KR101600959B1

KR101600959B1 - 가금 레오바이러스 시그마 c 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질 및 이에 대한 항체

Info

Publication number: KR101600959B1
Application number: KR1020130069548A
Authority: KR
Inventors: 김정우; 정경민; 박종배
Original assignee: 단국대학교 산학협력단; 주식회사 단바이오텍
Priority date: 2013-06-18
Filing date: 2013-06-18
Publication date: 2016-03-08
Also published as: KR20140146803A

Abstract

본 발명은 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질 및 이에 대한 항체에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질, 상기 재조합 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 상기 재조합 단백질의 제조 방법, 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 인식하는 항체 및 그 제조 방법, 상기 재조합 단백질을 유효 성분으로 포함하는 가금 레오바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 백신 조성물, 상기 재조합 단백질에 대한 항체를 유효성분으로 포함하는 가금 레오바이러스에 대한 감염증을 치료 또는 예방하는 약제학적 조성물 또는 사료 조성물, 및 상기 백신 조성물 또는 약제학적 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여함으로써 가금 레오바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질과 이에 대한 항체는 가금 레오바이러스에 대한 감염증을 보다 효율적으로 치료 또는 예방하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질 및 이에 대한 항체{Recombinant Protein Comprising Epitope of Avian reovirus sigma C Protein and Antibody thereto}

본 발명은 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질 및 이에 대한 항체에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질, 상기 재조합 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 상기 재조합 단백질의 제조 방법, 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 인식하는 항체 및 그 제조 방법, 상기 재조합 단백질을 유효 성분으로 포함하는 가금 레오바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 백신 조성물, 상기 재조합 단백질에 대한 항체를 유효성분으로 포함하는 가금 레오바이러스에 대한 감염증을 치료 또는 예방하는 약제학적 조성물 또는 사료 조성물, 및 상기 백신 조성물 또는 약제학적 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여함으로써 가금 레오바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

가금 레오바이러스는 닭에 감염되어 관절염, 흡수불량증후군, 장염, 간염, 심낭수종, 심근염, 만성호흡기질환 등의 질병을 유발하는 바이러스로서, 종계에 감염 시 모계로부터 수직 전파를 통하여 후대 병아리에게 감염 될 수 있다. 위의 임상 증상으로 인하여 양계 농장에서는 사육 성적 저하(증체율 저하, 사료 이용률 감소, 도체 폐기율 증가, 부화율 감소 등)의 문제가 발생하여 많은 경제적 손실을 일으키게 된다. 현재 국내외에는 각종 질병에 대한 백신이 시판되고 있으며 난황 내 모체 이행 항체의 간섭 기간에 따라 다소 접종 시기가 달라질 수 있으나 각종 소화기 질병은 어린 병아리에서 성추에 이르기까지 계속 발생하고 있으며, 그 발생 배경에는 일정 수준의 모체 이행 항체를 보유한 육계에서 백신 접종 시 나타나는 백신 브레이크 현상이 많은 부분을 차지할 것으로 여겨진다.

한편, 대한민국 공개특허 특2001-0069166호에는 조류 레오바이러스의 불활화 백신을 조제하는 방법에 대한 기술이 공개되어 있으나, 상기 불활화 백신은 불활화가 완벽하게 이루어지지 않을 수 있어 백신을 접종시켜도 질병이 유발되는 상태(vaccination brake)가 발생할 수 있는 단점이 있다. 따라서, 백신 브레이크 현상이 일어났을 때, 외부로부터 침입하는 병원체에 대한 방어력이 소실되는 시기에 이를 방어할 수 있는 수단을 개발하는 것이 질병으로부터 육계를 보호하는데 필수적인 사항이며, 레오바이러스에 대한 항체 생산 및 이를 이용한 레오바이러스 감염증 치료를 위해, 레오바이러스의 주요 단백질의 항원 결정기를 밝히는 것이 가장 중요하다.

대한민국 공개특허 특 2001-0069166호

Journal of General Virology (1995), 76, 1515-1520.

본 발명의 목적은 가금 레오바이러스 시그마 C단백질의 항원 결정기(epitope)를 포함하는 재조합 단백질 및 이에 대한 항체를 제공하여 가금 레오바이러스에 대한 감염증을 보다 효율적으로 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 가금 레오바이러스 시그마 C단백질의 항원 결정기(epitope)를 포함하는 재조합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기(epitope)를 인식하는 항체 및 그 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 유효 성분으로 포함하는 가금 레오바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질에 대한 항체를 유효성분으로 포함하는 가금 레오바이러스에 대한 감염증을 치료 또는 예방하는 약제학적 조성물 또는 사료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 백신 조성물 또는 약제학적 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여함으로써 가금 레오바이러스의 감염증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기(epitope)를 포함하는 재조합 단백질과 이에 대한 항체는 가금 레오바이러스에 대한 감염증을 보다 효율적으로 치료 또는 예방하는데 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 국내 레오바이러스 발생 농장의 육계에서 직접 분리한 바이러스를 사용하였고, 레오바이러스의 시그마 C 유전자가 포함되어 있는 S1 유전자 중에서 병원성 및 감염에 주요한 역할을 하는 항원 결정기인 시그마 C 유전자 전체 size를 대상으로 재조합 항원을 제작하였고, 이를 산란계에 면역하여 난황 항체를 생산하였다. 기존 백신 조성물과 비교할 때, 본 발명의 항체 생산 방법은 부작용의 위험이 없는 안정성 있는 항체를 간단한 방법으로 대량 생산할 수 있으며 생산 비용이 적게 드는 장점을 갖는다.

