CN114478794A - 幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统及其表达纯化方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统及其表达纯化方法和应用，本发明筛选出一种天然的幽门螺旋杆菌噬菌体双组份裂解系统即穴蛋白和裂解酶蛋白序列，并在其蛋白序列N端添加具有穿透外膜的α螺旋型多肽和疏水型多肽，改造后的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统基因通过毕赤酵母表达系统进行发酵诱导表达，表达量高；进一步提供了无需经过破菌处理的分泌型表达方法，并且纯化步骤简单方便；通过体外实验发现改造的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统对幽门螺旋杆菌标准菌株ATCC700392具有很强的裂解能力，为治疗幽门螺旋杆菌感染的研究提供物质和理论基础。

Description

幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统及其表达纯化方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统及其表达纯化方法和应用。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)为革兰氏阴性菌，定植于胃黏膜深处，感染HP会导致慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤，甚至是胃癌。目前临床采用抗生素治疗幽门螺杆菌感染，例如有两联疗法：抗生素与祕制剂联用；三联或四联疗法：克拉霉素+甲硝唑+祕剂、奥美拉唑+阿莫西林+克拉霉素或四环素+甲硝唑+祕剂+奥美拉唑。其中，标准剂量铋剂为枸橼酸铋钾220mg。目前较常用的是标准抗生素三联或四联疗法，但大多数抗生素在胃内低pH环境中活性降低且不能穿透黏膜层直接杀灭细菌。不仅如此，大量多次服用抗生素病人依从性差，且由于大量使用抗生素多株幽门螺杆菌出现抗生素耐药性，甚至出现多重耐药菌和超级细菌。因此，幽门螺杆菌难以根除，迄今尚无单一药物能有效根除幽门螺杆菌。因而，亟需开发一种新型药物来替代传统抗生素疗法，以达到根除幽门螺杆菌的目的。
噬菌体(bacteriophage)是一种细菌病毒，广泛存在于自然界。噬菌体治疗细菌感染的应用并不是刚被发现，早在上世纪二十年代，噬菌体疗法已被应用到细菌感染的治疗中，由于其特异性高等优点被科学家所重视，但当噬菌体直接作为抗菌制剂时会产生抗噬菌体菌株，而且作为一种病毒，其生物安全性无法得到保障。噬菌体在侵染细菌后期会表达一种双组份裂解系统即穴蛋白-裂解酶。通过穴蛋白在细胞膜打孔的协助使得裂解酶作用于细菌细胞壁，达到裂解细菌的作用。研究者认为噬菌体裂解系统不易使细菌产生耐药性、特异性强且能杀死在黏膜表面定植病原菌。穴蛋白与裂解酶作为一种蛋白质，理化性质研究已经很成熟，可以对其进行修饰改造，具有新型抗菌制剂的潜力。
噬菌体裂解系统在体外裂解的过程中适合于革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌表面存在外膜，会阻碍噬菌体双组份裂解系统与细胞壁、细胞膜的作用，使双组份裂解系统对革兰阴性菌无效。因此，如何在体外直接裂解革兰阴性细菌是裂解酶应用中的一个重大挑战。沙门菌裂解酶Lys68结合有机酸可将细菌生物膜减少约1log；抗菌肽(AMPs)作为先天免疫系统的一部分，泛的存在于动物和植物中，以防止病原微生物入侵，由于其两亲性，有些AMPs自己能跨膜OM，可通过破坏细胞质膜或作用于细胞内靶点来杀死细菌，而Art-175代表了另一类合成酶，它是基于AMPs和裂解酶的融合而产生的，Ar-75是广谱羊骨髓29-氨基酸(SMAP-29)与革兰氏阴性特异性裂解酶KZ144的融合，与KZ144相比，At-175透过外膜杀死铜绿假单胞菌，包括多耐药菌株。裂解酶与有机酸的联合应用以及基于抗菌肽和裂解酶的融合蛋白为杀灭革兰氏阴性菌提供了新思路。
目前还没有关于幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶研究的相关文献专利的报道；幽门螺旋杆菌作为革兰氏阴性菌，其噬菌体双组份裂解系统无法从外到内裂解幽门螺旋杆菌。本领域亟需一种有效的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统，可以实现从外到内裂解幽门螺旋杆菌。
发明内容
本发明的目的之一是提供幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统的蛋白序列。
本发明的另一个目的是提供幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统基因在毕赤酵母中分泌型表达和纯化的方法及应用，本发明所述幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统应用于体外抑菌试验，表明对标准幽门螺旋杆菌株ATCC700392具有良好的裂解作用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统，其蛋白序列从N端到C端依次包括A2-A3，其中A2为天然幽门螺旋杆菌噬菌体穴蛋白；A3为天然幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶。
发明人发现，本发明所述的裂解系统能够特异性的对天然幽门螺旋杆菌具有裂解效果。
本发明所述的裂解系统N端可加入其表达的序列片段，在本发明的一些优选的实施例中，所述的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统，其蛋白序列从N端到C端依次包括A1-A2-A3或者B1-A2-A3；其中A1为α螺旋型多肽；A2为天然幽门螺旋杆菌噬菌体穴蛋白；A3为天然幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶；B1为疏水型多肽。
在本发明的一种具体的实施方式中，A1为α螺旋型多肽，辅助裂解幽门螺旋杆菌外膜。核苷酸序列为Seq ID No.5，氨基酸序列为Seq ID No.6。
在本发明的一种具体的实施方式中，A2为天然幽门螺旋杆菌噬菌体穴蛋白，裂解幽门螺旋杆菌细胞膜。核苷酸序列为Seq ID No.9，氨基酸序列为Seq ID No.10。
在本发明的一种具体的实施方式中，A3为天然幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶，裂解幽门螺杆菌细胞壁。核苷酸序列为Seq ID No.11，氨基酸序列为Seq ID No.12。
在本发明的一种具体的实施方式中，B1为疏水型多肽，辅助裂解幽门螺旋杆菌外膜。核苷酸序列为Seq ID No.7，氨基酸序列为Seq ID No.8。
本发明幽门螺旋杆菌噬菌体穴蛋白与裂解酶基因序列是从已报到的幽门螺旋杆菌噬菌体全基因组中分析获得。在Genbank中，具体参见Seq ID No.9和Seq ID No.11。
在本发明的一种实施例中，本发明所述的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统的蛋白序列，其序列结构从N端到C端依次包括A2-A3，具体的氨基酸序列为Seq ID No.16所示。
在本发明的一种实施例中，本发明所述的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统的蛋白序列，其序列结构从N端到C端依次包括A1-A2-A3，具体的氨基酸序列为Seq ID No.2。
在本发明的一种实施例中，本发明所述的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统的蛋白序列，其序列结构从N端到C端依次包括B1-A2-A3，具体的氨基酸序列为Seq ID No.4。
