PT96994B

PT96994B - Metodo para purificacao da gp12o de hiv, de forma a proporcionar um glicopeptido

Info

Publication number: PT96994B
Application number: PT96994A
Authority: PT
Inventors: Nancy L Haighwood; Carl Scandella
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 1990-03-09
Filing date: 1991-03-08
Publication date: 1998-07-31
Also published as: CA2077753C; CA2077753A1; JP2624894B2; PT96994A; ATE207930T1; EP0519001B1; IE910779A1; EP0519001A1; WO1991013906A1; DE69132795D1; JPH09227588A; EP0519001B2; JPH05505616A; DE69132795T3; DE69132795T2

Description

DIRECÇÃO DE SERVIÇOS DE PATENTES

NÃO PREENCHER AS ZONAS SOMBREADAS

CAMPO DAS CEBOLAS, 1100 LISBOA TEL.: 888 51 51 / 2/ 3TELEX: 18356 INPI TELEFAX :8753 08

FOLHA DO RESUMO (Continuação)

Modalidade e n.° (íj)	TD	Data do pedido (22)	Classificação Internacional (51)
Resumo (continuação) (57) é uma glicoproteina de tamanho total, recombinante, de não fusão, gpl20 de HIV, tendo propriedades de interacção proteina/proteína, substancialmente idênticas à gpl20, como representado num vírus de HIV, incluindo afinidade de ligação para 0 CD4 e afinidade de ligação para, pelo menos, um anticorpo capaz da neutralizar a infectividade do HIV. • 1 i

DSM-5 -JMXffiEggSffi&nsK»-----------Titular; CHIRON CORPORATION

Epígrafe; METODQ PARA PORIFICAÇAO da gp!20 de HIV , DE FORMA A

PROPORCIONAR UM GLICOPEPTIDO

MEMÓRIA DESCRITIVA

Introdução

Campo do invento presente invento está relacionado, de uma forma com o campo da purificação de proteínas e, mais particularmente, com a purificação de antigénios derivados do HIV-1 úteis na produção de vacinas.

Antecedentes do invento

Tentativas para fazer vacinas contra o HIV-1 tiveram um sucesso limitado, quando medidas pelo critério de conseguir nos animais uma resposta imune similar ou equivalente à dos humanos que são seropositivos ao HIV-1. A principal meta, que não foi previamente conseguida, tem sido a produção de anticorpos que são neutralizantes do virus in vitro, em titulações que atingem tanto o nivel como a complexidade ( i.e., capacidade para neutralizar mais do que um isolado), observados em soro humano de indivíduos infectados. Todos os anticorpos neutralizantes em humanos têm mapeamento para a proteina do envelope, gpl60, ou uma das suas partes componentes (gpl20 ou gp41), e, assim, a maior parte da tentativas gue se fizeram em vacinas concentraram-se no desenvolvimento de antigénios relacionados com as proteínas do envelope.

Foram desenvolvidos cinco tipos destes antigénios: (1) gpl20 purificado obtido a partir de culturas de células de tecidos infectados com HIV (referido aqui como gpl20 derivada de virus); (2) gpl20 feita em células infectadas com virus recombinantes, tais como vaccinia ou baculovirus (gpl20 e gpl60 derivadas do vector dos virus vivo); (3) gpl20 recombinante I feita em células de mamíferos (gpl20 recombinante de mamíferos, muitas vezes referida incorrectamente como gpl20 recombinante nativa); (4) polipéptidos recombinantes desnaturados que representam todas ou várias porções da gpl20 e gp41 (antigénios recombinantes desnaturados); e (5) péptidos que representam pequenos segmentos do gpl20 e gp41 (péptidos).

Experiências de imunogenecidade têm sido completadas com todos estes tipos de antigénios, com resultados razoavelmente uniformes. Em geral, os antigénios são altamente imunogénicos ) quando em conjunto com um adjuvante numa variedade de espécies. Eles origiraram anticorpos capazes de neutralizar o homólogo do isolado de HIV-1, mas neutralizaram fracamente ou mesmo nada os isolados não homólogos. Os niveis de neutralização também não atingiram (em geral) os niveis de titulos neutralizantes encontrados em humanos infectados.

Por exemplo, a gpl20 completamente glicosilada, purificada a partir do virus ou produzida por engenharia genética em células de mamíferos, a gp!20 não glicosilada produzida em leveduras, e fragmentos de gpl20 produzidos em E.coli podem todos obter anticorpos neutralizadores do HIV-1 em animais exprimentais. Na sua maioria, as respostas dos animais imunizados com o virião, ou antigênios de gpl20 recombinante, são eficazes apenas na neutralização do virus isolado de onde é originário o antigénio gpl20. Uma excepção é o trabalho de Berman et al. (referência 1 abaixo) mostrando que a gpl20 recombinante purificada de HIV-1, secretada através da aplicação da engenharia genética a células do ovário de hamster chinês obtém grupos específicos de anticorpos neutralizadores em chimpanzés.

)

Um outro factor que tem sido particularmente dificil de superar quando se preparam vacinas para o HIV-1 é a diversidade da sequência. 0 HIV-1 e o HIV-2 são caracterizados por terem um nivel muito elevado de diversidade de sequências que ê mais pronunciado na porção gpl20 do envelope. Esta diversidade de sequências está agrupada em regiões conhecidas como hipervariáveis. Muitos grupos propuseram o uso de uma vacina cocktail, compreendendo substâncias antigénicas obtidas a partir de uma variedade de isolados de HIV, para fornecer protecção ) contra um extenso conjunto de fontes de infeccão.

Consequentemente, mantém-se a necessidade de obter uma substância antigénica tendo propriedades imunulógicas e de ligação de outras proteínas/proteínas do gpl20, como se encontra presente numa partícula virai de HIV-1. Em particular, subtâncias antigénicas capazes de induzir anticorpos neutralizantes, usando de preferência uma única fonte de material que induza anticorpos neutralizantes contra uma variedade de campos isolados, são altamente desejáveis.

Literatura relevante

As publicações que se seguem estão todas relacionadas com os cinco tipos de propostas para vacinas descritos acima:

(1) Berman et al., Human Immunodeficiency Virus Type I Challenge of Chimpanzees Immunized with Recombinant Envelope Glycoprotein gpl20, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1988) 85: 52005204;

(2) Berman et al., Expression and Immunogenicity of the Extracellular Domain of the Human Immunodeficiency Virus Type I Envelope Glycoprotein, gpl60, Journal of Virology (1988) 63: 3489-3498;

(3) Nara et al., Purified Envelope Glycoproteins from Immunodeficiency Virus Type I Variance Induced Individual, TypeSpecific Neutralizing Antibodies, Journal of Virology (1988) 62; 2622-2628;

(4) Arthur et al., Serological Responses in Chimpanzees Inoculated with Human Immunodeficiency Virus Glycoprotein (gpl20) Subunit Vaccine, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1987) 84: 8583-8587;

(5) Evans et al., An Engineered Polio Virus Chimaera Elicits Broadly Reactive HIV-1 Neutralizing Antibodies, Nature (1988) 339: 385-388;

(6) Barrett et al., Large-Scale Production and Purification of a Vaccinia Recombinant-Derived HIV-1 gpl60 and Analysis of its Immunogenicity, AIDS Research and Human Retroviruses (1989) 5: 159-171;

(7) Earl et al., Isolate- and Group-Specific Immune Response to the Envelope Protein of Human Immunodeficiency Virus

Induced by a Live Recombinant Vaccinia Virus in Macaques, AIDS

Research and Human Retroviruses (1989) 5: 23-32;

(8) Putney et_al., HTLV-III/LAV-Neutralizing

Antibodies to an E .coli-produced Fragment of the Virus Envelope, Science (1986) 234: 1392-1395;

(9) Steimer et al., Genetically Engineered Human

Immunodeficiency Envelope Glycoprotein gpl20 Produced in Yeast in the Target of Neutralizing Antibodies, Vaccines 87 (1987) 236241;

(10) Steimer et al., Recombinat env and gag Polypeptides in Characterizing HIV-l-Neutralizing Antibodies,

Vaccines 88 (1988) 347-355;

(11) Ho et al

Human Immunodeficiency Virus

Neutralizing Antibodies Recognize Several Conserved Domains on the Envelope Glycoproteins, Journal of Virology (1987) 61: 20242028; e (12) Palker et al., Type-Specific Neutralization of the Human Immunodeficiency Virus with Antibodies to env-Encoded Synthetic Peptides, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1988) 85: 1932> 1936.

Sumário do invento

Um objectivo do presente invento é fornecer um método para purificação da gpl20 de HIV, de forma a fornecer um glicopéptido tendo propriedades de ligação proteina/proteina, substancialmente idênticas à gpl20 virai do HIV natural.

E também um objectivo do presente invento fornecer uma composição compreendendo uma glicoproteína gpl20 de HIV purificada e na totalidade do seu comprimento (não existirá fusão se for recombinante), tendo a maior parte das suas moléculas propriedades de interacção proteina/proteina substancialmente idênticas à gpl20 que se encontra num virus HIV.

E	ainda outro objectivo deste invento fornecer	um
método para	estimular a formação de anticorpos capazes	de
neutralizar	infecções provocadas por múltiplos isolados virais	de

HIV.

E ainda outro objectivo do presente invento fornecer ι

uma composição de vacina que, quando administrada a sujeitos mamíferos reduz a susceptibilidade desse sujeito a infecções provocadas por virus HIV a partir de uma variedade de fontes.

Estes e outros objectivos deste invento, que se tornarão depois mais evidentes, foram conseguidos pelo fornecimento, numa configuração, de um método para purificação de gpl20 a partir de um meio que contém uma proteina gpl20 glicosilada, na totalidade do seu comprimento e sem fusão, o qual compreende o fraccionamento sequencial do meio contendo gpl20 > usando (1) cromatografia de troca iónica, (2) cromatografia de interacção hidrofóbica, e (3) filtração por exclusão de tamanho (cromatografia por exclusão de tamanho ou cromatografia de filtração em gel), recolhendo, em cada etapa, uma fracção que exibe afinidade especifica de ligação para o péptido CD4. Através da selecção de etapas de purificação por estas técnicas, e evitando cromatografia de afinidade e HPLC de fase reversa, é possivel obter uma molécula de gpl20 purificada que nunca foi desnaturada ou sujeita a condições de solução difícil, o que ocurreria numa coluna de cromatografia de afinidade usando anticorpos ou outras moléculas de ligação tendo uma elevada afinidade especifica para a gpl20. A gpl20 do presente invento, referida como gpl20 retentora da conformação, retém as propriedades de ligação ao receptor CD4 que se assemelha muito mais com a gpl20 natural apresentada pelas partículas virais do que a que havia antes disponível. Assim, uma outra configuração do invento é uma composição que compreende gpl20 em que a maioria da gpl20 é do tipo retentora da conformação. Configurações adicionais do invento incluem o uso de tais composições de gpl20 melhoradas em métodos imunológicos, tais como imunoensaios para anticorpos anti HIV, na produção de antisoro contra HIV, e em vacinas.

Descrição dos desenhos invento será melhor compreendido tendo como referência a seguinte descrição das configurações especificas, em conjunto com os desenhos que fazem parte da presente Memória Descritiva, em que:

I A Figura 1 é um diagrama esquemático de um plasmídeo de expressão exemplar para a produção de gpl20 recombinante de HIV-1 (rgpl20).

A Figura 2 é um quadro de sequências de aminoácidos alinhados para vários isolados de HIV-1, em que estão indicados os dominos constante (C) e variável (D). Locais potenciais de ligação N de glicosilação para a sequência HXB2 estão apenas indicados por [ ]; os resíduos de cisteina têm um * acima deles nesta figura. Estes dados da sequência foram publicados na Human

Retoviruses and AIDS 1988, A Compilation and Analysis of Nucleíc Acids and Aminoacids Sequences, editado por Geral Myers et al., publicado pelo grupo de Biologia Teórica e Biofísica, T-10, Mail Stop K710, Los Alamos National Laboratories, Los Alamos, New México, 87545. Há também uma versão de 1989 editada e publicada pela mesma fonte.

A Figura 3A é um gráfico que mostra fracções do produto comforme foram obtidas numa etapa de purificação, utilizando uma coluna HIC de fenil.

A Figura 3B é um gráfico que mostra fracções do produto, como são obtidas numa etapa de purificação utilizando uma coluna HIC de éter.

A Figura 3C é um gráfico que mostra fracções do produto conforme são obtidas numa etapa de purificação utilizando cromatografia de filtração em gel.

A Figura 4 é um gráfico que mostra a formação de um complexo CD4-gpl20 usando HPLC de filtração em gel.

A Figura 5 é um gráfico que mostra os dados da neutralização de HIV-ZR6 a partir do soro do babuíno 2964, analisado após 0, 5, 6, 7, 8, e9 imunizações com gpl20.

A Figura 6 é um conjunto de gráficos mostrando titulos de neutralização de todas as amostras de soro do babuino 2958, imunizado e do babuino 2964 imunizado com gpl20 do Exemplo 6.

A Figura 7 é um diagrama esquemático de uma concepção de regime de imunização interrompida de um primata.

Descrição das Configurações Especificas

Princípios Gerais de Purificação 0 presente invento deve-se em parte às investigações feitas em laboratório pelos presentes inventores, as quais demonstram que eliminando a cromatografia por afinidade das técnicas de purificação anteriores, se produz uma composição de glicopéptido gpl20 com melhores propriedades de ligação à CD4. Pensava-se antes que a purificação por afinidade era essencial na purificação de gpl20 para uso em vacinas, nas quais são necessários niveis elevados de pureza.

I

A cromatografia por afinidade e outros tipos de técnicas de separação por afinidade baseiam-se na interacção de ligação forte e especifica entre um anticorpo e uma proteina (ou entre uma lectina e uma glicoproteína), com o objectivo de separar a proteina de outras moléculas presentes no meio no qual a proteina se encontra. Técnicas apropriadas, tais como a mudança da força iónica ou do pH do meio de eluição, são depois utilizadas para dissociar o anticorpo da proteina, de forma que a proteina purificada possa ser obtida após as outras proteínas > contaminantes terem sido lavadas e retiradas para fora da coluna ou outro material de suporte ao qual o anticorpo esteja ligado. A cromatografia por afinidade é usada há mais de vinte anos no campo da bioquímica, mas o seu uso aumentou rapidamente com a chegada dos anticorpos monoclonais de alta especificidade no começo da década de 70. Para uma revisão da tecnologia, ver Freifelder, Phisical Biochemistry: Applications to Biochemistry and Molecular Biology, 2nd ed., W. H. Freeman & Co., 1982, págs 257-262.

Contudo, os presentes inventores descobriram que ocorre uma aparente modificação da conformação neste processo de 2 etapas de ligaçaõ/remoção, quando é usada a cromatografia por afinidade para purificar a molécula de gpl20 de forma que a proteína gpl20 resultante, embora purificada, não apresenta os mesmos epitopos que a molécula de gpl20 virai para induzir à formação de anticorpos ou para se sujeitar a interacções de ligação proteina/proteina, tais como a ligação com a molécula CD4. Assim, a gpl20 purificada por afinidade não se assemelha à gpl20 como apresentado por uma partícula virai, numa extensão ι

suficiente para permitir que tais proteinas purificadas sejam t

usadas na indução de anticorpos neutralizadores até ao limite que seria desejável, por exemplo, numa vacina eficaz.

Será reconhecido que a discussão de composições particulares de gpl20 como tendo uma propriedade especificada, tal como a capacidade ou não capacidade de se ligar à CD4, se relaciona com a composição como um todo e não pretende representar as propriedades de cada e de todas as moléculas de gpl20 na composição ao nivel molecular. Por exemplo, uma ) composição de gpl20 purificada com a utilização das técnicas publicadas pode referir-se a uma composição de gpl20 como tendo, por exemplo, 10% da capacidade de ligação para a CD4 de gpl20 naturado, como presente num virus HIV-1. Isto pode significar que a afinidade de ligação de cada e de todas as moléculas foi reduzida em 90%, mas é mais provável que algumas moléculas retenham a sua conformação original e afinidade de ligação, enquanto que a maioria das moléculas terá sido modificada de alguma forma ( por exemplo, terem mudado de conformação), de tal modo que elas perderam toda ou parte da sua afinidade de ligação. Por conseguinte, é provável que estejam presentes em qualquer composição de gpl20 uma variedade de moléculas de gpl20 tendo propriedades diferentes, e a eficácia das técnicas de purificação em reter as propriedades naturais de ligação é mais bem quantificada pelas propriedades de ligação da composição como um todo.

Os presentes inventores descobriram que é possível purificar a gpl20 do HIV de forma a fornecer uma composição de glicopéptido tendo as propriedades de ligação proteina/proteina (particularmente a ligação á CD4), substancialmente idênticas ao gpl20 natural do virus HIV. Numa composição do invento, 50% ou mais, preferencialmente 80% ou mais, e mais preferencialmente 90% ou mais das moléculas estão numa conformação que permite a ligação a uma molécula de CD4, o que se opõe a cerca de 10% ou menos de moléculas de gpl20, mesmo em composições não purificadas produzidas por algumas técnicas publicadas.

O processo do invento começa com uma fonte de gpl20, tal como um meio celular para o qual foi secretada uma molécula de gpl20 ou um lisado celular ou virai. O presente invento é particularmente útil para fornecer em forma pura com a sua conformação natural retida, e para purificar, uma proteina gpl20 recombinante glicosilada, na sua totalidade e sem fusão que foi secretada para o meio celular. Aqui uma proteina gpl20 recombinante refere-se a uma proteina produzida por uma célula não infectada por HIV, quer essa célula contenha o gene apropriado da gpl20 como o resultado de tranfecção, inserção cromossómica, retenção de um plasmídeo, ou por outros meios de expressão da proteina. Contudo, a gpl20 de fontes virais pode também ser utilizada. Preparações da composição original em crú contendo gpl20 não é uma parte dos aspectos mais amplos do presente invento, dado que a gpl20 foi previamente preparada tanto de fontes recombinantes como virais. A discussão das fontes de gpl20 é assim diferida até à última secção da Memória descritiva na qual as configurações preferidas do presente invento são discutidas.