도 1a는 RT-PCR을 통하여 수득한 산물인 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질을 코딩하는 유전자를 확인하기 위하여 전기영동한 사진이다(레인 1: 100bp DNA 마커, 레인 2 : RT-PCR 산물).
도 1b는 본 발명의 실시예 1에 따라 확보된 RT-PCR 산물을 클로닝하여 염기 서열을 확인하기 위하여 전기영동한 사진이다.
도 2a는 본 발명의 실시예 2에 따른 발현 벡터의 구성을 도식한 것이다.
도 2b는 본 발명의 발현 벡터를 분리한 후 제한효소 BamHI으로 절단하여 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 확인하기 위하여 전기영동한 사진이다(레인 1: 1kb DNA 마커, 레인 2 : pQE-30/가금 레오바이러스 시그마 C).
도 2c는 본 발명에 따른 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질을 분석하기 위해 웨스턴 블롯 분석으로 확인하여 전기영동한 사진이다(레인 1 : 단백질 분자량 마커, 레인 2 : 가금 레오바이러스 시그마 C를 재조합시키지 않은 벡터, 3~6: 재조합 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질)
도 3은 분리한 항혈청과 난황으로부터 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질에 대한 항체가를 분석하기 위하여 면역 후 주수에 따른 항체가를 나타낸 그래프이다.
도 4는 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 인식하는 난황 항체가 가금 레오바이러스에 대하여 중화 효과를 발휘하는지 알아보기 위해 reovirus의 cell line인 BHK-21을 이용하여 중화 테스트를 실시한 사진이다(A : 세포배양, B : 난황 항체와 함께 세포배양, C : 가금 레오바이러스와 함께 세포배양, D : 가금 레오바이러스, 난황 항체와 함께 세포배양, E : 가금 레오바이러스, 10배 희석한 난황항체와 함께 세포배양, F : 100배 희석한 난황 항체와 함께 세포배양).
도 5는 본 발명의 서열 번호 1의 염기서열을 갖는 재조합 단백질을 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 재조합 단백질의 구체적인 아미노산 서열을 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명은 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기(epitope)를 포함하는 재조합 단백질에 관한 것이다. 시그마 C 단백질은 세포 수용체 결합 부위를 포함하고 있으며 조류 레오바이러스의 감염과 병원성에 주역할을 하는 단백질로 알려져 있다.

본 발명에서 용어 “항원 결정기(epitope)"란 바이러스 및 세균 등의 항원에 항체가 결합하는 부위를 의미한다. 일반적으로 항원 결정기는 폴리펩타이드 단편들로 이루어져 있다.

또한, 본 발명의 가금 레오바이러스는 국내 가금 레오바이러스 감염 육계로부터 분리한 레오바이러스이고, ATCC에서 VR-826의 상품명으로 상업적으로 입수 가능하다.

본 발명의 재조합 단백질은

⒜ 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기(epitope)를 포함하는 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를, 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에, 삽입시키는 단계;

⒝ 상기 ⒜단계로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질 전환시키는 단계;

⒞ 상기 ⒝단계로부터 생성된 형질 전환체를 배양시키는 단계; 및

⒟ 상기 ⒞단계로부터 얻어진 배양물로부터 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기(epitope)를 포함하는 재조합 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 거쳐서 제조할 수 있다.

상기 유전자 재조합 기술로 본 발명의 재조합 단백질을 제조하기 위해서는 상기 재조합 단백질을 코딩하는 유전자가 요구된다. 상기 유전자는 가금 레오바이러스의 viral RNA를 주형으로 목적한 재조합 단백질을 코딩하는 유전자의 양 말단에 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하여 RT-PCR을 실시함으로써 제조할 수 있다. 본 발명에서는 서열 번호 1의 염기서열로 상기 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 명명하였다. 상기 서열 번호 1의 유전자의 염기서열은 994bp로 양쪽에 붙여준 enzyme을 제외한 시그마 C만의 염기서열 정보를 나타낸다.

본 발명의 일 구현예에서는 상기 RT-PCR은 RT-PCR primix (Solgent Co.)에 바이러스의 RNA 주형, 포워드 프라이머 (TAT GGATCC CTT GGG ATG GCG GGT CTC: 서열번호 3), 리버스 프라이머 (GTA AAG CTT CAC ACC TTA GGT GTC GAT GC: 서열번호 4)를 사용하여 실시 하였다.

본 발명의 재조합 단백질을 코딩하는 유전자는 상기 (a) 단계에 따라 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기(epitope)를 포함하는 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를, 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에, 삽입시키는 단계를 포함한다.

