JPH01503517A

JPH01503517A - 免疫原性組換え酵母発現産物とこの精製法

Info

Publication number: JPH01503517A
Application number: JP63504552A
Authority: JP
Inventors: ヌーセンツウェイグ，ビクター; バー，フィリップ　ジェイ
Original assignee: ニューヨークユニバーシティ; チロン　コーポレーション
Priority date: 1987-03-30
Filing date: 1988-03-30
Publication date: 1989-11-30
Also published as: HK112693A; IL85906A0; EP0307472B1; NZ224088A; ZA882269B; DE3875043T2; DK665688A; ATE81136T1; DE3875043D1; AU1791488A; EP0307472A1; AU615451B2; US4826957A; ES2009588A6; PH27079A; DK665688D0; WO1988007550A1; EP0307472A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】免疫原住組換え酵母発現産物とこの精製法本特許出願ハ、アーノット（Ａｒｎ０ｔ　）　、　Ｄ、　Ｅ、らの名前による１９８５年７月９日出願の係属中の米国特許出願第７５４．６４５号、および１９８６年６月２４日出願の係属中のＰＣＴ出願ＴＪ　Ｓ　８６１０１３７３号の部分継続出願で、両出願ともにニューヨーク大学（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　）に譲渡されたものである。この両出願はとも忙、本文で参考文献として引用する。

スモジウム・ビバッ　ス　Ｐ　ｖｉｖｘ　の環状小芽体（ｃｉｒ−ｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ　）　（ＣＳ　）タンパク質の反復免疫優性抗原決定基領域を含むこのタンパク質の一部を有するアミノ酸配列より成る免疫原性ポリペプチドおよびこのポリペプチドを精製する方法に関する。

プラスモジウム・ピバックス　Ｐ、　ｖｉｖａｘ　ＣＳタンパク質の免疫原性と特にこのタンパク質によって生じる免疫原性については、上述のアーノツ）　（Ａｒｎｏｘ　）らの出願およびアーノット（Ａｒｎｏｔ　）　、　Ｄ、　Ｅ、ら、サイエン乙工五匹−諺ユ２３０　：　８１５−．８１８　、１９８５　（参考文献として同様に引用）中に先に記載されている。

実際、プラスモジウム・ビバックス　Ｐ、ｖｉｖ＋ｘ　Ｃ８の全遺伝子が同定され、その配列が上述の文献に記載さム・ピバックス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）　ＣＳタンパク質は、Ａｓｐ　−Ａｒｇ　−Ａｌａ　−Ａｓｐ　／　Ａｌａ　−Ｇｌｙ　−Ｇｉｎ　−Ｐｒｏ　−または別の表記法ではＤＲＡＤ／ＡＧＱＰＡＧの配列を１９個直列に反復した中心領域より成る。この領域は、プラスモジウム・ビバックス　Ｐ、ｖｉｖａｘＣＳタンパク質の反復免疫優性抗原決定基を含有する。

（前記二表示法の対応は以下の如くである。Ａ−アラニン、Ｃ冒システィン、Ｄ −アスパラギン酸、Ｅ−グルｐミン酸、Ｆ−フェニルアラニン、Ｇ、ｍ／！Ｊシン、Ｈ−ヒスチジン、Ｉ■イソロイシン、Ｋ−リシ／、Ｌ−ロイシン、Ｍ−メチオニン、Ｎ−アスパラギン、Ｐ−プロリン、Ｑ−グルタミン、Ｒ−アルギニン、Ｓ−七リン、Ｔ−スレオニン、■−バリン、Ｗ−）リブトファン、およびＹ−チＬシジ。）本質的に１８個のアミノ酸残基のみより成る合成ペプチド（すなわち、上記配列の２１１反復およびＡｓｐ　−Ｇｌｙ−ＧＩｎ　−Ｐｒｏ　−Ａｌａ−Ｇｌｙ− Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａのよ５な次いで、前記天然のＣＳタンパク質を認識し、かつ、これに結合する抗体を産生ずる（１’ｉＦ乳類に注入した時）。

したがって、このようなペプチドは、マラリアに対するワクチンとして有用である。

プラスモジウム・ピパツク（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）マラリアに疫優性抗原決定基の配列に該当する配列を有する免疫原性ペプチド（すなわち、配列１個な含有すること。２個以上の反復配列を含有することが好適である）を合成することである。プラスモジウム・ビバックス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）の場合には、しかし、このＣＳタンパク質の反復単位配列がむしろ長いため（プラスモジウム・ファルシパーラム（Ｐ−ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　）の反復単位と対照的である）古典的なペプチド合成法を信頼し用いることができない。長いペプチドを作るため古典的合成技術を用いることは、世界中の何百万という人々に分は与えるためのマラリアワクチンの製造に必要とされる大規模の合成実施時において特に不都合である。

さらに、キャリアーまたはアジュバントの役割を果たす大分子にこの合成ペプチドを結合させることが必要である。その上、はとんどの場合において、ひとつの合成ペプチドに対する抗体の一部しか、この天然のタンパク質の同配列を認識しない。すなわち、キャリアー・タンパクに結合した合成ペプチドがたとえ免疫原性を示したＫしても、産生された抗体のほとんどは病原菌に対する防御免疫を仲介することができない。この観点からしてプラスモジウム・ファルシパーラム（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　）に対するワクチンを調製するためのひとつの候補である゛合成ペプチド（ＮＡＮＰ）、は例外であり、その理由は、抗ペプチド抗体の少なくとも７０％がマラリア小芽体を認識することである。この通常とは興なる知見は、おそらく、前記（ＮＡＮＰ）３ペプチドが多くのプロリン０およびアスパラギン（へ）（これらは、タンパク質分子中に上記と逆の順序で頻繁に見られるアミノ酸である）を含有することで説明される。この場合には、おそらく、溶液中における（　ＮＡＮＰ　）３の好適な立体配置が、天然のＣＳタンパク質の同一配列の立体配置を模倣するのであろう。しかし、プラスモジウム・ビバックス（Ｐ、ｖｉｖａｘ　）反復単位のアミノ酸配列の研究からは、プラスモジウム・ビバソクｘ　（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）ペプチドが（ＮＡＮＰ　）　３と同様に挙動するようには見えない。

る免疫原性ペプチドを製造する別の技術を探求した。本発明者達は、プラスモジウム・ビバックス（ｐ、　ｖｉ〜・ａｘ　）マラリアに対する免疫性を哺乳類に付与するために用いられる免疫原性ポリペプチドを発現する組換えＩ）ＮＡ遺伝子工学技術を探求した。

質の反復性アミノ酸配列の一部または全体を発現する組換え細菌を構築する技術は容易に入手できたが、本発明者達は、以下の理由から別の発現システムを探求した。

第一に、発現システムは信頼できるものであり、かつ目的のポリペプチドを連続的かつ高収率で産生できること。細菌は、大量培養で生産すると取扱いが困難で、かつ異種タンパク質産物を過剰発現する可能性があることである。

第二に、さらに重要なこととして、細菌の発現産物は、細菌によって同時に発現されるかまたは細菌増殖培地に必要な添加剤であるところの発熱性不純物および他の炎症性でかつ毒性のある物質から精製することが、しばしば困難である。