本发明还提供一种能够编码本发明所述的裂解系统的基因。为了增加宿主的表达效率，本发明将改造幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶核苷酸序列进行密码子偏好性优化。在本发明优选的实施方式中，当所述的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统基因序列从N端到C端依次为A2-A3时，其编码序列如Seq ID No.16所示；当所述的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统基因序列从N端到C端依次为A1-A2-A3时，其编码序列如Seq ID No.1所示；当所述的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统基因序列从N端到C端依次为B1-A2-A3时，其编码序列如Seq ID No.3所示。
本发明还提供能够表达本发明所述的裂解系统的宿主，在一些具体的实施例中，本发明是采用毕赤酵母为表达宿主。
本发明进一步提供一类包含能够编码本发明所述的裂解系统的基因的表达载体。在一种具体的实施例中，该表达载体属于pGAPZαA，携带α-信号肽介导目的蛋白分泌表达。为插入pGAPZαA中，在合成包含两种幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶基因序列时，在其N端补上Kex2、Ste13酶切位点(序列参见Seq ID No.13和Seq ID No.14)，并在两端分别添加了XhoI/XbaI酶切位点，序列参见Seq ID No.1和Seq ID No.3。再将其插入质粒pGAPZαA的XhoI/XbaI酶切位点。
另外，本发明还提供所述幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统的表达及纯化方法，具体为培养包含幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统基因的工程菌并在28～32℃培养16-20h后降低温度至24～26℃；收集上清纯化即得幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统。
本发明培养工程菌先升温后降温是为了提高幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统融合蛋白的表达。
本发明的方法对毕赤酵母宿主的种类没有任何限制。优选那些能够直接表达构象正确的目的蛋白的宿主。在一种实施例中所述的工程菌为毕赤酵母X33，将前述表达载体转化毕赤酵母X33的转化方法在本领域是公知的，例如电穿孔法等。
本发明诱导宿主表达蛋白的方法可采用本领域技术人员所公知的技术。在本发明优选的实施方式中，是在在30℃培养16-20h后降低温度至25℃再培养52-56h，使得目的蛋白可以获得更高效的表达。
本发明收集上清的方法可以按照本领域的常规方法，例如采用高速冷冻离心机离心收集。
本发明所述的纯化可以按照本领域的常规纯化方法，例如采用CaptoMMC离子交换层析，并通过梯度为20mM至1000mM的氯化钠溶液连续梯度洗脱包含α螺旋型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统融合蛋白和疏水型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统融合蛋白。
本发明还提供本发明所述的裂解系统在幽门螺旋杆菌裂解中的应用。
本发明还提供本发明所述的裂解系统在制备治疗慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜或胃癌药物中的应用。
本发明活性测定表明利用毕赤酵母分泌型表达制备得到α螺旋型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统融合蛋白和疏水型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统融合蛋白有活性。体外抑菌试验表明α螺旋型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统融合蛋白和疏水型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统融合蛋白均对幽门螺旋杆菌标准菌株ATCC700392具有很强的裂解能力。
本发明所提供的两种幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统，以及表达纯化幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统的方法具有以下优点：
通过在序列中引入A1或B1序列，可以提高了幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统裂解幽门螺旋杆菌标准菌株ATCC700392的能力。
在组成型表达系统中进行表达时，无需诱导剂，温度控制在25℃，分泌型表达α螺旋型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统融合蛋白和疏水型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统融合蛋白，无需经过破菌处理，且产量较高，其存在于菌体外，在直接离心收集发酵液上清后即可得到有活性的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统。
附图说明
图1.α螺旋型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白不同表达时间点发酵液上清电泳图。其中:1为marker，2为发酵0h发酵液上清，3为发酵24h发酵液上清，4为发酵48h发酵液上清，5为发酵72h发酵液上清，6为发酵96h发酵液上清。
图2.疏水型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白不同表达时间点发酵液上清电泳图。其中:1为marker，2为发酵0h发酵液上清，3为发酵24h发酵液上清，4为发酵48h发酵液上清，5为发酵72h发酵液上清，6为发酵96h发酵液上清。
图3.包含穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统融合蛋白不同表达时间点发酵液上清电泳图。其中:1为发酵0h发酵液上清，2为marker，3为发酵24h发酵液上清，4为发酵48h发酵液上清，5为发酵72h发酵液上清，6为发酵96h发酵液上清。
图4.α螺旋型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白弱阳离子纯化电泳图。其中:1为marker，2为柱前，3为穿出液，4为洗脱峰1，5为洗脱峰2，6为洗脱峰3(目的蛋白峰)，7为碱洗峰。
图5.疏水型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白弱阳离子纯化电泳图。其中:1为marker，2为柱前，3为穿出液，4为洗脱峰1，5为洗脱峰2，6为洗脱峰3前峰，7为洗脱峰3中间峰，8为洗脱峰3后峰,9为洗脱峰4(6-9峰为目的蛋白峰),10为碱洗峰。
图6.包含穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统融合蛋白阴离子纯化电泳图。其中:1为marker，2为柱前，3为穿出液，4为洗脱峰1，5为洗脱峰2，6为碱洗峰。
图7.α螺旋型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白处理菌体后的电镜图。
图8.疏水型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白处理菌体后的电镜图。