여기서, "발현 벡터"는 외래 유전자를 숙주 세포로 도입하고 발현시킬 수 있는 DNA 분자를 의미하는 것으로서, 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 특정한 숙주 세포에서 외래 유전자의 발현을 효과적으로 유도하는 다양한 발현 벡터가 상업적으로 입수 가능한데, 본 발명에서는 예를 들면 pUC19, pQE30, pGEX, pET21 등을 이용할 수 있으며, pQE-30을 이용하는 것이 바람직하다. pQE30 벡터는 His-tag이 결합된 단백질의 발현, 정제, 검출 및 분석을 위한 벡터로서, 대장균 발현 시스템에서 높은 수준의 발현을 할 수 있는 장점을 가지고 있다. pQE30 벡터를 사용하여 단백질 발현을 실시할 경우, N-terminal에 위치하는 6xHis tag 유전자를 이용하게 된다. 일반적으로 GST 또는 His-tag 유전자를 단백질 발현에 사용하는데 GST는 분자량이 크며 강한 전하를 가지기 때문에 실험에 주는 영향이 큰 반면, His-tag은 분자량이 작기 때문에 입체장해 등의 영향을 받기 어려운 장점이 있으며 항원 제작에도 사용할 수 있다. pQE30 벡터에는 단백질 발현에 최적화된 T5 promoter(촉진유전자)와 operator (작동유전자)가 있다. 또한, 2개의 강력한 terminator(전사종결유전자)가 있어서 read-through transcription(전사 번역 초과)를 막을 수 있도록 제작되었으며, 발현 산물의 안정성에도 중요한 역할을 한다. pQE30 벡터에 존재하는 βlactamase gene(bla)는 항생제인 암피실린에 내성이 있기 때문에 배양시 암피실린을 이용하여 pQE30 벡터만을 선별해낼 수 있다.

이러한 발현 벡터의 조절 서열에 본 발명의 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 작동가능하게 연결시켜 수득한 DNA 분자를 "재조합 발현 벡터"라고 한다.

이렇게 제조한 발현 벡터는 상기 ⒝단계에 따라 숙주 세포로 형질 전환시킨다. 본 발명의 숙주 세포는 원핵 생물 또는 진핵 생물 세포일 수 있다. DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들을 사용할 수 있으며, 대장균을 사용하는 것이 바람직하다.

숙주 세포로 형질 전환하는 방법은 통상의 형질 전환 방법, 예를 들면 양이온 지질-매개 형질전환(cationic lipid-mediated transfection), 전기천공(electroporation), DEAE-덱스트란 매개 형질전환(DEAE-dextran mediated transfection), 칼슘 포스페이트 형질전환(calcium phosphate transfection)을 사용할 수 있다. 당업계에 공지된 바를 참조하여 숙주 세포 및 발현 벡터 등의 종류에 따라 또 다른 최적의 형질전환 방법을 도입할 수도 있다.

형질 전환된 숙주 세포들은 상기 (c) 단계에 따라 본 발명에 따른 재조합 단백질의 생산에 적합한 영양 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포들은 적합한 배지와 재조합 단백질의 발현 및/또는 분리를 용이하게 하는 조건 하에 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 또는 대규모 발효, 셰이크 플라스크 배양에 의해 배양될 수 있다. 배양은 공지 기술을 사용하여 탄소, 질소 공급원 및 무기염을 포함하는 적합한 영양 배지에서 수행한다. 이러한 적합한 배지는 상업적으로 입수하거나 문헌(예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그)에 공지된 바에 따라 제조할 수도 있다.

형질 전환된 숙주 세포에서 생산된 재조합 단백질은 상기 (d) 단계에 따라 통상의 단백질 분리방법을 이용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질은 이에 제한되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 방법에 따라 배양물로부터 분리될 수 있다. 추가로 재조합 단백질은 크로마토그래피(예, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용해도(예, 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 공지된 방법을 통해서 정제될 수 있다.

상기 유전자를 이용하여 제조된 본 발명의 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기(epitope)를 포함하는 재조합 단백질은 서열번호 2번으로 명명하였다.

또한, 본 발명의 재조합 단백질에 대한 항체, 특히 난황 항체를 제공 할 수 있다.

난황 항체는 닭과 같은 조류의 난황 내에 축적된 면역물질 중에서 면역글로블린 G(IgG)를 난황 항체(Immunoglobulin of egg yolk; IgY)라 한다(Kim 등, 1999; Shin 등, 2003). 이러한 난황 항체는 사람이나 가축에 있어서 각종 질병의 예방 및 치료, 그리고 진단을 위하여 사용되어 왔는데, 그 원리는 질병의 원인체로부터 분리된 항원을 산란계에 면역함으로서 산란된 계란의 난황 내에 충분한 역가의 난황 항체가 축적되고 이것을 급여하여 수동 면역을 유도하거나 이 항체를 이용하여 진단에 이용하는 것이다. 난황 항체는 다클론성(polyclonal) 항체이나 산란계에 면역함으로서 병원체의 숙주 특이성이 포유류와 많이 다르기 때문에 단클론성(monoclonal)항체와 같이 항원 특이성 매우 높고 생산성은 매우 높고 생산단가는 매우 저렴한 장점을 가지고 있다.

본 발명은 서열번호 2번으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기(epitope)를 인식하는 항체를 제공할 수 있다. 더욱 상세하게는, 본 발명의 재조합 단백질을 항원으로 하여 가금 레오바이러스에 특이적인 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 제조할 수 있다. 폴리클로날 항체는 일반적으로 포유동물을 적절한 양의 항원으로 1회 이상의 회수로 면역화시키고 항체의 역가가 일정 수치에 이르렀을 때, 상기 포유동물의 항혈청으로부터 회수하여, 원하는 경우 공지된 공정을 이용하여 정제하고, 사용시까지 냉동 완충된 용액에 저장할 수 있다. 한편, 모노클로날 항체는 포유동물에 항원을 주입하여 생긴 B 림프구를 분리해서 마이엘로마 세포와 융합하여 하이브리도마 세포를 만들고 이를 배양하여 항체를 제조할 수 있다. 이러한 공정의 상세한 사항들은 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명의 난황 항체의 경우,

(a) 상기 재조합 단백질을 산란계에 투여하여 면역화시키는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계를 통해 면역화된 산란계로부터 산란된 알을 회수한 후, 회수된 알의 난황으로부터 재조합 단백질에 대한 난황 항체를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 가금 레오바이러스에 대한 항체 제조 방법 거쳐 제조할 수 있다.