第三に、細菌の発現生成物は、融合タンパク質であることがいちばん多く、つまり、細菌に結合した遺伝子に由来しさらに無関係の配列を付加された配列を含有する。

本発明者達は、組換えＤＮＡ技術分野における最近の進歩によって実質的に改良された酵母発現系に注目した。

酵母は細菌よりも硬質の有機体で、大量培養がはるかに容易である。さらに、酵母遺伝学とクローニングの最近の進歩によって、酵母発現系の収量が上昇した。

組換え酵母系の発現産物の精製は、細菌組換え系の発現産物の精製よりも最初から複雑であるというわけではなく、精製しようとしている特定のタンノシク質の特性にほとんど依存している。それにもかかわらず、このような精製は、一般に、古典的ペプチド合成技術で産生されるペプチドまたはタンパク質の精製よりも複雑である。

本発明者達は、Ｒ，Ｌ、パーク（Ｂｕｒｋｅ　）らの名前で１９８６年５月２９日出願でキロン・コーポレーション（Ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　）に譲渡された米国特許出願第８６８、６３９号の主題である一般的な酵母発現系を選択した。

この出願は、本文に参考文献として引用する。全直列反復配列とこの反復領域に先行する別の断片（配列がＮ末端からＣ末端に読まれる時）を包含するプラスモジウム・ビバックス（ｐ、　ｖｉｖａｘ　遺伝子の一部を（＃母生物体に組み込むため）選択した。この断片には、マラリア全種で高度に保存されておりかつ、それだけで免疫原性であることが以前から判明している配列が取り込まれている。（１９８４年９月１８日Ｖ、ナツ七ンツヴアイグ（Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ　）ら出願でニューヨーク大学（Ｎｅｗ　ＹｏｒｋＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　）に譲渡され、かつ本文で参考文献として引用されている米国特許出Ｈ第６４９，９０３号を参照。）発明の目的以上より、本発明の目的は、王二二二乏ヱニニエ二二りス（Ｐ、’　ｖｉｖａｘ　）環状小弁体（ＣＳ　）タンパク質に対するモノクローナル抗体に免疫化学的に反応性でかつマラリアのワクチン調製に有用である酵母の工学的操作による免疫原性ポリペプチドを提供することである。

本発明のもうひとつの目的は、大規模かつ高収率で実施することのできる先の免疫原性ポリペプチドの製造方法を提供することである。

別の目的は、抗マラリアワクチン調製物に組み入れるために適切な免疫原性ポリペプチドを提供することであるＯ別の目的は、キャリアーに結合することなく、抗マラリアワクチン調製物に用いるのにふされしい免疫原性ポリペプチドを提供することである。

別の目的は、溶菌した酵母細胞材料と酵母培地から成る先の酵母の工学的操作によるポリペプチドの純粋でない調製物から前記ポリペプチドを精製する方法を提供することである。

本発、明のこれらの目的およびその他の目的は、本明細書と、付随のクレームおよび付属図面を見れば当業者に明らかであろう。

図面の簡単な説明図１．は、本発明で用いられる酵母発現ベクターの構築図である。

図２は、酵母プラスミドｐＡＢ　２４のマツプである。

／　ｐＡＢ　２４ベクターで形質転換した酵母の溶菌液のウェスタン分析である。

図５．は、（ａ）本発明に従って精製した物質の光学濁度図（実線）　、（ｂ）溶出緩衝液の伝導度（実線−黒丸）、および（Ｃ）天然のＣＳタンパク質に対する溶出分画の抗体結合ｆｆ１ｉｌＦパーセント活性、のプロットである。

図６．は、本発明によって製造されかつ精製された工学的操作によるポリペプチドの純度を示すＳＤＳ　−ＰＡＧＥゲルのラジオオートグラフである。

図７．は、本発明の工学的操作によるポリペプチドを示す等電点電気泳動のラジオオートグラフである。

図＆は、競合的ラジオイムノアッセイの標準曲線であり、抗ビバックス（ｖｉｖａｘ　）　ＣＳタンパク質抗体に対する工学的操作による標識ポリペプチドの結合が、本発明の非櫃識の工学的操作によるポリペプチドの存在によって阻害されることを示す。

図９．は、工学的操作によるＣＳポリペプチドに結合したマウス抗血清を認識する放射性標識ヤギ抗マウスエρの量を、マウス血清希釈の関数としてプロットしたものである。

図１０．は、固定化された合成アミノ酸１８個（反復）のビバックス（ｖｉｖａｘ　）　ＣＳペプチドに対するＩｎマウス抗血清（工学的操作によるペプチド忙対して作製された）の結合を、抗体濃度の関数としてプロットしたものである。

図１１．は、本発明に従ってｖ４３Ｉ＋・精製され固定化された工学的操作によるＣＳポリペプチドに対するマウス抗血清結合において、合成ピバックス（ｖｉｖａｘ　）　ＣＳ反復ペプチドの阻害を合成（阻害性）ペプチドの濃度関数としてプロットしたものである。

図１１は、固定化された合成非反復（反復性でない）ペプチドに対するマウス抗血清の結合を、抗血清の希釈関数としてプロットしたものである。

発明の要約本発明は、本質的に下記のアミノ酸配列ＡＥＰＫＮＰＲＥＮＫＬＫＱＰＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧａＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＮＧＡＧＧＱＡＡＧＧＮＡＧＧＱＧＱＮＮＥＧＡＮＡＰＮＥＫＳＶＫＥＹＬＤＫＶＲＡＴＶＧＴＢＷＴより成るアミノ酸配列を有すること、および。

（ａ）　制限エンドヌクレアーゼＢｇｌ　ｎによる１　５　ｋｂのプラスモジウム・ビバックス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）　Ｃ５ＤＮＡ断片を適切なベクター中に得ること、（ｂ）　前記断片を適切なベクター中にサブクローン化すること、（Ｃ）　前記アミノ酸配列をコードする４、１ｋｂのプラス（ｄ）　前記断片を酵母発現ベクター中に取り込むこと、（ｅ）　前記発現ベクターによって酵母を形質転換すること、（ｆ）　前記ベクターによってコード化されるこのタンパク質を発現させることのできる条件下で酵母を培養すること、（２）前記発現タンパク質を含有する培地を採取すること、を有する段階から成る方法によって製造される酵母の工学的操作によるポリペプチドに関する。