E necessário substituir a cromatografia por afinidade (e HPLC de fase reversa ou outras técnicas que usam solventes orgânicos) por uma técnica de separação que não destrua a conformação desejada da molécula de gpl20. Surprendentemente, foi descoberto que a cromatografia por interacção hidrofóbica (HIC) fornece a purificação desejada, quando usada em conjunto com a cromatografia de troca iônica e cromatografia de filtração em gel. Esta descoberta foi inesperada dado que a gpl20 é uma glicoproteina com 22 locais conhecidos de glicosilação e, portanto, espera-se que seja altamente hidrofilica (em vez de hidrofóbica). Foi descoberto que a gpl20 tem, pelo menos, uma região de hidrofobicidade suficiente para permitir uma boa separação de contaminantes usando uma etapa de purificação com HIC. Por exemplo, foi conseguida uma purificação de quase 10 vezes mais numa coluna HIC de fenil. A Figura 3A mostra que a gpl20 foi a última fracção a eluir desta coluna. Contudo, sabiase previamente que existiam regiões hidrofóbicas na sequência de aminoácidos (a partir de pontos de hidrofobicidade), mas não se sabia nem era sugerido que a hidrofobicidade suficiente era retida após a glicosilação para permitir a separação da gp!20 de outras proteínas usando HIC.

Cada uma das etapas do processo de purificação é a seguir discutida em detalhe. De uma forma geral, o processo de purificação compreende a concentração do meio celular ou outra fonte de gpl20 para aumentar a concentração de gpl20, tipicamente através da remoção da água ou outras pequenas moléculas; a fraccionação do meio celular concentrado, usando material de troca iónica e recolhendo as fracções que exibem afinidade de ligação especifica para o péptido CD4; a fraccionação desta primeira fracção usando cromatografia de interacção hidrofóbica (usando de preferência duas etapas de HIC), de modo a fornecer uma segunda fracção exibindo a afinidade de ligação apropriada para a CD4; e a fraccionação da segunda fracção por filtração de exclusão de tamanho ou cromatografia para fornecer a desejada proteina purificada. Esta discussão referir-se-á geralmente à fonte de gpl20 como um meio de cultura celular, dado que este é a fonte mais comum. Contudo, podem ser usadas outras fontes de gpl20 alternadamente com um meio de cultura celular.

A etapa de concentração é uma primeira etapa convencional usada na purificação de muitas proteínas de uma variedade de fontes, nomeadamente através da remoção de água e de outras pequenas moléculas do meio celular de forma a que as subsequentes etapas de purificação possam ser realizadas num volume de material relativamente pequeno. Consequentemente, pode ser usada qualquer uma das várias técnicas de fraccionamento por tamanho. Técnicas preferidas são a diálise e a ultrafiltração. A etapa inicial de concentração pode apenas remover água e outras pequenas moléculas, tais como as que têm pesos moleculares de

1000 ou menos, ou podem ser usadas técnicas que removem algumas ou substancialmente todas as moléculas mais pequenas em peso molecular que a molécula de gpl20. Por exemplo, a ultrafiltração pode ser realizada usando membranas tendo uma variedade de dimensões moleculares, tais como pesos moleculares de 10.000, 20.000, 30.000, 50.000, ou 100.000. São preferíveis as moléculas de peso molecular no intervalo de 10.000 a 50.000, preferencialmente de cerca de 30.000.

Após a concentração do meio de cultura celular para eliminar as pequenas moléculas, o meio celular concentrado, contendo moléculas maiores que o tamanho da membrana de retenção, é fraccionado usando material de troca iónica. Péptidos de diferentes fontes podem comportar-se de forma diferente em fraccionação por troca iónica dadas as diferentes cargas. Por exemplo, a gpl20 obtida usando material genético isolado originalmente de um isolado de HIV-SF2 não é retido numa coluna Sephadex DEAE a um pH de 8 em NaCl 0,lM, enquanto que a gpl20 de um isolado de HIV-HTLV-IIIB se liga à coluna nas mesmas condições e pode ser eluido com um gradiente de sais de NaCl de desde cerca 0,1 a 0,5 Μ. E irrelevante se a molécula particular de gpl20 se ligue ou não à coluna, visto que o processo de troca iónica, incluindo a eluição, não parece afectar de forma adversa propriedades imunológicas ou outras propriedades de ligação proteina/proteina.

A etapa de troca iónica pode ser uma única etapa ou pode ser dividida em duas ou mais etapas. 0 tratamento com resina de troca aniónica é preferido pelo menos para uma sub-etapa (ou como a única etapa de troca iónica). Os trocadores iónicos compreendem tipicamente grupos amino aromáticos ou alifáticos e incluem DEAE-SEPHADEX, que é um dextrano substituido por dietilaminoetil, ou AG-3, e que tem um substituinte amino terciário numa resina amino epóxida. Como alternativa a estes matérias de basicidade fraca, podem ser usados iões de amónia quaternários e outros materiais de troca exibindo cargas totalmente positivas, tais como Q-SEPHAROSE-HP, um produto de Pharmacia que tem um ião de amónia quaternário ligado a uma coluna de Sepharose. Para a etapa de troca aniónica, é tipicamente usado um tampão com um pH no intervalo de 7 a 9, preferencialmente com um pH de cerca de 8. Um tampão exemplo tipico é o Tris, 0,02 M. As forças iónicas estão normalmente no intervalo de desde cerca de 0,05 a 0,2 M (expressos como NaCI), preferencialmente à volta de 0,1 M. Outras condições que devem ser controladas incluem a temperatura (por exemplo, desde cerca 0° a 25°C), conductividade total do material aplicado à coluna (por exemplo, desde de cerca de 15mS-cm), e uma taxa de fornecimento de proteina ao volume de resina (por exemplo, desde cerca de 15 a 20 g/1). Estes valores são valores preferidos para uma coluna de DEAE-SEPHADEX, e podem ser variados para os materiais de outras colunas de acordo com as sugestões do fabricante.

Alternativamente, o meio de cultura celular pode ser purificado por cromatografia de troca catiónica usando um grupo acidico de troca, fraco ou forte, tal com um grupo de ácido carboxílico ou de ácido sulfônico, respectivamente, embora essas separações sejam menos preferidas do que o uso de trocadores aniónicos. Um sistema tipico fortemente ácido, por exemplo, pode usar uma

SEPHADEX.

e eluído cerca de condições aniónica.

resina de troca iónica de sulfopropil tal como a SPUm meio celular contendo gpl20 é tipicamente adicionado a um pH que fica no intervalo de desde cerca de 6 a

8, preferencialmente a pH de cerca de 7. As outras sao semelhantes às que se usam para colunas de troca

As fracções que contêm as moléculas de gpl20 desejadas podem ser identificadas por qualquer uma das muitas técnicas conhecidas para identificar gpl20, tais como o reconhecimento por anticorpos, ligaçao pelo péptido CD4, ou electroforese em qel SDS. As fracções que contêm as moléculas de gpl20 podem ser identificadas através da realização de análises em aliquotas retiradas de cada fracção. Após se ter establecido um padrão de fraccionamento, os procedimentos de troca iónica são suficientemente reproduzíveis de forma a que as fraccões possam ser recolhidas sem haver necessidade de as testar. A liqação à CD4 foi verificada para cada nova etapa do presente invento, à medida que era incorporada no processo, e a liqação à CD4 pode ser usada para verificar se qualquer modificação das condições especificas e preferidas descritas aqui (tais como a mudança dos matérias de suporte da coluna, temperaturas, tampões, etc.) fornecem uma composição de gpl20 dentro do campo do invento. Detalhes adicionais ao medir a liqação entre a CD4 e a gpl20 estão descritos numa secção sequinte desta Memória Descritiva.

teste mais definitivo para a gpl20 é a liqação ao péptido CD4. A liqação ao péptido CD4 é tipicamente verificada por precipitação radioimunolóqica ou HPLC de filtração em qel, como descrito nos exemplos que se sequem. Quaisquer fracções

contendo o material gpl20 podem ser purificadas individualmente ou após combinação das fracções para fornecer um material em reservatório para usar numa etapa de purificação posterior.

Embora seja geralmente aqui feita a referência à capacidade de uma molécula de gpl20, numa fracção particular, de se ligar ao péptido CD4, o uso de tal linguagem não significa que se efectue de facto um ensaio de ligação para o péptido CD4 em cada etapa. Em vez disso, a linguagem é usada para indicar, tanto para esta como para uma etapa diferente, gue as condições são mantidas de forma a que a capacidade da gpl20 para se ligar ao péptido CD4, não se perde em qualquer etapa da técnica de separação.

A próxima etapa de purificação envolve cromatografia de interacção hidrofóbica, na qual a passagem das moléculas através da coluna é retardada por interacções hidrofóbicas entre o material de suporte da coluna (ou uma substância ligada ao material de suporte) e as moléculas a serem fraccionadas. E tipico de tais processos de fraccionamento uma elevada performance dos processos de cromatografia liquida usando uma coluna hidrofóbica. Uma coluna tipica é uma coluna HIC de éter ou uma coluna de HIC de fenil. Uma coluna HIC de éter contém grupos alifãticos ligados a um material de suporte da coluna por uma ligação éter, enquanto que uma coluna HIC de fenil contém grupos fenil ligados a um material de suporte. Como é entendido pelos vulgares especialistas das técnicas de HIC, a adição de amostra à coluna e a eluição são realizadas usando soluções com força iónica suficiente (o que pode ser zero para algumas moléculas) para provocar que o material a ser separado se cole às superfícies da resina usada na coluna. Diminuindo a força iónica do eluente (isto é, diminuindo a concentração de sais no eluente) reduz-se a tendência dos matérias hidrofóbícos de serem retidos pela coluna.

Numa purificação tipica de gpl20, as fracções obtidas por cromatografia de troca iónica são levadas a 35-45%, preferencialmente cerca de 40%, saturação em sulfato de amónia, e qualquer material insolúvel é removido por centrifugação antes de o sobrenadante ser aplicado à coluna HIC. 0 tratamento da fracção de cromatografia de troca iónica com, por exemplo, sulfato de amónia saturado a 40% é útil para a precipitação de algumas proteínas contaminantes neste ponto do processo, contudo este não é requerido. A molécula de gpl20 não precipita por si só em sulfato de amónia saturado a 40% em todas as estirpes ou variantes mutacionais dos isolados até à data. Se a gpl20 de outros isolados se precipitar em sulfato de amónia 40%, pode ser seleccionada uma concentração que se encontra abaixo da requerida para precipitar a gpl20, mas que é suficientemente elevada para fornecer uma força iónica que provoca a ligação do gpl20 à coluna HIC. Podem ser usados outros sais em substituição do sulfato de amónia, se desejado. As concentrações de sais discutidas neste parágrafo são um exemplo, e outros sais e concentrações de sais podem ser usadas através da variação das taxas de fluxo, temperaturas e tempos de eluição como é conhecido nesta técnica. 0 sulfato de amónia é preferido porque ele geralmente estabiliza a estrutura das proteínas quando presente a elevadas concentrações.

Podem ser usadas uma grande variedade de resinas de . ---.'‘“mm... ’ .- -------------f.—-—......cromatografia de interacção hidrofóbica, e o presente invento não está limitado a uma resina em particular. Exemplos de colunas HIC típicas incluem butil (butil Foyo Pearl, Toyo Soda), octil (octil Sepharose, Pharmacia) e fenil (Phenyl Sepharose, Pharmacia). Tal como com a cromatografia de troca iónica, a separação baseada em interacções hidrofóbicas não parece afectar de forma adversa a conformação da proteina.

As condições, sob as quais estas colunas são usadas, variam com as colunas especificas como é conhecido na técnica. Condições tipicas incluem um pH de desde cerca de 5 a 7 ( p.e., acetato de sódio 0,02 M, pH 5,0); uma força iónica de desde cerca de 0,05 a 2,0 M (expressos como NaCl), preferencialmente cerca de 0,1 M; e eluição usando um gradiente de desde sulfato de amónia a 40% (ou uma concentração inicial diferente como se descreve acima), diminuindo para sulfato de amónia 0%.

E possível utilizar apenas uma etapa de HIC, mas são preferíveis pelo menos duas sub-etapas HIC, usando de preferência diferentes suportes HIC (p.e., separação numa coluna HIC de fenil seguindo-se uma separação numa coluna de HIC de éter). Contudo, podem ser usadas duas separações na mesma coluna (p.e., numa coluna HIC de fenil). As condições podem ser ajustadas usando técnicas conhecidas para fornecer a separação dos picos de proteina que têm a actividade desejada dos outros picos contendo proteínas também presentes na fracção purificada pela cromatografia de troca iónica. Como antes, as fracções que contêm a actividade desejada são recolhidas e separadas das fracções que não contêm essa actividade.

As fracções contendo a actividade desejada obtidas da cromatografia de interacção hidrofóbica são sujeitas a filtração em gel (também conhecida como cromatografia de permeaçâo em gel, incluindo as técnicas de HPCL de filtração em gel). Se a pureza é suficiente após a HIC, o eluente da última coluna de HIC pode ser aplicado directamente à coluna de filtração em gel. 0 grau de purificação é medido através de uma electroforese em gel e revelador Coumassie Blue e deve ser de, pelo menos, 5%, preferencialmente de pelo menos 50% (por peso de proteínas presentes). Contudo, se o grau desejado de purificação não foi conseguido nesta fase, o processo do invento pode ainda ser realizado através da sujeição do eluente da HIC a uma cromatografia de troca iónica antes da filtração em gel. Uma pureza mais baixa é por vezes observada nesta fase, se fôr usado vm sistema de expressão inefeciente, de forma a que o meio celular inicial contém uma quantidade relativamente pequena de gpl20, quando comparada com as outras proteinas. A cromatografia de troca iónica HPLC, usando um material de suporte com iões anónia quaternários pendentes, é particularmente preferido se a troca iónica ou pressão média da cromatografia com uma resina de troca aniónica altamente eficiente, tal como a Pharmacia's Q Sepharose High Performance, é necessária nesta fase.

Nesta fase do processo de purificação (i.e., após HIC e, se necessário, a segunda etapa de troca iónica), as impurezas a serem removidas são na sua maioria impurezas com baixo peso molecular. Mais uma vez, os materiais específicos e condições usadas são particularmente restritos. Podem também ser usados geles de dextrano, poliacrilamida ou agarose. São selecionadas tipicamente as fraccões com peso molecular que antige desde 10K a

500Κ, preferencialmente desde 50K a 200K. Uma coluna particularmente preferida para usar com a HPCL é a SUPERDEX 200 (Pharmacia). As condições para tal utilização são tipicamente fosfato de sódio O,1M, pH 6,7. A cromatografia de exclusão em gel não parece afectar de forma adversa a presença de epitopos necessários para induzir à formação de anticorpos neutralizantes.

Uma purificação por afinidade da proteina G pode ser realizada em qualquer estádio do processo, por exemplo após a cromatografia de troca iónica e antes da cromatografia de interaeção hidrofóbica, para reduzir ou eliminar as contaminações de IgG, como é conhecido na técnica. Métodos apropriados para a realização da purificação por afinidade da proteina G são conhecidos na técnica e incluem o uso de colunas de afinidade, tais como a Protein G Sepharose Fast Flow, Pharmacia e semelhantes. Com o objectivo de não limitar o exemplo, pode ser usado tampão fosfato de sódio O,1M, pH 7, na purificação por afinidade da proteina G, contudo pode ser utilisado qualquer tampão convencional.

Em todas as etapas de purificação discutidas acima, as condições devem ser mantidas de forma a minimizar a desnaturação, incluindo durante a recolha e manuseamento das fracções produzidas nas etapas de separação. 0 pH de todas as soluções deverá por isso estar entre 4 e 9, preferencialmente entre 5 e 8. A força iónica deve ser desde 0,02 a 0,5 M (equivalentes de NaCl), preferencialmente entre 0,05 e 0,3 M, à excepção do sulfato de amónia que pode ser mais elevado como previsto previamente. As temperaturas deverão ser entre 0° e 25°C, preferencialmente entre 2°C e 8°C. Detergentes e solventes orgânicos devem ser completamente evitados.

As fracções obtidas por qualquer das etapas indicadas acima podem ser concentradas por ultrafiltraçâo ou outras técnicas de concentração para remover o solvente e outras moléculas pequenas, se desejado. Esta ultrafiltraçâo geralmente não é necessária, a não ser que o processo de fraccionamento tenha diluido as fracções contendo a gpl20, o que pode acontecer quando o pico do gpl20 está espalhado em várias fracções.

Resumidamente, o processo de purificação descrito acima foi conseguido através da realização de testes após cada nova etapa, para assegurar que a ligação à CD4 não estava diminuída.

Etapas que podem expôr a proteina a condições desnaturantes, tal como a cromatografia de fase reversa e por imunoafinidade, foram evitadas. A maior parte da purificação foi conseguida através da exploração da forte ligação da gpl20 a duas resinas hidrofóbicas diferentes, na presença de sulfato de amónia. Adicionalmente, a TM proteina purificada ligada à Superose 12, norneadamente uma resina de filtraçaõ em gel, numa forma hidrofóbica em pH neutro e NaCl O,1M. Este comportamento foi de alguma forma surprendente tendo em conta as características hidrofilicas dos hidratos de carbono e o facto de que a gpl20 tem mais do que 50% de hidratos de carbono em peso.

processo de produção foi realizado repetidamente na escala dos 40 1 (começando com 40 1 do sobrenadante da cultura celular), como descrito aqui. 0 procedimento foi também utilizado em escalas menores e maiores com colunas de tamanho apropriado, atingindo desde 0,4 1 a 200 1 de sobrenadante da cultura celular. O rendimento e pureza do produto foram quase constantes ao longo de toda esta escala. Recentemente a produção celular tem sido realizada em suspensões de culturas continuas. Esta modificação facilita a produção em larga escala de gpl20. Não foram detectadas diferenças significativas no comportamento do produto, de um lote para outro, usando vidros cilíndricos ou sobrenadantes de culturas continuas como material inicial.

Uma descrição detalhada de um processo actual de purificação é dada nos exemplos que se seguem. Embora, o presente invento não esteja limitado a esse exemplo especifico, o exemplo fornece uma orientação adicional através da indicação de parâmetros específicos para uma completa separação que se encontra no âmbito do presente invento.