본 발명에 이용되는 산란계는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 산란율이 높은 백색 레그혼계, 로드아일랜드계, 하이라인 브라운계 등을 이용하는 것이 바람직하다. 산란계에 항원을 투여하는 경로로는 복 멤브레인내, 근육내, 안내 또는 피하 주사 등이 포함된다. 본 발명의 항원, 즉 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질은 보조제, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 사용하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.

추가 항원 접종(booster)은 충분한 항체가 얻어질 때까지 실시할 수 있다. 바람직하게는 약 2주 간격으로 약 3회 면역을 실시하고, 필요할 경우에는 6 내지 10주 간격으로 실시한다. 면역화된 산란계로부터 알을 수집하고 이로부터 목적하는 항체를 분리한 후 유도된 항체의 양을 측정하여 그 증가량이 정체 상태에 도달하면, 최종적으로 알을 회수한다.

상기 유도된 항체의 양은 당업계의 통상적인 방법에 따라 측정할 수 있다. 바람직하게는, 효소 면역 흡착법 또는 마이크로 타이터법으로 측정한다. 더욱 바람직하게는, 마이크로 플레이트에 부착된 본 발명의 항원(가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질)과 본 발명에 따라 면역화된 알의 난황으로부터 분리한 항체를 반응시킨 후 2차 항체를 반응시키고 여기에 기질용액을 가하여 효소 작용에 의한 발색 반응을 일으킨 후 특정한 파장에서 측정함으로써 유도된 항체를 정량할 수 있는 방법인 효소 결합된 면역흡착 검사법 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay: ELISA)을 사용할 수 있다.

본 발명의 난황 항체는 상기 회수된 알에서 난황을 분리하고, 이를 증류수로 희석한 다음, 희석액의 pH를 4.0 내지 6.0으로 조절한 후 동결시키고, 동결체를 해동시켜 원심분리하며, 형성된 상등액을 여과함으로써 분리할 수 있다. 바람직하게는 회수된 알에서 난황을 분리하고 증류수를 가하여 10배로 희석한 다음, 희석액의 pH를 약 5.0으로 조절한 후 -30℃ 내지 -10℃에서 10 내지 20시간 이상 동결시키고, 동결체를 실온에서 해동시켜 5,000 내지 15,000×g, 1℃ 내지 10℃에서 20 내지 40분간 원심분리하며, 형성된 상등액을 여과지로 여과하여 분리한다.

이상, 본 발명의 재조합 단백질 및 이에 대한 항체는 모두 가금 레오바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는데 이용될 수 있다. 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질은 능동 면역을 통하여, 이에 대한 항체는 수동 면역을 통하여 가금 레오바이러스 감염증을 치료 또는 예방할 수 있다. 능동 면역은 병원체가 침입하였을 때 생체 스스로가 자기 몸속에 항체가 생성되게 하여 면역되는 것을 의미하고, 수동 면역은 다른 생체에서 생성된 면역체를 자신의 체내에 받아들임으로써 얻어진 면역을 의미한다.

상기의 방법으로 제조된 가금 레오바이러스 감염증을 치료 또는 예방할 수 있는 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질 또는 이에 대한 항체는 백신 조성물 또는 약제학적 조성물의 유효 성분으로 이용될 수 있다. 이러한 경우 유효 성분은 단독으로 이용되기 보다는 약제학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 이용하는 것이 적합하다.

여기서, 약제학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 백신 조성물과 약제학적 조성물에 이용할 수 있는 약제학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 포함 할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물 또는 약제학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화 할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비-수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

특히, 액상 제제의 경우에는 박테리아 포획 필터 등을 통한 여과에 의해 살균제 등을 혼입시켜 살균하는 것이 바람직하다. 이렇게 살균된 조성물은 예를 들면 동결건조에 의해 고형화시킬 수 있으며, 사용시에 이를 무균수 또는 무균 희석액에 용해시킨다.

본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약제학적 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 개, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약제학적 조성물의 투여량은 동물의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 동물에 면역보호반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 재조합 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물 또는 약제학적 조성물의 일일 투여량은 본 발명의 재조합 단백질 또는 항체의 면역원량의 멸균용액 ㎖ 당 0.1 내지 1000㎍의 단백질, 바람직하게는 0.1내지 100㎍ 일 수 있다. 백신 조성물의 경우에는 필요에 따라 초기 용량에 이어 임의로 반복된 항원자극을 수행할 수 있다.

또한, 본 발명의 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기(epitope)를 인식하는 항체를 통상의 사료와 혼합하여 가금 레오바이러스의 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 사료 조성물로 제조할 수도 있다.

사료로는 돼지고기, 소고기 및 닭고기 등의 부산물을 비롯하여 옥수수, 쌀, 일반 볏짚, 야초, 목초, 앤시리지, 건초, 산야초 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가축의 사육에 사용되는 사료이면 무방하다. 이러한 사료에 본 발명의 재조합 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질에 대한 항체를 첨가하여 배합하는 방법으로는 기계적 혼합, 흡착, 흡장 등의 방법이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 재조합 단백질 또는 이에 대한 항체를 포함하는 백신 조성물 또는 약제학적 조성물은 인간을 제외한 동물에 투여함으로써 가금 레오바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법에 이용될 수 있다. 재조합 단백질은 능동 면역을 통하여, 재조합 단백질에 대한 항체는 수동 면역을 통하여 가금 레오바이러스 감염증을 치료 또는 예방할 수 있다.