遺伝子を下記に記す（この遺伝子がコードするアミノ酸配列とともに）。

（Ｎ　−末ｆｉ　：ｌ　ＡＴＧＡＡＧＡＡＣＴＴＣＡＴＴＣＴｅＴｒＴＣＴＴＣＣＡＴＭＫＮＦ　Ｉ　ＬＬＡＶ　Ｓ　Ｓ　ＩＣＣＴＧＴｒＧ釘艶ＡＣ’Ｉ’ｌ’ＧＴＴＣＣＣＣＡＣＧＣＡＣｍｃＡＡＴＧＴＡＧＡＴｃ’ＩｎＬＬＶＤＬＦＰＴＨＣＧＨＮＶＤＬＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＴＡＡＡＣＴＴＡＡＡＴＧＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＣ−ＡＡＴＡＡＴＧＴＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴｒＣＡ　ＡＣＡＣＧＴＡＧＧＡＣＡＡＡＧＴＧＣｒＡＧＣＣＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧＳ　Ｓ　ＬＧＡＡＨＶＧＱＳＡＳＲＧＲＧＣ口π眩ｎ但ＡＡＣＣＣＡＧＡＴＱＡＣＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＴＧＣｒ肌−ＬＧＥＮＰＤＤＥＥＧＤＡＫＫＫＫ ωぶ刀晶却Ｍ互℃感仏ＣＣＡＡＡＡ−仏ＴＣＣＡ■ｍ晶品Ｔ晶ＧＣＴＧ晶ＸＤＧＫＫＡＥＰＫＮＰＲＥＮＫＬＫＡＡＣＣＡＧＧＡＧＡ巳−■Ｘ汰℃ハＣＡＧＣ但釦届混叙ＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＹ１３ＧＱＰＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴ−ＡＧＡＧＣＡＧＡπＸ■ＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＧＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＡＣＣ−ＡＧＣＡＧＧＴＧＡＴＡＧＡΩ ＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＧＣＡＧＧＴＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣａＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＡＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＤＴＯＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧ　Ｑ　Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｄ　ＲＡ　Ａ　Ｇ　Ｑ　Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｄ　ＲＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣλ１］臆ＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣλ ン刀ｍＡｃＡＧｃｃＡＧｃＡＧＧＡＧＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＣＴＯＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧλンスＧσ 匡旧ＡＣＡＧＣＣＡＧＣＤ　ＲＡ　Ａ　Ｇ　Ｑ　Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｄ　ＲＡ　Ａ　Ｇ　Ｑ　Ｐ　ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＡＡＴＧＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＮＧＡＧＧＱＧＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＡＣＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＡＡＡＡＴＡＡＴＧＡＡＧＧＴＧＣＧＡＡＡＧＧＮＡＧＧＱＧＱＮＮ　ＥＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＡＴＧＧＡＡＡＧＴＣＴＧ　Ｗシ講λシいＪＡＣＣＴＡＧＡＴＡＡＡＧＴＴＡＧＡＧＣＮＡＰＮＢＫＳＶＫＥＹＬＤＫＶＦＬＡＴＡＣＣＧＴＴＧＧＣＡＣＣＧＡＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＴＧＣＭ３ＴＧＴＡＡＣσｒＧＴαト ΩＲＸ旧ＴＴ　Ｖ　Ｇ　Ｔ　Ｅ　Ｗ　Ｔ　Ｐ　ＣＳ　Ｖ　Ｔ　ＣＧ　Ｖ　ＧＧＴＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＡＡＣＡ）ＪＪ− ＬＡ−ＣＣＡＧＡＧＧＡＴＣＶＲＶＲ８ＲＶＮＡＡＮＫＫＰＥＤＴＴＡＣＴＴＴＧＡＡＴＧＡＣＣＴＴＧＡＧＡＣＴＧＡＴＵＴＴＴＧＴＡＣＡＡＴＧＧＡＴＡＡＧＴＧＴＧＣＬ　Ｔ　Ｌ　Ｎ　Ｄ　Ｌ　Ｅ　Ｔ　Ｄ　Ｖ　ＣＴ　Ｍ　Ｄ　Ｋ　ＣＡＴＧＧＣＡＴＡＴＴＴＡＡＣＧＴＴＧＴＧＡＧＴＡＡＴＴＣＡＴＴＡＧＧＧＣＴＡＧＴＣＡＴＡＴＴＧＴＴＡＧ　Ｉ　Ｆ　Ｎ　Ｖ　ｖＳ　Ｎ　Ｓ　Ｌ　Ｇ　Ｌ　Ｖ　Ｉ　Ｌ　ＬＧＴＣＣＴＡＧＣＡＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴＡＡＬＡＬＦＮ〔Ｃ−末端〕酵母宿主中への挿入に選択したＤＮＡ断片は、下記の如くである。

ＧＣＡＧＡＡＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＣＡＣＧＴＧＡＡＡＡＴＡＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＡＣＣＡＧＧＡＧＡＣＡＡＥＰＫＮＰＲＥＮＫＬＫＱＰＧＤＧＡＧＣＡＧＡ′ＩＯＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＭ３ＡＴＯＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＡＣＣ肪Ｇ田届ＡＴＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＡ、ＧＱＰＧＣＡＯＧＡＧＡＴＡＧ−ＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣ島ＡＧ入ＣＡＧ肛ＡＧＡπ追ＡＣＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＡＱＡＴＧＧＡＣＡＡＣＷＡＧＡＣＡＧＡＧＣＡＧＡＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＤＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＣｒＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡＴＡＧＡＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＡ’１℃ＧＡＣＡＧＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＣＣＡｘＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＯｃＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧに℃ＡＧＣＴＧＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＧ　Ｑ　ｐ　Ａ　Ｇ　Ｄ　ＲＡ　Ａ　Ｇ　Ｑ　Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｄ　＊　ＡＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＡＡＴＧＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＧＣλスジ顕迫ＡＡＧＱＰＡＧＮＧＡＧＧＱＡＡＧＧＡＡＣＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＡＡＡＡＴＡＡＴＧＡＡＯＧ■χ：ＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＡＴＧＮＡＧＧＱＧＱＮＮＥＧＡＮＡ　ＰＮＡＡＡＡＧＴＣＴＧ’刀ＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＴＡＧＡ’ｒ思ＧＴＴＡＧ厘３ＣＴＡＣＣＧＴ■に℃ＡＣＥＫＳＶＫＥＹＬＤＫＶＲＡＴＶＧＴこの断片は、全直列反復配列およびデーム（Ｄａｍｅ　）ら、？　イｘ　ンｙ、　（５ｃｉｅｎｃｅ　）　２２５　：　６２８　（１９８４）のり−ジョン（Ｒｅｇｉｏｎ　）　ｌ　ｌＣ実質的に平行で、前記反復領域に先行しかつ、アミノ酸配列ＡＥＰＫＮＰＲＥＮＫＬＫＱＰＧをコードする領域を有する。

この配列は、現在までに研究された企てのマラリア種に保存されている副配列（５ｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ　）　Ｋ　Ｌ　Ｋ　Ｑ　Ｐを有する。

先のＤＮＡ断片は、アーノツ）　（Ａｒｎｏｌ　）ら（米国特許出願第７５４，６４５号およびサイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　２３０　：８１５−８１８．１１月１５日、１９８５年）（双方ともに参考文献として引用した）によって記載された如く単離されたＢｇｌ　ｎによる１　５　ｋｂ断片をサブクローン化することによって、全遺伝子から得た。次に、これを、下記の実施例１で述べる如く修飾酵母プラスミドｐＡＢ　２４のＤＮＡ中に挿入した。

酵母中でプラスモジウム・ビバックス（ｐ、　ｖｉｖａｘ抗原を発現するために、酵母のグリセルアルデヒド三リン酸の強い脱水素酵素とグルコースで調節可能なアルコール脱水素＃累−２（ＡＤＨ−２）プロモーターから成るハイブリッドプロモーターを用いた。このプロモーターを非相同遺伝子に融合することによって、炭素源としてグルコースを用いた酵母培養を高密度に増殖させる。醗酵増殖期において、培地にグルコースが欠損することによって、非相向タンパク質の発現が誘導される。前記プラスミドを多；ビー数に取り込むこと、つまり自己複製的な酵母プラスミドおよび酵母細胞の形質転換によって、高レベルのＣＳタンパク質を誘導により発現可能な株が産生された。