图9.包含穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统融合蛋白处理菌体后的电镜图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
材料：
菌株和质粒：表达菌株毕赤酵母X33购自MERCK，质粒pGAPZαA购自淼灵生物科技有限公司。幽门螺旋杆菌标准菌株ATCC700392购自上海北诺生物科技有限公司。
酶和试剂:
实施例中涉及分子生物学操作所用的酶均购于购自TakaRa，相应的操作步骤完全按照相关的产品说明书进行。
幽门螺旋杆菌液体培养基、幽门螺旋杆菌固体培养基、脱纤维绵羊血、幽门螺旋杆菌添加剂(含萘啶酮酸1mg、TMP 0.5mg、万古霉素0.3mg、两性霉素B0.2mg)均购自青岛海博生物，相应的配制方法完全按照相关的产品说明书进行。
溶菌酶(对照品)购自SIGMA。
实施例中所涉及的编码包含α螺旋型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统的核苷酸序列和包含疏水型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统的基因合成和测序工作由南京金斯瑞有限公司完成。
其他未标明来源的原、辅料均为市售产品。
实施例1：
包含α螺旋型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白的制备
一、包含α螺旋型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统表达载体和工程菌的构建
1、构建包含α螺旋型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统核苷酸序列：α螺旋型多肽和幽门螺旋杆菌噬菌体穴蛋白和裂解酶的多肽和核苷酸序列分别如下(Seq IDNo.5和Seq ID No.6，Seq ID No.9和Seq ID No.10，Seq ID No.11和Seq ID No.12)。设计采用连接臂连接的天然幽门螺旋杆菌噬菌体穴蛋白和裂解酶的核苷酸，在5’端加入α螺旋型多肽序列(基因序列为Seq ID No.5)获得包含α螺旋型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统核苷酸序列。按照毕赤酵母密码子偏好性对包含α螺旋型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统的穴蛋白和裂解酶核苷酸进行优化；得到最终的核苷酸序列如SeqID No.9和Seq ID No.11。在包含α螺旋型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统核苷酸序列两端引入XhoI/XbaI酶切位点、并补充Kex2、Ste13酶切位点，具体序列如Seq IDNo.1。
2、人工合成上述基因序列。通过XhoI/XbaI酶切位点插入到质粒pGAPZαA相应酶切位点中，构建成的重组质粒。
3、构建包含α螺旋型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统工程菌：将上述重组质粒通过电穿孔转化的方法导入到毕赤酵母X33中，构建包含α螺旋型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统工程菌。经测序，工程菌中的序列与设计一致。
二、工程菌的高密度发酵
接种工程菌阳性克隆100ul到20ml的LB培养基中，于30℃下摇床振荡培养过夜，按4％接种量接过夜菌于500ml的LB培养基，30℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度30℃，搅拌速度300rpm，通气量15L/min，pH为6.7，不断提高搅拌转速与通气量(转速最大1000rpm,通气量最大30L/min)以维持溶氧始终在30％以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉10g/L，蛋白胨20g/L，磷酸缓冲液终浓度100mmol/L,无氨基氮源14g/L，生物素4×10-4g/L,甘氨酸0.1wt％，pH为6～8。补料培养基：酵母浸出粉5g/L，蛋白胨30g/L，50％氨水和30％磷酸用于发酵过程中pH调控。α螺旋型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白不同表达时间点发酵液上清电泳图如图1所示。
当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30％以上；补料4hr-6hr后，降温至25℃，调节pH至6.0，溶氧不低于20％，继续培养52-54h后出罐，收集菌体。
发酵结束离心收集上清，上清蛋白浓度达到1-2mg/ml。
三、α螺旋型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白的纯化
α螺旋型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统发酵上清液经弱阳离子交换进行纯化，弱阳离子交换条件：缓冲液A-100mMNaAc-HAc，pH4.5；缓冲液B-100mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH4.5；0-100％B线性梯度60CV，出峰时改为等度；即可得到具有高纯度和活性α螺旋型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白，经电泳分析，纯度达到90％以上(图4)。
四、药敏试验：α螺旋型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白的活性
幽门螺旋杆菌标准ATCC700392复苏：按照说明书溶解ATCC700392冻干粉后，取100ul均匀涂抹于灭菌后的幽门螺旋杆菌固体培养基平皿中，至于37℃微氧环境(8％-10％CO2,5％-8％O2,82％-87％N2)中，孵育72h后观察菌落形态，同时做快速尿素酶试验，经验证ATCC700392是幽门螺旋杆菌。挑取单菌落，接种于幽门螺旋杆菌液体培养基中增殖48h，并用20mM磷酸缓冲液稀释至10-5(1000菌/ml)，待用。
α螺旋型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白溶液配制：用无菌纯化水将α螺旋型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白配制成10ug/ml、100ug/ml、1000ug/ml三个浓度，0.22um滤膜过滤后，备用。
溶菌酶(对照品)配制：用无菌纯化水将溶菌酶配制成10ug/ml、100ug/ml、1000ug/ml三个浓度，0.22um滤膜过滤后，备用。
药敏试验分别采用滤纸片法、液体法以及电镜观察来验证体外抑菌效果。
试验1(滤纸片法)
取100ul稀释至10-5的幽门螺旋杆菌涂布于幽门螺旋杆菌固体培养基平板，再分别取100ul稀释至10-5的大肠杆菌、铜绿假单胞菌和双歧杆菌涂布于普通琼脂固体培养基平板，每块平板分别贴灭菌滤纸片7个，滤纸片上分别加入20ul的灭菌水(阴性对照)、20ul的10ug/ml溶菌酶(阳性对照，总量0.2ug)、20ul的100ug/ml溶菌酶(阳性对照，总量2ug)、20ul的1000ug/ml溶菌酶(阳性对照，总量20ug)、20ul的10ug/mlα螺旋型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白(样品总量0.2ug)、20ul的100ug/mlα螺旋型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白(样品总量2ug)、20ul的1000ug/mlα螺旋型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白(样品总量20ug)。将涂布有幽门螺旋杆菌的平板置于37℃微氧环境(8％-10％CO2,5％-8％O2,82％-87％N2)，孵育72h后记录抑菌圈直径，重复3个平板。将涂布有双歧杆菌的平板置于37℃厌氧环境(厌氧箱)，孵育24h后记录抑菌圈直径，重复3个平板。将涂布有大肠杆菌、铜绿假单胞菌的平板置于37℃恒温培养箱，孵育24h后记录抑菌圈直径，重复3个平板。
