 분해하였다. 효소 활성은 청색 바탕에 선명한 띠로 보이며, 화살표로 나타내었다. M은 단백질 크기 마커이다.
도 19는 파아지 φEp14 엔도라이신의 뮤라미데이즈 활성을 나타낸다. 0.2% M. 라이소데익티커스 및 1% 아가로즈를 함유한 혼합물 (20 ㎖)을 90 ㎜ 페트리 디쉬에 부었다. 한천 상에 지름 5 ㎜의 홀을 형성하였다. 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) M15(pREP4, pLys28) 세포 추출물 (A) 및 M15(pREP4, pQE30) (B)를 홀에 가하였다. 플레이트는 오버나잇으로 28 ℃에서 배양하였다.
도 20은 φEp14 엔도라이신의 성장 저해 분석 결과이다. 유도된 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) 세포의 용해물을 E. 피리폴리애 Ep16/96 론 상에 스팟팅하였다. (A) M15(pREP4, pQE30) 용해물, (B) M15(pREP4, pLys28) 용해물.
도 21은 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) 내에서 φEp14 Rz 유전자 발현을 나타낸다. 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) M15(pREP4, pQE30) (실선) 또는 M15(pREP4, pQE30-Rz) (점선) 배양액은 OD 0.5 (600 ㎚)가 될 때까지 37 ℃로 배양하였다. ●, IPTG로 유도한 것 (최종 농도 1 mM). □, IPTG로 유도하지 않은 것.
도 22는 E. 피리폴리애 Ep16/96 지시자 론 상에서 파아지 φEp14 Rz 단백질의 활성을 나타낸다. (A) 앰피실린과 카나마이신이 함유된 LB 배지에서 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) M15(pREP4, pQE30) 세포 추출물; (B) 앰피실린이 함유된 배지에서 M15(pREP4, pQE30-Rz) 세포 추출물; (C) 앰피실린과 카나마이신이 함유된 LB 배지에서 M15(pREP4, pQE30-Rz) 세포 추출물.
도 23은 각기 다른 농도의 Rz 단백질로 처리하였을 때 E. 피리폴리애 Ep16/96 세포의 성장 저해효과를 나타낸다. 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) M15(pREP4, pQE30-Rz)로부터 유도된 세포 추출물을 양을 달리하여 2 ㎖의 E. 피리폴리애 Ep16/96 배양액에 NBGYE 브로쓰에 1.3 X 10⁶ cfu로 가하였다. ■, 10 ug; ▲, 30 ug; □, 50 ug; ○, 75 ug. M15(pREP4, pQE30)로부터 유도된 세포 추출물 (◆, 260 ug)을 대조군으로 하였다. 각각 24, 48 및 72시간 후, 100 ㎕의 각 혼합물을 LB 플레이트 상에 뿌렸다 (표 10).
도 24는 LB-X-Gal-IPTG 한천 상에 플라스미드를 하보링한 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) BL21(DE3)으로부터 β-갈락토시데이즈의 배출을 나타낸다. (A) pET15b; (B) pET15b-Rz; (C) pET15b-RzKm.
도 25는 가열변성된 ΦEp14 Rz 단백질의 E. 피리폴리애 Ep16/96 균주에 대한 항균활성을 나타낸다. M15(pREP4, pQE30)의 세포 추출물을 10, 20 및 30분간 100 ℃로, 그리고 30분간 80 ℃로 배양하였다. 미처리 세포 추출물 ("0")은 양성 대조군으로 사용하였고, 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) M15(pREP4, pQE30) 세포 추출물은 30분 동안 가열하고 ("c") 음성 대조군으로 이용하였다. 플레이트는 28 ℃에서 오버나잇 배양하였다.
도 26은 ΦEp14 Rz 단백질과 ΦEA1h 라이소자임 간의 유사성을 나타낸다 (13% 동일성).
도 27은 E. 피리폴리애 Ep16/96 론 상에서 ΦEp14 Rz1 단백질의 활성을 나타낸다. (A) 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) M15(pREP4, pQE30-Rz1) 세포를 앰피실린 함유 LB 배지 내에서 유도하였다 ; (B) M15(pREP4, pQE30-Rz1) 세포를 앰피실린과 카나마이신 함유 배지에서 유도하였다.
도 28은 파아지 ΦEp14 Rz1 단백질의 뮤라미데이즈 활성을 나타낸다. 0.2% M. 라이소데익티커스 및 1% 아가로즈를 함유한 혼합물 (20 ㎖)을 90 ㎜ 페트리 디쉬에 부었다. 한천 상에 지름 5 ㎜의 홀을 형성하였다. 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) M15(pREP4, pQE30) 세포 추출물 (A) 및 M15(pREP4, pQE30-Rz1) (B)를 홀에 가하였다. 플레이트는 오버나잇으로 28 ℃에서 배양하였다.
도 29는 가열변성된 ΦEp14 Rz1 단백질의 E. 피리폴리애 Ep16/96 균주에 대한 항균활성을 나타낸다. M15(pREP4, pQE30-Rz1)의 세포 추출물을 10, 20 및 30분간 100 ℃로 배양하였다. 미처리 세포 추출물 ("0")은 양성 대조군으로 사용하였고, 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) M15(pREP4, pQE30) 세포 추출물은 30분 동안 가열하고 ("c") 음성 대조군으로 이용하였다. 플레이트는 28 ℃에서 오버나잇 배양하였다.

아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

실시예 1. 박테리오파아지 , 생물체, 플라스미드 및 프라이머

본 발명에 사용된 박테리오파아지는 표 1에 나타내었다. 표 2에 나타낸 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) 균주들은 분자 클로닝, 플라스미드 번식 및 유전자 발현에 이용하였다. 플라스미드와 프라이머는 각각 표 3, 표 4(표 3과 연속된 표임)와 표 5, 표 6(표 5와 연속된 표임)에 나타내었다. 다른 균주들은 표 8 내지 표 17에 각각 나타내었다.

실시예 2. 박테리오파아지 분리

가지검은마름병 증상을 나타내는 강원도 춘천의 배 과수원에서 2005년과 2007년에 시료를 수집하였다. 가지, 잎, 과실은 지면으로부터 1m 높이의 것으로, 토양은 20-30㎝ 깊이에서 채취하였다. 물 시료는 과수원 인근의 작은 연못에서 채취하였다. 60㎖의 NBGYE가 담긴 플라스크에 E. 피리폴리애 Ep16/96 컬쳐 600㎕로 접종하고 28℃에서 OD₆₀₀이 0.4가 될 때까지 배양하였다. 10g의 조직 또는 15g(습윤중량)의 토양을 각 플라스크에 가하고 혼합물을 28℃에서 120 rpm 교반하며 2-3일간 배양하였다. 물 시료는 30 ml의 2X NBGYE를 300 ㎕의 오버나잇 Ep16/96 컬쳐 및 30 ml의 0.45 ㎛로 여과한 물을 플라스크에 가한 후 혼합물을 28℃에서 격렬하게 ㅎ흐흔들면서 2-3일간 배양하였다. 각 혼합물에 최종 농도 1%(v/v)가 되도록 클로로포름을 30분 동안 가하여 4 ℃에서 8,000 x g로 20분간 원심분리하였다. 상층액은 0.45 ㎛ 공극의 시린지 필터로 여과하고 4 ℃에서 보관하였다. 플라크 형성은 이중층 한천 기술 (double layer agar technique)을 이용하였다 (Adam, 1959). 100 ㎕의 상층액을 100 ㎕의 18-20시간 배양한 E. pyrifoliae Ep16/96 컬쳐와 혼합한 후 28℃에서 10분간 배양하고, 이 혼합물은 3 ㎖의 0.7 % NAGYE과 혼합한 다음 NAG에 부었다. 플라크 형성은 24시간 후 및 48시간 후에 확인하였다. 하나의 플라크를 집어 0.5-1 ㎖의 20 mM 인산칼륨 완충액(pH 6.8)이 담긴 마이크로원심분리 튜브에 넣고 교반하여 추출하였다. 튜브를 8,000 x g로 원심분리하고 추출액은 새로운 마이크로원심분리 튜브에 옮겨 4℃에 보관하였다. 파아지는 단일 플라크 분리방법을 이용하여 세 번 이상 정제하였다.

실시예 3. 플라크 분석

파아지 용균액은 20 mM 인산칼륨 완충액 (pH 6.8)으로 10번 순차 희석하였다. 그리고 나서, 100 ㎕의 파아지 희석액들을 100 ㎕의 E. pyrifoliae 균주 Ep16/96 오버나잇 배양액과 혼합한 다음 10분간 배양하였다. 3 ㎖의 0.7 % NAGYE을 가한 다음, 혼합물을 NAG에 부었다. 24시간 또는 48시간 동안 28℃로 배양한 후 플라크 수를 세었다.

실시예 4. 파아지 용균액 스톡 제조

이중층 한천 기술을 이용하여 높은 역가의 파아지 용균액 (high titer phage lysate)을 제조하였다. 100 ㎕의 E. pyrifoliae Ep16/96 오버나잇 배양액과 100 ㎕ (ca. 10⁵-10⁶ PFU per ml)의 파아지 용균액을 혼합하였다. 혼합물을 28℃에서 10분간 배양한 후 3 ㎖의 0.7% NAGYE와 혼합하여 NAG에 부었다. 28℃에서 오버나잇 배양한 후, 얻어진 슬러리는 3㎖의 20 mM 인산칼륨 완충액 (pH 6.8)과 함께 실온에서 한 시간 동안 배양하고, 유리막대로 긁어내어 50㎖의 원심분리 튜브에 옮겼다. 튜브는 4℃에서 8,000 x g로 20분간 원심분리하였다. 상층액은 0.45 ㎛ 공극의 시린지 필터로 여과하였다. 이 과정을 통해 용균액 1㎖당 약 10⁹-10¹⁰ PFU를 얻었다. 파아지 용균액은 4℃에 보관하였다. 장기 보관은 7 % (v/v) DMSO (Dimethylsulfoxide)에 넣어 -80℃로 보관하였다.

실시예 5. 기주범위분석 ( Host range analysis )

시험대상 세균 균주들을 NBGYE 또는 NB 배지에서 오버나잇 배양하였다. 3 ㎖의 0.7% NAGYE 또는 NA를 100 ㎕의 세포와 혼합한 다음 NAG 또는 NA에 평판배양하였다. 10 ㎕ (ca. 1.0 X 10⁸ PFU per ml)의 파아지 용균액을 세균 론 상에 스팟팅한 다음 28 ℃ 또는 37 ℃로 24시간 또는 48시간 동안 배양하였다. 각 균주는 시간을 달리하여 세 번씩 시험하였다.

실시예 6. 투과전자현미경 ( Transmission electron microscopy )

파아지 용균액 한 방울을 포름바로 코팅한 200-by-200 메쉬 니켈 격자 위에 스팟팅하여 2분간 두었다. 과량의 용액은 제거하였다. 격자 위의 파아지는 2% 우라닐 아세테이트 (uranyl acetate)로 2분간 네거티브 염색한 다음 Zeiss EM-109 전자현미경으로 50 kV로 관찰하였다.

실시예 7. 파아지 DNA 분리 ( Phage DNA isolation )

E. 피리폴리애 균주 Ep16/96을 28℃에서 과격하게 교반하면서 NBGYE 내에서 오버나잇 배양하였다. 60 ㎖의 NBGYE가 든 두 개의 플라스크에 600 ㎕의 오버나잇 배양한 E. 피리폴리애 Ep16/96 배양액을 각각 접종하고 28℃에서 0.4 of OD₆₀₀ (㎖당 약 1.2×10⁸ CFU)값이 0.4가 될 때까지 배양하였다. E. 피리폴리애 Ep16/96 세포를 파아지 현택액으로 감염시켜 감염 다중도 (multiplicity of infection; MOI)가 0.1이 되도록 하고 28℃에서 오버나잇 배양하였다. 각 결과로 얻어진 혼합물은 최종 농도 1%(v/v) 되도록 클로로포름을 가한 후 30분간 교반하고 4℃에서 8,000 x g로 20분간 원심분리하였다. DNA는 QIAGEN Lambda Midi Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 정제하였다.