以下の実施例１で述べる如＜、１％グルコースのＹＥＰ培地（１％　ｗ／ｖ酵母抽出物、２％ペプトン）中の培養で酵母を増殖させた。酵母材料２００リツトルがこのようＫして得られ、−８０℃に保存した。

このようＫして得た酵母材料は、具なる酵母タンパク質の複雑な混合物と培地添加物を含有していた。この材料を７．５％ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル上でゲル電気泳動し、その均質性が示された（図６、レーン１を参照）。発現操作およびプラスミド構築を図１．に図示し、以下の実施例１に記載した。プラスモジウム・ノーレージ−（Ｐ、　ｋｎｏｗｌｅｓｉ　）　ＣＳタンパク質の全ての抗体が、このＣＳタンパク質を１００℃で３０分間加熱した後または６Ｍグアニジンと１％β−メルカプトエタノール処理による完全変性後においてさえも、このタンパク質の免疫硬性抗原決定基を認識すると述べらタンパク質が加熱により同様の挙動図示すこと、または、本文で用いられた前記ポリベグチドのみから本質的に成り抗原決定基領域を有する二のタンパ、り質の断片が、通常タンパク質の変性が結果として生じるような加熱条件に曝した後にも抗プラスモジクム・ビバックス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ）ＣＳタンパク質抗体に免疫化学的に反応性であり続けることを確立したわけでは決してない。本発明中でＣＳタンパク質断片が極めて大量の無関係の物質と混合されることは、もうひとつの不明なことであった。混合物を加熱すると、その他のポリペプチドとの凝集が形成され抗原決定基のマスキングおよび（または）共沈を生じさせることがある。また、このような断片が、上記の加熱処理後も免疫原性であり絖けるかどうかも不明であった。

それＫもかかわらず、本発明者達は、酵母の工学的操作によるプラスモジウム・ビバックス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）　ＣＳポリペプチドの精製における開始処理として、加熱処理を用いた。（この特許出願で用いるように１ポリペプチド′は比較的長いタンパク質断片を言い、′タンパク質″は見金なタンパク質を言い、そして１ペプチド′：；比較的短いペプチド、例えば、３０個以下のアミノ酸喪基を有するペプチドを言う。１配列“という用島の使用に関しては、本発明によるポリペプチドおよびペプチドは、配列がＮ末端からＣ末端に述べられていてもまた：まＣ末端からＮ末端に述べられていても同一配列を有していれば機能的に同等であると理解される。）前記混合物を次いで１００℃に加熱した結果、溶！した酵母１ａ胞材料の大量沈殿が生じた。上清を分離し、乾燥後凍結乾燥した。

凍結した上清残渣は、前記酵母抽出物に比し純度が実質的に向上した（図６参照、レーン４）。

凍結乾燥物質の溶液を、次に、（ａ）電解質勾配を用いる陰イオン交換クロマトグラフィによって前記工学的操作によるＣＳポリペプチドを溶出すること、Φ）分子ふるいクロマ、トグラフイによって順次さらＩｃＭ製した。

ＣＳポリペプチド活性含有分画をラジオイムノアラ七イで同定した。少量の高次精ｇ！酵母材料を、高比放射能の１２５Ｉで放射性標識した。プラスモジウム・ビバッ　ス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）　ＣＳタンパク質の反復性抗原決定基に対し作製された固定化抗プラスモジウム・ビバンクス（Ｐ。

ｖｉｖａｘ　、　）モノクローナル抗体に対する顕識物質の結合凪害能について、各分画な古典的ラジオイムノアッセイで測定した。

本発明の精製工程の主な利点は簡便であること、およびスケール・アップが容易に出来ることである。このようにして精製された工学的操作によるプラスモジウム・ビ／＜７クス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）ＣＳポリペプチドは、ＳＤＳ　−ＰＡＧＥおよび等電点電気泳動で均質であり、このポリペプチドが溶菌酵母細胞材料および酵母培地に結合することのできる発熱性で炎症性かつ毒性を有する不純物を実質的に含有していないことが以上より予測される。

本発明の酵母発現操作と精製工程を組み合わせた収率は、酵母培養１リツトル当たり純粋ＣＳポリペプチド１３■であった。この培養物２００リツトルが、バイロフトスケール（試験規模）の装置（醗酵槽２５０リツトル）を用いて３日間で生産されたことから、大量の工学的操作によるＣＳポリペプチドが短期間に入手可能となることが明らかである。

酵母抽出物２００リツトルの原料は、ひとり当たりポリペプチド１００マイクログラムを用い約２万５千人をプラスモジウム・ビバックス（Ｐ、　ｖｉｖｌｘ　）に対し免疫するために充分な工学的操作によるＣＳポリペプチドを含有する。

本発明によって生産されるＣＳポリペプチドの主な利点には、この工学的操作によるペプチドが、（ａ）　不純物および無関係の抗原を含有せず、大規襖に生産できること、 φ）天然のＣ８分子の大断片に相当すること、（Ｃ）　水酸化アルミニウムをアジュバントとして用い、げつ書類において高い免疫原性が示されたこと、（ｄ）　産生された前記抗体が、′反復単位′およびＣ８分子の保存領域の双方に反応すること、が挙げられる。

この１反復単位′に対する抗体は、寄生体注入を非常に効率的に中和することが示された。この保存領域含有ペプチドに対する抗体も、同様に、寄生体注入を中和したが、医書活性を正確に定量化することはできなかった（バーガラ（Ｖｅｒｇａｒａ　）ら、ジャーナル・オブ・イミューノロジー（Ｊ’、：Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）　１３４　：　３４４５−３４４８．１９８５）。

さらに、このペプチドの一部であるＫＬＫＱＰという配列が、全てのＣＳタンパク質中に存在するという事実から、この領域が重要な機能を持っていることが示唆されるＯ本発明を例示するため、特定の案施例で以下に本発明を詳細に述べるが、範囲を限定するものではない。

Ｃ８遺伝子の制限、ベクター中への連結反応、宿主酵母細胞の形質転換および発現以下の記載で、全ての制限エンドヌクレアーゼおよび酵素は、ファルマシア・ファイン・ケミカル■（Ｐｈａｒｍａｃｉ２Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、（ビスヵタウｘ−（ＰｉｓｃａｔａｗａＶ）＋ニューシャーシー州（Ｎ、Ｊ、））、ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）　（ビバリー（Ｂｅｖｅｒ−１ｅｙ　）、マサチューセッツ州（ＭＡ））、ベーリンガー−７７／％イム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）、（インジアナポリｙ、　（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ　）　、インジアナ州（Ｉ　Ｎ　）　）またはベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−■（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ　）　（ゲイタース／＜　−り’（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ　）、メリーランド州（ＭＤ））から市販品を入手し、製造者の指示に従い用いる。