结果显示(表1)α螺旋型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白对幽门螺旋杆菌标准ATCC700392具有较好的特异性裂解作用。
表1α螺旋型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白抑菌圈
Figure BDA0002777414380000091
Figure BDA0002777414380000101
试验2(液体法及电镜观察)
取100ul稀释至10-5的幽门螺旋杆菌液体，加入多孔板，再分别加入20ul的灭菌水(阴性对照)、20ul的溶菌酶(阳性对照)使溶菌酶终浓度分别为10ug/ml、100ug/ml和1000ug/ml、20ulα螺旋型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白使融合蛋白终浓度分别为10ug/ml、100ug/ml和1000ug/ml。至于37℃微氧环境(8％-10％CO2,5％-8％O2,82％-87％N2)，摇床孵育，在0h、6h、24h和30h时分别记录菌液吸光值(OD600)，每个样重复3次，每个时间点留样电镜观察。
结果显示(表2和图7)α螺旋型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白对幽门螺旋杆菌标准ATCC700392具有较强的裂解作用。
表2α螺旋型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白液体法吸光值
Figure BDA0002777414380000102
Figure BDA0002777414380000111
实施例2：
包含疏水型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白的制备
一、包含疏水型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统表达载体和工程菌的构建
1、构建包含疏水型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统核苷酸序列：疏水型多肽和幽门螺旋杆菌噬菌体穴蛋白和裂解酶的多肽和核苷酸序列分别如下(Seq ID No.7和Seq ID No.8，Seq ID No.9和Seq ID No.10，Seq ID No.11和Seq ID No.12)。设计采用连接臂连接的天然幽门螺旋杆菌噬菌体穴蛋白和裂解酶的核苷酸，在5’端加入疏水型多肽序列(基因序列为Seq ID No.7)获得包含疏水型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统核苷酸序列。按照毕赤酵母密码子偏好性对包含疏水型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统穴蛋白和裂解酶核苷酸进行优化；得到最终的核苷酸序列如下Seq ID No.9和Seq ID No.11。在包含疏水型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统核苷酸序列两端引入XhoI/XbaI酶切位点、并补充Kex2、Ste13酶切位点，具体序列如下Seq ID No.3。
2、人工合成上述基因序列。通过XhoI/XbaI酶切位点插入到质粒pGAPZαA相应酶切位点中，构建成的重组质粒。
3、构建包含疏水型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统工程菌：将上述重组质粒通过电穿孔转化的方法导入到毕赤酵母X33中，构建包含疏水型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统工程菌。经测序，工程菌中的序列与设计一致。
二、工程菌的高密度发酵
接种工程菌阳性克隆100ul到20ml的LB培养基中，于30℃下摇床振荡培养过夜，按4％接种量接过夜菌于500ml的LB培养基，30℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度30℃，搅拌速度300rpm，通气量15L/min，pH为6.7，不断提高搅拌转速与通气量(转速最大1000rpm,通气量最大30L/min)以维持溶氧始终在30％以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉10g/L，蛋白胨20g/L，磷酸缓冲液终浓度100mmol/L,无氨基氮源14g/L，生物素4×10-4g/L,甘氨酸0.1wt％，pH为6～8。补料培养基：酵母浸出粉5g/L，蛋白胨30g/L，50％氨水和30％磷酸用于发酵过程中pH调控。α螺旋型多肽幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白不同表达时间点发酵液上清电泳图如图2所示。
当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30％以上；补料4hr-6hr后，降温至25℃，调节pH至6.0，溶氧不低于20％，继续培养52-54h后出罐，收集菌体。
发酵结束离心收集上清，上清蛋白浓度达到1-2mg/ml。
三、疏水型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白的纯化
疏水型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统发酵上清液经弱阳离子交换进行纯化，弱阳离子交换条件：缓冲液A-100mMNaAc-HAc，pH4.5；缓冲液B-100mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH4.5；0-100％B线性梯度60CV，出峰时改为等度；即可得到具有高纯度和活性疏水型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白，经电泳分析，纯度达到90％以上(图5)。
四、药敏试验：疏水型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白的活性
幽门螺旋杆菌标准ATCC700392复苏：按照说明书溶解ATCC700392冻干粉后，取100ul均匀涂抹于灭菌后的幽门螺旋杆菌固体培养基平皿中，至于37℃微氧环境(8％-10％CO2,5％-8％O2,82％-87％N2)中，孵育72h后观察菌落形态，同时做快速尿素酶试验，经验证ATCC700392是幽门螺旋杆菌。挑取单菌落，接种于幽门螺旋杆菌液体培养基中增殖48h，并用20mM磷酸缓冲液稀释至10-5(1000菌/ml)，待用。
疏水型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白溶液配制：用无菌纯化水将疏水型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白配制成10ug/ml、100ug/ml、1000ug/ml三个浓度，0.22um滤膜过滤后，备用。
溶菌酶(对照品)配制：用无菌纯化水将溶菌酶配制成10ug/ml、100ug/ml、1000ug/ml三个浓度，0.22um滤膜过滤后，备用。
药敏试验分别采用滤纸片法、液体法以及电镜观察来验证体外抑菌效果。
试验1(滤纸片法)