Características da gp!20 produzida pelo Processo de Purificação

A glicoproteina gpl20 produzida pelo processo do presente invento é pura quando avaliada por electroforese em gel SDS, com revelador Coumassie Blue, e retém a totalidade da sua actividade em ensaios de ligação à CD4. São calculados niveis de pureza de, aproximadamente, 95%. Aqui a pureza refere-se à ausência de outras proteínas, dado que a gpl20 pura é uma composição heterogénea, dadas as diferenças no conteúdo de hidratos de carbono de diferentes moléculas de gpl20. 0 produto do processo de purificação do presente invento parece ser indistinguível da gpl20 obtida a partir de fontes virais. Exemplos específicos de ensaios que podem ser utilisados para determinar se a gpl20 purificada tem a conformação do material obtido no presente invento, estão descritos nos exemplos que se seguem. Geralmente estes testes incluem a ligação à CD4, filtração em gel por HPLC ( sob condições tanto oxidantes como redutoras), e reacção com antisoro especifico para a gpl20.

Outros investigadores têm referido que a gpl20 recombinante, purificada por uma variedade de técnicas que não as especificadas aqui, exibem uma redução da afinidade de ligação para o receptor CD4. Embora a razão para esta redução na afinidade de ligação não seja conhecida com certeza, pensa-se que representa uma modificação da conformação da molécula durante a purificação. Por exemplo, um esquema de purificação que se tentou inicialmente para a gpl20, pelos presentes inventores, usava cromatografia por afinidade e HPLC de fase reversa. 0 material purificado por este processo era aproximadamente 80% puro e exibia o nivel esperado de reactividade num ensaio ELISA utilizando anticorpos monoclonais específicos para a gpl20. Contudo, a actividade de ligação medida in vitro para o receptor CD4 foi reduzida aproximadamente 10 vezes.

presente sistema fornece gpl20 que é de igual ou de mais elevada pureza que a gpl20 previamente disponível, enquanto retém toda a actividade de ligação à CD4. Além disso, a técnica de purificação fornece um rendimento razoável do produto e é apropriada para a produção em larga escala (na ordem das várias centenas de miligramas ou mais) de gpl20. Não é requerida nem a cromatografia por afinidade nem a HPLC de fase reversa, eliminando assim mudanças conformacionais associadas com estas técnicas de purificação (causadas por elevadas forças iónicas e contacto com solventes orgânicos). A actividade total foi observada em ensaios ELISA e de ligação ao receptor CD4. O material purificado, designado aqui como gp!20 retentora de conformação, parece indistinguível da gpl20 presente em particulas virais.

Por exemplo, a gpl20 recombinante retentora da conformação desejada de HIV-SF2 foi indistinguível da gpl20 virai do HIV-SF2. As proteínas tinham mobilidades muito semelhantes nos geles SDS. Elas desencadiaram imunoreactividades semelhantes em ensaios de precipitação imunológica, western blots e captura em fase sólida com todos os soros ensaiados.

A proteína purificada exibia um peso molecular de 12OK quer em geles SDS redutores ou não redutores; assim, a cadeia polipeptidica está intacta. A HPLC de filtração, em gel em tampão não desnaturante e a um pH neutro, obteve um peso molecular estimado em 130K, mostrando que a proteina purificada tem pouca tendência para se agregar sob estas condições. A proteina tem um supreendente carácter hidrofóbico, como é evidenciado por este comportamento em várias colunas.

A ligação da gpl20 recombinante à CD4 foi estudada directamente num ensaio HPCL de filtração em gel. Tal como gpl20 virai, a rgpl20 ligada à CD4 com elevada afinidade e uma estequiometria de 1:1. Pelo menos 90% das moléculas purificadas de gpl20 tinham a capacidade de se ligar à CD4, como foi medido por este ensaio. Finalmente, a proteina purificada tem uma K<} para a CD4 de ~6,9 nM. Este valor encontra-se no intervalo das medidas de afinidade de ligação da gpl20 virai e outras preparações purificadas para o receptor CD4 (ver Smith et al., Science (1987) 283: 1704 e Lasky et al., Cell (1987) 50: 975).

Fontes de qp!20 para purificação

Os aspectos mais vastos do presente invento não incluem a etapa de preparação do meio fonte contendo a molécula de gpl20. A preparação de gpl20 por técnicas de recombinação encontra-se descrita algures, tal como nas publicações citadas previamente na secção de Antecedentes do invento desta Descrição e nas publicações citadas aqui. As técnicas do presente invento têm sido aplicadas pelos presentes inventores a meios condicionados de gpl20, a partir de uma variedade de linhas celulares contendo material genético de diferentes isolados de HIV que produzem diferentes moléculas de gpl20. A gpl20 de fontes não recombinantes pode também ser utilizada (p.e., linhas de células infectadas por virus). Fontes especificas de gpl20 estão identificadas nos exemplos que se seguem e segue-se uma breve discussão acerca das culturas celulares para a expressão da gpl20, mas o presente invento não está limitado a estas fontes.

A gpl20-SF2 serviu como modelo para o desenvolvimento do presente processo de purificação. Estão disponíveis vários outros genes clonados de gpl20 de outros isolados de HIV-1 bem como outras formas alteradas criadas por mutagénese dos genes de gpl20 in vitro. Por exemplo, sequências completas de aminoácidos codificados por genes clonados de 15 isolados diferentes de HIV-1 (SF2, HXB2, BRU, MN, SC, NY5, CDC4, WMJ2, RF, MAL, ELI, Z96, Z3, Z321, e JY1) estão registados no Myers, et al, Human Retrovirus and AIDS (1990), Los Alamos, New México, Los Alamos National Laboratory, a totalidade do qual se encontra aqui incorporada para referência. Sete sequências (seis das quais são diferentes das descritas na S.N. 243944) estão descritas no Modrow et al.,

J.Virol. (1987) 61: 570-578. Srinivasan et al. , Gener (1987) 52: 71-82, registaram uma sequência adicional de um isolado de HIV-1 isolado no Zaire. Ambas estas publicações estão também incorporadas para referência. A experiência dos inventores, mostrou, até agora que os métodos aqui descritos podem ser usados para proteínas gpl20 de outros isolados, assim como formas mutantes do gene, mesmo sabendo que estas proteínas podem diferir consideravelmente da gpl20-SF2 na sequência e na composição de aminoácidos.

Em adição às fontes recombinantes, podem ser usadas as fontes virais naturais de gpl20. As linhas celulares que abrigam o HIV estão diponiveis pela American Type Culture Collection, Reckville, Maryland, USA (ATCC CRL 8543). Esta linha celular é referenciada na Patente Norte Americana No. 4.520.113. Outros isolados virais estão descritos no Tersmette et al., J.Virol. (1988) 62: 2026-2032 e Popovic et al., Science (1984) 224: 497500.

As fontes recombinantes são preferíveis tanto pela facilidade de produção como para evitar o perigo de infecção por virus HIV-1 activos. A gpl20 com comprimento total recombinante pode ser preparada usando qualquer um dos numerosos sistemas de expressão conhecidos. Todos estes sistemas conterão instruções codificando todos os isolados de aminoácidos da gpl20 madura (p.e., os aminoácidos 30 ou 31 a 509 do gene env no SF2).

As sequências de ácidos nucleicos da gpl20 do HIV podem ser obtidas por métodos de DNA recombinante, tais como uma visualização dos transcriptos reversos do mRNA, ou pela visualização das bibliotecas genómicas de qualquer célula. O DNA pode também ser obtido pela sintese de DNA de sequências publicadas usando as técnicas vulgarmente disponíveis e todo o aparelho da sintese de DNA. A sintese pode ser vantajosa porque podem ser introduzidos locais de restrição únicos na altura da preparação do DNA, facilitando desse modo o uso do gene em vectores contendo locais de restrição que, de outra forma, não se encontrariam presentes na fonte nativa. Além disso, qualquer modificação desejada nos locais do DNA pode ser introduzida pela sintese, sem haver necessidade de modificar mais o DNA por mutagênese.

Em geral, o DNA que codifica o polipéptido gpl20 do HIV de novas manchas pode ser obtido pela construção de uma biblioteca de cDNA a partir do mRNA obtido a partir de isolados de campo ou laboratório e (1) fazendo a visualização com sondas de DNA marcadas, codificadoras de porções da proteina do envelope, com o objectivo de detectar clones na biblioteca de cDNA que contenham sequências hómologas ou (2) amplificando o cDNA usando a reacção de polimerase em cadeia (PCR) e subclonando e visualizando com sondas de DNA marcado. Os clones são depois analisados através da análise por enzimas de restrição e sequenciação de ácido núcleico, de forma a identificar clones com a totalidade do comprimento e , se estes não estão presentes na biblioteca, recuperar fragmentos apropriados de vários clones e ligando-os nos locais de restrição comuns ao clone para se assemelhar a um clone codificando a totalidade de da molécula. As sondas de DNA podem ser preparadas a partir de material genético que se descreve nos exemplo juntos. Qualquer sequência a que falte a partir da extremidade 5' do cDNA da gp!20 do HIV pode ser obtida pela extensão 3' dos oligonucleótidos sintéticos complementares às sequências da gpl20 do HIV usando como modelo o mRNA (a chamada extensão do primer), ou sequências homólogas, podem ser fornecidas a partir de cDNAs conhecidos.

A produção de rgpl20 para purificação pelo processo do presente invento empregará, a não ser que esteja indicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia e recombinação de DNA dentro do campo da técnica. Tais técnicas estão vastamente explicadas na literatura. Ver p.e., Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning: A

Laboratory Manual 2a Ed. (1989); DNA Cloning: A Praticai I e II (D.N.

Approach, Volumes

Glover ed.

1985)

Oligonucleotides Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hibridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1985); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzimes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Praticai Guide to Molecular Cloning (1984).

Ao descrever o material genético usado para preparar a gpl20 recombinante para purifição pelo processo do presente invento, será usada a terminologia que se segue de acordo com as definições expostas abaixo.

Uma réplica é um elemento genético (p.e., um plasmídeo, um cromossoma, um virus) que funciona como uma unidade autónoma de replicaçâo de DNA in vivo; i.e., é capaz de se replicar sob o seu próprio controlo.

Um vector é uma réplica, tal como um plasmídeo, fago ou cosmideo, ao qual se pode ligar um outro segmento de DNA, de forma a realizar a replicação do segmento ligado.

Uma molécula de DNA refere-se à forma polimérica dos desoxiribolnucléotidos (adenina, guanina, timina, e/ou citosina), tanto na sua forma de hélice de cadeia simples como na sua forma de cadeia dupla. Este termo refere-se apenas à estrutura primária e secundária da molécula e não a limita a qualquer forma terciária particular. Assim este termo inclui o DNA de cadeia dupla encontrado, inter alia, em moléculas lineares de DNA (p.e., fragmentos de restrição), virus, plasmideos, e cromossomas. Na discussão da estrutura de moléculas de DNA de cadeia dupla particulares, as sequências podem ser descritas aqui de acordo com a convenção normal de fornecer apenas a sequência na direcção 5' - 3', ao longo da cadeia não transcrita de DNA (i.e., a cadeia que tem uma sequência homóloga ao mRNA).

Uma sequência código de DNA é uma sequência de DNA de dupla cadeia que é transcrita e traduzida num polipéptido in vivo quando colocada sob o controlo de sequências reguladoras adequadas. As fronteiras da sequência código sâo determinadas por um codâo de iniciação na terminação 5' (amina) e um codâo stop, de paragem da tradução, na terminação 3' (carboxilo). Uma sequência código pode incluir, mas não está limitada a isso, sequências procariotas, cDNA de mRNA de eucariotas, sequências de DNA genómico de DNA de eucariotas (p.e., mamíferos), DNA virai, e mesmo sequências de DNA sintético. Um sinal de poliadenilizaçâo e a sequência de terminação da transcrição estarão usualmente colocados na posição 3', em relação à sequência código.

As sequências de controlo da transcrição e tradução são sequências reguladoras de DNA, tais como os promotores,

intensificadores, sinais de poliadenilação, terminadores e semelhantes, que contribuem para a expressão da sequência código na célula hospedeira.

Uma sequência promotora é uma região de DNA reguladora, capaz de ligar a RNA polimerase numa célula, e iniciar a transcrição da cadeia a jusante (dírecção 3') da sequência código. Com o propósito de definir o presente invento, a sequência promotora é ligada (inclusivamente) na sua terminação 3 ’ pelo local de iniciação da transcrição e estende-se a montante (dírecção 5'), de forma a incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição a níveis detectáveis acima do background. Dentro da sequência promotora encontra-se um local de iniciação de transcrição (convenientemente definido através do mapeamento com a nuclease Sl), bem como dominios de ligação de proteínas (sequências de consenso) responsáveis pela ligação da RNA polimerase. Os promotores eucariotas conterão muitas vezes, mas não sempre, caixas TATA e CAT.

Uma sequência código está sob o controlo de sequências de controlo de transcrição e tradução numa célula, quando a RNA polimerase transcreve a sequência código para mRNA, que é depois traduzido nas proteínas codificadas pela sequência código.

Uma sequência sinal pode ser incluída antes da sequência código. Esta sequência codifica um péptido sinal, Nterminal em relação ao polipéptido, que comunica com a célula hospedeira para dirigir o polipéptido para a superfície celular ou secretar o polipéptido para o meio, e este péptido sinal é cortado pela célula hospedeira antes de a proteina deixar a célula. As sequências sinal podem encontrar-se associadas com uma variedade de proteínas nativas para os eucariotas e procariotas. Por exemplo, o factor alfa, uma proteina nativa de levedura, é secretado pela levedura, e a sua sequência sinal pode ser ligada a proteínas heterólogas a serem secretadas para o meio (Ver Patente Norte Americana com o No de série 4.546.082 e a EPO

0.116.201, com a data de publicação de 12 de Janeiro de 1983). Além disso, descobriu-se que o factor alfa e os seus análogos secretam proteínas heterólogas a partir de uma variedade de leveduras, tais como Sacharomyces e Kluyveromyces, (EPO

88312306.9 depositada em 23 de Dezembro de 1988; EPO 0324274 e a EPO com o No de publicação 0301669, com a data de publicação de 1 de Fevereiro de 1989). Um exemplo para usar em células de mamíferos é o sinal tPA usado para o factor de expressão VIIIc de cadeia leve.

Uma célula foi transformada por DNA exógeno ou heterólogo, quando esse DNA foi introduzido dentro da célula. O DNA transformante pode ser ou não integrado (ligado covalentemente) no DNA cromossómico fazendo o genoma da célula. Em procariotas, por exemplo, o DNA transformado pode ser mantido num elemento epissomático, tal como um plasmídeo ou vector virai. As células transformadas BPV são estáveis e permanecem epissomáticas. No que respeita às células eucariotas, uma célula transformada estável é aquela em que o DNA transformador tenha ficado integrado no cromossoma de forma a que seja herdado pelas células filhas através da replicação cromossómica. Esta estabilidade é demonstrada pela capacidade das células eucariotas

establecerem linhas celulares ou clones compreendendo uma população de células filhas contendo o DNA tranformador. Um clone é uma população de células derivadas de uma única célula ou ancestral comum por mitoses.

Uma linha celular é um clone de uma primeira célula que é capaz de crescer com estabilidade in vitro por muitas gerações.

Duas sequências de DNA são substancialmente homólogas quando, pelo menos cerca de 85% (preferencialmente cerca de 90%, e mais preferencialmente cerca de 95%) dos nucleótidos, coincidem com o comprimento definido de sequências de DNA. As sequências, que são substancialmente homólogas, podem ser identificadas com uma experiência de hibridização Southern sob, por exemplo, condições rigorosas, como definido para esse sistema particular. A definição das condições apropriadas fica ao critério dos especialistas nesta técnica. Ver, p.e., Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Vols I & II, supra; Nucleic Acid Hibridization, supra.

Uma região heteróloga de uma construção de DNA é um segmento indentificável de DNA dentro de uma molécula de DNA maior que não se encontra em associação com a molécula maior na natureza. Assim, quando a região heteróloga codifica um gene de mamifero, o gene será usualmente flanqueado pelo DNA que não flanqueia o DNA genómico do mamifero no genoma do organismo que serve de fonte. Um outro exemplo de sequência código heteróloga é uma construção em que a sequência código por si só não se encontra na natureza (p.e., um cDNA em que a sequência código genómica contém intrões, ou sequências sintéticas tendo codões diferentes dos do gene nativo). Os acontecimentos de variações alélicas ou mutações de ocorrência natural não dão origem a uma região heteróloga de DNA como definida aqui.

Uma composição compreendendo A (em que A é uma única proteina, molécula de DNA, vector, etc.) é substancialmente livre de B (em que B compreende uma ou mais proteínas contaminantes, moléculas de DNA, vectores, etc.) onde, pelo menos 75% em peso, é de proteínas, DNA, vectores (dependendo das categorias das espécies a que pertencem A e B) na composição é A. De preferência, A compreende, pelo menos, 90% em peso das espécies A+B na composição, mais preferencialmente 99% em peso. E também preferível que uma composição, que é substancialmente livre de contaminações, contenha apenas espécies de único peso molecular (no que respeita à porção polipeptidica da glicoproteina, tal como a gpl20), tendo a actividade ou caracteristicas das espécies de interesse.

Um anticorpo é qualquer imunoglobulina, incluindo anticorpos e fragmentos destes, que se liga a um epitopo especifico. 0 termo abrange, inter alia, anticorpos policlonais, monoclonais e quiméricos. Para mais detalhes acerca de anticorpos quiméricos, ver as Patentes Norte Americanas com os Nos.

4.816.397 e 4.816.567.

Os vectores são usados para facilitar a manipulação do DNA que codifica o polipéptido do gene gpl20 do HIV, tanto para a preparação de grandes quantidades de DNA para mais processamentos (vectores de clonagem) como para a expressão do polipéptido do gene gpl20 do HIV (vectores de expressão). Vectores compreendem plasmideos, virus (incluindo fagos), e fragmentos de DNA .<rz =?

integráveis, i.e., fragmentos que são integráveis no genoma do hospedeiro por recombinação. Os vectores de clonagem não necessitam de conter sequências de controlo da expressão. Contudo, as sequências de controlo num vector de expressão incluem sequências de controlo de transcrição e tradução, tal como um promotor de transcrição, uma sequência que codifica locais de ligação adequados para ribossomas, e sequências gue controlem a terminação da trancrição e tradução. 0 vector de expressão deve incluir, de preferência, um gene seleccionado para facilitar a expressão estável do gene da gpl20 de HIV, e/ou para identificar os transformantes. Contudo, o gene de selecção para manter a expressão pode ser fornecido por um vector independente em sistemas de co-transformação usando células hospedeiras eucariotas.