バク質遺伝子を含有するｐＵＣ９ベクター（ファルマシア−７７イン−’ｒ　ミカル＠（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、）、ビス力タウエイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　）、ニューシャーシー州（ＮＪ　’）　）は、バクテリオファージ・ラムダ・ベクターであるＥＭＢＬ　３のＢａｍ　ＨＩ　ｆｌｉ位へ挿入した１５ｋｂのＢｇｌ　ｎ断片乞サブクローン化することによって誘導した（参考文献として引用したアーノット（Ａｒｎｏｔ　）らの米国特許８願第７５４，６４５号に開示されている）。

ｐｌＪｃｓｃｉクローンをＢｇｌ　ＩＩとＸＢａ　Ｉで消化しＡｆ）ｖで精製し、反復全配列をフードする４、　１　ｋｂ断片を得た（アーノット（Ａｒｎｏｔ　）ら、サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　２３０　：　８１５−８１８．１９８５、参考文献として引用）。このゲル精製断片を、次に、Ｆｏｋ　ＩとＢ４ｎ　ｌで消化し、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　）の３８ＯＡＤＮＡシンセサイザーを用いホスホルアミダイト法によって合成された以下の５′−リン酸化合成リンカ−に連結結合さりンカーＩは、Ｎｃｏ　１部位をひとつ提供し、一方、リンカ−■は、ＳａＪ　Ｉ接着末端を提供する。

リンカ−含有断片をＮｃｏ　ｌとＳａｌ　ｌで消化し、ゲル電気泳動で単離し、Ｎｃｏ　Ｉ　／　Ｓａｌ　ＩＩで消化したｐＢＳ　１００上でクローン化する（以下に構築を示す）。生成したプラスミドをｐＡＧ　／　Ｐ、　ｖｉｖａｘ　１と命名する。　ｐＥ３ｓ　１００は、ＡＤＨ−２調節ＧＡＰＤＨ（グリ七ルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素）プロモーター（１２００ｂｐ”）およびＧＡＰＤＨターミネータ−（９００ｂｐ　）含有ｐＢＲ３２２由来グラスミドであり（図１参Ｎ）、その構築を以下で述べる。

このプロモーターのＡＤＨ−２部位は、野生株ＡｂＨ−２遺伝子（プラスミドｐＡＤＲ２、バイヤー　（Ｂｅｙｅｒ　）とヤング（Ｙｏｕｎｇ　）　、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）、３００　：　７２４７２８　（１９８２）参考文献として引用）を、ＡＴＧ開始；トンの＋６６位とＡＤＨ−２領域外のｐＡＤＲ２中の他の２部位で切断する制＠醇素ＥｃｏＲ５で切断することによって構築した。結果として生成したひとつのベクター断片と二つの小断片の混合物をＢａ１３１エクソヌクレアーゼで消化し、約３００　ｂｐを除去した。ＣＣＴＣＧＡＧＧの配列ＧＧＡＧＣＴＣＣを有する合成Ｘｈｏ　ｌリンカ−を化学的に合成し、Ｂａｄ　３１処理ＤＮＡ上に結合した。結果として生成したＤＮＡ　＋Ｊンカー・ベクター断片（約５　ｋｂ　）をカラムククマトグラフイ（７７＃　？　シフ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）のセファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ４Ｂ）によって、前記リンカ−から分離し、制限酵素Ｘｈｏ　Ｉで切断後再結合し、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）をアンピシリン耐性に形質転換するために用いた。Ｘｈｏ　ｌ　リンカ−付加の位置は、当分野で広く公知の標準的技術を用い、ＤＮＡ配列決定によって決めた。ＡＤＨ−２遺伝子の５′非転写領域（ＡＴＧから一２３２位）内に位置するＸｈｏ　ｌリンカ−含有のプラスミド１個を制限＃素Ｘｈｏ　ｌで勇断し、−重鎖に特異的なヌクレアーゼＳ１で処理後、絖いて制＠醇素ＢｃｏＲＩで処理し、Ｘｈｏ　ｌリンカ一部位にひとつの平滑断端とひとつのＥｃｏＲｌ端を有する直線状ベクター分子を創製した。

このプロモーターのＧＡＰ部は、プラスミドｐＰＧＡＰ（１９８５年５月３　日出願のキロン・コーポレーション（Ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　）の欧州特許出願第１６４，５５６号に開示、文献として引用、１９８４年５月１１日出願の該当する米国ｍＭ第６０９．５４０号の出願日を認定された）を酵素Ｂａｍ　ＨＩおよびＥｃｏ　ＲＩで切断後、０．４　Ｋｂｐ　ＤＮＡ断片を単離することによって構築した。プラスミドｐＰＧＡＰは、酵母の０ＡＰＤＨ７’ロモ一ター１個とＮｃｏ　ｌおよびＳａｌ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位と隣接するターミネータ−配列を含有する酵母プラスミドである。この精製断片を酵素Ａｌｕ　ｌで部分消化しＢａｍ　ＨＩ部位近傍で平滑断端乞創製後、プラスミドｐＪＳ　１０４？：構築するために用いた。

プラスミドｐＪＳ　１０４は、上述の直線状ベクター上にあるＡＤＨ−２断片にこのＡｌｕ　ｌ−Ｅｃｏ　ＲＩ　ＧＡＰプロモーター断片を結合することＫよって構築した。

Ｂａｍ　ＨＩ　−Ｎｃｏ　Ｉ　ＡＤＨ−ＧＡＰ　７’　ｏ　モー　１−断片は、ＡＤＨ−ＧＡＰ　７　ａモーターのＧＡＰ断片がｐ、ｙｓ　１０３では約２００　ｂｐであり、ｐＪＳ　１０４では４００　ｂｐであることを除きｐ、ｙｓ　１０４　（上記）と同一のグラスミドｐＪｓ　１０３から得た。

ｐＪｓ　１０３の構築は、このＢａｒｎ　ＨＩ　−Ｅｃｏ　ＲＩ断片０．４ｋｂをＡＩｕＩで売主に消化しく　ＰＪＳ　１０４で部分消化した代わりに）、ひとつの２００　ｂｐ断片を単離したことを除き、ｐＪｓ　１０４の構築と同じであった。プロモーター、王１Δモジウム・ピバツ　ス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）セグメントおよびターミ・ネーターを含有する上記の全領域（以後１発現力セント“ と命名する）を、Ｂａｍ　ＨＩによる消化で切除後ゲル電気泳動で精製し、Ｂａｍ　ＨＩ消化ｐＡ３２４中にクローン化した。このプラスミドの制限マツプを図２に示す。

ｐＡＢ２４は、酵母中における自己複製に必要な完全２ｍｕ配列（ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ　）　：イースト・サツカロミセス（、Ｙｅａｓｔ　ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）の分子生物学、１　：　４４５、コールド・スプリング＋　ハーバ−出版（Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　）、１９８１　）とｐＢＲ３２２配列を含有する酵母発現ベクター（図２）である。これは、また、プラスミドＹＥｐ　２４由来酵母ＵＲＡ　３遺伝子（ポットスタイン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　）ら、ジーｙ　（Ｇｅｎｅ　）　（１９７９）且：１７文献として引用）およびプラスミドｐｃｉ　／　ｌ由来酵母ＬＥＵ２ｄ遺伝子（キ’０７−’：１−ボレーショ：ｙ　（Ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏ−ｒａｔｉｏｎ　）の名前による１９８４年８月２２日出願の欧州特許出Ｈ第１１６．２０１号を参照、文献として引用）を含有する。前記発現力セントは、ｐＢＲ３２２のＢａｍ　ＨＩ部位に挿入され、こうすることによって、テトラサイクリン耐性細菌遺伝子を妨害する。