실시예 8. 박테리오파아지 Φ Ep14 게놈 서열결정 및 서열분석

게놈 완전 서열결정은 마크로젠(Macrogen Inc., Seoul, Korea)에 의해 수행되었다. 간단히 설명하면, 파아지 게놈 DNA를 네뷸라이저로 자르고 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 뭉툭한 끝 (blunt-end) 재생 및 탈인산화하였다. 원하는 크기 (2-5 kb)의 DNA 조각들은 뭉툭한 끝 상태로 pCR4Blunt-TOPO 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 연결되었고 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) DH10B 세포에 전기천공으로 집어넣었다. 서열결정 반응은 ABI Prism 373XL DNA 분석기 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)로 분석하였다. 클론은 10배 이상의 redundancy가 얻어질 때까지 서열결정하였다. 콘틱(contigs) 간의 갭은 채워지고 게놈의 말단은 파아지 게놈 DNA 상에서 프라이머 워킹 (primer walking)에 의해 서열결정되었다. 서열 데이타의 결합은 SeqMan II (Dnastar, Madison, WI, USA) 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 수행하였다. ATG 또는 GTG 개시 코돈을 바탕으로 GeneMark (Lukashin and Borodovsky, 1998) (http://opal.biology.gatech.edu/GeneMark/), Glimmer (Delcher et al. 1999) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/MICROBES/glimmer_3.cgi) 및 ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)를 이용하여 오픈 리딩 프레임 (ORFs)을 예측하였다. 번역된 오픈 리딩 프레임은 보존된 도메인의 서치를 포함하는 BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) (Altschul et al. 1997)를 이용하여 GenBank 데이타베이스 내의 단백질과 비교하였다. tRNAscan-SE (http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/) (Lowe and Eddy, 1997)로 추정 tRNA 서치를 수행하였다. 아미노산과 뉴클레오타이드 정렬은 ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2)를 이용하여 수행하였다. 트랜스멤브레인 부위 (transmembrane region)는 TMpred 프로그램 (Hofmann and Stoffel, 1993)을 이용하여 European Molecular Biology network-Swiss node (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)에서 예측하였다.

실시예 9. 파아지 DNA 분석 ( Phage DNA analysis )

파아지 DNA를 KpnI으로 37℃에서 16시간 동안 절단하고, 70℃로 10분간 가열한 후 즉시 냉각시켰다. DNA 조각을 0.8% 아가로즈 젤에 전개시켰다. 젤은 에티듐 브로마이드로 염색하고, UV에 노출한 후, gel documentation system (Vilber Lourmat, France)을 이용하여 촬영하였다.

실시예 10. 서던 블랏 혼성화 ( Southern blot hybridization )

파아지 DNA는 KpnI로 절단하고, 얻어진 조각들은 0.8 % 아가로즈 젤에 전개시킨 후 hybond-N+ 막 (Amersham, UK)으로 이동시켰다 (Sambrook and Russell ; 2001). KpnI로 절단한 파아지 DNA 전부를 디그옥시제닌 (digoxigenin; DIG) DNA 레이블링 킷트 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)로 레이블했다. 레이블 반응은 37℃로 16시간 동안 수행하였다. 혼성화는 68℃로 16-20시간 수행하였고, 막은 세척한 후 Roche Diagnostics로 탐색하였다.

실시예 11. 염색체 DNA 분리

세균 게놈 DNA 분리는 Neumann et al.(1992)의 방법을 변형하여 수행하였다. 세균 세포는 100 ㎖ LB 배지에서 배양한 후 6,000 x g로 10분간 원심분리하여 수확하였다. 펠렛은 무균수로 한 번 세척한 후 10 ㎎/㎖ 라이소자임을 함유한 5 ㎖의 SET 완충액 (50 mM NaCl, 25 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 7.5)에 재현탁하여 50 ㎖ 팔콘 튜브로 옮겼다. 37℃에서 한 시간 동안 배양한 후 2.5 ㎖의 0.5 M EDTA를 가하고 튜브를 실온에서 5분간 배양하였다. 그런 다음 4 ㎖의 10% (w/v) SDS 및 640 ㎕의 프로티네이즈 K (18 ㎎/㎖)를 가하고 가끔 뒤집어 주면서 65℃에서 0.5-1시간 동안 배양하였다. DNA를 추출하기 위해 용균된 세포를 동량의 페놀: 클로로포름: 아이소아밀알콜 (phenol:chloroform:isoamylalcohol; PCI) (25:24:1)과 서서히 혼합하였다. 4,000 x g로 15분간 원심분리한 후 위쪽 수상 (aqueous phase)은 새 튜브로 옮겨 RNase A (10 ㎎/㎖)를 최종 농도 20 ㎍/㎖가 되도록 가하고 한 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이 용액은 동량의 PCI로 추출하였다. 최종적으로 5 M NaCl이 최종농도 0.1 M가 되게 가하고 100% 에탄올 2배 부피를 가하여 서서히 뒤집어 주었다. DNA를 다 푼 다음 70% 에탄올로 헹구고 건조시킨 후 적절한 양의 TE (10/1) 완충액 (pH 8.0)에 용해시켰다.

실시예 12. 세균 형질전환 ( Transformation of bacteria )

실시예 12.1 CaCl ₂ 또는 RbCl 방법에 의한 형질전환 ( Transformation by calcium chloride or rubidium chloride method )

CaCl₂를 이용하여 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) 컴피턴트 세포를 제조하였다. 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) 균주는 500 ㎕의 CaCl₂에 재현탁하여 4℃에 보관하였다. 세포는 6,000 x g로 10분간 원심분리하여 수확하고 5 ㎖의 미리 식힌 0.1 M CaCl₂로 세 번 세척하였다. 세포를 수집하여 500 ㎕의 CaCl₂에 재현탁하고 4 ℃에 보관하였다.

효율적인 컴피턴트 세포를 제조하기 위해 RbCl 방법을 선택하였다. 2 ㎖의 오버나잇 배양액을 200 ㎖의 LB 배지에서 OD₆₀₀이 0.4-0.6이 될 때까지 배양하였다. 배양액은 얼음에서 30분간 식힌 다음 6,000 x g로 10 분간 4℃에서 원심분리하였다. 세포를 모으고 40 ㎖의 차가운 TFBI에 재현탁한 다음 부드럽게 흔들면서 얼음에 한 시간 동안 두었다. 원심분리 후 세포를 8 ㎖의 차가운 TFBII에 재현탁하고 살균된 에펜도르프 튜브에 100 ㎕씩 분주하여 -80℃에 보관하였다.

형질전환을 위해 연결된 DNA 또는 플라스미드를 100 ㎕의 컴피턴트 세포와 혼합하여 10분간 차갑게 두었다. 42℃로 1분간 열충격을 가한 후 세균은 5분간 차갑게 배양한 후 500 ㎕의 LB 배지를 가하였다. 혼합물은 37℃에서 흔들며 90분간 더 배양한 후 적절한 항생제 플레이트에 가하였다. 재조합 플라스미드는 Wizard®Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 분리하였다.

실시예 12.2 전기천공을 이용한 형질전환 ( Transformation using electroporation )

E. pyrifoliae 단일 콜로니 또는 LB 한천 플레이트에서 얻은 식물-관련 세균을 5 ㎖의 LB 브로쓰에 접종하였다. 배양액은 28℃에서 회전 교반기로 격렬하게 폭기하며 배양하였다. 100 ㎕의 선배양 세포 (pre-cultured cells)를 100 ㎖의 LB 브로쓰에 넣고 OD₆₀₀가 0.4-0.6 될 때까지 배양하였다. 배양액을 15-30분간 얼음 위에 놓고 이후 세포를 50 ㎖의 얼음물로 두 번 세척하였고, 6,000 x g로 10분간 4℃에서 원심분리하여 수확하였다. 상층액은 조심스럽게 따라버리고, 펠렛은 3 ㎖의 차가운 물과 1 ㎖의 차가운 40% 글리세롤로 재현탁하였다. 재현탁한 세포는 살균된 에펜도르프 튜브당 100 ㎕씩 담아 -80℃에서 보관하였다.

전기천공을 위하여 1-2 ㎕의 플라스미드 DNA를 컴피턴트 세포와 혼합하여 얼음 위에서 10분간 배양하였다. 차가워진 혼합물은 차가운 2-㎜ 전기천공 큐벳 (Bio-Rad, CA, USA)으로 옮겨 담고 2.5 kV, 200 Ω 저항 및 40 uF 전기용량으로 Bio-Rad MicroPulser 전기천공기로 전기천공하였다. 800 ㎕의 LB 배지를 전기천공된 세포에 가하고 90분 동안 28℃로 배양하였다. 세포는 항생제를 함유한 LB 한천 플레이트에 뿌렸다.

실시예 12.3. 접합 ( Conjugation )

E. pyrifoliae 16/96 및 Escherichia coli S17-1(pSup2021) 균주를 항생제를 포함하는 5 ㎖의 LB 배지에서 오버나잇 배양하였다. 1 ㎖의 각 배양액을 6,000 x g로 10분간 원심분리한 후 100 ㎕의 LB 배지에 재현탁하였다. 50 ㎕를 혼합하여 LB 한천 플레이트 상에 위치한 나이트로셀룰로스 필터에 뿌리고 28℃에서 오버나잇 배양하였다. 세균은 5 ㎖의 LB 배지에서 보텍싱하며 재현탁하였고, 10^-2 내지 10^-3로 희석하고 50 ㎍/㎖의 카나마이신 함유 LB 배지에 뿌렸다. 28℃로 2-3일간 배양한 후 카나마이신 저항성 콜로니를 LB-Km 배지 및 MM2-Km 배지 양쪽에서 동시에 배양하였다. MM2-Km 한천 플레이트 상의 점액성 콜로니를 선택하였다.

실시예 12.4. E. 피리폴리애 균주 Ep16 /96 cpsB 의 특정 부위 돌연변이

cpsB 유전자의 돌연변이를 위해 복제시 박테리오파아지 fd의 유전자 2 단백질을 필요로 하는 플라스미드 pfdA8를 자살 벡터로 이용하였다. cpsB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 E. 피리폴리애 균주 Ep16/96의 게놈 완전 서열 (GenBank database accession no: FN392235)로부터 얻었다. cpsB 유전자의 내부 절단에 의해 얻은 810 bp DNA 조각은 cpsBep1 및 cpsBep2 프라이머 (Table. 4)를 이용한 PCR로 증폭하였고, pBluescript KS+의 EcoRV 부위에 클론하였다. 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) DH5α 내로 형질전환한 후 형질전환체를 Ap 및 X-Gal 함유 LB 한천 배지에 나타내었다. 플라스미드 pBlue-cpsB810를 제한 효소 BamHI 및 SalI으로 절단한 다음 pfdA8의 BglII 및 SalI 부위로 이동시켰다. 얻어진 플라스미드는 pfdA8-cpsB810으로 표시하고, fd 유전자 2의 발현으로 Escherichia coli DH2 내에서 증식시켰다. 이 플라스미드를 E. 피리폴리애 균주 Ep16/96에 전기천공으로 도입하여 플라스미드로 단일 교차 상동 재조합 (single cross-over homologous recombination)하여 cpsB를 파괴하였다. 카나마이신 저항성 콜로니에 대해 MM2 한천 플레이트 상에서 엑소폴리사카라이드 합성능을 분석하였다.

실시예 13. 중합효소 연쇄반응

Eppendorf mastercycler gradient 5331을 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 반응은 10x PCR 완충액 5 ㎕, 각 프라이머 10 pmol, 0.2 mM의 각 dNTP들 및 1 u의 Taq 또는 Pfu DNA 폴리머레이즈를 함유한 50 ㎕ 부피 내에서 수행되었다. 클로닝용 PCR 산물은 QIAquick-spin PCR Purification Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)로 스핀 컬럼을 이용하여 정제되었다.

실시예 14. Φ Ep14 셀룰레이즈 유전자 ( ORF15 )

실시예 14. 1. Φ Ep14 셀룰레이즈 유전자 클로닝

pUC18 또는 pUC19를 클로닝하기 위해, 정제된 파아지 DNA 유래 셀룰레이즈 유전자의 PCR 증폭에 프라이머 Cel15F1 및 Cel15R (Table. 4)을 이용하였다. PCR 산물을 정제하고 EcoRI 및 HindⅢ로 절단하고, pUC18 및 pUC19에 연결하였다. 연결된 DNA는 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) JM109을 형질변환시켰다. 형질변환된 세포의 선택은 앰피실린 (100 ㎍/㎖)이 함유된 LB 한천 플레이트에서 수행하였다. 결과로 얻어진 플라스미드는 pCel15F1 및 pCel15F1R로 각각 명명하였다. 뉴클레오타이드 서열은 DNA 서열결정으로 확인하였다.