이하, 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 가금 레오바이러스 균주의 확보 및 유전자 재조합

1-1: 가금 레오바이러스 균주의 확보

충청남도 아산시에 위치한 육계 농장의 증체 불량, 관절염의 임상 증상을 나타낸 22주령 육계(품종:Ross)를 부검하여 장기를 채취하였고, 레오바이러스 분리를 위해 -70℃에 보관하며 실험에 이용하였다. 10%의 fetal bovine serum(Gibco Co., USA) 및 1% penicillin-streptomycin(Gibco Co., USA)을 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle medium [DMEM(Gibco Co., USA)]에 baby hamster kidney (BHK-21) cell을 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 배양된 BHK-21 cell에 가금 레오바이러스 Type-1(ATCC Number: VR-826)을 감염시켰다. 37℃, 5% CO₂ incubator에서 가금 레오바이러스에 감염된 BHK-21 cell이 약 80% CPE가 일어날 때까지 약 1-3일간 배양하였다. 이 배양액을 -70℃에 보관하며 control로 사용하였다.

1-2 : 가금 레오바이러스의 RNA 추출

Total RNA Extraction kit(Intron Co.)를 사용하여 RNA를 추출하였다. 시료 20mg에 350㎕의 L-buffer를 첨가하여 균질화하고 충분한 vortexing 후 실온에 10분간 정치시켰다. 350㎕의 Binding Buffer를 첨가한 후, 다시 15초 간 충분히 vortexing하였다. 원심분리기로 13,000rpm 4℃에서 3분 동안 원심분리 하여 상층액을 새 tube에 옮겨 담은 뒤, 350ul의 70% ethanol과 inverting하여 섞었다. Cell lysate를 column에 옮겨 13,000rpm에서 30초 동안 원심분리하여 분리된 용액은 버린 후, 700㎕의 Washing Buffer A를 첨가하였다. 원심분리기로 13,000rpm 30초 동안 원심분리 후, 분리된 용액은 버렸다. 700㎕의 Washing Buffer B를 첨가한 후, 13,000rpm 30초간 원심분리 후, 새로운 tube에 옮겨주었다. 마지막으로 20㎕의 Elution Buffer 첨가 후, 실온에서 10분 간 방치하였다. 13,000rpm 1분 간 원심 분리하여 얻은 RNA는 -20℃에서 냉동 보관하며 사용하였다.

1-3: 가금 레오바이러스의 시그마 C 단백질을 코딩하는 유전자의 재조합

가금 레오바이러스의 시그마 C 단백질을 코딩하는 유전자는 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하는 RT-PCR을 통하여 제조하였는데, 상기 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 유전자에 특이적인 프라이머는 GenBank의 데이터를 기초로 하여 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질 유전자(1,010bp)를 증폭할 수 있도록 제작하였다. 상기 RT-PCR은 RT-PCR primix (Solgent Co.)에 바이러스의 RNA 주형 3㎕, 포워드 프라이머 (TAT GGATCC CTT GGG ATG GCG GGT CTC) 1㎕, 리버스 프라이머 (GTA AAG CTT CAC ACC TTA GGT GTC GAT GC) 1㎕을 첨가한 뒤, DEPC-treated water로 총 부피를 30μl로 맞추어 주었다. Reovirus의 핵산 검출을 위한 RT-PCR 반응조건은 94℃ 15분의 역전사 반응 과정을 거쳐 94℃ 1분, 65℃ 1분, 72℃ 1분 30초의 과정을 35회 반복하였다. 최종합성 단계로 72℃에서 7분간 반응시켜 유전자 산물을 증폭하였다. RT-PCR 과정은 PCR 증폭기(Pro-DNi TC-25)에서 수행하였다. 이렇게 증폭된 RT-PCR 산물은 1% 아가로스 겔(SeaKem LE agarose, BMA. USA) 상에서 100V로 30분간 전기영동 (RunOne Electrophoresis Cell, Embi Tec. USA)한 후 에티듐 브로마이드로 염색하여 밴드를 확인하였다.

도 1a에 나타낸 바와 같이 상기 RT-PCR을 통하여 수득한 산물은 1,010bp의 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질을 코딩하는 유전자를 확인할 수 있었다 (레인 1 : 100bp DNA 마커, 레인 2 : RT-PCR 산물). 도 1a에서 진한 글씨체는 제한효소 인식 부위를 나타내었다.

확보된 RT-PCR 산물을 도 1b에 나타낸 바와 같이 T&A plasmid vector (RBC Co, Taiwan)에 클로닝하여 GenBank의 데이터베이스를 기초로 하여 염기서열을 확인하였고, 분석된 염기서열의 상동성을 미국 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에서 제공하는 BLAST 프로그램으로 비교하였다. 그 결과 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질 유전자와 68%의 유사성을 나타내었다. 상기 실시예 1의 결과로부터, 가금 레오바이러스는 변이가 다양한 바이러스로서, 국내 육계 농장으로부터 취득한 레오바이러스를 이용하였기 때문에 국내에 적합한 예방 및 치료제 개발에 사용할 수 있을 것으로 판단하게 되었다.