取100ul稀释至10-5的幽门螺旋杆菌涂布于幽门螺旋杆菌固体培养基平板，再分别取100ul稀释至10-5的大肠杆菌、铜绿假单胞菌和双歧杆菌涂布于普通琼脂固体培养基平板，每块平板分别贴灭菌滤纸片7个，滤纸片上分别加入20ul的灭菌水(阴性对照)、20ul的10ug/ml溶菌酶(阳性对照，总量0.2ug)、20ul的100ug/ml溶菌酶(阳性对照，总量2ug)、20ul的1000ug/ml溶菌酶(阳性对照，总量20ug)、20ul的10ug/ml疏水型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白(样品总量0.2ug)、20ul的100ug/ml疏水型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白(样品总量2ug)、20ul的1000ug/ml疏水型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白(样品总量20ug)。将涂布有幽门螺旋杆菌的平板置于37℃微氧环境(8％-10％CO2,5％-8％O2,82％-87％N2)，孵育72h后记录抑菌圈直径，重复3个平板。将涂布有双歧杆菌的平板置于37℃厌氧环境(厌氧箱)，孵育24h后记录抑菌圈直径，重复3个平板。将涂布有大肠杆菌、铜绿假单胞菌的平板置于37℃恒温培养箱，孵育24h后记录抑菌圈直径，重复3个平板。
结果显示(表3)疏水型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白对幽门螺旋杆菌标准ATCC700392具有较好的特异性裂解作用。
表3疏水型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白抑菌圈
Figure BDA0002777414380000131
Figure BDA0002777414380000141
试验2(液体法及电镜观察)
取100ul稀释至10-5的幽门螺旋杆菌液体，加入多孔板，再分别加入20ul的灭菌水(阴性对照)、20ul的溶菌酶(阳性对照)使溶菌酶终浓度分别为10ug/ml、100ug/ml和1000ug/ml、20ul疏水型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白使融合蛋白终浓度分别为10ug/ml、100ug/ml和1000ug/ml。至于37℃微氧环境(8％-10％CO2,5％-8％O2,82％-87％N2)，摇床孵育，在0h、6h、24h和30h时分别记录菌液吸光值(OD600)，每个样重复3次，每个时间点留样电镜观察。
结果显示(表4和图8)疏水型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白对幽门螺旋杆菌标准ATCC700392具有较强的裂解作用。
表4疏水型多肽的幽门螺旋杆菌噬菌体三组分裂解系统融合蛋白液体法吸光值
Figure BDA0002777414380000142
Figure BDA0002777414380000151
实施例3：
包含穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统融合蛋白的制备
一、包含穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统表达载体和工程菌的构建
1、构建包含穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统核苷酸序列：幽门螺旋杆菌噬菌体穴蛋白和裂解酶的多肽和核苷酸序列分别如下(Seq ID No.9和SeqID No.10，Seq ID No.11和Seq ID No.12)。按照毕赤酵母密码子偏好性对包含穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统的穴蛋白和裂解酶核苷酸进行优化；得到最终的核苷酸序列如下Seq ID No.9和Seq ID No.11。在包含幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统核苷酸序列两端引入XhoI/XbaI酶切位点、并补充Kex2、Ste13酶切位点，具体序列如Seq ID No.15所示，氨基酸序列如Seq ID No.16所示。
2、人工合成上述基因序列。通过XhoI/XbaI酶切位点插入到质粒pGAPZαA相应酶切位点中，构建成的重组质粒。
3、构建包含穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统工程菌：将上述重组质粒通过电穿孔转化的方法导入到毕赤酵母X33中，构建包含穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统工程菌。经测序，工程菌中的序列与设计一致。
二、工程菌的高密度发酵
接种工程菌阳性克隆100ul到20ml的LB培养基中，于30℃下摇床振荡培养过夜，按4％接种量接过夜菌于500ml的LB培养基，30℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度30℃，搅拌速度300rpm，通气量15L/min，pH为6.7，不断提高搅拌转速与通气量(转速最大1000rpm,通气量最大30L/min)以维持溶氧始终在30％以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉10g/L，蛋白胨20g/L，磷酸缓冲液终浓度100mmol/L,无氨基氮源14g/L，生物素4×10-4g/L,甘氨酸0.1wt％，pH为6～8。补料培养基：酵母浸出粉5g/L，蛋白胨30g/L，50％氨水和30％磷酸用于发酵过程中pH调控。穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统融合蛋白不同表达时间点发酵液上清电泳图如图3所示。
当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30％以上；补料4hr-6hr后，降温至25℃，调节pH至6.0，溶氧不低于20％，继续培养52-54h后出罐，收集菌体。
发酵结束离心收集上清，上清蛋白浓度达到1-2mg/ml。
三、穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统融合蛋白的纯化
穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统发酵上清液经阴离子交换进行纯化，阴离子交换条件：缓冲液A-100mMTris-HCL，pH8.5；缓冲液B-100mM MTris-HCL+1M NaCl，pH8.5；0-100％B线性梯度60CV，出峰时改为等度；即可得到具有高纯度和活性穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统融合蛋白，经电泳分析，纯度达到90％以上(图6)。
四、药敏试验：穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统融合蛋白的活性
幽门螺旋杆菌标准ATCC700392复苏：按照说明书溶解ATCC700392冻干粉后，取100ul均匀涂抹于灭菌后的幽门螺旋杆菌固体培养基平皿中，至于37℃微氧环境(8％-10％CO2,5％-8％O2,82％-87％N2)中，孵育72h后观察菌落形态，同时做快速尿素酶试验，经验证ATCC700392是幽门螺旋杆菌。挑取单菌落，接种于幽门螺旋杆菌液体培养基中增殖48h，并用20mM磷酸缓冲液稀释至10-5(1000菌/ml)，待用。
穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统融合蛋白溶液配制：用无菌纯化水将穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统融合蛋白配制成10ug/ml、100ug/ml、1000ug/ml三个浓度，0.22um滤膜过滤后，备用。
溶菌酶(对照品)配制：用无菌纯化水将溶菌酶配制成10ug/ml、100ug/ml、1000ug/ml三个浓度，0.22um滤膜过滤后，备用。
药敏试验分别采用滤纸片法、液体法以及电镜观察来验证体外抑菌效果。
试验1(滤纸片法)