실시예 14. 2. 셀룰레이즈 플레이트 분석 ( Cellulase plate assay )

셀룰레이즈 활성을 나타내는 데는 콩고 레드 투명존 분석방법 (Congo red clearing zone assay; Wood et al., 1982)이 적절하다. pCel15F1, pCel15F1R 또는 pUC18을 포함하고 있는 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) JM109 균주를 이쑤시개로 1% (w/v) 카복시메틸 셀룰로스 (Sigma, St. Louis, MO, USA) 및 앰피실린 (100 ㎍/㎖)을 함유하는 LB 한천 플레이트에 접종시켰다. 플레이트는 37℃에서 오버나잇 배양한 후 실온에서 30분간 0.1% (w/v) 콩고 레드 용액으로 염색한 후 1 M NaCl로 탈색 처리하였다.

실시예 15. Φ Ep14 엑소폴리사카라이드 - 디폴리머레이즈 유전자 ( ORF16 )

실시예 15. 1. E. 피리폴리애 에서 Φ Ep14 엑소폴리사카라이드 - 디폴리머레이즈 유전자 클로닝 및 발현

엑소폴리사카라이드-디폴리머레이즈 유전자를 lac 프로모터 하에서 발현시키기 위해 정방향 프라이머 상에 공통 라이보좀 결합 부위 (consensus ribosome binding site) 및 ATG 개시코돈에 스페이서가 제공되었다. 프라이머 Dpo16K 및 Dpo16L (Table. 4)는 PCR 증폭으로 제조하였다. PCR 산물은 정제한 후 EcoRI 및 HindⅢ로 절단하고 pUC18, pUC19 및 pBGS18 벡터에 삽입하였다. 얻어진 플라스미드pUC18-Dpo16F, pUC19-Dpo16F 및 pBGS18-Dpo16F는 E. 피리폴리애 균주 Ep16/96를 전기형질변환시켰다. 플라스미드 pBGS18-Dpo16F도 P. 스튜어티(P. stewartii) 아종 스튜어티(stewartii) KACC10085에 도입되었다.

실시예 16. Φ Ep14 엔도라이신 유전자 ( ORF28 )

실시예 16. 1. Φ Ep14 엔도라이신 유전자 클로닝과 발현

정제된 파아지 DNA 유래 엔도라이신 유전자의 PCR 증폭을 위해 프라이머 Lys28F 및 Pys28R (Table. 4)를 이용하였다. PCR 산물을 정제하고, BamHI 및 HindⅢ로 절단하고, 발현 벡터 pQE30에 연결하였다. 연결된 DNA는 Escherichia coli JM109로 형질변환되었다. 형질변환된 세포의 선택은 앰피실린 (100 ㎍/㎖)이 함유된 LB 한천 플레이트에서 수행하였다. 정확하게 삽입되었는지 및 유전자 서열은 플라스미드 인서트의 뉴클레오타이드 서열결정으로 체크하였다. 얻어진 플라스미드는 pLys28로 명명하고, 발현을 위해 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) M15(pREP4)에 도입되었다.

에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) M15(pREP4, pLys28)는 앰피실린 (100 ㎍/㎖) 및 카나마이신 (25 ㎍/㎖)이 함유된 5 ㎖ LB 배지에서 오버나잇 배양하였다. 오버나잇 배양액은 100 ㎖ LB 배지에 넣어 희석한 후 37℃에서 격렬하게 흔들며 배양하였다.OD₆₀₀ 값이 0.5가 되었을 때 배양액에 1 mM IPTG를 가하였다. 시료는 IPTG를 가하기 직전 및 다양한 시각에 채취하여 SDS-PAGE로 분석하였다.

3시간 동안 유도한 배양액은 침전시키고 펠렛은 음파처리 완충액 [10 mM 이미다졸, 0.3 M NaCl, 50 mM NaH₂PO₄ (pH 7.8)]에 현탁시켰다. 음파처리 후 10,000 x g로 30분간 원심분리하여 투명한 세포 용균액을 얻었고, -80℃로 보관하였다.

실시예 16. 2. 자이모그램 분석 ( Zymogram assay )

실시예 16. 2. 1. 기질 (농축된 세포 현탁액) 제조

Deutsch et al. (2004)의 방법을 약간 응용하여 농축된 세포 현탁액을 제조하였다. B. 폴리퍼멘티쿠스 SCD 또는 E. 피리폴리애 Ep16/96 균주를 LB 배지에서 오버나잇 배양하였다. 배양액은 원심분리 (6,000 x g, 4℃, 10분)하여 세포를 살균수로 세 번 세척하였다. 침전은 최초 배양액 1% (v/v)를 함유한 살균수에 재현탁했다. 현탁액은 15분간 121℃로 오토클레이브한 다음 4℃에 보관하였다.

실시예 16. 2. 2. SDS - PAGE 및 복원용 ( renaturing ) SDS - PAGE

Laemmli (1970)의 방법에 따라 SE260 Mini-Vertical unit (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)로 SDS-PAGE를 수행하였다. Leclerc and Asselin (1989) 및 Takac et al. (2005)의 방법을 변형하여 자이모그램을 수행하였다. 세포 추출액을 100℃에서 10분간 시료 완충액과 함께 배양한 다음 4% (v/v)의 살균한 B. 폴리퍼멘 티쿠스 SCD 및 E. 피리폴리애 Ep16/96 세포가 함유된 12% (w/v) 폴리아크릴아마이드 분리용 젤 (pH 8.8)에 로딩하였다. 전기영동 후 젤들은 실온에서 증류수에 넣어 30분간 세척하였다. 젤들은 1% (v/v) Triton X-100을 함유한 50 mM Tris-Cl (pH 7.5)로 옮겨 실온에서 부드럽게 흔들며 오버나잇 배양하여 단백질을 복원 (renaturation)시켰다. 젤은 증류수로 세척한 후 0.1% (w/v) 메틸렌 블루를 함유한 0.01% (w/v) KOH로 실온에서 두 시가 동안 염색하고, 증류수로 세척하였다. 용균 활성은 청색 바탕의 투명 존으로 체크하였다.

실시예 16. 3. M. 라이소데익티쿠스 에 대한 한천 웰 확산 분석법 ( Agar - well diffusion assay against M. lysodeikticus )

0.2% M. 라이소데익티쿠스 (lysodeikticus) ATCC 4698 (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 함유한 1% 아가로즈 젤 20 ㎖를 90 ㎜ 페트리 디쉬에 붓고 실온에서 한 시간 건조시켰다. 직경 5 ㎜ 웰을 한처 플레이트에 팠다. 40 ㎕의 세포 추출액을 각 웰에 넣고, 28℃에서 오버나잇 배양하였다. 용균 활성은 불투명한 바탕에 웰 주위의 투명 존으로 체크하였다.

실시예 16. 4. 항균 활성

엔도라이신의 항균 활성은 E. pyrifoliae Ep16/96 세포 론 상에서 성장 억제정도를 분석하여 얻어내었다. NAG 한천 플레이트에 100 ㎕의 오버나잇 배양액을 함유한 3 ㎖의 0.7% NAGYE를 가하고 엔도라이신을 함유한 10 ㎕의 세포 용균액을 표면에 가하였다. 플레이트는 28℃에서 오버나잇 배양하였다.

실시예 17. Φ Ep14 Rz 유전자 ( ORF31 )

실시예 17. 1. Φ Ep14 Rz 유전자 발현용 벡터 구축

먼저 pQE30 내로의 클로닝을 위해, Rz 유전자를 증폭하기 위한 E. pyrifoliae Ep16/96 ΦＥp14의 게놈 서열로부터 프라이머를 디자인하였다. 프라이머 Rz31A 및 Rz31B (Table. 4)를 PCR 반응시켰다. 증폭된 조각들은 BamHI 및 SalI으로 절단하고, 정제하고 pQE30에 연결하였다. 제조된 플라스미드 pQE30-Rz는 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) 균주 M15(pREP4)에 형질변환되었다.

실시예 17. 2. Φ Ep14 Rz 유전자 발현

에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) M15(pREP4, pQE30-Rz) 내에 Rz 유전자를 클로닝하기 위해, 이 균주를 앰피실린 (100 ㎍/㎖) 및 카나마이신 (25 ㎍/㎖)을 함유한 200 ㎖의 LB 배지에서 37℃로 배양하였다. OD₆₀₀ 0.5가 되면 배양액에 1 mM IPTG를 가하여 유도하고 200 rpm으로 한 시간 동안 배양하였다. 배양액은 6,000 x g로 10분간 원심분리하고, 침전물은 2.5 ㎖의 완충액 [10 mM 이미다졸, 0.3 M NaCl, 50 mM NaH₂PO₄ (pH 7.8)]에 현탁하였다. 음파처리 후 10,000 x g로 30분간 원심분리하여 투명한 세포 용균액을 얻었고 -80℃에 보관하였다. 단백질 농도는 Bio-Rad Bradford assay kit로 측정하였다.

실시예 17. 3. 플레이트 성장 저해 분석 ( Plate growth inhibition assay )

Rz 단백질에 대한 세균 균주의 민감성 (Table. 8)은 지표 세포 (indicator cells) 론이 자란 한천 플레이트 상에서 스팟 테스트로 분석하였다. 각 균주의 오버나잇 배양액 (100 ㎕)을 3 ㎖의 0.7 % NAGYE와 혼합하고 NAG 플레이트 표면에 가한 후 10 ㎕의 세포 용균액을 그 표면에 스팟팅하였다. 식물 병원균주의 경우 28℃로 오버나잇 배양하고 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) 균주는 37℃로 배양하여 저해 존을 체크하였다.

실시예 17. 4. 배양액 내에서 세포 성장 분석 ( Cell growth assay in culture )

E. 피리폴리애 균주 Ep16/96을 NBGYE 배지에서 28℃로 오버나잇 배양하였다. 오버나잇 배양액은 NBGYE 배지 내에서 6.5 X 10⁵ cfu/㎖가 되도록 희석하고 시험관에 분주하였다 (2 ㎖/tube). 다양한 양의 투명해진 세포 용균액 (10-200 ㎍의 총 단백질)을 가하여 28℃로 3일간 200 rpm으로 배양하였다. IPTG로 유도된 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) M15 (pREP4, pQE30)의 용균액을 음성 대조군으로 삼았다. 세균 성장속도는 600 ㎚의 광학밀도를 측정하여 모니터하였다.

실시예 18. 뉴클레오타이드 접근 번호 ( Nucleotide accession number )

본 발명의 ΦＥp14 뉴클레오타이드 서열은 젠뱅크 데이타베이스에 접근번호 JN585957로 기탁되어 있다.

<결과>

1. E. 피리폴리애 박테리오파아지 분리

E. 피리폴리애를 감염시킨 9개의 박테리오파아지를 아시아 배 가지검은마름병과 유사한 증상을 보이는 춘천 인근의 배 과수원에서 2005년 및 2007년 채취한 식물, 토양 및 물 시료로부터 분리하였다. ΦEp5는 천안의 배 과수원의 토양 시료에서 분리하였고, 그곳에서는 가지검은마름병 증세가 나타나지 않았으나, 식물에서 파아지 분리는 실패하였다. 이들 중 네 개는 조직에서 수집된 것이고, 네 가지는 토양 시료, 한 가지는 물 시료에서 수집된 것이다 (표 1). 본 발명에서 분리된 아홉 가지 파아지의 특성은 표 5에 나타내었다. 이들 분리체는 4℃ 보관시 비교적 안정적이었다.