실시예 2: 발현 벡터 구축과 단백질 발현 및 확인

2-1: 발현 벡터의 구축

상기의 방법으로 재조합 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 유전자에 대한 양성 클론을 선발한 후 플라스미드를 제한효소 BamHI 과 HindⅢ으로 절단하여 1,010 bp의 DNA 단편을 수득한 후 이 단편과 상기 제한효소로 절단하여 준비한 발현 벡터 pQE-30을 라이게이션하였다. 이를 E. coli 컴페턴트 세포 Dh5α에 형질전환시켜 블루/화이트 콜로니를 스크리닝하였고 이 중 화이트 콜로니를 선별하여 다시 M15(pREP-4)에 형질전환시킨 뒤 양성 클론을 선택하였다 (도 2a 참조).

그로부터 발현 벡터를 분리한 후 제한효소 BamHI으로 절단하여 아가로스 겔을 이용하여 전기 영동해 본 결과 도 2b에 나타낸 바와 같이 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질을 코딩하는 유전자가 확인되었다 (레인 1 : 1kb DNA 마커, 레인 2 : pQE-30/가금 레오바이러스 시그마 C).

2-2 : 대장균을 이용한 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질의 발현 및 분리

상기에서 얻어진 양성 클론을 취하여 100㎍ 암피실린이 첨가된 5㎖의 LB broth(Duchefa co. Netherland)에 접종한 후 37℃, 200rpm에서 12 내지 16시간 동안 진탕 배양하였다. 상기 배양된 세포를 100㎍ 암피실린이 첨가된 100㎖의 LB broth에 접종하여 37℃, 200rpm으로 흡광도(OD600)가 0.5 내지 0.6이 될 때까지 배양하였다. 흡광도(OD600)가 0.5 내지 0.6이 되면 0.5 mM의 IPTG(isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside, DUCHEFA Co. Netherland)를 첨가한 후 4시간 동안 배양하였다. 원심분리기를 이용하여 균주를 회수한 다음 용해 완충액 (50mM Tris-HCl and 0.5M NaCl, pH8.0)으로 재부유시킨 후 1% Triton X-100과 40㎍/㎖의 phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)를 첨가하여 20분간 실온에서 반응하였다. 100㎍/㎖의 lysozyme을 첨가한 후, 1시간동안 Icing하였다. 이 cell을 액체질소로 급속 동결시킨 다음 37℃ water bath에서 녹이는 과정을 3번 반복하였다. 이를 4℃ 10,000g 조건으로 10분간 원심분리하여 상층액과 침전물을 회수하였다. 침전물에 Washing buffer A(0.01M Tris-HCl, 0.1M sodium phosphate buffer, 2M Urea, pH 8.0) 50ml을 첨가하여 실온에서 30분간 반응한 후, 10,000g에서 10분간 원심분리하는 과정을 3회 반복하였다. 침전물에 Denaturation buffer(0.01M Tris-HCl, 0.1M sodium phosphate buffer, 8M Urea, pH 8.0) 50ml을 처리하고 1시간 동안 Icing을 하였으며 4℃ 10,000g 조건으로 30분간 원심분리하여 상층액을 회수하여 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질을 수득하였다.

2-3 : 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질의 분석

앞서 수득한 단백질이 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질인지 여부는 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 여기서, SDS-폴리아크릴아미드 겔은 두 장을 동시에 만들어 사용하였고, 단백질 역시 동일한 1.5㎖ 튜브에서 조작한 단백질을 절반씩 나누어 SDS-폴리아크릴아미드 겔 두 장에 각각 로딩하고 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 후한 장은 쿠사미 블루 R-250(시그마 Co. USA)으로 염색하여 육안으로 단백질의 양상을 보았고, 다른 한 장은 나일론 멤브레인(Amersham Pharmacia Biosciences, UK)에 블로팅시킨 후 5% skim milk/TBS-T로 4℃에서 16시간 블로팅시켰다. 이어서, 멤브레인을 TBST (100mM Tris-Cl pH7.5, 0.9% NaCl, 0.1% Tween 20)로 4회 세정하고, 1차 항체인 monoclonal rabbit anti-His-Tag antibody (1:2,000)(KOMA biotech, Korea)를 반응시킨 후 TBS-T로 4회 세정하였다. 2차 항체로 AP-conjugated goat anti-rabbit IgG (1:10,000) (시그마-Aldrich)를 반응시킨 후 4회 세정한 다음 BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate, Amersham Pharmacia Bioscience, UK)와 NBT(Nitro blue tetrazolium, Amersham PharmaciaBioscience, UK)로 발색반응을 유도하였다. 도 2c에 나타낸 바와 같이 레인 2-6에서 26 kDa 크기의 단백질이 검출됨을 확인할 수 있었다 (레인 1 : 단백질 분자량 마커, 레인 2 : 가금 레오바이러스 시그마 C를 재조합시키지 않은 벡터, 3~6: 재조합 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질). 이는 대장균에서 발현시킨 단백질이 항-His-Tag 항혈청과 특이적으로 반응하여 나타난 결과이고, 이로써 대장균에서 유도되어 발현된 단백질은 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질 임이 확인되었다.