Os vectores apropriados geralmente contêm réplicas (origem da replicação, para usar em vectores não integrativos), e sequências controlo que são derivadas de espécies compatíveis com o hospedeiro de expressão pretendido. Pelo termo vector replicável, como usado aqui, entende-se que abrange os vectores contendo tais réplicas, bem como os vectores que são replicados pela integração no genoma hospedeiro. As células hospedeiras transformadas são células que foram transformadas ou transfectadas com vectores contendo o DNA codificador do gene de gpl20 do HIV. A gpl20 do HIV expressa será secretada para o sobrenadante da cultura, sob o controlo de sinais de processamento adequados no péptido expresso, p.e., sequências sinal homólogas ou heterólogas. Apenas as proteinas secretadas são totalmente glicosiladas e totalmente capazes de se ligar à

CD4. Ver Fennie et al., J.VIROL·. (1989) 63: 639-646.

Os vectores de expressão para as células hospedeiras incluem vulgarmente uma origem da replicação, um promotor localizado a montante da sequência codificadora do gene gpl20 de HIV, junto com um local de ligação do ribossoma, um local de poliadenilaçâo, e uma sequência de terminação da transcrição. Os especialistas compreenderam que certas sequências destas não são necessárias para a expressão em determinados hospedeiros. Um vector de expressão para utilisar em micróbios precisa apenas de conter uma origem de replicação reconhecida pelo hospedeiro, um promotor que funcione no hospedeiro, e um gene de selecção.

Promotores vulgarmente utilizados são derivados de polioma, do virus do papiloma bovino, do CMV (citomegalovirus, tanto murideo como humano), o adenovírus virus do sarcoma de Rouse, e virus simio 40 (SV40). Outras sequências controlo (p.e., sequências de terminação, poliA, intensificadoras, ou amplificadoras) podem também ser usadas.

Um vector de expressão é construído de forma a que a sequência codificadora do gene gpl20 de HIV esteja localizada no vector com as sequências reguladoras apropriadas, sendo a posição e orientação da sequência codificadora no que respeita às sequências controlo, de tal forma que a sequência codificadora é transcrita e traduzida sob o controlo das sequências controlo (i.e., a RNA polimerase que se liga à molécula de DNA nas sequências de controlo transcreve a sequência código). As sequências controlo podem estar ligadas à sequência código antes da inserção no vector, tal como nos vectores de clonagem descritos acima. Alternativamente, a sequência código pode ser

clonada directamente num vector de expressão que já contenha as sequências controlo e um local de restrição apropriado. Se a célula hospedeira seleccionada é uma célula de mamífero, as sequências de controlo podem ser homólogas ou heterólogas para a sequência codificadora do gene da gpl20 de HIV, e a sequência código pode ser DNA genómico contendo intrões ou cDNA.

Podem ser usadas culturas de células eucariotas superiores, tanto células de vertebrados como de invertebrados, incluindo insectos, e os procedimentos de propagação destes são conhecidos. Ver, por exemplo, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors (1973).

Células apropriadas para a expressão do gene da gpl20 em eucariotas superiores incluem: linhas CVI de rins de macaco transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); células de rins de bebés Hamster (BHK, ATCC CRL 10), células de ovário DHFR de Hamster chinês (descrito por Urlaub and Chasin, PNAS (USA) 77:4216 (1980); células Sertoli de rato (TM4, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rins de macaco (CVI ATCC CCL 70); células de rim do macaco verde Africano (VERO76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rins de caninos (MDCK, ATCC CCL 34); células do figado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células humanas de pulmão (W138, ATCC CCL75); células de figado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de rato (MMT 060652, ATCC CCL 51); células de hepatoma de rato (HTC, Ml, 54, Bauman, Μ., et al., J.Cell. Biol. 85: 1-8 (1980)) e células TRI (Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sei. 383: 44-68 (1982)).

Será apreciado que, quando expresso em células de mamíferos, o produto do gene recombinante da gpl20 de HIV pode ter um peso molecular mais elevado devido à glicosilaçâo. Entende-se assim que formas glicosiladas parcialmente ou na sua totalidade de gpl20 de HIV, que tenham pesos moleculares algo diferentes dos 120KD, estão dentro do espirito do invento.

Outros vectores de expressão preferidos são aqueles para usar em sistemas eucariotas. Um sistema de expressão eucariota exemplar é o que emprega o virus vaccinia, que é bem conhecido nesta técnica. Ver, por exemplo, Macket et al. (1984) J.Virol. 49:857; DNA Cloning, Vol. II, págs 191-211, supra; Publicação PCT No. WO 86/07593. Vectores de expressão de leveduras são conhecidos na técnica. Ver, p. e., as Patentes Norte Americanas Nos. 4.446.235; 4.443.539; 4.430.428; ver também as Publicações europeias com os Nos. 103.409; 100.561; 96.491. Um outro sistema de expressão preferido é o vector pHSl, que transforma as células do ovário do Hamster chinês. Ver a publicação PCT com o No. WO 87/02062. Os tecidos de mamíferos podem ser co-transformados com DNA codificando um marcador seleccionado tal como a dihidrofolato reductase (DHFR) ou timidina cinase e DNA codificando a gpl20 de HIV. Se o gene DHFR do tipo selvagem for empregue, é preferível seleccionar uma célula hospedeira que seja deficiente em DHFR, permitindo assim o uso da sequência codificadora de DHFR, como marcador para uma transfecção com sucesso em meio hgt, ao qual falta hipoxantina, glicina e timidina. Uma célula hospedeira apropriada neste caso é a linha de células do ovário de Hamster chinês (CHO), deficiente na actividade da DHFR, preparada e propagada como descrito por Urlaub e Chasin, 1980, Proc. Nat. Acad. Sei. (USA) 77: 4216.

Dependendo do sistema de expressão e do hospedeiro seleccionado, a gpl20 do HIV é produzida pelo crescimento das células hospedeiras transformadas por uma construção de DNA exógena ou heteróloga, tal como um vector de expressão descrito acima sob condiçOes nas quais a proteina gpl20 de HIV é expressa. A gpl20 de HIV é depois isolada das células hospedeiras e purificada. Se o sistema de expressão secreta o gene gpl20 de HIV para o meio de crescimento, a proteina pode ser purificada directamente do meio isento de células como descrito. A selecção das condiçOes apropriadas de crescimento e métodos iniciais de recuperação do crude são ao critério dos especialistas na técnica.

Uma vez que a sequência código para a gpl20 de HIV tenha sido preparada ou isolada, pode ser cionada num vector apropriado, e assim mantida numa composição de células que é substancialmente isenta de células que não contenham a sequência codificadora do gene de gpl20 de HIV (p.e., isenta de outros clones da biblioteca). Numerosos vectores de clonagem são conhecidos pelos especialistas na técnica. Exemplos de vectores de DNA recombinante para clonagem e células hospedeiras que eles podem transformar incluem os vários vectores de bacteriófagos lambda (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E.coli), pKT230 (bactérias gram negativas), pGV1106 (bactérias gram negativas), pLAFRl (bactérias gram negativas), pME290 (bactérias gram negativas que não a E.coli), pHVl4 (E.coli e Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), actinofago, fago C31 (Streptomyces), YIpS (Saccharomyces), YCpl9 (Saccharomyces), e o virus do papiloma bovino (células de mamíferos). Ver na generalidade, DNA Cloning: Vols I & II, supra;

T. Maniatis et al., supra; B. Perbal, supra.

A mutagénese direccionada localmente para a inserção de locais de quebra (quando desejado) é conduzida usando um primer que compreende um oligonucleótido sintético complementar ao DNA de cadeia simples do fago a sofrer mutagénese, com excepção para os desencontros limitados representando a desejada mutação. Em termos breves, o oligonucleótido sintético é usado como um primer para dirigir a síntese de uma cadeia complementar ao fago, e a resultante cadeia dupla de DNA é tranformada numa bactéria hospedeira suportadora do fago. As culturas da bactéria transformada são plaquedas no topo do agar, permitindo a formação de placas a partir de células únicas que hospedam o fago.

Teoricamente, 50% das novas placas conterão o fago tendo, como cadeia simples, a forma mutada; 50% terão a sequência original. As placas resultantes são hibridizadas com um primer sintético que sofreu cinase a uma temperatura que permita a hibridização de pares exactos, mas no qual os desencontros com a cadeia original são suficientes para evitar a hibridização. As placas que hibridizam com a sonda são depois repicadas, feita uma cultura, e o DNA é recuperado.

Um método geral para a incorporação em locais específicos de aminoácidos não naturais em proteínas, é descrito por Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz, (April 1989), Science, Vol 244, págs 182-188. Este método pode ser usado para criar análogos com aminoácidos não naturais.

Embora o aspecto de purificação do invento possa ser

realizado num meio celular contendo soro fetal de bezerro, que é tipicamente utilizado em crescimento de células de mamíferos, é preferível usar um meio de cultura contendo quantidades relativamente pequenas de FCS. Por exemplo, células COS transfectadas com uma construção de plasmideo contendo o gene gpl20, podem ser usadas como fonte de gpl20. Tais células que expressam, de forma tarnsitória, a gpl20, podem crescer em meio de Delbeco essencial modificado (DMEM) com ou sem antibióticos, piruvato de sódio, glutamina, e 1% (em vez dos normais 5-6%) de soro fetal de bezerro. 0 meio de cultura com reservatório de células de vários intervalos de tempo, após a transfecçâo, pode ser sujeito ao processo de purificação do presente invento.

sistema de expressão usado exprimentalmente pelos presentes inventores para a expressão da gpl20 é totalmente descrito no Pedido de Patente Norte Americano com o No 138.894, depositado em 24 de Dezembro de 1987 (incorporado aqui como referência). Os vectores específicos usados estão identificados como pCMV6al20-SF2 (referido como pCMV6ARVl20tpa na USSA 138894) e Ad-dhfr. Os vectores foram utilizados para transfectar uma linha de células CHO para originar o produtor de gpl20 identificado como CHO-A-6al20-145-0,1-22. Não se observa qualquer vantagem na utilização desta linha celular sobre outros produtores de gpl20 preparados por outras técnicas.

Deve ser reconhecido que nenhum método especifico, linha celular ou isolados genéticos de virus usados na produção de gpl20 na sua forma de crude são preferidos pelos presentes inventores sobre qualquer outra técnica. Está previsto que as presentes técnicas de purificação produzirão gp!20 retentora da conformação a partir de qualquer fonte que contenha gpl20 na totalidade do seu comprimento, glicosilada e não fundida. Os exemplos específicos relacionados com a produção de gpl20 na secção de Exemplos que se segue resultam de decisões que foram tomadas em muitos casos apenas por conveniência. 0 material genético especifico, linhas celulares, condições de crescimento e semelhantes foram seleccionados a partir dos mais familiares e imediatamente disponíveis para os inventores, e os presentes inventores acreditam que qualquer das fontes de gpl20, descritas na literatura cientifica ou desenvolvidas posteriormente, podem ser igualmente bem utilizadas na prática do presente processo de purificação.

Fontes do péptido CD4 para usar como padrões da ligação gpl20/CD4.

As moléculas de CD4, úteis para testar se as composições de gpl20 têm as propriadades de ligação descritas aqui, podem ser preparadas de variadas formas, incluindo o isolamento a partir de recursos naturais e por técnicas da engenharia genética. Um fragmento solúvel de CD4 humana, capaz de se ligar à molécula de gpl20, é descrito no pedido PCT No 8903222, publicado a 20 de Abril de 1989, e depositado a 5 de Outubro de 1988. Moléculas de CD4 modificadas exibindo ligação à gpl20 são descritas no pedido PCT no 8902922, publicado a 6 de Abril de 1989, e depositado a 3 de Outubro de 1988. Uma linha de células secretoras de CD4 semelhante à usada como fonte na preparação da CD4 usada nos exemplos que se seguem pode ser obtida pela ERC BioServices Corporation, 649A Lofstrand Lane,

Rockeville, MD 20850, USA, e está registada como linha celular CHO ST4.2 na edição de Janeiro de 1990 do AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog publicado pelo National Institut of Health do U.S.D.H.H.S. Outras fontes de CD4 e técnicas de purificação estão descritas em, por exemplo, Smith et al., Science (1987) 238: 1704-1707; Lasky et al., Cell (1985) 42: 93-104; e Littman et al., Nature (1987) 325: 453-455. A purificação de CD4 a partir de meio celular envolve tipicamente a ligação da CD4 (ou outras moléculas que contenham hidratos de carbono) à conconvalinaA, acoplada a um suporte sólido, tal como a Sepharose 4B seguida por cromatografia de troca iônica. Se desejado, pode efectuar-se mais purificação por cromatografia de afinidade usando um anticorpo monoclonal especifico para a molécula de CD4. Ao contrário da gpl20, não há problemas aparentes na utilização da cromatografia por afinidade para purificar a CD4.

Utilizações da gp!20 do invento

Embora uma importante utilização da gpl20 retentora da conformação deste invento seja uma vacina, existem também uma variedade de outras utilizações. Por exemplo, a gpl20 retentora da conformação é particularmente útil na preparação de anticorpos anti-id que encaixam no local de ligação da molécula de gpl20 para a molécula CD4. Outros usos incluem a sua utilização como padrões nos ensaios de ligação competitiva para a presença de partículas virais de HIV-1. Com efeito, a glicoproteina gpl20 do presente invento pode ser usada de qualquer forma na qual as moléculas de gp!20 previamente disponíveis têm sido utilizadas, embora se assemelhe mais à gpl20 na forma em que é naturalmente encontrada nas partículas virais.

Uma utilidade óbvia da composiçaõ de gpl20 do presente invento é em imunoensaios tanto para anticorpos anti-HIV como para polipéptidos HIV, particularmente anticorpos anti-gpl20 e gpl20 virai. A concepção dos imunoensaios está sujeita a uma grande quantidade de variações na técnica. Assim, a discussão que se segue é apenas ilustrativa e não inclusiva. Contudo, ver, em geral, as Patentes Norte Americanas com os Nos 4.743.678; 4.661.445; e 4.753.873 e as Publicações EPO com os Nos 181.150 e

216.191.

Um imunoensaio para a gpl20 virai pode usar, por exemplo, anticorpos monoclonais dirigidos para um epitopo virai, uma combinação de anticorpos monoclonais dirigidos para epitopos da gpl20 virai, anticorpos policlonais dirigidos para a gpl20 virai ou uma combinação de anticorpos monoclonais e policlonais.

Os protocolos dos imunoensaios podem ser baseados, por exemplo, numa composição, reacção directa, ou ensaios do tipo sandwich. Os protocolos podem também, por exemplo, ser heterogéneos e usar suportes sólidos, ou podem ser homogéneos e envolver reacçôes imunológicas em solução. A maioria dos ensaios envolve a utilização de anticorpos marcados ou polipéptidos. Os marcadores podem ser, por exemplo, fluorescentes, quimioluminescentes, radioactivos ou moléculas corantes. São também conhecidos ensaios que amplificam o sinal da sonda. Exemplos de tais ensaios são aqueles que utilizam biotina e avidina, e enzimas marcadas e imunoensaios mediados, tais como os ensaios ELISA.

Tipicamente, um imunoensaio para um anticorpo anti-HIV envolverá a selecção e preparação da amostra teste, tal como uma amostra biológica, e depois a incubação desta com a composição de gpl20 do presente invento, sob condições que permitam a formação de complexos antigénio-anticorpo. Estas condições são bem conhecidas na técnica. Num formato heterogéneo, por exemplo, a gpl20 é ligada a um suporte sólido para facilitar a separação da amostra do polipéptido após incubação. Exemplos de suportes sólidos que podem ser utilisados são a nitrocelulose, em forma de membrana ou de cúpulas de microtitulação, cloreto de polivinilo, em forma de folhas ou cúpulas de microtitulação, latex de poliestireno, em contas ou placas de microtitulação, fluoreto de polivinlidina, conhecido como Immobulon , papel diazotizado, membranas de nylon, contas activadas e contas de proteina A. mais especificamente, Dynatech, placas de microtitulação Immulon 1 ou contas de poliestireno com 0,25 polegadas, finalizados Spec por Precision Plastic Bali, são usados no formato heterogéneo. 0 suporte sólido é tipicamente lavado após a separação deste da amostra teste. Por outro lado, no formato homogéneo, a amostra teste é incubada com o antigénio gpl20 em solução, sob condições que conduzirão à precipitação de qualquer complexo antigénioanticorpo formado, como é conhecido na técnica. Os complexos precipitados são depois separados da amostra teste, por exemplo, por centrifugação. Os complexos formados que compreendem anticorpos anti-HIV são depois detectados por qualquer uma das numerosas técnicas. Dependendo do formato, os complexos podem ser detectados com Ig anti-Xenogénicos marcada ou, se é usado um formato competitivo, através da medição da quantidade de ligação, com o anticorpo competitivo marcado.

Em imunoensaios em que os polipéptidos virais de gpl20 são o analisado, a amostra teste, tipicamente uma amostra biológica, é incubada com anticorpos anti-gpl20 mais uma vez sob condições que permitem a formação de complexos antigénioanticorpo. Podem ser empregues vários formatos, tais como ensaios sandwich, em que o anticorpo ligado ao suporte sólido é incubado com a amostra teste; lavado, incubado com um segundo anticorpo marcado para o analisado; e o suporte é novamente lavado. 0 analisado é detectado pela determinação de se o segundo anticorpo se encontra ligado ao suporte. Num formato competitivo, que pode ser heterogéneo ou homogéneo, a amostra teste é usualmente incubada com o anticorpo e um antigénio competitivo marcado, ou sequência ou simultâneamente. Estes e outros formatos são bem conhecidos na técnica.