2. 플라크 형태

기주인 E. 피리폴리애 균주 Ep16/96 론 상에서 플라크 형태를 조사하였다. 파아지 ΦEp4, ΦEp10-1, ΦEp13은 뚜렷한 투명 무리를 가진 1 내지 4 ㎜ 플라크를 만들었고, 플라크가 성장을 멈춘 후에도 확장을 계속 했다. 파아지 ΦEp12는 2-3 ㎜의 투명 플라크를 만들었고, 나머지는 0.5-1 ㎜의 깨끗한 플라크를 만들었다 (도 1, 도 2)

3. 전자 현미경

여섯 개의 파아지 입자의 형태를 투과 전자 현미경으로 관찰하였다 (도 3). 박테리오파아지는 Ackermann (2001, 2007) 및 Bradley (1967)의 방법에 따라 형태 유형으로 분류된다. 관찰된 모든 파아지는 꼬리가 있고, 따라서 카우도바이랄스 (Caudovirales)에 속한다. 파아지들은 형태학적 특성에 근거하여 두 패밀리 범주로 분류된다. 파아지 ΦEp4 및 ΦEp13은 대칭적인 헤드와 수축성 꼬리로 이루어진다. 다른 박테리오파아지들 ΦEp6, ΦEp11, ΦEp12 및 ΦEp14는 대칭적인 헤드와 좀더 짧고 수축성인 꼬리를 가진다. 따라서, 파아지 ΦEp4 및 ΦEp13은 미오비리대 (Myoviridae) 패밀리 또는 브래들리 (Bradley) 그룹 A1에 속하고, 파아지 ΦEp6, ΦEp11, ΦEp12 및 ΦEp14는 포도비리대 (Podoviridae) 패밀리 또는 브래들리 그룹 C1의 특징들과 일치한다. 박테리오파아지들의 형태학적 특징은 표 5에 요약되어 있다.

4. 기주 범위 ( Host range )

E. 아밀로보라 KACC10060^T , 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) DH5α 및 일곱 E. 피리폴리애 균주를 포함하는 식물 관련 세균에 대한 9종의 박테리오파아지의 기주 범위를 각 세균 론 상에서 조사하였다. 기주 범위 분석에 총 106개의 세균 균주를 사용하였다. 모든 파아지들이 7종의 E. 피리폴리애 균주, E. 아밀로보라 KACC10060^T, E. 페르시치나 KACC10053^T, E. 피시디 KCAA10086^T, 에르위니아 속 및 P. 스튜어티 아속 스튜어티 KACC10085^T를 감염시켰다. 시험 대상 106개의 세균 균주 중 각 파아지에 민감한 균주의 수는 다음과 같다: ΦEp3, 27; ΦEp4, 32; ΦEp5, 28; ΦEp6, 28; ΦEp10-1, 35; ΦEp11, 28; ΦEp12, 27; ΦEp13, 39; ΦEp14, 28. 파아지 ΦEp5, ΦEp6, ΦEp11 및 ΦEp14는 기주 범위가 동일하며, ΦEp10-1 및 ΦEp13은 기주 범위가 유사하다.

5. 서던 블랏에 의한 파아지 게놈 비교 ( Phage genome comparison by Southern blot )

E. 피리폴리애 균주 Ep16/96의 혼합 용균액 (crude lysates)으로부터 파아지 DNA를 분리하였다. 제한 효소 KpnI을 이용하여 DNA 제한 프로파일을 만들었으나, 파아지 ΦEp12는 KpnI (도 4) 저항성이었다. 파아지 ΦEp5 및 ΦEp14는 시료를 채취한 지역이 다르긴 하지만 동일한 제한 프로파일을 나타내었다 (표 1). 파아지 ΦEp6 및 ΦEp11은 유사한 제한 프로파일을 나타내었고, 이는 ΦEp5 및 ΦEp14의 것과도 유사하였다. 파아지 ΦEp10-1 및 ΦEp13은 유사한 제한 패턴을 나타내었다. 다른 파아지들은 구별되는 제한 패턴을 나타내었다.

파아지 게놈 간의 관련성을 조사하기 위해 서던 블랏 분석을 수행하였다 (도 5). 파아지 ΦEp4, ΦEp10-1 및 ΦEp14 용균액에서 얻은 게놈 DNA는 DIG로 표지하여 유사 DNA 서열을 탐지하는 탐침으로 이용하였다. 도 5는 파아지 ΦEp14, ΦEp3, ΦEp4 및 ΦEp10-1에 대하여 탐침으로 얻은 서던 블랏 결과를 나타낸다. 파아지 ΦEp14는 파아지 ΦEp5, ΦEp6 및 ΦEp11와 강하게 혼성화하였고, 파아지 ΦEp3와는 약하게 혼성화 결합하였다. 파아지 ΦEp4는 파아지 ΦEp10-1 및 ΦEp13와 약하게 결합하였고, 파아지 ΦEp10-1은 파아지 ΦEp4와 비교할 때 ΦEp13와 좀더 강하게 혼성화하였다. 따라서, 파아지 ΦEp5, ΦEp6, ΦEp11 및 ΦEp14는 ΦEp3보다 좀더 가까운 연관관계를 나타내었고, 파아지 ΦEp10-1 및 ΦEp13은 다른 파아지들보다 좀더 유사하다. 파아지 ΦEp12는 이들 파아지들과 완전히 달랐다.

6. 박테리오파아지 Φ Ep14 의 게놈 구성 및 규명

박테리오파아지 ΦEp14의 완전한 게놈 서열은 숏건 라이브러리 전략을 이용하여 결정하였다. 파아지 ΦEp14의 게놈은 이중 사슬 DNA 분자로서 60,714 bp이고, 평균 G+C 함량 62.78%이다. 숏건 라이브러리의 서열 어셈블리와 뒤이은 프라이머 이동 염기배열 결정법 (primer walking)으로 폐쇄된 원모양의 서열을 얻었다. ΦEp14 DNA는 제한효소 및 아가로즈 젤 분석을 통하여 원형 게놈의 특징을 보여주었다. ΦEp14 DNA는 게놈 서열에서 단 한 번 나타나는 AscⅠ 및 PflMI로 한 번 또는 두 번 절단하였다. 한 번만 자르는 제한효소 (AscⅠ 및 PflMI)로 게놈을 절단하면 DNA는 절단되지 않은 DNA와 젤 상에서 유사한 위치를 나타내었다. AscⅠ 및 PflMI로 두 번 절단하면 도 6과 같이 DNA 두 조각이 만들어진다. 따라서, 이는 ΦEp14 게놈이 고리모양으로 순서를 바꾸는 것을 암시한다.

ΦEp14 게놈에는 64개의 추정 단백질 코딩 부위가 있다. 54개의 추정 ORF에는 ATG 개시코돈이 있으며, 대체 개시코돈인 GTG가 10개의 추정 ORF에 있다. 64개의 ORF 중, 22개는 반대방향으로 전사된다 (도 7). 추정 ORF들은 BLASTp와 보존 도메인을 이용하여 분석하였다. 44개의 ORF에 대해 의미 있는 매치가 얻어졌고, 이 중 20개의 ORF에 대해서는 생물학적 기능이 결정되었다. tRNA 유전자는 발견되지 않았다.

7. 추정 Φ Ep14 유전자에 대한 생물정보공학적 분석

64 ORF의 추론된 아미노산 서열을 데이타베이스의 알려진 서열과 비교하여 기능이 알려진 유전자와의 유사성을 나타내었다. 각 단백질 간의 기능 결정 및 유의미한 유사성은 표 7에 제시되었다.

8. 파아지 Φ Ep14 의 ORF 들과 유사성

8. 1. ORF1 및 3

ORF1은 신트로포보툴루스 글리콜리쿠스 (Syntrophobotulus glycolicus) DSM 8271의 터미네이즈 작은 서브유닛 (236 aa 중 47% 동일성) 및 부르크홀데리아 (Burkholderia) 파아지 Bcep22의 gp36 (261 aa 중 45% 동일성)에 대해 유사성을 나타낸다. ORF3는 부르크홀데리아 (Burkholderia) 파아지 BcepIL02의 gp44 (521 aa 중 57% 동일성), 부르크홀데리아 (Burkholderia) 파아지 Bcep22의 gp49 (531 aa 중58% 동일성), 애시도보락스 아베내 (Acidovorax avenae) 아종 시트룰리 (citrulli) AAC00-1의 추정 터미네이즈 큰 서브유닛 단백질 (533 aa 중 53% 동일성), 및 다양한 다른 파아지 유래 터미네이즈의 큰 서브유닛과 유사성을 나타낸다.

8. 2. ORF2

ORF2는 보존 도메인 서치를 바탕으로 HTH_XRE 패밀리 유사 단백질을 코딩한다. ORF2는 예르시니아 슈도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis) IP 31578의 YpsI31758_A0035 (60 aa 중 55% 동일성)에 대해 유사성을 나타낸다. 바실러스 서브틸리스 (Bacillus substilis) 프로파아지 PBSX는 추정 HTH (Wood, 1990)를 포함하는 XRE 억제자를 코딩한다. 따라서, ORF2의 산물은 전사 억제자로 작용할 수 있다.

8. 3. ORF5

ORF5 유전자 산물은 파아지 마이너 테일 단백질을 코딩하며, 라넬라 속 (Rahnella sp.) Y9602의 파아지 마이너 테일 단백질 L (311 aa 중 29% 동일성)과 유사성을 나타낸다.

8. 4. ORF7

ORF7은 시노리조비움 (Sinorhizobium) 파아지 PBC5의 PBC5p43 (701 aa 중 57% 동일성), 오크로박테리움 인터미디움 (Ochrobactrum intermedium) LMG 3301의 OINT_3000019 (720 aa 중 54% 동일성), 로즈박터 속 (Roseobacter sp.) AzwK-3b의 RAZWK3N_16720 (688 aa 중 54% 동일성) 및 부르크홀데리아 (Burkholderia) 파아지 Bcep22의 gp51 (745 aa 중 51% 동일성)와 유사성을 나타낸다.

8. 5. ORF15

ORF15는 셀룰레이즈를 코딩하며, 에르위니아 (Erwinia) 파아지 vB_EamP-L1의 글라이코사이드 하이드롤레이즈 (488 aa 중 45% 동일성)에 유사성을 보이며, 아미노산 258-594 부위는 셀룰레이즈 (글라이코실 하이드롤레이즈 패밀리 5)(pfam00150)와 유사성을 나타낸다.

8. 6. ORF16

박테리오파아지가 코딩하는 디폴리머레이즈는 세균 세포 표면에 존재하는 다당류를 파괴한다 (Hughes, 1998). ORF16 유전자 산물은 EPS-디폴리머레이즈를 코딩하고, 에르위니아 (Erwinia) 파아지 vB_EamP-L1의 EPS-디폴리머레이즈 (684 aa 중 34% 동일성) 및 ΦEah1, ΦEa100, Era103와 같은 다른 E. 아밀로보라 박테리오파아지의 EPS-디폴리머레이즈와 유사성을 나타낸다. ΦEp14 EPS-디폴리머레이즈의 N-말단 (아미노산 8-82)은 calx-beta 도메인과 유사성을 나타낸다.

8. 7. ORF20

ORF20은 O. 인터미디움 (intermedium) LMG 3301의 OINT_3000033 (100 aa 중 45% 동일성) 및 시노리조비움 (Sinorhizobium) 파아지 PBC5의 PBC5g14 (100 aa 중 41% 동일성)과 유사성을 나타낸다. ORF20은 테일의 파이버 단백질을 코딩한다.

8. 8. ORF27

ORF27은 DNA 메틸레이즈 또는 헬리케이즈인 것으로 보이며, 아데닌 또는 사이토신과 같은 잔기에 메틸기를 가하거나 복제 이전 DNA를 푸는 역할을 한다. 가장 높은 유사성을 보인 것은 시노리조비움 파아지 PBC5의 추정 DNA 메틸레이즈 (1662 aa 중 57% 동일성 및 935 aa 중 44% 동일성)이며, ORF27의 두 부분 (aa 1733-3337 및 aa 3999-4914)에서 유사성을 나타내었다. 이는 또한 세균 유래 DNA 메틸레이즈 또는 헬리케이즈와 유사성을 보였다.