取100ul稀释至10-5的幽门螺旋杆菌涂布于幽门螺旋杆菌固体培养基平板，再分别取100ul稀释至10-5的大肠杆菌、铜绿假单胞菌和双歧杆菌涂布于普通琼脂固体培养基平板，每块平板分别贴灭菌滤纸片7个，滤纸片上分别加入20ul的灭菌水(阴性对照)、20ul的10ug/ml溶菌酶(阳性对照，总量0.2ug)、20ul的100ug/ml溶菌酶(阳性对照，总量2ug)、20ul的1000ug/ml溶菌酶(阳性对照，总量20ug)、20ul的10ug/ml穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统融合蛋白(样品总量0.2ug)、20ul的100ug/ml穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统融合蛋白(样品总量2ug)、20ul的1000ug/ml穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统融合蛋白(样品总量20ug)。将涂布有幽门螺旋杆菌的平板置于37℃微氧环境(8％-10％CO2,5％-8％O2,82％-87％N2)，孵育72h后记录抑菌圈直径，重复3个平板。将涂布有双歧杆菌的平板置于37℃厌氧环境(厌氧箱)，孵育24h后记录抑菌圈直径，重复3个平板。将涂布有大肠杆菌、铜绿假单胞菌的平板置于37℃恒温培养箱，孵育24h后记录抑菌圈直径，重复3个平板。
结果显示(表5)穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统融合蛋白对幽门螺旋杆菌标准ATCC700392具有较好的特异性裂解作用。
表5穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统融合蛋白抑菌圈
Figure BDA0002777414380000171
Figure BDA0002777414380000181
试验2(液体法及电镜观察)
取100ul稀释至10-5的幽门螺旋杆菌液体，加入多孔板，再分别加入20ul的灭菌水(阴性对照)、20ul的溶菌酶(阳性对照)使溶菌酶终浓度分别为10ug/ml、100ug/ml和1000ug/ml、20ul穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统融合蛋白使融合蛋白终浓度分别为10ug/ml、100ug/ml和1000ug/ml。至于37℃微氧环境(8％-10％CO2,5％-8％O2,82％-87％N2)，摇床孵育，在0h、6h、24h和30h时分别记录菌液吸光值(OD600)，每个样重复3次，每个时间点留样电镜观察。
结果显示(表6和图9)穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统融合蛋白对幽门螺旋杆菌标准ATCC700392具有一定的特异性裂解作用。
表6穴蛋白和裂解酶的幽门螺旋杆菌噬菌体二组分裂解系统融合蛋白液体法吸光值
Figure BDA0002777414380000182
需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏万邦医药科技有限公司
江苏万邦生化医药集团有限责任公司
<120> 幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统及其表达纯化方法和应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 663
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcgagaaga gagaagctga agctatctgg ctgactgctt tgaaatttct tggaaaacat 60
gctgccaaga aattagctaa gcaacagctg tccaagttgg gcgctggtgc catgcaacaa 120
cacctggtta ttctaggtta cgagacgtcc aagcttattc cttatctttt ggttgccacc 180
ataggtttat ttgttggatt tctatacgtg ctgagaacta tacgtcctaa agagcttaag 240
aacaagactg aaaaagcttt ctacataata caaggcgttg gcagttccat gttgataacc 300
tggatatcat atgaaattgc cgactacttc ttcaaattgc caatatctct gtgcgtggct 360
atctccggtg gtgtcggata ccttggatct gactccgtat cagttttggt actagatatt 420
ctgaagaaac gtctgggcgc tggtgccatg gacttgacga atttggagga tgcactgaat 480
aacggtaatt ttaaagagca agtttatagt ggattggatg gtgtgtatag gatttcaaag 540
gtattgaacc aattagattt attgaagaat ttttcagagc atgatcttga aatagtcggt 600
ggcaatggct gggtttttca cgaacatagt caagcaattg tttatgaaat tttgaaatct 660
aga 663
<210> 2
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Trp Leu Thr Ala Leu Lys Phe Leu Gly Lys His Ala Ala Lys Lys
1 5 10 15
Leu Ala Lys Gln Gln Leu Ser Lys Leu Gly Ala Gly Ala Met Gln Gln
20 25 30
His Leu Val Ile Leu Gly Tyr Glu Thr Ser Lys Leu Ile Pro Tyr Leu
35 40 45
Leu Val Ala Thr Ile Gly Leu Phe Val Gly Phe Leu Tyr Val Leu Arg
50 55 60
Thr Ile Arg Pro Lys Glu Leu Lys Asn Lys Thr Glu Lys Ala Phe Tyr
65 70 75 80
Ile Ile Gln Gly Val Gly Ser Ser Met Leu Ile Thr Trp Ile Ser Tyr
85 90 95
Glu Ile Ala Asp Tyr Phe Phe Lys Leu Pro Ile Ser Leu Cys Val Ala
100 105 110
Ile Ser Gly Gly Val Gly Tyr Leu Gly Ser Asp Ser Val Ser Val Leu
115 120 125
Val Leu Asp Ile Leu Lys Lys Arg Leu Gly Ala Gly Ala Met Asp Leu
130 135 140
Thr Asn Leu Glu Asp Ala Leu Asn Asn Gly Asn Phe Lys Glu Gln Val
145 150 155 160
Tyr Ser Gly Leu Asp Gly Val Tyr Arg Ile Ser Lys Val Leu Asn Gln
165 170 175
Leu Asp Leu Leu Lys Asn Phe Ser Glu His Asp Leu Glu Ile Val Gly
180 185 190
Gly Asn Gly Trp Val Phe His Glu His Ser Gln Ala Ile Val Tyr Glu
195 200 205
Ile Leu Lys
210
<210> 3
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcgagaaga gagaagctga agctggtttc ttcattccag cagtcatctt gccatccatc 60