Quando usada em vacinas, a glicoproteína gpl20 do presente invento é por vezes referida como uma sub-unidade de vacina, como a gpl20 é uma sub-unidade do virus HIV. Como tal oferece vantagens significativas em relação às vacinas tradicionais em termos de segurança e custo de produção; contudo, sub-unidades de vacinas são muitas vezes menos imunogénicas do que as vacinas totalmente feitas de virus, e espera-se que adjuvantes com capacidades imunoestimuladoras significativas sejam requeridos com o objectivo de atingir o seu máximo potencial na prevenção da doença. Contudo, todos os adjuvantes testados até agora mostram a capacidade de induzir à formação de anticorpos neutralizantes multi-isolados, quando usados com a gp!20 retentora de conformação do invento, de forma que aduvantes específicos não fazem parte dos aspectos mais vastos do presente invento. Contudo, certos adjuvantes são preferidos dadas as suas próprias propriedades vantajosas.

Correntemente, os únicos adjuvantes aprovados para uso em humanos nos Estados Unidos são os sais de aluminio (alum). Estes adjuvantes têm sido úteis em algumas vacinas incluindo a Hepatite B, difteria, polio, raiva e influenza.

Adjuvante Completo de Freund (CFA) é um potente agente imunoestimulador que tem sido usado com sucesso com muitos antigénios numa base exprimental. 0 CFA é composto de um óleo mineral, um agente emulsificador tal como o Arlacel A, e mycobactérias mortas tais como Mycobacterium tuberculosis. Soluções aquosas de antigénios são misturadas com estes componentes para criar uma emulsão de água em óleo. Contudo, o CFA provoca vários efeitos secundários incluindo a dor, formação de abcessos e febre, o que evita o seu uso tanto em vacinas para uso humano como veternário. Os efeitos secundários são primariamente devidos às reacções do paciente ao componente mycobacteriano do CFA.

Adjuvante Incompleto de Freund (IFA) é semelhante ao CFA mas sem o componente bacteriano. Embora o seu uso não esteja aprovado nos Estados Unidos, o IFA tem sido útil para vários tipos de vacinas noutros paises. 0 IFA tem sido usado com sucesso em humanos com a vacina influenza e polio e com várias vacinas para animais incluindo a raiva, esgana canina e doença de patas e bocas. Experiências mostraram que tanto o óleo como o emulsificador usados no IFA podem provocar tumores em ratos, indicando que um adjuvante alternativo seria uma melhor escolha para usar em humanos.

dipéptido muramil (MDP) representa uma unidade minima do complexo da parede celular das mycobactérias que gera a actividade adjuvante observada com o CFA (ver Ellouz et al. (1974) Biochem. Biophys. Res. Comm., 59;1317). Foram feitos muitos análogos sintéticos do MDP que exibem um largo espectro do potencial adjuvante e efeitos secundários (revisto em Chedid et al. (1978) Prog. Allergy, 25; 63). Três análogos que podem ser especialmente úteis como adjuvantes de vacinas são os derivados treonil do MDP (ver Byars et al. (1987) Vaccine , 5: 223), derivados n-butil do MDP (ver Chedid et al. (1982) Infect. and Immun., 35: 417), e derivados lipofilicos do tripéptido de muramil (ver Gisler et al. (1981), Immunomodulations of Microbial Products and Related Synthetic Compounds, Y. Yamamura e S. Kotani, eds., Excerpta Medica, Amsterdam, pág. 167). Estes compostos estimulam eficazmente a imunidade humoral ou mediada por células e exibem baixos niveis de toxicidade.

Um derivado lipofilico do MDP prometedor é o N acetilmuramil - L - alanil -D - isoglutamil - L - alanina - 2 [1,2- dipalmitoil - sn - glicero - 3- ( hidroxifosforiloxi)] etilamida (MTP-PE). Este péptido de muramil tem caudas fosfolipidicas que permitem a associação das porções hidrofóbicas da molécula com um ambiente lipidico, enquanto que a porção de péptido de muramil se associa com o ambiente aquoso. Assim, o próprio MTP-PE pode actuar como agente emulsificador para originar emulsões água-óleo estáveis.

Em experiências em ratos, o MTP-PE mostrou ser eficaz como adjuvante na estimulação de titulos de anticorpos gD anti48

HSV contra o antigénio gD do virus Herpes simplex, e essa eficácia era grandemente melhorada se o MTP-PE e a gD fossem distribuídos no óleo (IFA) em vez de na solução aquosa. Dado que o IFA não está aprovado para o uso em humanos, têm sido investigados outros sistemas de óleos de distribuição para o MTPPE e antigénio. Uma emulsão de esqualeno 4% com Tween 80 0,008% e gD de HSV deu resultados muito bons no porco da india. Esta formulação, MTP-PE-LO (baixo óleo), foi emulsificada pela passagem através de uma agulha hipodérmica e era bastante instável. Apesar de tudo, MTP-PE-LO originou elevados titulos de anticorpos no porco da india e uma boa proteeção no desfio pelo HSV de um porco da india imunizado (ver Sanchez-Pescador et al. (1988) J.Immunoiogy, 141: 1720-1727 e Technological Advances in Vaccine Development (1988) Lasky et al., eds., Alan R. Liss, Inc., págs. 445-469). A formulação MTP-PE-LO foi também eficaz na estimulação da resposta imune à proteina do envelope do HIV produzida por leveduras no porco da india. Tanto os titulos de anticorpos pelo ELISA como os titulos de anticorpos neutralizantes do virus foram estimulados a um elevado nivel com a formulação MTP-PE. Contudo, quando a mesma formulação foi testada em animais maiores, como cabras e babuinos, as composições não foram eficazes. Apesar disso, este sistema representa um sistema de adjuvantes potencial para usar com o antigénio gpl20.

As experiências também demonstraram que uma composição de adjuvante compreendendo um óleo metabolizável e um agente emulsificador, em que o óleo e o agente emulsificador estão presentes na forma de uma emulsão de óleo em água tendo gotas de óleo em que substancialmente todas têm menos de 1 micron de diâmetro, é uma composição de adjuvante eficaz para aumentar a eficiência das vacinas. Investigações demonstraram uma surpreendente superioridade de tais composições de adjuvantes em relação a composições de adjuvantes contendo óleo e agentes emulsificadores nos quais as gotas de óleo eram significativamente maiores. Estas composições de adjuvantes superiores são o objecto de um pedido de patente independente (EPO 0399843), a descrição do qual se encontra aqui incorporada para referência.

As formulações de adjuvantes são geralmente preparadas a partir dos ingredientes descritos acima antes de combinar o adjuvante com o antigénio gpl20. 0 antigénio gpl20, ao conseguir * acesso ao tecido do animal estimula a formação de anticorpos específicos e reage especificamente com esses anticorpos, in vivo ou in vitro. De qualquer modo, o antigénio estimula a proliferação dos linfócitos T com receptores para o antigénio e reage com o linfócito para iniciar a série de resposta designadas por imunidade mediada por células.

A formulação de uma vacina do invento empregará uma quantidade eficaz de antigénio gpl20. Isto é, será incluída uma quantidade de antigénio que, em combinação com o adjuvante, irá provocar por parte do sujeito a produção de uma resposta imunológica especifica e suficiente, de forma a fornecer protecção ao sujeito a partir de uma subsequente exposição ao virus HIV.

Uma formulação de adjuvante preferida, designada por MF-59, compreende Tween 80 0,5%, Span 0,5%, esqualeno 5,0% em solução MTP-PE contendo MTP-PE 0,40 microgramas/ml. A composição da emulsão é passada 10 vezes através de um microfluidizador a

10.000 psi, a 0°C. O material resultante é passado através de um filtro de 0,2 micron e armazenado em argon a 4°C.

Não se pode assegurar que a prescrição de uma única dose fornecerá orientação especifica para cada e todas as formulações de gpl20 que podem ser empregues como vacinas. A quantidade eficaz de antigénio será uma função da sua actividade inerente e pureza, que variará de isolado para isolado. A orientação para as proporções iniciais de componentes da formulação da vacina pode ser obtida a partir da secção de Exemplos, que mostra várias formulações que têm provado ser eficazes na estimulação de anticorpos neutralizantes. Estas proporções serão ajustadas para preparações individuais de gpl20 retentora da conformação, como bem entendido na técnica.

As composições de vacina do invento são úteis tanto na prevenção da infecçâo por HIV-1 como para propósitos terapêuticos nos animais já infectados com HIV-1 para reduzir ou eliminar a infecçâo por HIV-1. Enquanto todos os animais que podem ser atacados pelo HIV-1 podem ser tratados desta maneira, o invento, é claro, é particularmente dirigido para a prevenção e uso terapêutico da vacina do invento no homem. Muitas vezes é requerida mais do que uma administração para se atingir o efeito profilático ou terapêutico desejado; o protocolo exacto ( dose e frequência) pode ser estabelecido por procedimentos clinicos padrão. As composições de vacina são administradas de qualquer forma convencional que introduzirá a vacina no animal, usualmente por injecção. Para administração oral, a composição de vacina pode ser administrada numa forma semelhante às usadas para a administração oral de outros matérias protaináceos, tais como a insulina. Como discutido acima, as quantidades precisas e formulações para usar tanto na prevenção como na terapia podem variar dependendo das circustâncias da pureza inerente e actividade do antigénio, de quaisquer ingredientes ou transportadores adicionais, do método de administração e semelhantes.

Com o intuito de não limitar as ilustrações, as doses de vacina administradas serão tipicamente, no que respeita ao antigénio gpl20, um minimo de cerca de 0,lpg/dose, mais tipicamente um minimo de cerca de lgg/dose, e mais tipicamente um minimo de cerca de lC^g/dose. As doses máximas não são tipicamente tão criticas. Contudo, usualmente a dose não será mais do que 1 mg/dose, tipicamente não mais do que 500qg/dose, muitas vezes não mais do que 25(^g/dose. Estas doses podem ser suspendidas num veiculo ou transportador farmacêutico adequado, em volumes suficientes para transportar a dose. Geralmente o volume final, incluindo os transportadores, adjuvantes e semelhantes, será tipicamente pelo menos 0,1 ml, mais tipicamente pelo menos cerca de 0,2 ml. O limite máximo é determinado pela natureza prática da quantidade a ser administrada, geralmente não mais do gue cerca de 0,5 ml a cerca de 1,0 ml.

Tendo em conta o que se disse acima, o invento também inclui um método de uso das composições de vacina do invento para prevenção das infecções pelo HIV-1 num animal e um método de uso das composições de vacina do invento para tratamento terapêutico de animais já infectados com o HIV-1.

Os animais aqui usados incluem mamíferos, tais como primatas, por exemplo, chimpanzés, babuínos e humanos.

invento vai ser agora descrito de forma geral, sendo o mesmo melhor compreendido tendo como referência os exemplos detalhados que se seguem e que estão aqui colocados apenas com o propósito de ilustrar e não devem ser considerados como limitantes do invento a não ser que seja especificado.

Exemplo 1

Mutagénese e expressão da gp!20 do HIV em células de mamíferos.

gene codificando a gpl60 do envelope do HIV-SF2 foi tratado por engenharia genética para a expressão das sequências da gpl20 pela introdução de um codão stop a seguir à Arg509 no local de processamento gpl20-gp41. A extremidade 5' do gene foi modificada para inserir um local 5' para a endonuclease de restrição Nhel nas sequências que codificam a Glu31, de forma a que sequência sinal natural possa ser substituída por outras sequências sinal para testar o melhoramento da secreção a partir células de mamíferos. Com o objectivo de produzir gpl20 como uma glicoproteína secretada pelas células de mamíferos, a sequência sinal do HIV e as sequências 5' não traduzidas foram substituídas pelas t-PA humanas, mutagenizadas de forma a colocar um local Nhel perto da extremidade 3' do DNA com o sinal tPA para codificar a Ala Ser. A resultante construção de gene foi fundida com uma série de promotores. A expressão transitória de gpl20 foi avaliada a seguir à transfecçâo de vector de expressão em células COS-7 e foram feitas comparações com niveis de gp!20 secretada pelos testes ELISA de captura em cabra (descrito abaixo) e western blot. Os niveis mais elevados de expressão foram observados com o uso do promotor CMV IE-1, pelo menos 50 vezes mais do que com o promotor antecedente, SV40. Para a construção de linhas de células permanentes o plasmideo de expressão pCMV6aSF2-120 (Figura 1) foi cotransfectado com um plasmideo de expressão dhfr usando coprecipitação em fosfato de cálcio, dentro de células CHO dhfr (dg 44; ver abaixo). As resultantes linhas celulares foram caracterizadas pela visualização dos clones com a gpl20 pelo ELISA de captura em cabra. As linhas celulares de maior expressão foram amplificadas em reservatórios de metotrexato. Os clones foram isolados ao nivel do 0,1 mM. Usando a proteina purificada como padrão, viu-se que as linhas celulares secretavam gpl20 no intervalo de 5 mg por litro ao nivel frasco

T.

As células usadas para a expressão do gene da gpl20 foram originalmente obtidas pelo Dr. Leslie Rall da Chiron Corporation, em Setembro de 1985, após aproximadamente 100 passagens. Estas células foram originalmente isoladas pelo Dr. Gail Urlaub e Dr. Lawrence Chasin na Universidade de Colômbia, New York e estão descritas em Urlaub et al., Cell (1983) 33: 45. As células foram designadas como DG44. Elas são derivadas das células K-l de ovário de Hamster chinês (CHO) que foram feitas como deficientes em dihidrofolato reductase (dhfr”) em virtude de uma dupla delecção.

As células CHO dhfr” foram cultivadas continuamente no seguinte meio: meio Hams F-12 suplementado com soro fetal de bezerro dializado 10%, estreptomicina 200gg/ml. 0 meio e o soro foram obtidos da Universidade de Califórnia, San Francisco Cell Culture Facility, San Francisco, CA. Todos os outros ingredientes foram fornecidos pela Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. As células foram mantidas pela passagem duas vezes por semana com uma divisão de 1:10 em frascos T-75.

Para armazenamento, foram congeladas aliquotas de células em soro fetal de bezerro (FCS), dimetil sulfóxido 10% e armazenadas a -80°C na fase gasosa do nitrogénio liquido. Para este próposito, cresceram células em frascos T-75 até à confluência (aproximadamente 10 células por frasco T-75). As células foram tripsinizadas, centrifugadas e ressuspensas em DMSO g

10% em FCS no gelo, a uma concentração de cerca de 5 x 10 células/ml. Um ml de aliquotas foram transferidas para recepientes criopreservativos. Quando as células eram requeridas, uma aliquota era descongelada num banho de água a 37°C , e as células eram colocadas em frascos T-75 para continuar a cultura e a passagem.

Os dois ensaios usados como descrito a seguir para a detecção de antigénios relacionados com o envelope do HIV-1 foram realizados da seguinte maneira. Para ambos os ensaios, foi usada como modelo a gpl20 purificada derivada de CHO, usando diluições de duas vezes a partir de 200 ng/ml até 0,195 ng/ml.

(a) ELISA de captura em cabras: 0 reagente de captura para este ensaio foi a imunoglobulina purificada por afinidade em Sepharose proteina A a partir de uma cabra que estava hiperimunizada com env-2-3 (SF2) purificado, que está descrito a seguir, um polipéptido não glicosilado produzido em leveduras correspondendo à sequência de aminoácidos da gpl20 do virus HIV55

SF2 isolado. 0 reagente usado para detectar o antigénio capturado foi um antisoro policlonal criado em coelhos para o mesmo antigénio. As placas foram cobertas com 5gg/ml de imunoglobulina de cabra para o env-2-3 (SF2), incubadas com diluições de lisados virais ou antigénios gpl20 derivados de células de mamíferos e depois o antigénio capturado foi detectado pelo antisoro policlonal de coelho para o env-2-3 (SF2) diluido de 1/100 seguido pela conjugação e substrato ABTS.

(b) ELISA de captura em humanos: Este ensaio é idêntico ao ELISA de captura em cabras, descrito acima, com a excepção de que o reagente de captura foi a imunoglobulina purificada por Sepharose proteína A a partir de soro humano obtido de sangue de dadores seropositivos para o HIV-1.

Exemplo 2

Produção celular

Uma linha celular, CHO-A-6al20-145-0.1-22, obtida como descrito no Exemplo 1, foi escolhida para a produção em garrafas cilíndricas, em meio com soro reduzido e sem metotrexato. As culturas em garrafas cilíndricas (850 cm²) foram estabelecidas e expandidas até à confluência no meio (meio de Eagle modificado por Dulbeco e meio Ham F-12, 1:1) suplementado com soro fetal de bezerro 6% (FCS). Para a produção, o suplemento foi reduzido até FCS 1% com HB-CHO 0,03% (Hana Biolgics, Alameda, CA.). 0 meio condicionado (200 ml) foi recolhido todas as 24-48 horas, armazenado a 2-8°C, posto em reservatório e clarificado por filtração através de cápsulas de filtros com 0,45 micron

(Gelman). As células foram mantidas por mais de dois meses em cada uma das corridas de produção, sem haver perda aparente na produção de gpl20. Os niveis de expressão atingiram desde 5a 20 mg/1.

Exemplo 3

Purificação (1) Concentração. A concentração do sobrenadante da cultura celular do Exemplo 2 (40 1) foi realizada usando uma filtração até final (cápsulas de filtros de 0,45 microns, Gelman) e ultrafiltração de fluxos cruzados usando um ultrafiltro de fibra concâva de retenção 30K (AG Technology #UFP-30-C-6; 6 pés²e fibras i.d. de 0,5 mm) conduzidas por uma bomba de distribuição

positiva (Waukesha	#18) .	A taxa de	permeaçâo	foi	de
aproximadamente 150	ml/min	a uma taxa	de recirculação	de
aproximadamente 12	1/min e	uma pressão de	26 psi. A	filtração

continuou até que o volume de retenção atingisse 1-2 L. As etapas de filtração foram realizadas numa sala fria a 2-8°C. O concentrado da ultrafiltração era um liquido castanho e claro.