8. 9. ORF28 -32

서열 분석에서 용균 카세트 (lysis cassette)는 ORF28 내지 ORF32로 구성된다. ORF28 및 ORF29는 기주 세포의 용균에 관여하는 것으로 추측되었다. ORF28에 의해 코딩되는 유전자의 산물은 슈도모나스 (Pseudomonas) 파아지 PaP1의 엔도라이신 (191 aa 중 99% 동일성; Sun et al., 2010)과 가장 높은 서열 유사성을 나타내었다. 엔도라인신 (Endolysin)은 세포벽의 펩타이도글라이칸을 파괴한다. 분비신호 서열 (secretory signal sequence)이 부족하면, 대부분의 엔도라이신은 침투성 단백질인 홀린 (holin)의 도움 없이 뮤레인 (murein)에 도달하지 못한다. 홀린과 엔도라이신은 2요소 세포 용균 시스템을 이루는데, 이 효소들은 이중쇄 DNA 파아지에 의해 코딩된다. 홀린은 보통 1차 구조에 따라 두 종류로 분류된다. Ⅰ종 홀린 (ClassI holins)은 세 개의 트랜스멤브레인 도메인을 가지며, 반면 Ⅱ종 홀린은 두 개의 트랜스멤브레인 도메인을 가진다 (Young, 2000). ORF29에서 추정되는 아미노산 서열은 슈도모나스 브라시카세아룸 아속 (Pseudomonas brassicacearum subsp.) 브라시카세아룸 (brassicacearum) NFM421의 PSEBR_cmegm96 (117 aa 중 32% 동일성)과 유사성을 보인다. ORF29의 개시코돈은 앞쪽 (upstream)에 위치한 엔도라이신 유전자의 종결코돈과 하나의 뉴클레오타이드가 겹친다. 이는 ORF29 N-말단에 하나의 트랜스멤브레인 도메인이 있으며, C-말단 서열에 전하가 많아 홀린 서열과 결합하기에 좋은 특징을 나타낸다 (도 8). 따라서, ORF29에 의해 코딩된 산물은 홀린의 좋은 후보자가 될 수 있다. ORF30에서 추정되는 아미노산 서열은 P. syringae pv. syringae B728a로부터 추정되는 리포프로테인 (94 aa 중 33% 동일성)과 유사성을 나타낸다. ORF30에 의해 코딩되는 산물은 데이타베이스 내에서 알려진 홀린 서열과는 서열 유사성이 없음에도 불구하고 다른 홀린으로서 기능할 것으로 예상된다. 이것도 또한 홀린 서열 즉, 하나의 트랜스멤브레인 도메인과 C-말단 부분의 하전된 잔기와 관련된 대부분의 특징들을 나타낸다(도 9). ORF31은 Xenorhabdus nematophila ATCC19061의 XNC1_1187 (146 aa 중 50% 동일성), Rahnella sp. Y9602의 라이신 단백질 (174 aa 중 42% 동일성), X. bovienii SS-2004의 엔도펩티데이즈 (143 aa 중 47% 동일성) 및 몇몇 파아지의 추정 Rz 엔도펩티데이즈와 유사성을 나타내며, 보존 도메인 탐색 결과 아미노산 91 내지 185 유래 파아지 용균 도메인 (pfam03245, 9.93e-12)으로 밝혀졌다. ORF31이 코딩하는 산물은 하나의 트랜스멤브레인 도메인과 C-말단의 많이 대전된 (highly charged) 친수성 부분이다 (도 10). ORF32는 ORF31의 +1 리딩 프레임 내에 완전히 포함된 유전자 산물로서 (도 11), NCBI의 ORF finder를 통해 확인되었으며, GeneMark 및 Glimmer 프로그램으로는 발견되지 않았다. 이것은 101개의 아미노산 폴리펩타이드를 코딩하며, 프롤린 잔기를 많이 포함하고 (101개 잔기 중 18개), Escherichia coli O103:H2 str. 12009의 추정 리포프로테인 Rz1 전구체 (74 aa 중 47% 동일성)와 유사성을 보인다. 위에 언급한 바와 같이, ORF31은 하나의 트랜스멤브레인 도메인과 하전된 C-말단 서열을 가지며, 몇몇 파아지 유래 추정 Rz 엔도펩티데이즈와 유사성을 나타내며, 특히 ORF32에 포함되어 있다. 그러므로, 이는 ORF31이 Rz 단백질에 대응함을 암시한다.

8. 10. ORF33

ORF33의 산물은 파아지 인테그레이즈 (integrase)로 확인되었다. 이것은 Mesorhizobium loti MAFF303099의 인테그레이즈 후보자 (probable integrase) (365 aa 중 68% 동일성), Bradyrhizobium sp. BTAi1의 추정 인테그레이즈 (365 aa 중 67% 동일성), Oligotropha carboxidovorans OM5의 추정 인테그레이즈 (365 aa 중 67% 동일성) 및 Afipia sp. 1NLS2의 인테그레이즈 패밀리 단백질들 (365 aa 중 67% 동일성)과 매우 현저한 유사성을 보이며 보존적인 멀티도메인 INT_P4 (박테리오파아지 P4 인테그레이즈; cd00801, 1.19e-38)를 코딩하는데, 이는 잠재성 파아지, 삽입 플라스미드, 병원성 유전자 섬 및 공생 유전자 섬, 및 다른 이동성 유전자 요소들에서 발견된다. P4 인테그레이즈는 파아지 게놈과 박테리아 유전자에 위치하는 접합 부위 간의 삽입 및 제거 부위 특이적 재조합 반응을 매개한다. 또한, DNA 절단-재결합 효소, 인테그레이즈, 리콤비네이즈의 INT_REC_C (cd01182, 1.41e-15) C-말단 촉매 도메인은 파아지 φEp14 인테그레이즈 내에 존재한다. 파아지 람다와 같이, ORF33은 유전자 지도 상에서 왼쪽으로 전사되는데, 다시 말하면, 파아지의 대부분의 유전자와 반대방향으로 유전자 클러스터 내에 존재한다 (도 7).

8. 11. ORF35

ORF35는 HTH_17 (pfam12728, 9.27e-05)의 DNA-결합 나선-접힘-나선 도메인 (helix-turn-helix domain) 을 코딩하는데, 이는 전사 조절자로서 기능을 수행한다. 이것은 Xanthobacter autotrophicus Py2의 Xaut_0732 (67 aa 중 58% 동일성)와 유사성을 나타낸다.

8. 12. ORF43 및 ORF44

ORF43과 ORF44는 N-말단 (aa 17-62)에 HTH_XRE 모티프 (smart00530, 4.62e-05) 및 C-말단 (aa 131-169)에 HTH_IcIR (pfam09339,2.36e-05)의 IcIR 나선-접힘-나선 도메인을 각각 포함한다. ORF43이 코딩하는 유전자 산물은 Burkholderia 파아지의 Bcep22gp13 (174 aa 중 40% 동일성)과 유사성을 나타내며, ORF44는 Neisseria meningitidis MC58의 NMB2094 (72 aa 중 36% 동일성)와 유사성을 나타낸다.

8. 13. ORF51

ORF51은 아데닌-특이적 DNA 메틸레이즈를 코딩하며, Pantoea 속 aB의 MT-A70 패밀리 단백질 (203 aa 중 65% 동일성) 및 Enterobacter hormaechei ATCC 49162의 아데닌-특이적 DNA 메틸레이즈 (207 aa 중 60% 동일성)과 유사성을 나타낸다. MT-A70은 인간 mRNA 및 m6A 메틸트랜스퍼레이즈 (A-MTase)의 S-아데노실메티오닌-결합 서브유닛이며, mRNA 전구체 내에서 서열 특이적으로 아데닌을 메틸화한다.

8. 14. ORF53

ORF53은 파아지 O 패밀리 단백질인 것으로 보이며, Y. pseudotuberculosis IP 32953의 YPTB1793 (300 aa 중 44% 동일성), Pantoea ananatis AJ13355의 파아지 오리진 유래 추정 전사 조절자 (148 aa 중 55% 동일성) 및 E. pyrifoliae Ep1/96의 파아지 O 패밀리 단백질 (153 aa 중 53% 동일성)과 유사성을 나타낸다.

9. 파아지 φ Ep14 셀룰레이즈 유전자의 발현

650 bp 조각을 Cel15F1 및 Cel15R 프라이머를 이용하여 증폭하였다. PCR 산물은 벡터 pUC18 및 pUC19 내로 삽입되었다. 그 결과 얻어진 재조합 플라스미드는 각각 pCel15F1과 pCel15F1R로 표시하고, Escherichia coli JM109에 도입되었다. pCel15F1R은 전사 방향이 반대이다. pCel15F1, pCel15F1R 또는 pUC18을 함유한 Escherichia coli JM109를 1% CMC 및 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유한 LB 한천 플레이트에서 배양한 후 0.1% 콩고 레드 용액으로 플레이트를 염색하고, 1M NaCl로 탈색하였다. 플라스미드 pCel15F1은 셀룰레이즈 활성을 나타내었고, pCel15F1R은 약한 활성을 나타내었다 (도 12).

10. 파아지 φ Ep14 엑소폴리사카라이드 - 디폴리머레이즈의 일부 특성 규명

10. 1. 서열 분석

φEp14 ORF16은 Pantoea 파아지 및 E. amylovora 박테리오파아지의 EPS-디폴리머레이즈와 밀접한 관련이 있다. ORF16에 의해 코딩되는 EPS-디폴리머레이즈는 Erwinia 파아지 vB_EamP-L1의 같은 효소 (51% 유사성, 34% 동일성; Born et al., 2011), Pantoea 파아지 LIMElight의 같은 효소 (50% 유사성, 33% 동일성; Adriaenssens et al., 2011), Erwinia 파아지 ΦEa1h의 같은 효소 (50% 유사성, 33% 동일성; Kim and Geider, 2000; Muller et al., 2011a), Erwinia 파아지 ΦEa100의 같은 효소 (49% 유사성, 33% 동일성; Muller et al., 2011a), 및 Erwina 파아지 Era103의 같은 효소 (49% 유사성, 33% 동일성; Vandenbergh and Cole, 1986)와 현저한 유사성을 나타낸다. vB_EamP-L1, LIMElight, ΦEa1h, ΦEa100 및 Era103 유래 EPS-디폴리머레이즈들은 ORF16의 배열에서 구조적으로 보존된 부분을 공통적으로 가진다 (도 13).

10. 2. EPS - 디폴리머레이즈 유전자의 발현

프라이머 Dpo16K 및 Dpo16L을 이용하여 약 2,835 bp 크기의 조각을 증폭하였다. lac-프로모터의 제어 하에 프로모터 없는 유전자를 발현시키기 위해 PCR 산물을 벡터 pBGS18 및 pUC18 내로 클론하였다. lac-프로모터에 반하여, 이것을 pUC19 내로 서브클론 하였다. 재조합 플라스미드로 E. pyrifoliae를 형질변환하기 전에 EPS-디폴리머레이즈 유전자가 lac-프로모터의 제어 하에 E. pyrifoliae 내로 전사될 수 있는지를 시험하였다. pBGS18 또는 pUC18 내에서 lac-프로모터 제어 하에 녹색형광단백질 (Green Fluorescence protein; GFP) 유전자는 전자천공을 이용하여 E. pyrifoliae Ep16/96 균주 내로 도입되었다. 모든 E. pyrifoliae Ep16/96 세포에서 GFP가 발현되었고 (도 14), 이는 E. pyrifoliae 내에서 lac-프로모터가 EPS-디폴리머레이즈 유전자를 성공적으로 전사함을 가리킨다. 재조합 플라스미드 pUC18-Dpo16F 및 pUC19-Dpo16F는 E. pyrifoliae Ep16/96 균주 내로 전기형질변환되었고, pBGS18-Dpo16F는 단옥수수와 옥수수에 스튜어트 세균 시들음병과 잎마름병의 원인균인 P. stewartii 아속 stewartii KACC10085 내로 전기형질변환되었다. 1% 글루코스 함유 NA 플레이트에서 배양하면, E. pyrifoliae Ep16/96 균주 (pUC18-Dpo16F)는 점액이나 분비물을 생산하지 않았던 반면 (도 15B), pUC18 또는 pUC19-Dpo16F가 하보링된 균주에 의해서는 점액과 분비물이 생산되었다 (도 15A 및 15C). 따라서, 이러한 결과는 E. pyrifoliae에서 유리되는 엑소폴리사카라이드가 EPS-디폴리머레이즈에 의해 분해됨을 가리킨다. E. pyrifoliae 유래 엑소폴리사카라이드 (피리폴란; pyrifolan) 및 P. stewartii 유래 엑소폴리사카라이드의 반복 단위의 구조는 유사하다 (Kim et al., 2002; Nimtz et al., 1996). ΦEp14 EPS-디폴리머레이즈가 스튜아탄 (stewartan; P. stewartii의 엑소폴리사카라이드)을 분해하는지 시험하기 위해, P. stewartii 아종 stewartii KACC10085를 pBGS18-Dpo16F로 형질변환시켰다. P. stewartii 아종 stewartii KACC10085 균주 (pBGS18-Dpo16)는 노랗고 끈적이는 점액을 생성하지 않았고 (도 16B), 반면 대조군 플라스미드 pBGS18이 하보링된 균주는 점액을 생성하였다 (도 16A).