2-4 : 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질의 정제 및 단백질의 농도 분석

실시예2-2에서 수득한 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질을 원심분리에 의해 Soluble fraction인 상청액과 insoluble fraction (inclusion body)을 포함하는 침전물로 분리하였다. 침전물은 washing buffer (0.01M TrisHCl, 0.1M sodium phosphate buffer, and 2M urea, pH 8)로 세척하여 실온에서 30분간 방치한 뒤, 10,000xg에서 10분간 원심분리하는 과정을 세 번 반복하였다. 정제된 침전물은 denaturation buffer(0.01M TrisHCl, 0.1M sodium phosphate buffer, and 8M urea, pH 8)로 부유시켜 얼음에서 1시간 동안 방치한 뒤, 16,000xg에서 30분간 원심분리하였고 상청액을 4°C에 보관하였다. 이 상청액은 dialysis tubing(시그마, Korea)과 1X phosphate-buffered saline (PBS) 2L를 이용하여 실온에서 12시간 동안 투석하였으며, 새 buffer로 교체한 뒤 4시간 더 투석을 실시하였다. 또한, BCA(Bicinochoninicacid) Kit (Pierce Co.)를 사용하여 상기에서 획득한 정제된 재조합 단백질의 농도를 확인하였다.

실시예 3 : 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질의 면역원성 조사

3-1 : 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질에 대한 항혈청 및 난황 항체의 생산

상기 실험에서 획득한 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질에 대한 항체 생산을 위해 46주령의 하이라인 브라운계 산란계에 면역을 수행하였다. 산란계의 사육 및 사양 관리는 단국대학교 실험 연구동에서 수행하였으며, 정제된 재조합 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질과 프라운즈 컴플리트 보조제(시그마 Chemical Co.)를 각각 동량 혼합하여 유화하였다. 상기 유화액 1㎖를 산란계의 흉근에 0.25㎖씩 4곳에 근육주사 하였으며, 추가 접종은 1차 접종 후 2주 간격으로 프라운즈 인컴플리트 보조제 (Gibco Co. USA)로 유화하여 1차 접종과 동일한 방법으로 총 6회 실시하였다. 각 접종 전에 산란계의 익하 정맥에서 채혈하여 혈청을 분리하고 이를 -20℃에 저장하였고 난은 매일 회수하여 8℃의 저온실에 저장하여 분석에 이용하였다.

3-2 : 산란계의 혈청과 난황으로부터 항체가의 확인

분리한 항혈청과 난황으로부터 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질에 대한 항체가를 분석하기 위해 ELISA를 실시하였다. 재조합 단백질을 5㎍/㎖가 되도록 카르보네이트-비카르보네이트 완충용액 (pH 9.6)으로 희석하여 Microtest Ⅲ flexible assay plate (Falcon 3911, BD Biosciences, USA)의 각 구에 100㎕씩 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 코팅막을 세정용 완충용액 (PBST, 0.02M NaH₂PO₄, 0.13M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.2)으로 3회 세정한 후 5% skim milk (pH 7.3)/PBS를 각 구에 175㎕씩 분주한 후 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이어서, PBS-T로 5회 세정하고 5% skim milk/PBS와 세정용 완충용액(PBS-T, phosphate buffered saline-Tween 20)을 동량으로 섞은 희석 완충용액을 이용하여 수득한 항혈청과 난황을 각각 2,000배 희석하여 3배씩 연속적으로 희석한 후, 상기 재조합 단백질이 코팅된 구에 분주하여 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 한편, 2차 항체로는 알칼리성 포스파타제 콘주게이티드 래비트 항-치킨 IgG(Jackson Immuno Research Laboratories Inc. USA)를 5,000배로 희석하여 37℃에서 1시간 30분 동안 상기 플레이트의 구에 분주하여 반응시켰다. 기질 완충용액으로는 인산 기질 타블렛(ρ-nitrophenyl phosphate, PIERCE Co. USA)을 0.5mM MgCl₂가 포함된 10% 디에탄올아민(pH 9.8)에 용해시킨 용액을 사용하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더기(EL-800, BIO-TEK Instrument Inc. USA)를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하여 반응을 조사하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이 항체가는 면역 후 2주부터 꾸준하게 항체가가 상승하다가 10주에 최고의 항체가를 나타내었다(혈청 내 항체가 302,000, 난황 내 항체가 약 355,000). 그 후부터는 항체가가 감소하는 경향을 보여주었다. 이와 같은 현상은 면역 직후부터 2주경까지 혈중에 형성된 항체가 3주경부터 난황으로 이전되어 축적됨으로써 나타나는 현상으로 추정되었다.

3-3 : 난황 항체의 분리

면역 접종한 산란계로부터 수득한 알을 채집하여 김 등(1998, 석사학위논문, 단국대학교)의 방법에 의해 난황 단백부분을 분리하였다. 먼저, 채집된 알에서 난황만을 분리하여 증류수로 10배 희석하고, 희석된 난황용액을 pH 5.0으로 조절한 후 -20℃에서 2일 동안 동결하였다. 동결된 난황을 실온에서 해동시킨 후 30분 동안 4℃에서 10,000×g로 원심분리하여 상등액을 수거하였다. 상기 상등액을 여과하여 수용성 분획(WSF)을 분리하여 동결 건조한 후 보관하였다.