(2) Cromatografia DEAE. 0 concentrado foi aplicado a uma coluna de troca iónica (11,4 cm dm x 15cm) preenchida com Sephadex A-50 DEAE (Pharmacia), foi equilibrada em tampão (TrisHCl 0,02 M, pH 8,0 , NaCl 0,1 M) com uma taxa de fluxo de 35 ml/min à temperatura ambiente. O concentrado da ultrafiltração foi posto num volume de 2 1 e com uma condutividade de 1,4 mS pela adição de cloreto de sódio (solução stock 4M). A fracção não adsorvida contendo o produto foi recolhida em fracções de 250 ml

TM usando o colector de fracções Isco Foxy A albumina do soro, outras proteínas e a maior parte do material com cor castanha ligados à coluna e foram eluidos com um gradiente por etapas com NaCl 1M. Estas fracções continham uma pequena mas variável quantidade de produto; não foi feita qualquer tentativa para recuperar o produto da fracção ligada. A resina Sephadex A-50 DEAE foi rejeitada após cada utilização. A fracção que passa através da coluna mostrou conter a maior parte do produto do ensaio ELISA. Neste estádio de pureza foi dificil localizar a banda de gpl20 difusa num gel SDS.

(3) Cromatografia de interacção hidrofóbica em fenil. A fracção DEAE foi levada a 40% de saturação em sulfato de amónia pela adição de sulfato de amónia sólido. Após uma mistura total foi removida uma pequena quantidade de precipitado por centrifugação. Uma coluna HIC TSK Phenil-5PW (5,5 cm diam x 20 cm) foi lavada com, pelo menos, dois volumes de água usando um preparado HPLC Gilson. A coluna foi depois equilibrada com dois ou mais volumes de tampão A (acetato de sódio 0,02 M, pH 5,0, 40% saturado com sulfato de amónia). 0 equilíbrio da coluna foi verificado por medidas da conductividade do efluente. A fracção do sobrenadante após a adição do sulfato de amónia foi aplicada à coluna por bombagem através da bomba A a 30 ml/min, a coluna foi depois lavada com tampão A até que a linha de base estabilizasse (usualmente cerca de 15-20 min). Foi corrido um gradiente de acetato de sódio 0,02 M, pH 5,0, durante 40 minutos para eluir o produto. As fracções abaixo do pico de DO foram ensaiadas em TM electroforese de gel SDS usando um sistema Pharmacia Phast para localizar o produto. Neste estado de pureza a banda de gp!20 era claramente discernivel. As fracções contendo produto foram postas em reservatório para o próximo estádio de cromatografia (ver Fig.

3A) .

(d) Cromatografia de interacção hidrofóbica em éter. Foi realizada uma segunda etapa de HIC numa coluna HPCL TSK Ether-5PW (5,5 cm diam x 20 cm) seguindo-se o mesmo procedimento que foi usado para a coluna HIC de fenil. A coluna foi lavada com pelo menos dois volumes da coluna de água, depois equilibrada com tampão A (40% saturado em sulfato de amónia, acetato de sódio 0,02 M, pH 5,0). 0 produto em reservatório da coluna fenil foi trazido para uma conductividade de 165 S/cm pela adição de sulfato de amónia, seguindo-se centrifugação durante 10 minutos a 12.000 rpm. As amostras foram carregadas e eluidas como descrito acima usando um gradiente de 40 minutos de tampão A 100% a tampão B 100%. As fracções contendo produto (ver Fig. 3B) foram localizadas por electroforese em gel SDS num sistema Phast , depois postas em reservatório para a cromatografia de filtração em gel. 0 pico gpl20 da coluna de éter era apenas gpl20 com pequenas quantidades de contaminantes de baixo peso molecular. Estes contaminantes foram retirados por cromatografia de filtração em gel (abaixo).

(5) Cromatografia de filtração em gel. A fracção da HIC em éter foi concentrada numa membrana de ultrafiltração (Amicon YM-30) para uma concentração de proteina de, aproximadamente, 10 mg/ml como medido pela A-280 assumindo um coeficiente de extinção de 0,6 =1 mg/ml, depois diafiltrado contra pelo menos cinco volumes de fosfato de sódio 0,1 M, pH 6,9. A amostra foi aplicada a uma coluna de filtração em gel (Superdex™ 200,

Pharmacia, 1,6 cm diam x 60 cm) a uma concentração de proteina total de não mais do que 10 mg/ml num volume de não mais do que 4% do volume da coluna e eluida com fosfato de sódio 0,1 M, pH 6,9. As fracções de 1 ml foram colectadas, sujeitas a electroforese em gel SDS com Comassie Brilliant Blue R350 como revelador num sistema Phast, e para conseguir uma HPCL de filtração numa coluna Dupont GF-450 (tampão de corrida: fosfato de sódio 0,2 M, pH 6,7, lml/min), para localizar as fracções que contêm o dimero, e depois postas em reservatório. A extremidade superior do pico da gpl20 continha gpl20 pura enquanto que a extremidade inferior do pico foi recromatografada na coluna de filtraçaõ em gel. 0 reservatório produzido foi concentrado numa membrana Amicon YM-30, diafiltrado contra 5 volumes de água destilada, e liofilisado durante pelo menos dois dias, a uma pressão de menos de 10 microns.

(6) Sumário dos Resultados da Purificação. A tabela 1 sumariza os resultados de uma purificação típica começando com 40 de sobrenadante da cultura celular. Estes dados mostram se consegue uma purificação de 250 vezes com um rendimento de 2025%. 0 produto aparece como uma banda ampla migrando a ~ 120 KD no gel SDS. A densiometria revelou 80-90% da intensidade da revelação abaixo da banda da gpl20. Isto representa provavelmente um minimo estimado de pureza desta preparação dado que as bandas de gpl20 sofrem pouca contrastação. Aproximadamente 7 vezes menos de Comassie Brilliant Blue foi ligado por microgramas de proteina quando comparado ao BSA. O aparecimento da banda no gel não foi alterado pelo pré-tratamento da amostra com 2mercapotetanol ou ditiotreitol, mostrando que a proteina não está a

quebrada elevadas excede os internamente.

temperaturas,

90%.

A análise da HPCL de fase também sugere que a pureza reversa, do produto

Quadro 1

Quadro de purificação da rgp!20 do SF2

Etapa	Volume	Proteina	rgpl20	Pureza
1.Sobrenadante da cultura	40,0 1	55,0 g	210 mg	0,4%
2.Concentrado por UF	3,76	44,9	180	0/4
3.DEAE	4,75	8,55	140	1/6
4.HIC fenil	0,724	0,996	150	15
5.HIC éter	0,260	0,354	110	31
6.Filtração em gel	0,020	0,053	48	90
	Exemplo 4

(1) Comparação da rgp!20 SF-2 purificada com a gp!20 virai.

A gpl20 purificada foi sujeita a uma electrforese em gel SDS de poliacrilamida para avaliar o tamanho e pureza. A proteina migrou para a localização esperada de uma proteina com 120K com uma banda ampla contrastada característica de glicoproteinas. A banda ampla é consistente com a heterogeneidade esperada dos hidratos de carbono nos 22 locais esperados de glicosilação ligados ao N, que foi descrito para os outros isolados. Para comparar a gpl20 recombinante com a que se encontra nos viriões, foram preparados e analisados lisados de células HUT-78 infectadas com HIV-SF2 por western blot com soro de humano HIV positivo e soro especifico de gp!20 de animal. Os padrões observados foram consistentes com a conformação conservada.

(2) Sequenciação N-terminal. A sequência de aminoácidos aminoterminal foi determinada pela degradação automática de Edman. As sequências observadas e esperadas eram:

Observada EKLWVTVYYGVPVWK

Esperada TEKLWVTVYYGVPVWK

Esta sequência confirma que o sinal heterólogo foi correctamente processado pela peptidase sinal , seguindo a serina do sinal, e assim a proteina não está fundida com quaisquer amonoácidos adicionais. A esta sequência falta a treonina Nterminal que se encontra na gpl20 virai do isolado HTLVIIIB (Robey et al., PNAS (1986) 83: 7023-7027). A sequência do aminoácido N-terminal coincide com a sequência prevista para o envelope do HIV-SF2 a partir da sequência do DNA deste isolado, pelo menos nos primeiros quinze aminoácidos.

(3) Composição de aminoácidos. A análise dos aminoácidos foi realizada em cinco lotes de gpl20 purificada como descrito no Exemplo 3. A média destes valores é concordante com a composição esperada a partir da sequência de DNA dentro do erro experimental, para todos os aminoácidos com excepção da ile (33,5 observações vs. 39 esperadas) e da ser (32,7 observações vs 24 esperadas). 0 valor da ser foi variável dentro dos cinco lotes e provavelmente representa um contaminante rico em serina.

(4) Electroforese em gel nativa e IEF. A heterogeneidade da carga da gpl20 foi evidente nas experiências focando o ponto isoeléctrico e na electroforese em gel nativa. A focagem do ponto isoeléctrico revelou a presença de múltiplas

bandas dentro do envelope a pH de 5 a 7. A proteína migrou como uma única mancha ampla num gel de poliacrilamida não desnaturante.

(5) HPLC de filtração em gel. 0 peso molecular da gpl20 recombinante foi 120 K na presença de SDS; o peso molecular na ausência de SDS foi medido por HPLC de filtração em gel. A um pH neutro em tampões de força iónica média, a gpl20 purificada eluiu como um único grande pico com uma retenção de volume correspondente a um peso molecular de »13OK. Estava também presente uma pequena quantidade de dimero; a fracção do dimero ι

aumentou para 10-20 do total da gpl20 depois de armazenada em solução. A fracção do dimero foi isolada na etapa de filtração em gel e analisada separadamente. Esta fracção de dimero migrou como um monómero quando analisada em electroforese em gel SDS, na presença de um agente redutor mas como um dimero na ausência de agentes redutores (2-mercaptoetanol ou ditiotreitol), de forma que estaria provavelmente ligada por pontes dissulfito. A composição em aminoácidos da fracção do dimero era indistinguível daquela que se encontra na fracção monomérica. A fracção dimérica ) também se liga à CD4 quando testada por ensaios radioimunológicos de precipitação. 0 pico da gpl20 na HPLC de filtração em gel era mais amplo do que se esperaria para uma proteína com este peso molecular. 0 pico extra largo obtido para a gpl20 pode ser atribuído à heterogeneidade da metade de hidratos de carbono. O elevado peso molecular da gpl20, relativamente às impurezas presentes, tornou possivel o uso da HPLC de filtração em gel, como um ensaio de purificação após a etapa da HIC de fenil. Foi usado rotineiramente como um ensaio na etapa de filtração em gel para eliminar do reservatório do produto as fracções contendo os dimeros de gpl20.

(6) Ligaçao CD4. A CD4 usada neste exemplo era recombinante, CD4 solúvel derivada de uma linha de células CHO transfectado por um plasmídeo de expressão codificando a totalidade do domínio externo. Detalhes na produção de CD4, para usar como modelode ligaçao, estão indicados no exemplo 5. As experiências de ligação foram feitas por precipitação radioimunológicas por HPLC de filtração em gel.

(a) Técnicas gerais de precipitações radioimunológicas. Monocamadas de células confluentes produzindo (por exemplo) gpl20 foram marcadas num meio modificado de Eagle modificado por Dulbeco sem cisteína e metionina (cys-met-DME). Cinco ml de cysmet-DME com 100 mCi/ml cada de met e cys, foram adicionados a cada um dos fracos T-75 por 6-8 horas. As amostras marcadas foram recolhidas, centrifugadas para remover as células, e armazenadas a -80°C até ao seu uso. As amostras a serem precipitadas foram ajustadas para 1 x tampão de lise [NaCI 0,1 M, Tris 0,2 M pH 7,5, EDTA 1 mM, NP40 0,5%, deoxicolato 0,5%, albumina de soro bovino (BSA) 0,1%, Fluoreto de fenil metil sulfonil (PMSF) 1 mM, aprotinina 17 mg/ml]. As amostras foram pré-clareadas com um décimo do volume de soro de cabra normal durante 30 minutos a

4°C, seguindo-se 30 minutos de precipitação com Sepharose Proteina A (PAS) (¾ de volume de suspensão 20%) a 4°C. A imunoglobulina de animais hiperimunizados ou amostras de soro humano HIV positivo foram purificadas por afinidade usando PAS pelas técnicas Standard. 0 soro foi titulado para a melhor razão sinal/ruido; a maioria das fracções de imunoglobulina foram usadas a 5-10 mg por amostra. As precipitações imunológicas eram de 1-12 horas a 4°C, dependendo do volume da amostra, seguindo-se 1 hora com PAS. Todas as amostras foram ajustadas para o mesmo volume dentro de uma experiência. 0 PAS foi lavado com tampão de lise sem BSA, seguindo-se Tris 0,12 M pH7, e os pellets foram solubilizados numa amostra de tampão Laemmli, fervidos e aplicados a geis. Os geis foram tratados com En^Hance™, secos e fluorografados.

(b) Ligação da CD4 por precipitação radioimunológica. A 35

CD4 foi marcada com S como descrito acima, e a concentração de CD4 foi determinada usando um ELISA de captura com o emprego de anticorpos monoclonais e soro policlonal de coelho criado contra a CD4. Para experiências de co-precipitação, a CD4 foi adicionada em quantidades crescentes para uma quantidade fixa de gpl20 (1 qg) para determinar a quantidade saturante, e depois coprecipitada com antisoro anti gpl20. Esta quantidade de CD4 foi usada para experiências de titulação de gpl20. A CD4 marcada foi pré-clareada com soro normal, como descrito acima. A seguir à pré-clareagem do componente marcado, a CD4 e a gpl20 foram complexadas durante 1 hora a 4°C, e foi depois adicionado o anticorpo contra o componente não marcado (10 mg por amostra) durante 1 hora a 4°C. OKT4 foi adquirida da Ortho Diagnostics. A PAS foi adicionada durante 1 hora a 4°C, e os complexos foram lavados e preparados para a electroforese descrita acima.

Ambas as gpl20 pré e pós-purificação eram eficazes na ligação à CD4 neste ensaio, como se mostra pela intensidade equivalente das bandas para quantidades adicionadas equivalentes de gp!20. Um análogo não glicosilado da gp 120 produzido em ii levedura (env 2-3; ver Pedido de Patente Norte Americano com o No. 138.894, depositada em 24 de Dezembro de 1987) foi incapaz de se ligar à CD4 neste ensaio. A forma dimérica da gpl20 isolada da coluna Superdex™200 também se ligou à CD4 neste ensaio. A saturação da ligação foi determinada graficamente. A partir dos niveis de saturação médios foi medido um Kj de 6,9 nM.

(c) Ligação da CD4 por HPLC de filtração em gel. A gpl20 purificada e a CD4 não marcada foram misturadas num volume de 60 μΐ contendo fosfato de potássio 0,3 M, pH 6,8. Após a mistura, uma porção da amostra (45 μΐ) foi injectada numa coluna HPLC de filtração em gel Dupont GF-450 com um injector de amostra Waters WISP 712 corrido em fosfato de potássio 0,4 M, pH 6,8 a lml/min. A densidade óptica foi registada a 215 nm e os dados foram registados usando o software para cromatografia Waters

TM

Maxima 820 ,

Quando a CD4 e a gpl20 foram aplicads separadamente a uma coluna HPLC de filtração em gel, cada componente deu um único pico no tempo de eluição esperado (ver Fig. 4; o traço A é a CD4 sózinha, o traço B é a gpl20 sózinha). Quando os componentes foram misturados antes da cromatografia, apareceu um novo pico com um tempo de eluição correspondente a 160 K e os picos a 120 K e 40 K diminuiram (Fig. 4; traço C). Este resultado fornece uma evidência fisica directa da formação de um complexo 1:1 entre a CD4 e a gpl20. Foram feitas experiências adicionais variando as razões de CD4 e gpl20 a diferentes concentrações de reagentes. Os resultados destas experiências defenderam a existência de um complexo de elevada afinidade entre uma molécula de CD4 e uma molécula de gpl20.

ίϊ.·*^Γ

Exemplo 5

As células CHO foram co-transfectadas com AD-dhfr e um plasmídeo de expressão codificando CD4 humana solúvel recombinante (totalidade do dominio externo). 0 vector de expressão foi construído através da clonagem da sequência codificadora da CD4, um presente do Dr. Littman da UCSF, no vector pCMVôa (pCMV6al20-SF2 menos a sequência codificadora da gpl20). Foi isolada uma linha celular que secreta CD4 solúvel. A linha celular resultante, identificada como CHO ST4,2 está disponível em publicações, como foi previamente descrito. 0 gene cionado, ST 4.2, codifica 380 aminoácidos correspondendo aos quatro dominios extracelulares à fronteira transmembranar. O processo de purificação para esta proteina envolve duas colunas. Primeiro, o sobrenadante das células CHO foi carregado e eluido a partir de uma coluna de troca catiónica S.Sepharose. Um litro do sobrenadante CHO foi diluido para 15 L com ãgua duplamente destilada e carregado em 300 ml de resina inchada equilibrada em 0,2 x PBS/ EDTA 2,5 mM, pH 7,0 (conductividade de 3,6 ohm ^cm'’·) a uma taxa de carregamento de 3,6 1/h à temperatura ambiente. A coluna foi enxaguada com 500 ml de 0,2 x PBS/ EDTA 2,5 mM e 200 ml de NaCl 50 mM 0,2 x PBS EDTA 12,5 mM. A eluição foi com 11 de NaCl 200 mM 10,2 x PBS EDTA 12,5 mM. 0 eluido desta coluna de S. Sepharose foi depois corrido numa coluna de afinidade com anticorpos monoclonais. O anticorpo monoclonal (25-10-F5.5C1; depois aqui referido como 25-10-F5) usado para esta purificação reconhece um epitopo conformacional na metade amino terminal ( dentro dos dois primeiros dominios semelhantes à imunoglobulina) da região extracelular da CD4. Outros anticorpos com especificidade para qualquer epitopo dentro dos mesmos dominios deverão ser igualmente eficazes. 0 eluente da S. Sepharose foi filtrado (0,45 micron) e carregado na coluna de afinidade a lml/min ou menos. A coluna carregada foi enxaguada com água destilada (25 x o volume da resina) e eluida com formato de trietilamina 5mM, 10 ml de tampão de eluição por 4 ml de gel de resina. 0 pH do eluente mAb foi ajustado para pH 7 com Tris 1 M (pH 8,0). As fracções eluidas da coluna de afinidade foram dialisadas e concentradas. 0 quadro 1 mostra o rendimento em cada etapa do procedimento de purificação.