11. Φ Ep14 엔도라이신 특성 규명

11. 1. 서열 분석

ΦEp14 게놈의 41,947-41,537 뉴클레오타이드에 위치한 엔도라이신 유전자는 197 aa 단백질을 코딩하며, 계산된 분자량은 21.8 kDa이며, 예측 pI는 9.18이다. 이것은 Pseudomonas 파아지 PaP1 유래 엔도라이신 (67% 유사성, 49% 동일성; Sun et al., 2010), Pseudomonas 파아지 PAK_P1 유래 pg077 (67% 유사성, 49% 동일성; Debarbieux et al., 2010), Pantoea 종 aB 유래의 보존적 이론 단백질 (conserved hypothetical protein)(66% 유사성, 49% 동일성) 및 Pseudomonas 파아지 JG004의 엔도라이신 (66% 유사성, 48% 동일성; Garbe et al., 2011)과 유사성을 가진다.

11. 2. Φ Ep14 엔도라이신 유전자의 클로닝 및 발현

프라이머 Lys28F 및 Lys28R을 이용하여 PCR로 유전자를 증폭하여 발현벡터 pQE30에 끼워넣었다. 얻어진 플라스미드를 pLys28이라고 명명하고, Escherichia coli M15 (pREP4)에 형질변환하였고, 세포 밀도 (A₆₀₀) 0.5에서 IPTG를 가하여 엔도라이신 생산을 유도하였다. Escherichia coli M15(pREP4, pLys28) 세포의 총 단백질 추출물은 IPTG 유도 후 다양한 시간 간격 (0-4 hr)을 두어 SDS-PAGE로 분석하였다. 예상 분자량 약 23 kDa의 재조합 융합 단백질이 발현되었다 (도 17).

11. 3. Φ Ep14 엔도라이신의 활성

11. 3. 1. 자이모그램 분석

세균 세포벽에 대한 ΦEp14 엔도라이신의 용균 활성을 조사하기 위해 자이모그램 분석을 수행하였다 (도 18). IPTG로 유도된 Escherichia coli M15(pREP4, pLys28)의 총 단백질 추출물은 멸균된 E. pyrifoliae 또는 B. polyfermenticus SCD 세포를 함유하는 SDS-폴리아크릴아마이드 젤에서 분리되었다. 젤 복원 (renaturation) 후, 하나의 투명 띠가 약 23 kDa에서 발견되었는데 (도 18, 레인 4 및 6), 이는 SDS-PAGE에 의해 나타난 재조합 엔도라이신의 크기와 일치하였다.

11. 3. 2. 한천 웰-확산 분석 ( Agar well - diffusion assay )

pLys28 또는 pQE30이 하보링된 Escherichia coli M15(pREP4)의 유도된 배양액을 감압동결건조된 M. lysodeikticus 세포를 함유한 한천 플레이트 홀에 가하였다. 재조합 엔도라이신 단백질을 함유한 홀 주위에 투명한 부분이 관찰된 반면 (도 19A), 대조군 용해물은 용균 효과가 관찰되지 않았다 (도 19B).

11. 3. 3. 항균활성 분석

ΦEp14 엔도라이신을 외부에서 넣어주었을 때 성장 억제를 유도할 수 있는지를 시험하기 위해 Escherichia coli M15(pREP4, pLys28) 용해물을 생균 E. pyrifoliae Ep16/96이 있는 한천 플레이트 상에 스팟팅하였다. 이 효소는 E. pyrifoliae의 성장을 직접적으로 억제하지는 못하였다 (도 20).

12. Φ Ep14 Rz 단백질 특성 규명

12. 1. Φ Ep14 Rz 유전자 클로닝 및 발현

Rz 유전자를 PCR로 증폭한 다음 발현 벡터 pQE30에 클론하였다. 얻어진 플라스미드 pQE30-Rz를 Escherichia coli M15(pREP4)에 도입하여 OD₆₀₀ 값이 0.5일 때 IPTG를 가하여 Rz 유전자 발현을 유도하였다 (도 21). IPTG 유도 후 Escherichia coli 균주 M15(pREP4, pQE30-Rz)의 세포 성장이 억제되었고, 배양액에서는 세포 용균 현상이 나타났다. 유도되지 않은 쪽과 유도된 M15(pREP4, pQE30)의 배양액에서 성장에는 차이가 없었다.

12. 2. Rz 단백질 생산에 필요한 요건

처음에 E.coli 균주 DH5α는 재조합 플라스미드 선택용 클로닝 호스트 균주로 이용되었다. 앰피실린 함유 LB 플레이트 상에서 선택되었을 때 모든 저항성 콜로니에는 pQE30이 있었다. Rz 유전자의 발현이 Escherichia coli DH5α 세포에 치명적일 것으로 예측되었다. 재조합 플라스미드 선택은 Escherichia coli JM109 균주로도 가능했는데, 이는 pQE30-Rz를 하보링한 세포에 lac 억제자가 필요함을 가리키며, 플라스미드 pQE30-Rz가 Escherichia coli M15(pREP4) 내로 도입되었다. lac 억제자 유전자를 가진 플라스미드 pREP4는 Rz 단백질에 의한 세포 손상을 피하기 위해 IPTG가 없을 때 pQE-플라스미드 내에서 lac-프로모터를 억제하는 것이 중요하다. E.coli M15(pREP4, pQE30-Rz)가 앰피실린만을 함유한 배지에서 성장할 때 유도된 세포 용해물은 활성을 나타내지 않았으며 (도 22B), 이는 앰피실린과 카나마이신을 함유한 배지에서와 대조적이었다 (도 22C). pET15b에는 lac 억제자와 앰피실린-저항성 유전자가 있다. 유도된 Escherichia coli BL21(DE3) (pET15b-Rz) 용해물도 마찬가지로 활성이 없었다. 카나마이신-카셋을 함유하는 pET15b-RzKm이 하보링된 BL31(DE3)이 앰피실린과 카나마이신을 포함하는 배지에서 성장하였고, 유도된 용해물은 활성을 나타내었다. 이러한 결과들을 표 18에 요약하였다.

12. 3. 플레이트 성장 억제 분석 ( Plate growth inhibition assay )

ΦEp14 Rz 단백질에 영향을 받는 세균 균주를 조사하기 위해, 성장저해분석을 수행하였다. 시험된 대부분의 세균 균주들은 ΦEp14 Rz 단백질에 민감하였으나, 카나마이신 저항성 유전자를 발현하는 모든 균주들과 Delftia acidovorans KACC10255는 영향을 받지 않았으며, 네 개의 균주만이 약간 민감하였다: B. cepacia KACC10167, P. chlororaphis KACC10216, P. fluorescens ATCC31948 및 R. radiobacter KACC10798 (표 19 ~ 표 26).

12. 4. 배양액에서 E. pyrifoliae 성장 저해

유도된 Escherichia coli M15(pREP4, pQE30-Rz)에서 얻어진 세포 용해물을 2 ㎖의 접종시 ca. 1.3 X 10⁶ cfu인 E. pyrifoliae Ep16/96 배양액에 가하였고, 세포 성장은 광학 밀도 (A₆₀₀)를 측정하여 모니터하였다. 도 23과 같이, 세포 성장은 세포 용해물의 양에 의존적이었고, 반면 대조군 균주 M15(pREP4, pQE30)의 용해물은 세포 성장 저해에 아무런 영향도 없었다. 비록 M15(pREP4, pQE30-Rz) 용해물 유래 단백질 50 ㎍을 가하여 배양 24시가 후까지 세포 성장이 저해되었더라도, 세포 생존율은 회복되었다. 75 ㎍의 단백질을 함유하는 배지에서 세포 성장은 완전히 파괴되었고, 배양 후 72 시간 동안 배양액을 플레이팅해도 한천 상에 콜로니가 형성되지 않았다 (표 27).

12. 5. β 갈락토시데이즈 분비

앰피실린 함유 배지에서 배양된 Escherichia coli BL21(DE3)(pET15b-Rz) 또는 BL21(DE3)(pET15b-RzKm) 세포들에 IPTG 유도 후 세포 성장 지체가 유도되었고 (데이타 나타내지 않음), 이는 세포막 손상이 원인이라고 생각된다. Rz 단백질이 세포막 손상 효과를 나타내는지를 알아보기 위해, 이러한 플라스미드가 하보링된 Escherichia coli 균주들을 LB-X-Gal-IPTG를 함유한 한천 플레이트에서 배양하였다. Rz 유전자를 발현시키자 배지에 β 갈락토시데이즈가 분비되었다 (도 24). 이와 같은 결과들은 상기 성장 저해와 밀접한 관련이 있다.

12. 6. 효소 활성

ΦEp14 Rz 단백질이 효소 활성이 있는가를 알아보기 위해 기질로서 감압 동결건조한 M. lysodeikticus 세포를 이용하여 한천 웰-활산 분석을 수행하였다. 홀에 투명한 존이 나타나지 않았고, 열을 가하여 변성시킨 Rz 단백질 또한 투명 존이 없었다. 이 결과는 자연 상태 및 열 변성 상태의 Rz 단백질 모두 용균 활성을 나타내지 않음을 말해준다 (데이타 나타내지 않음).

12. 7. 열 변성된 Rz 단백질의 항균활성

짧은 시간 또는 긴 시간 열 변성시킨 후, ΦEp14 Rz 단백질을 함유한 세포 용해물은 E. pyrifoliae Ep16/96 론 상에서 여전히 세포 성장 저해를 나타내었다 (도 25). 따라서, Rz 단백질의 항균활성은 온전한 단백질 구조에 의존적이지 않았다. φEa1h 라이소자임에 대해서도 유사한 결과가 보고되었다 (Salm and Geider, 2004). 그러나, ΦEp14 Rz 단백질과 φEa1h 라이소자임 간의 서열 유사성은 매우 낮았다 (도 26).

13. Φ Ep14 Rz1 단백질의 부분적 특성 규명

13. 1. Φ Ep14 Rz1 유전자 클로닝과 발현

ΦEp14 Rz1 유전자를 Rz 유전자 내의 +1 리딩 프레임에 완전히 끼워넣었다. 프라이머 Rz1F 및 Rz1R을 이용하여, 유전자를 PCR로 증폭시키고 플라스미드 pQE30에 클로닝하였다. 제조된 플라스미드 pQE30-Rz1을 Escherichia coli M15(pREP4) 내로 도입하여 IPTG를 가하여 Rz1 유전자 발현을 유도하였다.

13. 2. 플레이트 성장 저해 분석 ( Plate growth inhibition assay )

IPTG로 유도한 후 M15(pREP4, pQE30-Rz1) 배양액에서 맑아진 세포 용균액을 제조하여 E. pyrifoliae Ep16/96 세포 론 상에서 저해 존의 형성을 시험하였다 (도 27). 용균액이 한천 상에 저해존을 형성하였다. 흥미롭게도 Rz1 유전자 발현은 Rz 유전자와 같이 활성 단백질 생산을 위해 배지 내에 필수적으로 카나마이신을 가해줄 필요가 있었다.

13. 3. 효소 활성

Rz1 단백질이 뮤라미데이즈 (muramidase) 활성을 나타내는지를 확인하기 위해 감압 동결건조된 M. lysodeikticus 세포로 한천 웰-확산 분석을 수행하였다 (도 28). 홀 주위에 투명한 존이 관찰되지 않았다.

13. 4. 열 변성된 Rz1 단백질의 항균 활성

열 변성된 Rz1 단백질이 E. pyrifoliae Ep16/96의 성장에 미치는 영향을 조사하였다. 놀랍게도 이 단백질은 Rz 단백질과 같은 결과를 보여주었다 (도 29).