gctttcttaa tagtgccagg tgctggagct atgcaacaac acctggttat tctaggttac 120
gagacgtcca agcttattcc ttatcttttg gttgccacca taggtttatt tgttggattt 180
ctatacgtgc tgagaactat acgtcctaaa gagcttaaga acaagactga aaaagctttc 240
tacataatac aaggcgttgg cagttccatg ttgataacct ggatatcata tgaaattgcc 300
gactacttct tcaaattgcc aatatctctg tgcgtggcta tctccggtgg tgtcggatac 360
cttggatctg actccgtatc agttttggta ctagatattc tgaagaaacg tctgggcgct 420
ggcgctatgg acttgacgaa tttggaggat gcactgaata acggtaattt taaagagcaa 480
gtttatagtg gattggatgg tgtgtatagg atttcaaagg tattgaacca attagattta 540
ttgaagaatt tttcagagca tgatcttgaa atagtcggtg gcaatggctg ggtttttcac 600
gaacatagtc aagcaattgt ttatgaaatt ttgaaatcta ga 642
<210> 4
<211> 204
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Phe Phe Ile Pro Ala Val Ile Leu Pro Ser Ile Ala Phe Leu Ile
1 5 10 15
Val Pro Gly Ala Gly Ala Met Gln Gln His Leu Val Ile Leu Gly Tyr
20 25 30
Glu Thr Ser Lys Leu Ile Pro Tyr Leu Leu Val Ala Thr Ile Gly Leu
35 40 45
Phe Val Gly Phe Leu Tyr Val Leu Arg Thr Ile Arg Pro Lys Glu Leu
50 55 60
Lys Asn Lys Thr Glu Lys Ala Phe Tyr Ile Ile Gln Gly Val Gly Ser
65 70 75 80
Ser Met Leu Ile Thr Trp Ile Ser Tyr Glu Ile Ala Asp Tyr Phe Phe
85 90 95
Lys Leu Pro Ile Ser Leu Cys Val Ala Ile Ser Gly Gly Val Gly Tyr
100 105 110
Leu Gly Ser Asp Ser Val Ser Val Leu Val Leu Asp Ile Leu Lys Lys
115 120 125
Arg Leu Gly Ala Gly Ala Met Asp Leu Thr Asn Leu Glu Asp Ala Leu
130 135 140
Asn Asn Gly Asn Phe Lys Glu Gln Val Tyr Ser Gly Leu Asp Gly Val
145 150 155 160
Tyr Arg Ile Ser Lys Val Leu Asn Gln Leu Asp Leu Leu Lys Asn Phe
165 170 175
Ser Glu His Asp Leu Glu Ile Val Gly Gly Asn Gly Trp Val Phe His
180 185 190
Glu His Ser Gln Ala Ile Val Tyr Glu Ile Leu Lys
195 200
<210> 5
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atctggctga ctgctttgaa atttcttgga aaacatgctg ccaagaaatt agctaagcaa 60
cagctgtcca agttg 75
<210> 6
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ile Trp Leu Thr Ala Leu Lys Phe Leu Gly Lys His Ala Ala Lys Lys
1 5 10 15
Leu Ala Lys Gln Gln Leu Ser Lys Leu
20 25
<210> 7
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtttcttca ttccagcagt catcttgcca tccatcgctt tcttaatagt gcca 54
<210> 8
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Phe Phe Ile Pro Ala Val Ile Leu Pro Ser Ile Ala Phe Leu Ile
1 5 10 15
Val Pro
<210> 9
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgcaacaac acctggttat tctaggttac gagacgtcca agcttattcc ttatcttttg 60
gttgccacca taggtttatt tgttggattt ctatacgtgc tgagaactat acgtcctaaa 120
gagcttaaga acaagactga aaaagctttc tacataatac aaggcgttgg cagttccatg 180
ttgataacct ggatatcata tgaaattgcc gactacttct tcaaattgcc aatatctctg 240
tgcgtggcta tctccggtgg tgtcggatac cttggatctg actccgtatc agttttggta 300
ctagatattc tgaagaaacg tctg 324
<210> 10
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Gln Gln His Leu Val Ile Leu Gly Tyr Glu Thr Ser Lys Leu Ile
1 5 10 15
Pro Tyr Leu Leu Val Ala Thr Ile Gly Leu Phe Val Gly Phe Leu Tyr
20 25 30
Val Leu Arg Thr Ile Arg Pro Lys Glu Leu Lys Asn Lys Thr Glu Lys
35 40 45
Ala Phe Tyr Ile Ile Gln Gly Val Gly Ser Ser Met Leu Ile Thr Trp
50 55 60
Ile Ser Tyr Glu Ile Ala Asp Tyr Phe Phe Lys Leu Pro Ile Ser Leu
65 70 75 80
Cys Val Ala Ile Ser Gly Gly Val Gly Tyr Leu Gly Ser Asp Ser Val
85 90 95
Ser Val Leu Val Leu Asp Ile Leu Lys Lys Arg Leu
100 105
<210> 11
<211> 210
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggacttga cgaatttgga ggatgcactg aataacggta attttaaaga gcaagtttat 60
agtggattgg atggtgtgta taggatttca aaggtattga accaattaga tttattgaag 120