キロンー＝ｙ−ボシーシ＊　ン（Ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　）によって単離されたサツカロマイ七ス・セリピジアエ（Ｓａｃｃｂ４ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）株Ａ　Ｂ　１１０　（ｖ　７　）（Ｍａｔ）、Ｉｅｕ２−０４、Ｉｅｕ２−３とＩｅｕ　２−１１２の双方、シ１４−３、）ｌ！Ｓ　４　５８０　、　ｃｒｒ”　）をヒネン（Ｈｉｎｎｅｎ　）ら、プロシーデイングズ・オプ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシイズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ　ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）７５　：　１９２９−１９３３　（１９７８）に従ってｐＡＢ　２４７　Ｐ、−分区１−５によって形質転換した。ＧＡＰ調節ベクターを有する単一形質転換コロニーをＩｅｕ−（ロイシン欠損）選択培地２−中で増殖させ、ｌｏｇ期、゛あるいは定常期を遅延させた。前記のプラスミドを有する酵母のみがこの培地中で増殖できる。次いで、培養物を１％グルコースＹＥＰ（酵母抽出物１％Ｗ／Ｖ　ｓペプトン２％Ｗ／ｖ）中で１：２０（ｖ／ｖ　）に希釈し、この培地中でた和するまで（３６時間）増殖させた。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ　）とジチオスレイトール（ＤＴＴ　）存在下で細胞を溶菌し、この溶菌液を遠心分離によって清澄とした。透明となった溶菌液をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた（レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ　）、Ｕ、に、、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）、２７７：６８０．１９７０　）。クーマーシー・ブルーで染色し、約３８　ｋＤの重いバンドカフースモジウム・ピバックス（Ｌ凪工旺）プラスミド含有形質転換体の抽出物に観察された（図３）。このバンドは、発現ベクターで形質転換されたこれらの細胞中に検出されたが、一方、対照（ｐｃｉ／１）プラスミドを有する細胞抽出物には欠損していた。

融合タンパク質は、総細胞タンパク質の１０％を超えている。細胞泳動県営（ＤＮＡ構築から予測される２　３　ｋＤに対し３　Ｆ３　ｋＤ　）の理由は、ブースモジラム・ノーシー９　二（Ｐ、　ｋｎｏｗｌｅｓｉ　）　ＣＳタンパク質で先に報告されているように（オザキ（０ｚａｋｉ　）ら、−ｋｙｖ　（Ｃｅ１ｌ　）ム：１８５．１９８３　）　ＳＤＳ結合異常に帰することができ、おそらく疎水性タンパク質の割合が小さいことによるのであろう。

この３３　ｋＤバンドの本質を確認するため、酵母によって合成された夕／バク５ｉ、を、同様に、ウェスタン分析した。上述の如く調製した清澄酵母溶菌液をポリアクリルアミドゲル上で電気泳動しくレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ　）　、上記）、タンパク質を、次に、ニトロ七ルーースフイルター上で電気プロントした（タウビン（Ｔｏｗｂｉｎ　）ら、王７６　：　３４５０．１９７９　）。このフィルターを、ＰＢＳ中１％（ＢＳＡ）で１時間ブレインキュベートし、次に、プラスモジウム・ピバックス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）　ＣＳタンパク質に対するモノクローナル抗体で４℃で１２時間処理した。

シュ（百洋わさび）・ペルオキシダーゼ結合第ニャギ抗マウス抗体（バイオラド・ラボラトリーズ（ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）、リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　）、カリホルニア州（ＣＡ））を添加した。最後に、このフィルターをホースラディツシュ・ペルオキシダーゼ発色試薬（バイオラド（Ｂｉｏ　−Ｒａｄ　）、リンチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　）、カリホルニア州（ＣＡ））とインキュベートし洗浄した。

ウェスタン分析からこの融合タンパク質が前記モノクローナル抗体と反応することが示された（図４）。

実施例２：プラスモジウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖｉｖ２ｘ　）の環状小芽体の精製環状小芽体ポリペプチドの一部を発現する酵母培養を実施例１の如く調製した。

発現ポリペプチドは、反復ドメイン全体および保存領域すなわちデーム（Ｄａｍｅ　）、Ｊ、　Ｂ、らサイｘ　：ｙｙ、　（５ｃｉｅｎｃｅ　）　２２５　：　６２８　（１９８４）のリージョン（Ｒｅｇｉｏｎ　）　Ｉを有するアミノ酸２３４個のみより成っていた。発現ポリペプチドのＮ末アミノ酸は、ヌクレオチド位１ｉ　３８５　７　（ＧＣＡ　）のアラニンであり、Ｃ末アミノ酸は、ヌクレオチド位＆　１０８４−１０８６　（ＣＣＡ）のプロリンである。アーノソト（Ａｒｎｏｔ　）ら、サイエｙ　、Ｘ　（５ｃｉｅｎｃｅ　）　２３０　：　８１５−８１８．１９８５゜酵母によって発現されるペプチド断片の第一段階精製は、抽出物を１００℃温度とすることから成っていた。精製は以下の如く行った。

酵母培養２０リツトルからのベレット状酵母の抽出物をビーズ・ビータ−中に入れ、この酵母を、等量の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，３，０，１％トリトンＸ１１ｍＭＥＤＴＡ、　１　ｍＭＰＭｓＦ　（）ｘニル）　チルスｙホ＝ルフルオリド）へプスタチン１マイクログラム／−で希釈した。この抽出物（３７０−ｄ　）を、ｌ　ｍＭ　ＰＭＳＦとｌｖイクログラム／−のロイペプチン含有沸とう水２００−に添加した。この混合物を温度１００℃とし、常に撹拌しながら温度１００℃に１０分間保った。混合液を０℃に冷却後、ベックマン超遠心ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ　ｔＪｌｔｒａｃｅｒ＋ｔｒｉｆｕｇｅＲｏｔｏｒ　）　Ｔ　Ｉ−１９（ベンクマン・インストルメンソ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　）、パロアルト（Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ　）、カリホルニア州（ＣＡ））中で１８，０００回転回転子１５分間遠心した。上滑を除去し、凍結乾燥した。

乾燥物質を水１２〇−中に溶解し、小量の不溶性物質残渣を除去するため遠心し、蒸留水に長く４８時間透析し角度凍結乾燥した。この粉末′？：ｐＨ７，５の３　ｍＭリン酸ナナトリウムカリウム緩衝液溶解し、その伝導度を水で０．５８　ｍＳＫ調整した。この溶液を遠心し不溶性物質を除去し、同緩衝液中で平衡としたＤＥＡＥ−セファセル（Ｓｅｐｈａ−ｃｅｌ　）　（７アルマシア・ファイン・ケム■（Ｐｈａｒｍａｃｉ３Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍ　Ｃｏ、　）、ビス力タウエイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　）、二ｗ−シャーシー州（ＮＪ））カラム（５ｃｍＸ　２４ｃ！ｎ）中の陰イオン交換クロマトグラフィにかけた。流速を１００ｉ／時間に調整し、試験管１本当たり２１−を集めた。このカラムを同緩衝液５００１ｎｌすなわちおよそカラム１本分の容量で次に洗浄した。開始緩衝液１５００　ｍ’を、０．７５　Ｍ　ＮａＣ１も含有する同緩衝液１５００−と漸次混合して直線勾配を有する緩衝液で、溶出を続けた。このカラムから溶出する種々の分画における環状小芽体ポリペプチドの存在を下記の競合的ラジオイムノアン七イを用いて検出した。