국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC97010P 20111129

<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> New Bacteriophage Ep14 <130> hallym-srlim-ep14 <160> 19 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 60714 <212> DNA <213> bacteriophage Ep14 <400> 1 ggagtcaacc cactgaattt gcagaccagc cgatgccaac aaagaaaccg cctactcagg 60 caaaaaagaa tagagcgccg tctaagcgtt ctaggacgac cccgaacaaa gaagcgctga 120 cctcagacca gcaaaacttt gtggatgaac tgttgatgga tgagcacatg attggatggc 180 gtgcctacca gcgcgcctac aagtgctcta accgccgctc ctgcgagcag tcggcctctc 240 gcctgttgag tttggtcaag gtgcaggagg ccatcaagaa gggcatggcg gcccgttctg 300 agcgtattca gtacggtcag gatgagctgc tgcgtcgtct cgtccacatc gccaccgcag 360 acccgaacga gatcgttcac taccggcgcg actgctgccg tcactgtcac ggcatcgagc 420 accagtacca gtggcgcgat gagaacgagt tcgcagaggc attgctgaag gccagcgaac 480 gcgacgacga cgacgacggc ccgcagcgac cgctaccgac gaacgacggc ggctatggct 540 tcaaccctaa gcgcgagcct catcccgagt gcccgaactg cgacggtgac ggctatggcc 600 acatgcacgt cgaggacacg cgcttcctct ccggacctgc gcggatgctc tatgccggca 660 tggaaatgac 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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2305 2310 2315 2320 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2325 2330 2335 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2340 2345 2350 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2355 2360 2365 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2370 2375 2380 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2385 2390 2395 2400 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2405 2410 2415 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2420 2425 2430 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2435 2440 2445 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2450 2455 2460 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2465 2470 2475 2480 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2485 2490 2495 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2500 2505 2510 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2515 2520 2525 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2530 2535 2540 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2545 2550 2555 2560 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2565 2570 2575 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2580 2585 2590 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2595 2600 2605 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2610 2615 2620 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2625 2630 2635 2640 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2645 2650 2655 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2660 2665 2670 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2675 2680 2685 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2690 2695 2700 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2705 2710 2715 2720 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2725 2730 2735 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2740 2745 2750 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2755 2760 2765 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2770 2775 2780 Ala Ala Ala 2785 <210> 14 <211> 657 <212> PRT <213> phage Ea1h <400> 14 Met Pro Glu Thr Lys Ile Lys Pro Trp Asn Thr Glu Ile Trp Thr Asp 1 5 10 15 Ser Ile Ala Thr Leu Arg Thr Met Asp Pro Val Val Ser Gly His Thr 20 25 30 Val Glu Val Ala Gly Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gly Gly Lys 35 40 45 Phe Ala Tyr Asp Pro Asn Asp Thr Thr Thr Ala Asp Asp Gly Gly Phe 50 55 60 Thr Ile Val Thr Ala Thr Gly Lys Arg Phe Lys Arg Ala Asp Pro Ile 65 70 75 80 Asp Thr Leu Asp Ile Thr His Phe Gly Ala Tyr Cys Asn Gly Ile Ala 85 90 95 Asp Asp Met Phe Ala Val Val Arg Met Arg Ala Trp Ala Ala Thr Ile 100 105 110 Asn Ala Thr Phe Asn Pro Gly Val Arg Ile Pro Ser Gly Ile Thr Thr 115 120 125 Leu Ser Ala Tyr Asp Phe Gly Ser Ser Glu Leu Pro Ser Phe Lys Ile 130 135 140 Arg Gly Pro Glu Val Ala Tyr Gly Arg Ile Pro Ala Ala Gln Ile Gln 145 150 155 160 Pro Phe Asp Leu Ser Tyr Thr Gly Tyr Leu Ile Lys Val Lys Ala Arg 165 170 175 Arg Met Glu Val Ser Asn Leu Met Leu Ser Gly Val Gly Ser Gln Cys 180 185 190 Gly Phe Leu Glu Asn Thr Val Thr Arg Gly Asp Tyr Cys Arg Ile His 195 200 205 Gly Ile Gln Ala Arg Asn Leu Thr Gly Arg Ala Phe His Val Tyr Asp 210 215 220 Thr Ile Asp Thr Ala Val Thr Gln Cys Tyr Ser Thr Ser Gly Lys Ala 225 230 235 240 Ser Phe Phe Arg Thr Asp Trp Ser Asn Glu Asn Pro Gly Ala Trp Asp 245 250 255 His Pro Thr Ala Ile Tyr Ile Ala Asp Cys Asn Phe Glu Thr His Thr 260 265 270 Gly Glu Tyr Ala Val Ser Cys Ile Arg Ala Gly Gln Ser Val Met Arg 275 280 285 Asn Cys Trp Phe Asp Arg Asn Glu Arg Gly Phe Asp Ile Ser Gln Gly 290 295 300 Gly Trp Leu Leu Glu Asn Ile Thr Gln Glu Asn Ser Val Tyr Pro Ser 305 310 315 320 Ala Thr Gln Tyr Ala Lys Ile Val Gln Ile Arg Asn Arg Phe Thr Gln 325 330 335 Gly Lys Gly Met Asp Asp Thr Val Ser Gly Tyr Asp Pro Ser Gln Asp 340 345 350 Pro Ser Gly Gln Pro Pro Ser Trp Val Asn Ser Gly Tyr Glu Asn Gly 355 360 365 Thr Ala Glu Phe Ala Leu Leu Gly Phe Ile Asn Ser Gly Ser Met Ser 370 375 380 Tyr Gly Tyr Glu Ser Ser Gln Phe Lys Val Ser Asn Met Thr Ala Asn 385 390 395 400 Gln Val Trp Ile Asp Val Gly Ser Phe Thr Leu Ala Gly Ala Thr Gly 405 410 415 Glu Gly Ile Asn Leu Glu Phe Val Gly Ala Gly His Phe Asp Ala Ala 420 425 430 Thr Ser Asn Pro Arg Pro Asn Gly Thr Asn Tyr Gly Gly Gly Lys Thr 435 440 445 Thr Ile Met Met Gln Gln Lys Asp Ser Asp Ala Lys Ala Arg Ala Ser 450 455 460 Trp Phe Ser His Gly Ala Ser Pro Ile Val Ala Val Arg Val Ala Met 465 470 475 480 Asn Arg Asn Arg Pro His Val Tyr Ile Gln Leu Ala Pro Tyr Thr Gly 485 490 495 Pro Ile Ala Met Thr Val His Thr Ser Ser Lys Ser Asn Phe Glu Gly 500 505 510 Gly Ile His Tyr Tyr Gln Asn Ile Val Met Thr Glu Val Thr Ala Asp 515 520 525 Val Ala Ala Ala Ala Ala Pro Leu Ile Pro Ala Thr Trp Asn Val Ser 530 535 540 Asn Gly Asn Tyr Gly Leu Gly Met Gln Leu Asp Thr Gly Lys Leu Ala 545 550 555 560 Val Asp Gly Pro Ala Leu Ala Gly Ser Asn Ala Ser Ser His Phe Pro 565 570 575 Ile Gln Tyr Asn Gly Lys Asp Val Leu Leu Ala Val Gln Pro Ser Pro 580 585 590 Leu Ser Thr Arg Ile Gln Arg Cys Thr Ile Ala Thr Leu Pro Lys Ala 595 600 605 Thr Glu Asn Pro Tyr Gly Val Val Leu Val Ser Asp Ala Val Ser Gly 610 615 620 Lys Gly Val Thr Thr Trp Arg Met Ala Phe Cys Asp Gly Ser Ala Trp 625 630 635 640 Phe Thr Val Asp Gly Gly Thr Asn Leu Gly Thr Gly Thr Val Ser Asn 645 650 655 Thr <210> 15 <211> 657 <212> PRT <213> phage Ea100 <400> 15 Met Pro Glu Thr Lys Ile Lys Pro Trp Asn Thr Glu Ile Trp Thr Asp 1 5 10 15 Ser Ile Ala Thr Leu Arg Thr Met Asp Pro Val Val Ser Gly His Thr 20 25 30 Val Glu Val Ala Gly Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gly Gly Lys 35 40 45 Phe Ala Tyr Asp Pro Asn Asp Thr Thr Thr Ala Asp Asp Gly Gly Phe 50 55 60 Thr Ile Val Thr Ala Thr Gly Lys Arg Phe Lys Arg Ala Asp Pro Ile 65 70 75 80 Asp Thr Leu Asp Ile Thr His Phe Gly Ala Tyr Cys Asn Gly Ile Ala 85 90 95 Asp Asp Met Phe Ala Val Val Arg Met Arg Ala Trp Ala Ala Thr Ile 100 105 110 Asn Ala Thr Phe Asn Pro Gly Val Arg Ile Pro Ser Gly Ile Thr Thr 115 120 125 Leu Ser Ala Tyr Asp Phe Gly Ser Ser Glu Leu Pro Ser Phe Lys Ile 130 135 140 Arg Gly Pro Glu Val Ala Tyr Gly Arg Ile Pro Ala Ala Gln Ile Gln 145 150 155 160 Pro Phe Asp Leu Ser Tyr Thr Gly Tyr Leu Ile Lys Val Lys Ala Arg 165 170 175 Arg Met Glu Val Ser Asn Leu Met Leu Ser Gly Val Gly Ser Gln Cys 180 185 190 Gly Phe Leu Glu Asn Thr Val Thr Arg Gly Asp Tyr Cys Arg Ile His 195 200 205 Gly Ile Gln Ala Arg Asn Leu Thr Gly Arg Ala Phe His Val Tyr Asp 210 215 220 Thr Ile Asp Thr Ala Val Thr Gln Cys Tyr Ser Thr Ser Gly Lys Ala 225 230 235 240 Ser Phe Phe Arg Thr Asp Trp Ser Asn Glu Lys Pro Gly Ala Trp Asp 245 250 255 His Pro Thr Ala Ile Tyr Ile Ala Asp Cys Asn Phe Glu Thr His Thr 260 265 270 Gly Glu Tyr Ala Val Ser Cys Ile Arg Ala Gly Gln Ser Val Met Arg 275 280 285 Asn Cys Trp Phe Asp Arg Asn Glu Arg Gly Phe Asp Ile Ser Gln Gly 290 295 300 Gly Trp Leu Leu Glu Asn Ile Thr Gln Glu Asn Ser Val Tyr Pro Ser 305 310 315 320 Ala Thr Gln Tyr Ala Lys Ile Val Gln Ile Arg Asn Arg Phe Ala Gln 325 330 335 Gly Lys Gly Met Asp Asp Thr Val Ser Gly Tyr Asp Pro Ser Gln Asp 340 345 350 Pro Ser Gly Gln Pro Pro Ser Trp Val Asn Ser Gly Tyr Glu Asn Gly 355 360 365 Thr Ala Glu Phe Ala Leu Leu Gly Phe Ile Asn Ser Gly Ser Met Ser 370 375 380 Tyr Gly Tyr Glu Ser Ser Gln Phe Lys Val Ser Asn Met Thr Ala Asn 385 390 395 400 Gln Val Trp Ile Asp Val Gly Ser Phe Thr Leu Ala Gly Ala Thr Gly 405 410 415 Glu Gly Ile Asn Leu Glu Phe Val Gly Ala Gly His Phe Asp Ala Ala 420 425 430 Thr Ser Asn Pro Arg Pro Asn Gly Thr Asn Tyr Gly Gly Gly Lys Thr 435 440 445 Thr Ile Met Met Gln Gln Lys Asp Ser Asp Ala Lys Ala Arg Ala Ser 450 455 460 Trp Phe Ser His Gly Ala Ser Pro Ile Val Ala Val Arg Val Ala Met 465 470 475 480 Asn Arg Asn Arg Pro His Val Tyr Ile Gln Leu Ala Pro Tyr Thr Gly 485 490 495 Pro Ile Ala Met Thr Val His Thr Ser Ser Lys Ser Asn Phe Glu Gly 500 505 510 Gly Ile His Tyr Tyr Gln Asn Ile Val Met Thr Glu Val Thr Ala Asp 515 520 525 Val Ala Ala Ala Ala Ala Pro Leu Ile Pro Ala Thr Trp Asn Val Ser 530 535 540 Asn Gly Asn Tyr Gly Leu Gly Met Gln Leu Asp Thr Gly Lys Leu Ala 545 550 555 560 Val Asp Gly Pro Ala Leu Ala Gly Ser Asn Ala Ser Phe His Phe Pro 565 570 575 Ile Gln Tyr Asn Gly Lys Asp Val Leu Leu Ala Val Gln Pro Ser Pro 580 585 590 Leu Ser Thr Arg Ile Gln Arg Cys Thr Ile Ala Thr Leu Pro Lys Ala 595 600 605 Thr Lys Asn Pro Tyr Gly Val Val Leu Val Ser Asp Ala Val Ser Gly 610 615 620 Lys Gly Val Thr Thr Trp Arg Met Ala Phe Cys Asp Gly Ser Ala Trp 625 630 635 640 Phe Thr Val Asp Gly Gly Thr Asn Leu Gly Thr Gly Thr Val Ser Asn 645 650 655 Thr <210> 16 <211> 657 <212> PRT <213> phage Era103 <400> 16 Met Pro Glu Thr Lys Ile Lys Pro Trp Asn Thr Glu Ile Trp Thr Asp 1 5 10 15 Ser Ile Ala Thr Leu Arg Thr Met Asp Pro Val Val Ser Gly His Thr 20 25 30 Val Glu Val Ala Gly Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gly Gly Lys 35 40 45 Phe Ala Tyr Asp Pro Asn Asp Thr Thr Thr Ala Asp Asp Gly Gly Phe 50 55 60 Thr Ile Val Thr Ala Thr Gly Lys Arg Phe Lys Arg Ala Asp Pro Ile 65 70 75 80 Asp Thr Leu Asp Ile Thr His Phe Gly Ala Tyr Cys Asn Gly Ile Ala 85 90 95 Asp Asp Met Phe Ala Val Val Arg Met Arg Ala Trp Ala Ala Thr Ile 100 105 110 Asn Ala Thr Phe Asn Pro Gly Val Arg Ile Pro Ser Gly Ile Thr Thr 115 120 125 Leu Ser Ala Tyr Asp Phe Gly Ser Ser Glu Leu Pro Ser Phe Lys Ile 130 135 140 Arg Gly Pro Glu Val Ala Tyr Gly Arg Ile Pro Ala Ala Gln Ile Gln 145 150 155 160 Pro Phe Asp Leu Ser Tyr Thr Gly Tyr Leu Ile Lys Val Lys Ala Arg 165 170 175 Arg Met Glu Val Ser Asn Leu Met Leu Ser Gly Val Gly Ser Gln Cys 180 185 190 Gly Phe Leu Glu Asn Thr Val Thr Arg Gly Asp Tyr Cys Arg Ile His 195 200 205 Gly Ile Gln Ala Arg Asn Leu Thr Gly Arg Ala Phe His Val Tyr Asp 210 215 220 Thr Ile Asp Thr Ala Val Thr Gln Cys Tyr Ser Thr Ser Gly Lys Ala 225 230 235 240 Ser Phe Phe Arg Thr Asp Trp Ser Asn Glu Asn Pro Gly Ala Trp Asp 245 250 255 His Pro Thr Ala Ile Tyr Ile Ala Asp Cys Asn Phe Glu Thr His Thr 260 265 270 Gly Glu Tyr Ala Val Ser Cys Ile Arg Ala Gly Gln Ser Val Met Arg 275 280 285 Asn Cys Trp Phe Asp Arg Asn Glu Arg Gly Phe Asp Ile Ser Gln Gly 290 295 300 Gly Trp Leu Leu Glu Asn Ile Thr Gln Glu Asn Ser Val Tyr Pro Ser 305 310 315 320 Ala Thr Gln Tyr Ala Lys Ile Val Gln Ile Arg Asn Arg Phe Thr Gln 325 330 335 Gly Lys Gly Met Asp Asp Thr Val Ser Gly Tyr Asp Pro Ser Gln Asp 340 345 350 Pro Ser Gly Gln Pro Pro Tyr Trp Val Asn Ser Gly Tyr Glu Asn Gly 355 360 365 Thr Ala Glu Phe Ala Leu Leu Gly Phe Ile Asn Ser Gly Ser Met Ser 370 375 380 Tyr Gly Tyr Glu Ser Ser Gln Phe Lys Val Ser Asn Met Thr Ala Asn 385 390 395 400 Gln Val Trp Ile Asp Val Gly Ser Phe Thr Leu Ala Gly Ala Thr Gly 405 410 415 Glu Gly Ile Asn Leu Glu Phe Val Gly Ala Gly His Phe Asp Ala Ala 420 425 430 Thr Ser Asn Pro Arg Pro Asn Gly Thr Asn Tyr Gly Gly Gly Lys Thr 435 440 445 Thr Ile Met Met Gln Gln Lys Asp Ser Asp Ala Lys Ala Arg Ala Ser 450 455 460 Trp Phe Ser His Gly Ala Ser Pro Ile Val Ala Val Arg Val Ala Met 465 470 475 480 Asn Arg Asn Arg Pro His Val Tyr Ile Gln Leu Ala Pro Tyr Thr Gly 485 490 495 Pro Ile Ala Met Thr Val His Thr Ser Ser Lys Ser Asn Phe Glu Gly 500 505 510 Gly Ile His Tyr Tyr Gln Asn Ile Val Met Thr Glu Val Thr Ala Asp 515 520 525 Val Ala Ala Ala Ala Ala Pro Leu Ile Pro Ala Thr Trp Asn Val Ser 530 535 540 Asn Gly Asn Tyr Gly Leu Gly Met Gln Leu Asp Thr Gly Lys Leu Ala 545 550 555 560 Val Asp Gly Pro Ala Leu Ala Gly Ser Asn Ala Ser Phe His Phe Pro 565 570 575 Ile Gln Tyr Asn Gly Thr Asp Val Leu Leu Ala Val Gln Pro Ser Pro 580 585 590 Leu Ser Thr Arg Ile Gln Arg Cys Thr Ile Ala Thr Leu Pro Lys Ala 595 600 605 Thr Glu Asn Pro Tyr Gly Val Val Leu Val Ser Asp Ala Val Ser Gly 610 615 620 Asn Gly Val Thr Thr Trp Arg Met Ala Phe Cys Asp Gly Ser Ala Trp 625 630 635 640 Phe Thr Val Asp Gly Gly Thr Asn Leu Gly Thr Gly Thr Val Ser Asn 645 650 655 Thr <210> 17 <211> 178 <212> PRT <213> phage Ea1h <400> 17 Met Ser Val Lys Lys Ala Leu Ala Gly Gly Ala Cys Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Ala Ser Phe Phe Gly Ile Val Thr Asp Lys Val Arg Ile Ser 20 25 30 Gln Glu Gly Leu Glu His Leu Ile Asp Cys Glu Gly Cys Lys Arg Gln 35 40 45 Ala Tyr Lys Asp Gly Ala Gly Val Pro Thr Ala Gly Val Gly Ser Thr 50 55 60 Ile Gly Ile Val Met Gly Arg Leu Tyr Thr Asp Gly Glu Val Ala Lys 65 70 75 80 Met Leu Ala Lys Asp Val Met Ile Ala Glu Gln Cys Leu Asn Arg Asn 85 90 95 Val Lys Val Asp Leu Asn Gln Gly Glu Trp Asp Ala Tyr Val Ser Phe 100 105 110 Val Phe Asn Val Gly Cys Ser Ala Phe Val Ser Ser Thr Thr Tyr Arg 115 120 125 Ile Leu Asn Gly Val Lys Pro Gly Thr Arg Ile Gln Ala Cys Glu Ala 130 135 140 Met Gly Met Trp Asn Lys Ile Thr Val Asn Gly Val Lys Val Phe Ser 145 150 155 160 Gln Gly Val Tyr Asn Arg Arg Ile Lys Asp Met Ala Leu Cys Val Lys 165 170 175 Tyr Met <210> 18 <211> 351 <212> DNA <213> bacteriophage Ep14 <400> 18 atggatgacc tgacccctcc gggcggcctg tgggccagtc tgggtgttgc agtaaccggc 60 atcgtcggcg gtgcaatctg gctcgtccag aaactttcaa gcggttcggt cgatcgggca 120 ggcgaccggg ctgaagtcaa cattatcgcg gtgcttcagg aagagcggga caagtggcgg 180 gagctttaca ccgcctccga agctgagaag cgccagtatt ttcagcaatt catggaagcc 240 agctctcagg tgaatttact cacggagaag gtctcgatcc tgaccgagca ggtggaagcg 300 ctgaaaagtg aggtagagcg ccttaacacg gcgctggaga aaaaccgatg a 351 <210> 19 <211> 116 <212> PRT <213> bacteriophage Ep14 <400> 19 Met Asp Asp Leu Thr Pro Pro Gly Gly Leu Trp Ala Ser Leu Gly Val 1 5 10 15 Ala Val Thr Gly Ile Val Gly Gly Ala Ile Trp Leu Val Gln Lys Leu 20 25 30 Ser Ser Gly Ser Val Asp Arg Ala Gly Asp Arg Ala Glu Val Asn Ile 35 40 45 Ile Ala Val Leu Gln Glu Glu Arg Asp Lys Trp Arg Glu Leu Tyr Thr 50 55 60 Ala Ser Glu Ala Glu Lys Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Phe Met Glu Ala 65 70 75 80 Ser Ser Gln Val Asn Leu Leu Thr Glu Lys Val Ser Ile Leu Thr Glu 85 90 95 Gln Val Glu Ala Leu Lys Ser Glu Val Glu Arg Leu Asn Thr Ala Leu 100 105 110 Glu Lys Asn Arg 115