Tabela 1

Quadro de Purificação para a ST4,2 CD4 Produzida eni Células CHO tratadas por

Engenharia Genética

Fracção	Volume (ml)	Concentração (mg/litro)	Proteina (mg)	mc\|^deC04/	mg C04/ mg de proteina	C04 total (mg)	Rendimento (X)	Grau de Purificação
Sobrenadante	• 486	1020	496	30.8	0.03	14.7	—	1
Eluído da S-sefarose	1000	11.9	11.9	11.12	0.93	11.12	76	31
Eluído da	30	0.183	5.49	274	1.00	8.22	56	34
Coluna de Afinidade
Fluxo de	1000	N.D,^a	N.D.	0.05	N.D.	0.05	0.4	...

de Afinidade

a. N.D, = Não determinado

Os niveis de CD4 activa nas várias fracções foram determinados utilizando um ELISA de captura empregando os anticorpos monoclonais 25-10-F5 como reagentes de captura e um antisoro policlonal de coelho criado contra a ST4.2 purificada como reagente detector. As fracções e o fluxo através de cada coluna foram comparados com o sobrenadante inicial e com um padrão de CD4 conhecido. Isto permitiu a quantificação da CD4 /,

activa que foi recuperada em cada etapa. Também permitiu estimar o aumento de pureza seguindo cada etapa da purificação. Isto foi feito comparando a quantidade total (miligramas) de CD4 activa, como determinado pelo ELISA, com o total de miligramas de proteína, como determinado pelo microensaio de proteinas Pierce. Utilizando estas técnicas o rendimento para a coluna S. Sepharose mostrou ser de 76% e para a coluna de afinidade de 74%, dando um rendimento total de 56%. De notar que a coluna S. Sepharose sózinha resultou numa purificação 31 vezes maior, obtendo uma solução que era 93% em CD4, logo após a primeira etapa. A coluna de afinidade aumentou a pureza do eluente da S.Sepharose para uma homogeneidade essencial.

A pureza destas fracções finais foi analisada de duas formas. Primeiro-, a proteina foi corrida num gel SDS 12% e revelada com Comassie Brilliant Blue. Esta análise visual indicou que a proteina estava altamente purificada; pelo menos 95% do produto final era CD4. Foi realizada uma análise dos aminoácidos nas amostras de ST4,2, purificadas de acordo com este protocolo, que também indicou que o material estava altamente purificado.

A capacidade de ligação da gpl2Q na ST4,2 purificada foi analisada pelo ELISA e usando uma coluna gpl20. A ST4,2 pode ser revestida em placas de microtitulaçâo e reterá a capacidade de ligaçaõ da gpl20. Para testar a capacidade de ligação à gpl20 dos vários lotes de CD4, placas de microtitulaçâo foram incubadas com várias concentrações de CD4 de cada lote, e é depois adicionada uma única concentração de gpl20 em todas as cúpulas. A gpl20 ligada foi detectada com antisoro policlonal de coelho para a gpl20 (soro de coelho anti-env2-3). Foi visto um forte sinal que titulou à medida que as quantidades de de ST4,2 que cobriu a placa diminuíram. A ligação da gpl20 foi também ensaiada para dois dos lotes fazendo correr a ST4,2 purificada ao longo de uma coluna de afinidade de gpl2Q, Esta foi carregada com uma solução inicial de ST4,2 de 10qg/ml. 0 conteúdo em CD4 de cada fracção foi determinado por análise por immunoblot das várias fracções utilizando antisoro policlonal de coelho contra a ST4,2 discutido acima. Estes resultados indicaram que perto de 100% do material da CD4 imunoreactivo estava absorvido à gpl20, na matriz da coluna, e eluiu como um pico especifico.

A ST4,2 nativa e desnaturada foi coberta em placas de microtitulação, e foi comparada a capacidade dos vários reagentes imunológicos específicos para a CD4 para reconhecer as duas formas da proteina. Um soro policlonal de coelho, preparado por imunização com ST4,2 purificada, reconheceu tanto a forma nativa como a forma desnaturada da CD4; a OKT4A, que se sabe reconhecer um epitopo conformacional, reagiu claramente com a CD4 nativa, mas não reagiu com a proteina que foi desnaturada. O anticorpo monoclonal 25-10-F5 mostrou um padrão de reactividade semelhante ao 0KT4A.

Preparações de ST4.2 purificada foram armazenadas a 80°C e 4°C e testadas periodicamente para (1) a imunoreactividade com o antisoro policlonal de coelho que reconhece tanto a CD4 nativa como a desnaturada, (2) reconhecimento por anticorpos monoclonais OKT4A e 25-10-F5 que apenas reagem com a CD4 nativa e (3) ligação da gpl20. Foi observada uma significativa perda de actividade conseguida pelos anticorpos monoclonais OKT4A e 25-10F5 bem como a ligação da gpl20, em armazenamento a 4°C. Contudo, o material armazenado a -80°C reteve a totalidade da actividade. Adicionalmente, também se verificou que a ST4,2 purificada perde actividade após repetidos congelamentos e descongelamentos.

Exemplo 6

Foi realizada uma experiência de imunização para comparar a produção de anticorpos neutralizantes usando uma composição de gpl20 do invento retentora da conformação para outras moléculas de gpl20 cuja conformação será modificada. Um análogo da gpl20 (env2-3) preparado em leveduras, que é desnaturado e não glicosilado, foi usado como antigénio de comparação. Ambos os matérias de gpl20 eram derivados do mesmo gene fonte, isolado de HIV-1 SF2. A produção de anticorpos foi medida em babuinos usando o plano de imunização que se mostra no Quadro 2.

Tabela 2

6ruDO Animei	Adjuvante Nome Dose	Antigénio Nome Dose	Volume ,P°r local	Locais por Animal	Via de injecção
	t Numero (s)

1	(U 2951,2953,2964	MTP-PE 250/jg em ICFA (SY)	gp!20/SF2	55/íg	0,5mL	Um	IM/	Coxa
2	(3) 2952,2957,2958	MTP-PE 250/íg em ICFA (SY)	env2-3/SF2	25/xg	0,5mL	Um	IM/	Coxa
3	(3) 2949,2954,2966	MTP-PE 250/4g em s (MF/KE)	gpl20/SF2	55/jg	0,5ml	Um	IM/	Coxa
4	(3) 2950,2956,2967	MTP-PE 250>g em S (MF/KE)	env2-3/SF2	25/ig	0,5ml	Um	IM/	Coxa
5	(2) 2955, 2965	Alum 0,8mg	gpl20/SF2	55/ig	0,5ml	Um	IM/	Coxa
6	(2) 2947, 2948	Aluai 0,8mg	env2-3/SF2	25/zg	0,5ml	Um	XM/	Coxa

Os imunogénios foram preparados da seguinte forma:

(1) Grupos 1 e 2: Adicionar uma parte de antigénio (gpl20 ou env 2-3) a duas partes de adjuvante de Freund incompleto (ICFA), misturado na seringa, e injectar 500μ1 por animal· (2) Grupos 3 e 4; Frasco aquecido de antigénio / adjuvante MTP-PE à temperatura ambiente, levar ao vortex por um minuto, e injectar 500μ1 por animal dentro de 30 minutos (remisturar quando necessário).

(3) Grupos 5 e 6: Frasco aquecido de antigénio / alum à temperatura ambiente, levar ao vortex por um minuto, e injectar 500μ1 por animal em 30 minutos (remisturar quando necessário).

A imunização foi realizada no principio da experiência e na 4a, 8a, 12a e 20a semana após o inicio da experiência. Foram retiradas amostras de sangue no inicio da experiência (présangria) e nas alturas indicadas nos quadros (abaixo) que registam os resultados.

Os resultados estão sumarizados nas tabelas 3 e 4 anexas. Os animais imunizados por env 2-3 mostraram actividade neutralizante contra o isolado homólogo, HIV-SF-2, em todos os grupos adjuvantes, e num grupo adjuvante (IFA-MTP) neutralização contra HIV-MN (3 de 7 animais no total). Há um animal que mostra neutralização detectável contra HIV-HTLV-IIIB com este antigénio.

Em contraste, todos os animais imunizados com gpl20 mostram actividade neutralizadora em todos os três grupos de adjuvantes contra o HIV-SF2 e HIV-MN, ambos depois de quatro e cinco imunizações. Seis dos oito animais imunizados com gpl20 também têm actividade neutralizadora significativa contra o HIV72

HTLBIIIB, e os animais são de todos os três grupos adjuvantes.

Tabela 3

Títulos de Neutralização de Babuínos Imunizados com Env 2-3 (SF2)

Animal	Adju- vante	Títulos de	9 Neutralização
	Virus Soro	SF2 Bleed7c	Bleed 12d	] Bleed 5b	MN Bleed 12d	1 Bleed	HTLVIIIB 5b Bleed 12d
2952	l^f	10	7.5	4	5	0	0
2957	1	20	20	0	1.8	0	0
2958	1	20	77	200	170	0	4.9
2950	2	6	0	0	0	0	0
2956	2	6.5	0	0	0	0	0
2967	2	12	4.5	0	nt®	0	nr.^e
2947	3	11	nt^e	0	0	0	0
2948	3	<4	nt®	0	0	0	0
tpositivos/#anima is	8/8	4/6	2/8	3/7	0/8	1/7
Média		11	18	26	25	0	0.7

a. Os ensaios de neutralização foram realizados da seguinte forma: Os stocks de virus foram titulados para as unidades formadoras sinsiciais (SFU) em células CEM-SS. 0 soro a ser testado foi> inactivado termicamente, diluido em série por duas vezes e misturado com 200 SFU durante 1 hora a 37°C, e depois pipetado nas células CMS-SS ligadas a microcúpulas com poli-L-lisina durante 1 hora a 37°C. As misturas de soro de virus foram depois removidas e as células alimentadas com meio. A formação de sinsiciais foi marcada 5 dias após a infecção. A neutralização foi marcada através do cálculo de Vn (# de sinsiciais formados nas cúpulas teste) divido por Vo (# de sinsiciais nas cúpulas só com virus) para cada diluição do soro teste, e Vo/Vn foi traçado como uma função da diluição do soro. Os titulos registados são o inverso da diluição que deu Vn/Vo < 0,1 (>90% de neutralização).

semanas, duas semanas a seguir é às

b. Bleed terceira imunização

c. Bleed quarta imunização.

d. Bleed quinta imunização.

e. nt, não testado.

f. Adjuvante 1 = IFA (adjuvante de Freund incompleto) + 250 gg de MTP-PE.

Adjuvante 2 = MF101 (250 gg de MTP-PE)

Adjuvante 3 = Alum é às 14 semanas, duas semanas é ás 23 semanas, três semanas depois depois da da

Tabela 4

Títulos de Neutralização de Babuínos Imunizados con gp!2O (SF2)

Animal	Adju- vante	Títulos de Neutralização^
	Virus	SF	MN	HTLVIIIB
	Soro	Bleed ?c	Bleed 12d	Bleed 5b	Bleed 12d	Bleed 5b Bleed 12d
2951	1®	40	160	140	128	>2	55
2953	1	64	8	8	17	0	15
2964	1	>64	2 30	80	>256	7	82
2949	2	16	9.5	4.5	9.5	0	U
2954	2	16	13	8	24	0	0
2966	2	65	27	32	29	0	4
2955	3	16	nte	5	40	0	15
2965	3	7	nt®	4	17	4.8	14
Ipositivo/fanimais	8/8	6/6	8/8	8/8	3/8	6/8
Média		36	75	35	65	1.7	23
	a. Os	ensaios de	neutralização	foram	realizados	como

descrito no Quadro 1.

	b. Bleed	5 é às	10 semanas, duas	semanas	depois	da
terceira imunização, c. Bleed	7 é às	14 semanas, duas	semanas	depois	da
quarta	imunização. d. Bleed	12 é às	23 semanas, três	semanas	depois	da
quinta	imunização. e. Os adjuvantes estão descritos no	Quadro 1

Jovens adultos (machos e fêmeas) babuínos (Papio) foram imunizados com 55gg de gpl20 formulada num de dois adjuvantes: hidróxido de aluminio (alum, 0,8 mg por dose); ou adjuvante de Freund incompleto mais 250qg de tripéptido de muramil (IFA-MTP). Qs animais foram imunizados aproximadamente todas as quatro semanas e foi analisado o soro para registar a perda do titulo especifico do envelope. Os dados sumarizando a resposta especifica ao antigénio, para cada animal no estudo , estão ilustrados nos quadros 5 e 6. Os titulos específicos do envelope terão o seu pico a seguir a cada elevação e depois declinarão. De notar que os titulos do alum e IFA-MTP diferem aproximadamente de 10 vezes. As linhas bases dos titulos foram atingidas após seis meses de repouso, e os animais foram depois reabastecidos em intervalos de ura mês. Para medir a eficácia dos anticorpos do envelope na neutralização de virus, o soro foi testado em ensaios de neutralização in vitro contra os isolados do virus HIV-SF2 homólogos e heterólogos. 0 soro foi testado nos pontos de titulos de envelope elevados conhecidos para a neutralização do virus, nas semanas 10 (após três imunizações), 23 (apôs cinco imunizações) antes do repouso, e na semana 57 (após seis imunizações) depois da elevação a seguir ao repouso. Foram empregues dois ensaios de neutralização de virus, um ensaio de inibição p24gag descrito em Haigwood et al.,AIDS Res. Hum. Retrov. (1990) 6_: 855-869 e Steimer et al., Vaccine (1988), H. Gimsberg et al., Editor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, págs 347-355, e um ensaio de inibição da infecção central por Nara et al., AIDS Res. Hum. Retrov. (1987), 3: 283-302. No quadro 5, anticorpos neutralizantes eficazes contra o HIV-SF2 e HIV-MN foram gerados só após três imunizações em ambos os grupos adjuvantes, e os titulos foram mantidos ou aumentados com subsequente elevação. No quadro 6 os anticorpos específicos para o HIV-BRU e HIV-HTLVIIIB foram observado com reprodução após cinco e seis imunizações; não foi observado titulo contra o HIVZR6 após seis imunizações. Apesar disso, tanto os titulo de neutralização do homólogo de SF2 como do heterólogo foram mais elevados nos animais tratados com IFA-MTP do que os animais tratados com alum.

«SSSSb-ws;

TABELA 5

Títulos do Neutralização de Babuínos Imunizados

Animal	Adju-g vantè	Títulos de	Neutralização
				SF2						MN
	Soro	Bleed	5^C	Bleed 12d	Bleed 22<* Bleed	5d	Bleed i2d	Bleed 22e
		A^a	B*>	A	B	A	A	B	A	B	B
2951	1	1,250	ntf	400	160	500	90	140	800	128	250
2953	1	500	50	475	8	2,300	35	8	175	17	100
2954	1	2,100	10	2,000	230	5,000	100	80	350	210	600
2955	2	300	nt	250	nt	160	50	5	200	40	28
2965	2	125	nt	350	nt	800	—h	4	50	17	21
#positivo/#animais	5/5	2/3	5/5	3/3	5/5	4/5	5/5	5/5	5/5	5/5

a. Ensaio realizado pelo método de Steimer et al., 1988. Os títulos são os recíprocos da maior diluição para atingir uma inibição >50% da produção de p25gag.

b. Ensaio realizado pelo método de Nara et al., 1987. Os titulos são os recíprocos da maior diluição para antigir uma inibição dos centros infecciosos >90%.

c. Bleed 5 é às 10 semanas, duas semanas a seguir à terceira imunização.

d. Bleed 12 é às 23 semanas, duas semanas a seguir à quinta imunização.

e. Bleed 22 é às 7 semanas, duas semanas a seguir à sexta imunização.

f. nt = não testado.

g. Adjuvante 1 = IFA (Adjuvante de Freund incompleto) + 250 mg de MTP-PE.

Ajuvante 2 = Alum.

h. — indica <10 para o ensaio A; <4 para o ensaio B.

TABELA 6

Títulos do

Neutralização de Babuínos Imunizados com qp!20

Adju-g

Animal vante

Títulos de Neutralização

	BRU			IIIB			Zr6
Vírus Bleed	Bleed	Bleed	Bleed	Bleed	Bleed	Bleed	Bleed	Bleed
Soro 5^	12®	22f	5d	. 12®	22¹	5d	12e	22f
A^a B^b	A B	B	B	B	B	B	B	B

2951	ie	-C	-	80	29
2953	1	-	-	20
2964	1		-	100 20	140	7
2955	2	-	-	15	-
2965	2	-	-	-	-	5

55	51	w	-
15	6	-
82	180	-
15	11	-
14	9	-	-

Ipositivo/ 0/5 0/5 4/5 1/5 2/5 2/5 5/5 5/5 0/5 0/5 0/5

a. Ensaio realizado peio método de Steimer et al .,

1988. Os titulos sâo os recíprocos da maior diluição para antigír uma inibição >50% na produção de p25gag.

b. Ensaio realizado pelo método de Nara et al, , 1987.

Os titulos são os reciproco da maior diluição para atingir uma inibição dos centros infecciosos >90%.

c. - indica <10 ensaios para A; <4 ensaios para B.

d. Bleed 5 é às 10 semanas, duas semanas a seguir à terceira imunização.

e. Bleed 12 é às 23 semanas, duas semanas a seguir à quinta imunização.

f. Bleed 22 é às 57 semanas, duas semanas a seguir à sexta imunização.

g. Os adjuvantes são como descritos no Tabela 5.

soro recolhido dos babuínos imunizados com gpl20, que apresentavam uma resposta mais elevada após seis imunizações, foi também testado para a capacidade de neutralizar isolados de virus adicionais como HIV-SF2, HIV-MN, HIV-RF, HIV-CC, HIV-ZR6 e HIVNDK (Tabela 7a). Note-se que os titulos de neutralização para o HIV-SF2 foram determinados pelo ensaio de inibição p24gag, enquanto que a neutralização do HIV-MN foi ensaiada pelo protocolo dos centros infecciosos de Nara et al. Assim, a diferença marcada na neutralização destes dois isolados pode ser compreendida, em parte, pelos dois ensaios diferentes usados.

Os dados demonstram que a proteina gpl20 retentora da conformação natural tem mais sucesso na produção de anticorpos de neutarlização cruzada do que formas disponíveis por anteriores processos de purificação.