陽性分画が、２から１０ｍ５の間の伝導率で、対称形のピークとして分画Ｎｏｓ、　６５−９０の間に溶出した（図５）、６５−９０の全分画を凍結乾燥し、０．３　Ｍ　ＮａＣ１６〇−中に再溶解後、室温下で数時間０．３　Ｍ　ＮａＣＪに透析した。透析物を遠心分離し少量の不溶性物質を除去後、３分の１すなわち２０−を０．３Ｍｆｆ１化ナトリウムで平衡とＬ　タセ７７デツクス（５ｅｐｂａｄｅｘ　）　Ｇ　−２００（７アルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　）上で分子ふるいクロマトグラフィにかけた。この七ファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）は超微細であり、カラムは直径５ｃｍ長さ１００αであった。試験管１本当たり２１−の試料をカラムから集めた。ＣＳポリペプチドが５１−５７の試験管に急峻な対称ピークとなって溶出した。しかし、管中少量の高分子量および低分子量の物質が、このピークの前後に分散していた。試験管５１−５７の内容を集め蒸留水に対し長（透析しそして凍結乾燥した。純粋環状小芽体ポリペプチド８９Ｎ９を総量で回収した。これを基準とし、酵母抽出物２０リツトルからの収率は８９×３すなわち純粋なタンパク質２６７■あるいは酵母培養１　＋Ｊットル当たり約１３１１ｙであると我々は算出した。回収環状小芽体ポリペプチドの純度をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ　）および変性条件下の等電点電気泳動によって評価した。等電点電気泳動によって、１−当たり２ダの濃度で４．３の等電点な有する単一バンドが検出された（図７゛）。ＳＤＳ　−ＰＡＧＥによって、分子量４３．０００と４５．０００の間の二重バンドが検出されＹこ（図６）。

ｌ−当たりタンパク質１　ｒ！１９を含有するＣＳポリペプチド溶液の２８０　ｎｍにおける吸光係数は０．２であった。このポリペプチド試料を部分Ｎ未配列解析にかけた。そして主配列は、アラニン−グルタミン酸−ブロリン−リシン− ７スパラギンープロリンと予測通りであった。別の試料を１２５Ｉで放射性標識し、プラスモジウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｖｉｖａｘ　）のＣＳタンパク質１ｃ特異的なモノクローナル抗体で免疫沈降した。計数値の７５から８５％が、本抗体によって特異的に認識された。

固相競合的ラジオイムノアッセイを用い精製操作中の工学的操作によるＣＳポリペプチドを検出した。ラジオイムノアッセイで得たシグナルによる抗原量１（関する標準曲線を下記の如＜ＲＳ！シた。前記の工学的操作による精製ＣＳポリペプチドを淘知のヨードダン法を用い＋２５１で放射性標識し、タンパク質１マイクログラム当たり約２　Ｘ　１０’カウント／分の比放射能とした。一定量の放射性標識工学的操作によるポリペプチドおよび種々の量の精製した工学的操作によるコールド（すなわち非標識）ＣＳポリペプチドを含有する混合物（総量１００マイクロリツトル中）を調製した。この混合物３０マイクロリツトルを、次に、ブースモジラム・ピバツ　ス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖｉｖａｘ）環状小芽体タンパク質に対するモノクローナル抗体（２Ｆ２）を先に塗付した微量力価プレートフェルの底に入れた。このモノクローナル抗体は環状小芽体タンパク質の反復抗原決定基に反応する。（ナージン（Ｎａｒ−ｄｉｎ　）　Ｅ、　Ｈ，ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイスン（Ｊ、をＬ塗土）、二：２０．１９８２　）。

標識ペプチドのウェル底への結合を凪害するコールドペプチドの効果は、コールドペプチド濃度に比例していた。

このアッセイでは、１−当たり５ナノグラムはどの低濃度のコールドペプチドを検出した（図８）。カラム分画および抽出物のアッセイを上述と全く同様に行い、得た阻害度を標準曲線と照らし合わせ（図８）このＣＳタンパク質ヘフチド濃度を算出した。このアッセイ法において、希釈および洗浄は全て、１．０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）および０．１％アジ化ナトリウム含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ　）中で行った。

これらのアッセイの結果に基づき、酵母培養物は、１リツトル当たり６０■の環状小芽体タンパク質を含有し、この精製物質の回収は、全体でおよそ２０％であったと我々は算出した。精製最初の段階では全（損失がなく、すなわち抽出物煮沸後のこの段階で、出発抽出物の５ＤＳ−ＰＡＧＥで観察された無関係のタンパク質バンドの９０％を上回る量が除去された。

実施例３：＃母の工学的操作によるプラスモジウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｖｉｖａｘ　）によるマウスの免疫前記の精製された工学的操作によるＣＳポリペプチドを、次に、マウスを免疫する抗原として用いた。異系の雌性スイス−ｆｙｘフスｐ　−（５ｗ１ｓｓ　−Ｗｅｂｓｔｅｒ　）　８−１２週令マウス１０匹に対し、水酸化アルミニウムに吸着させた前記精製ペプチド５０マイクログラムを注射した。

３週後および６週後に、水酸化アルミニウムｔアジュバントとして再度用い同量の抗原でマウスをブースター投与した。１０日後、マウスを出血させ、血清なイムノラジオメトリック・アッセイで分析しＣＳポリペプチドに対する抗体を検出した。このアッセイでは、微量力任プレートのウェルを精製工学的操作によるＣＳポリペプチド（ＰＢＳ中１０マイクログラム／−）で塗布し、次いで、希釈の異なるＰＢＳ　−ＢＳＡ中マウマウス血清３０マイクロリツトルのウェルなインキュベートした。次にウェルを洗浄し、ＰＢＳ　−ＢＳＡ中に希釈した放射性標識のアフイニイテイ精製ヤギ抗マウスイムノグロブリン（１０ｃｐｍ／タンパク質１マイクログラム）　ｓｏ、ｏｏｏ　ｃｐｍで再度インキュベートした。そして、再びウェルを洗浄し計数した。

全ての血清が、１　：　１０．０００以上希釈の、工学的操作によるＣＳポリペプチドと反応した。プール血清の力価結果を図９に示した。これらの血清がプラスモジウム・ビバックス（Ｐ、ｖｉｖａｘ　）　ＣＳタンパク質に対する大量の抗体を含有することが、下記の二実験で示された。