Claims (10)

1. 에르위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 및 에르위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora)에 대하여 용균능을 갖는 기탁번호 KACC 97010P의 박테리오파아지(Bacteriophage) ΦEp14.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파아지는 서열번호 1의 유전자 서열로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파아지 ΦEp14.
   
3. 제1항의 박테리오파아지 ΦEp14를 유효성분으로 포함하는, 아시아 배나무 가지검은마름병 (Asian pear blight) 또는 화상병 (fire blight)의 예방 또는 치료용 농약 조성물.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 농약 조성물은 수간주사 조성물, 생물제제 조성물, 비료 조성물, 영양 조성물, 식물 강화 조성물, 식물 보호 조성물, 토양 개량 조성물(soil conditioner composition) 또는 생산량 증가 조성물(yield enhancer composition)임을 특징으로 하는 농약 조성물.
   
5. 세균의 세포벽을 분해하여 용균하는 활성을 갖는 기탁번호 KACC97010P의 박테리오파아지 ΦEp14 엔도라이신과 트랜스멤브레인 도메인을 가지는 기탁번호 KACC97010P의 박테리오파아지 ΦEp14 홀린을 함께 처리하여 그램 양성균 또는 그램 음성균을 용균하는 방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 엔도라이신은 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시됨을 특징으로 하는 방법.
   
7. 제5항에 있어서, 상기 홀린은 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시됨을 특징으로 하는 방법.
   
8. 세균의 세포벽을 분해하여 용균하는 활성을 갖는 기탁번호 KACC97010P의 박테리오파아지 ΦEp14 엔도라이신과 트랜스멤브레인 도메인을 가지는 기탁번호 KACC97010P의 박테리오파아지 ΦEp14 홀린을 함유하는 아시아 배나무 가지검은마름병 (Asian pear blight) 또는 화상병 (fire blight)의 예방 또는 치료용 농약 조성물.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 농약 조성물은 수간주사 조성물, 생물제제 조성물, 비료 조성물, 영양 조성물, 식물 강화 조성물, 식물 보호 조성물, 토양 개량 조성물(soil conditioner composition) 또는 생산량 증가 조성물(yield enhancer composition)임을 특징으로 하는 농약 조성물.
   
10. 세균의 세포벽을 분해하여 용균하는 활성을 갖는 기탁번호 KACC97010P의 박테리오파아지 ΦEp14 엔도라이신과 트랜스멤브레인 도메인을 가지는 기탁번호 KACC97010P의 박테리오파아지 ΦEp14 홀린, 기탁번호 KACC97010P의 박테리오파아지 ΦEp14 Rz 및 기탁번호 KACC97010P의 박테리오파아지 ΦEp14 Rz1을 함유하는 항균제.

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