aatttttcag agcatgatct tgaaatagtc ggtggcaatg gctgggtttt tcacgaacat 180
agtcaagcaa ttgtttatga aattttgaaa 210
<210> 12
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Asp Leu Thr Asn Leu Glu Asp Ala Leu Asn Asn Gly Asn Phe Lys
1 5 10 15
Glu Gln Val Tyr Ser Gly Leu Asp Gly Val Tyr Arg Ile Ser Lys Val
20 25 30
Leu Asn Gln Leu Asp Leu Leu Lys Asn Phe Ser Glu His Asp Leu Glu
35 40 45
Ile Val Gly Gly Asn Gly Trp Val Phe His Glu His Ser Gln Ala Ile
50 55 60
Val Tyr Glu Ile Leu Lys
65 70
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aagagagaag ctgaagct 18
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Lys Arg Glu Ala Glu Ala
1 5
<210> 15
<211> 576
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctcgagaaga gagaagctga agctatgcaa caacacctgg ttattctagg ttacgagacg 60
tccaagctta ttccttatct tttggttgcc accataggtt tatttgttgg atttctatac 120
gtgctgagaa ctatacgtcc taaagagctt aagaacaaga ctgaaaaagc tttctacata 180
atacaaggcg ttggcagttc catgttgata acctggatat catatgaaat tgccgactac 240
ttcttcaaat tgccaatatc tctgtgcgtg gctatctccg gtggtgtcgg ataccttgga 300
tctgactccg tatcagtttt ggtactagat attctgaaga aacgtctggg cgctggtgcc 360
atggacttga cgaatttgga ggatgcactg aataacggta attttaaaga gcaagtttat 420
agtggattgg atggtgtgta taggatttca aaggtattga accaattaga tttattgaag 480
aatttttcag agcatgatct tgaaatagtc ggtggcaatg gctgggtttt tcacgaacat 540
agtcaagcaa ttgtttatga aattttgaaa tctaga 576
<210> 16
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Met Gln Gln His Leu Val Ile Leu Gly Tyr Glu Thr Ser Lys Leu Ile
1 5 10 15
Pro Tyr Leu Leu Val Ala Thr Ile Gly Leu Phe Val Gly Phe Leu Tyr
20 25 30
Val Leu Arg Thr Ile Arg Pro Lys Glu Leu Lys Asn Lys Thr Glu Lys
35 40 45
Ala Phe Tyr Ile Ile Gln Gly Val Gly Ser Ser Met Leu Ile Thr Trp
50 55 60
Ile Ser Tyr Glu Ile Ala Asp Tyr Phe Phe Lys Leu Pro Ile Ser Leu
65 70 75 80
Cys Val Ala Ile Ser Gly Gly Val Gly Tyr Leu Gly Ser Asp Ser Val
85 90 95
Ser Val Leu Val Leu Asp Ile Leu Lys Lys Arg Leu Gly Ala Gly Ala
100 105 110
Met Asp Leu Thr Asn Leu Glu Asp Ala Leu Asn Asn Gly Asn Phe Lys
115 120 125
Glu Gln Val Tyr Ser Gly Leu Asp Gly Val Tyr Arg Ile Ser Lys Val
130 135 140
Leu Asn Gln Leu Asp Leu Leu Lys Asn Phe Ser Glu His Asp Leu Glu
145 150 155 160
Ile Val Gly Gly Asn Gly Trp Val Phe His Glu His Ser Gln Ala Ile
165 170 175
Val Tyr Glu Ile Leu Lys
180

Claims (10)

1.一种幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统，其特征在于，其蛋白序列从N端到C端依次包括A2-A3或者A1-A2-A3或者B1-A2-A3；其中A1为α螺旋型多肽；A2为天然幽门螺旋杆菌噬菌体穴蛋白；A3为天然幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶；B1为疏水型多肽。
2.根据权利要求1所述的裂解系统，其特征在于，A1核苷酸序列为Seq ID No.5，氨基酸序列为Seq ID No.6；A2核苷酸序列为Seq ID No.9，氨基酸序列为Seq ID No.10；A3核苷酸序列为Seq ID No.11，氨基酸序列为Seq ID No.12；B1核苷酸序列为Seq ID No.7，氨基酸序列为Seq ID No.8。
3.根据权利要求1所述的裂解系统，其特征在于，所述的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统的氨基酸序列为Seq ID No.15。
4.根据权利要求1所述的裂解系统，其特征在于，所述的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统的氨基酸序列为Seq ID No.2或Seq ID No.4。
5.编码权利要求1～4任一项所述的裂解系统的基因。
6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于，基因序列为Seq ID No.16或Seq ID No.1或Seq ID No.3所示的核苷酸序列。
7.能够表达权利要求1～4任一项所述的裂解系统的宿主；优选的，所述宿主为毕赤酵母。
8.包含能够编码权利要求1～4任一项所述的裂解系统的基因的表达载体。
9.权利要求1～4任一项所述的裂解系统的表达及纯化方法，其特征在于，具体为培养包含幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统基因的工程菌并在28～32℃培养16-20h后降低温度至24～26℃；收集上清纯化即得幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统。
10.权利要求1～4任一项所述的裂解系统在幽门螺旋杆菌裂解或制备治疗慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜或胃癌药物中的应用。
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Citations (3)

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