１）　（Ａｓｐ　−Ｇｌｙ　−Ｇｌｎ　−Ｐｒｏ　−Ａｌａ　、−Ｇｌｙ　−Ａｓｐ　−Ａｒｇ−Ａｌａ　）２の配列から成り、ブースモジラム・ビパソｌｘ　（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）　ＣＳタンパク質の直列反復２個を表す１８個のアミノ酸の合成ペプチド（１８−ｍｅｒ　）を、（ａ）１９８５年７月９日出願で本発明で参考文献として引用した係属中の米国特許出願第７５４．６４５号、および０：Ｉ）アーノット（Ａｒｎｏｔ　）ら、サイｘ　７ス（５ｃｉｅｎｃｅ　）、２３０：８１５．１９８５　Ｋ記載された如く合成した。このペプチドを微量力価プレートのウェルを塗付するのに用い、血清の抗体含量を上述のイムノラジオメトリックアラ七イで検出した。１　：　４．０００以上の力価に対し、全血清が反応した。第二回抗原ブースター注射後に得たプール血清の力価結果を図１０に示した。

２）１８個のアミノ酸の合成ペプチドを再び用い、プール抗血清中に存在する抗体が工学的操作によるＣＳポリペプチドを塗付したプラスチックプレートのウェルに結合することを阻害した。これらの実験では、我々は最初にマウスプール血清（第二回ブースター注射（ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ））の１　：　３，０００希釈試料を上述の１８個のアミノ酸より成るぺ１チドの濃度を上昇させインキュベートした。対照として、血清試料を同濃度でアミノ酸配列が異なる無関係の別の１８−ｍａｒペプチドとインキュベートシタ。室温で１時間インキュベーシヨｙ後、混合物３０マイクロリツトルを、工学的操作によるＣＳポリペプチドを前塗付したプレートフェルに添加した。このウェルを次に洗浄し、上述の如く放射性標識ヤギ抗マウスイムノグロブリンとインキュベートし再度洗浄後計数した。図１１に示した結果から、′反復′ペプチド（対照ペプチドではない）が抗体とＣＳタンパク質の反応をおよそ５０％阻害することが示された。希釈および洗浄は全て、これらの実験においてＰＢＳ　−ＢＳＡで行った。

同血清を、また、デーム（Ｄａｍｅ　）ら、上記のリージョン（Ｒｅｇｉｏｎ　）　Ｉに対する抗体存在の可能性について分析した。この目的のため、我々は固定化抗原として、合成小ペプチドＮ）（２−Ｃｙｓ　−Ｔｙｒ　−Ａｓｎ　−Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ　−。

出−且し−Ｎ１−Δ扛−拒一卦ゴーショーシ！−〇Ｉｎ−、ＰｙニーＣ０ＯＨを用いた。このペプチドは、現在までに調べられているマラリア全寄生体のＣＳタンパク質金工に共通のアミノ酸５個の配列Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−Ｇｌｎ　−Ｐｒｏ　（デーム（Ｄａｍｅ　）ら、サイｘ　：ｙ　ス（５ｃｉｅｎｃｅ）、２２５　：　５９３．１９８４およびエニ７　（Ｅｎｅａ　）、■、、私信）を有する。最初のアミノ酸２個（ＣｙｓとＴｙｒ　）は、ＣＳタンパク質に外来性であり、キャリアータンパク質に結合させ１２５Ｉで放射性傾識する目的で付加した。このペプチドを用い微量力価プレートのウェルを塗付し血清中抗体含量を上述の如く検出した。第２回ブースター後、全血清が１　：　２．０００以上の希釈でこの小ペプチドを認識した。これらの血清プールの力価結果を図１２に示した。

プラスモジウム・ビバックス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）小芽体を抗原として用い、間接イムノフルオレセンスによってこの血清をまた、試験した。全ての血清は、１　：　１０００以上の希釈で陽性であった。

最後に、この工学的操作によるＣＳタンパク質に対する比較的低濃度の抗体が、プラスモジウムーピバックス（ｐ、　ｖｉｖｌｘ　）小芽体の感染性を中和することが、別の実験から示された。本アッセイは、ジャーナル・オプ・（文献として引用）に記載の如く、ヒト肝癌細胞系統Ｈｅｐ　６２を寄生体侵入の標的として用いて行った。下記の表１に示した結果から、１：　５０００の血清希釈で有意な阻害度が得られたことがわかる。阻害のツクー七ントは、Ｚｏｏ−（（実験平均値／対照群の平均値）　Ｘ　１００　）として算出した。対照群は、同濃度の正常（免疫前）マウス血清とインキュベートした小芽体のみより成っていた。

表　１酵母の工学的操作によるＣＳタンパク質に対する抗体によるインビトロにおけるプラスモジウム・ビ／くソクス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）小芽体の肝細胞阻害（血清　希釈）−′　％阻害５．０００　４２゛已４ｆｆづ責下刃７でスミ）−１１“２４図、２ｐワ７７ソノしアミドｔ　ケル、０．３ニジ１ｖ算庫（ｍ　４；　’Ｌ囚、４図、５四、７（Ｗ＞　ｔ＞　ｏｐ　７＞へ９７Ｆ７ｊ、ｘＥＦ？（”４　ｕ”ｔヒ耐２冬す” ”ｔ）’１％−Ａ　（ｍｇ／ｍｌ） ω嘴幻友（Ｘ１０−３）手続補正書（自発）昭和６３年１λ月２２日

Claims

【特許請求の範囲】

１．本質的に下記のアミノ酸配列から成るアミノ酸配列を有し、【配列があります】かつ、（ａ）制限酵素ＢｇｌＩＩによる１５ｋｂのブラスモジウム・ピバックス（Ｐ．ｖｉｖａｘ）ＣＳＤＮＡ断片を適切なベクター中に得ること、（ｂ）前記断片を適切なベクター中にサブクローン化すること、（ｃ）前記アミノ酸配列をコードする４．１ｋｂのブラスモジウム・ピバックス（Ｐ・ｖｉｖａｘ）ＤＮＡ断片を得ること、（ｄ）前記断片を酵母発現ベクター中に取り込むこと、（ｅ）前記発現ベクターによつて酵母を形質転換すること、（ｆ）前記ベクターによつてコードされるこのタンパク質を発現させることのできる条件下で酵母を培養すること、（ｇ）前記発現タンパク質を含有する培地を採取すること、を有する段階より成る方法によつて製造される酵母の工学的操作によるポリペブチド。
２．前記断片をサブクローニングするための前記ベクターが、ｐＵＣ９である請求項１に記載のポリペブチド。
３．前記酵母発現ベクターが、前記４．１ｋｂのプラスモジウム・ピバックス（Ｐ．ｖｉｖａｘ）ＤＮＡ断片を含有するプラスミドｐＡＢ２４である請求項２に記載のポリペブチド。
４．前記発現ベクターが、さらに、アルコール脱水素酵素−２とグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素のハイブリッドブロモ−ターとグリセルアルデヒド −３−リン酸脱水素酵素ターミネーターを含有する請求項３に記載のポリペブチド。
５．前記ハイブリッドブロモ−ターが、プラスミドｐＳＪ１０３から得られる請求項４のポリペブチド。
６．さらに酵母２ｍｕ配列を含有する請求項５に記載のポリペブチド。
７．前記形質転換酵母が、ＡＢ１１０株である請求項１に記載のポリペブチド。
８．前記形質転換酵母が、ロイシン欠損成長培地中で培養される請求項１に記載のポリペブチド。
９．本質的に【配列があります】から成るアミノ酸配列を有するポリペブチド。