Exemplo 7

À repetida imunização dos grupos de babuínos do grupo IFA-MTP foi realizada para determinar se uma exposição repetida adicional à gpl20 podia resultar em anticorpos eficazes na neutralização de um grupo ainda maior de isolados, A imunização repetida não alterou de forma drástica os titulos dos anticorpos

neutralizantes contra o HIV-SF2, HIV-MN, HIV-RF, ou HIV-CC. Contudo, as imunizações repetidas resultaram no aparecimento de um pequeno titulo de anticorpos neutralizantes contra os isolados africanos, HIV-ZR6 e HIV-NDK (Tabela 7b). 0 desenvolvimento temporário da neutralização do HIV-ZR6 foi examinado pondo num gráfico os dados da neutralização do virus (Figura 5) do soro analisado de babuino 2964, após 0, 5, 6, 7, 8, e 9 imunizações com gpl20.

A neutralização foi marcada medindo o número de unidades formadoras sinsiciais por ml (sfu/ml), em cúpulas contendo soro exprimental (Vn, média dos duplicados da cúpulas), e dividindo este número pelas sfu/ml do virus sózinho (Vo, média das 8 réplicas de cúpulas). Esta fracção, Vn/Vo foi traçada contra a diluição da amostra de soro, e a neutralização foi marcada pela verificação da diluição do soro que permitiu uma redução de 90% no Vn, i.e., Vn/Vo = 0,1. As amostras estão indicadas pela chave à direita, em que os números correspondem às bleed. A bleed 0 é a pré-sangria, que mostra a neutralização do virus. A bleed 12 seguiu 5 imunizações; a bleed 2 seguiu 6 imunizações, a bleed 24 seguiu 7 imunizações; a bleed 27 seguiu 8 imunizações; a bleed 22 seguiu 9 imunizações.

Como está evidente na Figura 5, administrações repetidas alteram o declive da curva de neutralização, de forma que a neutralização foi detectada na bleed- 32, seguindo 9 imunizações. Estes resultados demonstram que administrações repetidas seleccionaram clones produtores de anticorpos que têm especificidade mais ampla.

ϊ e

TABELA 7a

Virus HIV SF2 MN BRU HTLVIIIB HXB3 V32 RF CC ZR6

Titulo 5000 600 140 180 59 32 33 33 <4

Os resultados são da Bleed 22 às 57 semanas, duas semanas após a sexta imunização, usando um ensaio realizado pelo método de Steimer et al.,.

Tabela 7b

Títulos Neutralizantes de Vírus para o Babuíno 2964 a seguir à 6, 7, 8 e 9 Imunizações com gp!20

Títulos de Neutralização

Animal Bleed	Irnuni zação 6	HIV-SF2 HIV-MN³	HIV-RFb 33	HTV-CCb HIV-Zr6 HIV-NDK^b
2964	22θ	5,000	600	33 —c	ntd
2964	24f	7	1,500	700	21	10	—
2964	279	8	4,100	400	18	10	5
2964	32h	9	7,000	310	18	6 4	—
		a. As Bleeds 22	e 24	foram	testadas em	diferentes

das bleeds 27 e 32.

b. As Bleeds 24, 27 e 32 foram testadas simultaneamente; A bleed 22 foi testada num dia diferente.

c. —indica <10 para o ensaio A; <4 para o ensaio B.

d. nt = nao testado.

e. A Bleed	22	é	às	57	semanas,	duas	semanas	a	seguir	à
sexta imunização.
f. A Bleed	24	é	às	61	semanas,	duas	semanas	a	seguir	à
sétima imunização.
g. A Bleed	27	é	àS	67	semanas,	duas	semanas	a	seguir	à

oitava imunização.

h. Bleed 32 é às 84 semanas, duas semanas a seguri à nona imunização.

Exemplo 8

Análises de todas as amostras de soro de dois babuinos individuais, 2964 e 2958, delinearam também diferenças na proteina recombinante desnaturada, não glicosilada e animais imunizados com a recombinante nativa glicosilada (rgpl20) (Figura 6). 0 babuino 2964 foi vacinado com a proteina recombinante nativa glicosilada e o babuino 2958 foi vacinado com a proteina recombinante desnaturada e não glicosilada. A neutralização do HIV-SF2 foi ensaiada pelo ensaio de inibição p25gag descrito em

Haigwood et al , AIDS Res, and Hum. Retrov. (1990) 6j 855-869. Todos os outros isolados foram ensaiados pelo ensaio de inibição da infecçâo central. 0 soro de cada bleed foi ensaiado para a actividade neutralizadora de virus contra o HIV-SF2, HIV-MN e HIV-HTLVIIB. Mais administração com proteina desnaturada não glicosilada não aumentaram os titulos de anticorpo ou de neutralização para lá dos niveis medidos na semana 10, e não houve neutralização detectável do HIV-HTLVIIIB. Nos animais imunizados com rgpl20, os titulos de HIV-SF2, HIV-MN e HIVHTLVIIIB aumentarm seguindo cada administração, sendo o maior aumento observado a seguir ao repouso. Os padrões de actividade de neutralização eram semelhantes para todos os três virus, contudo a magnitude das respostas variou. O aparecimento da neutralização do- HIV-HTLVIIIB foi atrasada relativamente à dos outros dois isolados. Em experiências adicionais com babuinos discutidas no Exemplo 9 abaixo, demonstramos que a proteina recombinante desnaturada não glicosilada formulada em MF59 foi incapaz de induzir neutralização para a actividade neutralizadora para o HIV-MN ou HIV-BRU (os dados não estão ilustrados); o soro de gpl20 neutralizou estes três isolados bem como O HIV-ZR6 após repetidas administrações (Quadro 8).

Exemplo 9

Os babuinos foram imunizados com 55pg de gpl20 formulada com quer: emulsão microfluidizada contendo muramil tripéptidofosfatidil muramil etanolamina, lOOMg (MF59) ou adjuvante de Freund incompleto (IFA). A formulação de MF59 foi esqualeno 5%, Tween 80 0,5%, Spen-85 0,5% com MTP-PE endógeno a 0,4mg/ml em

água, o qual foi emulsifiçado com um microfluidizador, e armazenado em árgon até ser utilizado. Foi depois misturado com o antigénio por agitação e injecção. Os dados sumarizando a resposta especifica aos antigénios para os babuinos encontra-se na Tabela 8. Os títulos específicos da gpl20 também atingiram um pico, depois decresceram seguindo cada administração neste estudo. Os titulos mais elevados foram conseguidos com MF59 e não IFA. A neutralização dos virus foi testada contra os isolados* homólogos e heterólogos e foi determinada nas semanas 10, 24, e 38, seguindo estas três, quatro e cinco imunizações respectivamente. Os resultados deste ensaio estão sumarizados na Tabela 8. Neste estudo, os animais no grupo MF59 tinham titulos mais elevados e uma grande proporção de animais positivos no grupo do que no grupo IFA. Os titulos neutralizadores, eficazes contra o HIV-SF2 e HIV-MN, foram observados depois de três imunizações, e contra o HIV-HTLVIIIB e HIV-ZR6 depois de cinco imunizações. Os animais imunizados com a gpl20 recombinante nativa e glicosilada em MF59, responderam com anticorpos que são eficazes na neutralização de HIV-BRU e HIV-ZR6, após apenas cinco imunizações. Num estudo prévio, a neutralização dos isolados africanos foi conseguida apenas após a oitava (HIV-NDK) ou nona (HIV-ZR6) imunização. Adicionalmente, os titulos conseguidos no Exemplo 9 com gpl20 recombinante nativa e glicosilada, tendo como adjuvante MF59 versus HIV-ZR6, foram elevados. Também o aparecimento dos anticorpos neutralizadores eficazes contra o HIV-BRU e HIV-ZR6 foi simultâneo no estudo, em contraste com o Exemplo 6 descrito acima. Este resultado pode ser devido ao adjuvante ou ao regime de imunizações, que permite dois períodos de repouso mais pequenos no Exemplo 9 comparando com um único longo periodo de repouso do Exemplo 6.

Tabela 8

Titulas de Neutralização dos Babuínos Imunizados

Adju-b

Animal vante Títulos de Neutralização

SF2a «Nb BRUb Zrfib

Bleed

Bleed.

Bleed

Soro

5®

12f

140

5®

12 £

14^g

5e

12f

140

se

12f

14g

7246	1	nte	70	110	nt	2	6	nt	-d	3	-	-	-
7247	1	16	21	35	-	-	7	-	-	-	-	-	-
7248	1	30	65	70	7	4	11	-	-	4	-		-
7249	1	100	210	50	-	18	25	-	-	-	-	-	4
7258	2	200	40	250		8	29	-	-	4	-	-	-
7259	2	30	60	70	15	45	29	-	-	4	-	-	8
7260	2	250	50	310	10	48	20	-	-	6	-	-	-
7261	2	100	31	350	22	51	20	-	-	5	-	-	6
7262	2	100	500	400	15	51	45			3	-	-	4
fpositivo/	8/8	9/9	9/9	5/8	8/9	9/9	0/8	0/9	7/9	0/9	0/9	4/9

animais

a. Ensaio realizado pelo método de Steimer et al,, 1988. Os títulos são o reciproco da maior diluição para atingir >50% de inibição na produção de p25gag.

b. Ensaio realizado pelo método de Nara et al., 1987.

Os títulos são o reciproco da maior diluição para atingir >90% de inibição dos centros infeccíosos.

c. nt = não testado.

d. - indica <10 para o ensaio a; <4 para o ensaio b.

e. A Bleed 5 é a 10 semanas, duas semanas a seguir à terceira imunização.

f. A Bleed 12 é às 24 semanas, duas semanas a seguir à quarta imunização.

g. A Bleed 14 é a 38 semanas, três semanas a seguir à quinta imunização.

h. Adjuvante 1 = IFA (Adjuvante de Freund incompleto) + 250 mg de MTP-PE.

) Adjuvante 2 = MF59 (100 mg de MTP-PE).

Exemplo 10

Seguindo um procedimento semelhante ao descrito acima para os babuinos, quatro chimpanzés (Pan troglodytes) foram imunizados com 55μς de gpl20 com o adjuvante 2xMF59 (2 animais), adjuvante sózinho (1 animal), ou não foram imunizados (1 animal), para determinar a imunogenecidade da proteina nesta espécie de primatas, os seres vivos mais relacionados com o homem. A concepção do regime experimental está ilustrada na Figura 7. Na Figura 7, as bandas sombreadas representam as linhas de tempo para cada um dos três estudos, babuínos do Exemplo 6 (linha de topo), babuinos do exemplo 9 (linha média), e chimpanzés do Exemplo 10 (linha de baixo). A escala do tempo em semanas está ilustrada na base da figura. As imunizações estão indicadas pelas barras verticais, numeradas acima para indicar o número da imunização, na posição da linha do tempo da ínjecção. Os babuinos do Exemplo 6 foram imunizados nas semanas 0, 4, 8, 12, 21, 55, 59, 65 e 80, com excepção do babuino 2964 que foi imunizado na semana 82 em vez de na semana 80. Os babuinos do Exemplo 9 foram imunizados nas semanas 0, 4, 8, 22, e 36. Os chimpanzés foram imunizados nas semanas 0, 4, 8 e 28. A formulação de 2xMF59 foi de esqualeno 10%, Tween 80 1%, Span-85 1% com MTP-PE endógeno a 0,4 mg/ml em água, que foi emulsifiçado com um microfluidizador, e armazenado em a-rgon até à utilização, quando foi misturado com o antigénio por agitação e ínjecção. Os animais foram imunizados três vezes intramuscularmente em intervalos de meses, e o soro foi analisado para ver o titulo especifico do envelope e para os anticorpos neutralizadores dos virus para os bleeds seguindo cada imunização. Os dados estão sumarizados no Quadro 9 para os dois chimpanzés imunizados. Nenhum dos outros chimpanzés controlo desenvolveu anticorpos específicos para a gpl20 ou anticorpos neutralizantes (os dados não estão ilustrados). Ambos os animais imunizados com a proteina recombinante nativa e glicosilada desenvolveram boas respostas ao antigénio imunizador, e ambos os animais tinham anticorpos neutralizadores de virus eficazes contra o H1V-SF2 e HIV-MN. O soro de um dos chimpanzés também neutralizou o HIV-HTLVIIIB depois de três imunizações. Os chimpanzés são impulsionados a seguir a um período de repouso de

S ft·»-· ' seis meses, e os soros são analisados seguindo esta imunização. Quando os titulos neutralizadores de virus contra o HIV-SF2 são suficientemente elevados, os animais são desafiados com um stock de HIV-SF2 titulado de chimpanzé. Os chimpanzés são reimunizados duas semanas antes do desafio. Dada a existência de anticorpos neutralizantes eficazes contra isolados heterólogos, existe também uma possibilidade de desafio por virus heterólogos, neste animais.

| TABELA 9

Titulos de Neutralização de Chimpanzés Imunizados com 2x MF-59 (gp!2O de Animais)

a.

b.

Títulos de Neutralização

Animal Bleed	Imunização	Isolado de Virus’	SF2	MN	MN	IIIB
Ensaio: Titule da Elisa	A^a	A	BD	B
10143	0	0	<100		—c			φ.»	-w.
10143	1	1	<100		ntd	nt		—	—
10143	2	2	5,800		60	--		—
10143	4	3	15,700		280	—		15
10144	0	0	<100		—	—		—	—
10144	1	1	<100		nt	nt		—	—
10144	2	2	11,000		25	—		—
10144	4	3	52,600		400	72		40	7
#positivo/fAnimais	2/2		2/2	1/2		2/2	1/2
Ensaio	A	realizado	pelo método	de	Steimer	et	al., 1988.
Ensaio	B	realizado	pelo método	de	Nara	et	al.	, 1987.

c. — indica <10 para o ensaio A; <2 para o ensaio B.

d. nt ~ não testado.

Depósitos de material genético

Os seguintes materiais de exemplo foram depositados com a American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Os números de acesso ATCC para os depósitos são:

Depósito	ATCC #	Depositado
Células de ovário de Hamster Chinês
CHO-A-6al20-145-0.1-22	CRL 10379	9 de Março 1990
Células de ovário de Hamster Chinês
CHO-DG44	CRL 10378	8 de Março 1990
E.coli
HB101 (pCMV6al20-SF2)	68249	8 de Março 1990

Todas as publicações e pedidos de patentes citados nesta Descrição estão aqui incorporados para referência, da mesma forma que como se cada uma das publicações individuais ou Pedido de Patente fosse especifica e indvidualmente indicada para ser incorporada para referência.

Tendo agora sido totalmente descrita a invenção, será evidente para os especialistas nestas técnicas que o invento pode sofrer muitas alterações e modificações, sem prejudicar o espirito ou âmbito das reivindicações anexas.

Lisboa, 8 de Março de 1991 íao ASEHTE OFIGÍAL CA PPOPtTWSS ÍNC’JSTRW

Claims

REIVINDICAÇÕES propriedades idênticas à

1- Um método para purificar gpl20 de HIV , de forma a proporcionar um glicopéptido purificado gpl20, possuindo de ligação proteina/proteina, substancialmente gpl20 do HIV virai e natural, caracterizado pelo facto de compreender:

a. o fraccionamento de uma preparação natural de gpl20 contendo gpl20 de comprimento total, glicosilado, utilizando cromatografia de permuta iónica, de forma a proporcionar uma primeira colecção de frações;

b. a selecção de uma fracção proveniente da referida primeira colecção que exibe uma afinidade de ligação especifica para o péptido CD4, produzindo, desse modo, um primeiro material fraccionado;

c. fraccionamento do referido primeiro material fraccionado por cromatografia de interacçâo hidrofóbica, de forma a proporcionar uma segunda colecção de fracções;

d. selecção de uma fracção proveniente da referida segunda colecção que exibe afinidade de ligação especifica para o péptido CD4, produzindo, desse modo, um segundo material fraccionado;

e. fraccionamento do referido segundo material fraccionado, por cromatografia de exclusão por tamanho, de forma a proporcionar uma terceira colecção de fracções; e

f. selecção de uma fracção a partir da referida terceira colecção que exibe afinidade de ligação especifica para o péptido CD4, proporcionando, dessa forma, o referido gpl20 purificado.
2- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida cromatografia de permuta iónica ocorrer num suporte sólido possuindo grupos de permuta de amina terciária.
3- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o referido suporte sólido ser o dextrano dietilaminoetil substituido.
4- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a referida cromatografia ser HPLC.
5- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 4, caracterizado pelo facto de a separação na fase (a) ocorrer a um pH de cerca de 6 a 9.
6- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida cromatografia de interacção hidrofóbica ocorrer num suporte sólido possuindo grupos alifáticos ou fenilicos pendentes.
7- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 6, caracterizado pelo facto de a referida cromatografia de interacção hidrofóbica ocorrer em duas sub-fases, sendo uma primeira sub-fase na qual o suporte sólido é uma fenil agarose, e uma segunda sub-fase na qual o suporte sólido é uma agarose de éter alifático.
8- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizado pelo facto de ambas as sub-fases serem a HPLC.
9- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto de a referida separação na fase (c) ocorrer utilizando um gradiente de sulfato de amónio decrescente, com uma concentração inicial de cerca de 40% de saturação.
10- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto da referida cromatografia de filtração em gel utilizar um suporte capaz de retardar moléculas mais pequenas do que gpl20.
11- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o referido suporte de filtração em gel ter uma gama de fraccionamento de cerca de 50.000 até cerca de 200.000.
12- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 11, caracterizado pelo facto de a referida cromatografia de filtração em gel ser a HPLC.
13- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender as fases de:

a. recolha de um meio celular que contém uma proteina gpl20 glicosilada, de comprimento total, de não fusão, em que o referido meio celular é um meio condicionado contactando uma célula não infectada por HIV, que expressa o referido gp!20; e

b. concentração do referido meio celular por remoção de moléculas provenientes do referido meio, possuindo pesos moleculares inferiores ao do gpl20, produzindo, desse modo, um meio celular concentrado para uso como uma preparação natural.
14- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto do referido segundo material fraccionado ser sujeito a uma forte cromatografia de permuta aniónica anterior à fase (e).
15- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 14, caracterizado pelo facto de a referida cromatografia de permuta aniónica forte utilizar um suporte sólido possuindo grupos de permuta de amónio quaternário.
16- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 15, caracterizado pelo facto de a referida forte cromatografia de troca aniónica ser realizada com um pH de cerca de 7 a 9.