실시예 4 : 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 인식하는 난황 항체를 이용한 중화 테스트

앞서 생산된 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기를 인식하는 난황 항체가 가금 레오바이러스에 대하여 중화 효과를 발휘하는지 알아보기 위해 reovirus의 cell line인 BHK-21을 이용하여 중화 테스트를 실시하였다. BHK-21을 6-well plate에 약 70% 정도 자라도록 배양한 뒤, well-1은 배지 1,400㎕를 넣어 negative로 사용하였고, 난황 항체가 cell의 일반적인 성장에 영향을 끼치지 않는 것을 확인하기 위해 well-2에는 배지와 난황 항체를 각각 700㎕씩 넣어 배양하였다. well-3에는 배지와 reovirus를 700㎕씩 넣어 positive로 사용하였고, well-4는 Vrius와 난황 항체를 각각 700㎕씩 넣어 난황 항체의 virus 중화 능력을 관찰하였다. well-5는 Virus 700㎕와 10배 희석한 난황 항체 700㎕를 넣었으며, well-6은 Virus 700㎕와 100배 희석한 난황 항체 700㎕를 넣었다. 그 후, 37℃ CO₂ incubator에서 48 시간 동안 배양하며 cell을 관찰하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 바이러스만 감염시킨 well-3과 비교해 보았을 때, 바이러스와 난황 항체(희석하지 않은 origin)를 함께 배양한 well-4는 cell이 덜 사멸한 것을 확인할 수 있었다(A : 세포배양, B : 난황 항체와 함께 세포배양, C : 가금 레오바이러스와 함께 세포배양, D : 가금 레오바이러스, 난황 항체와 함께 세포배양, E : 가금 레오바이러스, 10배 희석한 난황항체와 함께 세포배양, F : 100배 희석한 난황 항체와 함께 세포배양).

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> Recombinant Protein Comprising Epitope of Avian reovirus sigma C Protein and Antibody thereto <130> P2013106 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 994 <212> DNA <213> Avian reovirus sigma C gene <400> 1 cttgggatgg cgggtctcac tcagtcgcaa cgaagagagg tcgtggggtt gatactctca 60 ttgacttcga acgcgattat aaatcctggc gatttaatcc aactgcgtga gcgtgtatcg 120 gcactagaat ctgccaatgc gctgttgaat gggactgtta agggcgtatt agatcagttg 180 gtggatttgt cacaaaagtt aagtaatgca gcggaagccg tggttgaaat acggagagag 240 ttggactccc taaccgctag cgtccgaact atccaatcct ctttgggatc gcttacagat 300 agtgtgtcgg atctttccgg ccgagtaact actaacacct cttcaatcac aagtctgacg 360 agtagggtgg acggtctcac ggttgatgtg gctaatctta aacgtgacgt gtcaaatcag 420 ggtcttcaag ttagtagtct cgcacagcgt gtaactagtt tagaatctgg cgctggatct 480 gtccatacat ttgctgcccc ccttaaattg gatagcggga tcgtgtcact cgacctagac 540 ccctactttt gttctgtgga tcacaacctt acgtcatatt ccgcgagtgc gcagctcatg 600 aatttccagt ggttcgtgcg cggtgaggga ggatcgtctg actcaattga catgagcgtg 660 actgctcata gtcatggccc gcggacagac tatatgatgt cgactactca atcgttgact 720 gtcactggaa attctgttac cctagatctt tgatctcgac gctctcgttt ccccaccctc 780 tgactattct cgactgattc cgtgtcatgg tttccaacag gcgacgtttc cggtggatct 840 ttcctttaag cgagatgacg tcacgtattc ataccaggtg tatggctcgt acacaactcc 900 acgcgttttc aggataactt tctctcctgg caattcagtg cctgcggtca tacgtttcat 960 aaccgtgcgt acgggcatcg acacctaagg tgtg 994 <210> 2 <211> 250 <212> PRT <213> Avian reovirus sigma C Protein <400> 2 Leu Gly Met Ala Gly Leu Thr Gln Ser Gln Arg Arg Glu Val Val Gly 1 5 10 15 Leu Ile Leu Ser Leu Thr Ser Asn Ala Ile Ile Asn Pro Gly Asp Leu 20 25 30 Ile Gln Leu Arg Glu Arg Val Ser Ala Leu Glu Ser Ala Asn Ala Leu 35 40 45 Leu Asn Gly Thr Val Lys Gly Val Leu Asp Gln Leu Val Asp Leu Ser 50 55 60 Gln Lys Leu Ser Asn Ala Ala Glu Ala Val Val Glu Ile Arg Arg Glu 65 70 75 80 Leu Asp Ser Leu Thr Ala Ser Val Arg Thr Ile Gln Ser Ser Leu Gly 85 90 95 Ser Leu Thr Asp Ser Val Ser Asp Leu Ser Gly Arg Val Thr Thr Asn 100 105 110 Thr Ser Ser Ile Thr Ser Leu Thr Ser Arg Val Asp Gly Leu Thr Val 115 120 125 Asp Val Ala Asn Leu Lys Arg Asp Val Ser Asn Gln Gly Leu Gln Val 130 135 140 Ser Ser Leu Ala Gln Arg Val Thr Ser Leu Glu Ser Gly Ala Gly Ser 145 150 155 160 Val His Thr Phe Ala Ala Pro Leu Lys Leu Asp Ser Gly Ile Val Ser 165 170 175 Leu Asp Leu Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Val Asp His Asn Leu Thr Ser 180 185 190 Tyr Ser Ala Ser Ala Gln Leu Met Asn Phe Gln Trp Phe Val Arg Gly 195 200 205 Glu Gly Gly Ser Ser Asp Ser Ile Asp Met Ser Val Thr Ala His Ser 210 215 220 His Gly Pro Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Thr Thr Gln Ser Leu Thr 225 230 235 240 Val Thr Gly Asn Ser Val Thr Leu Asp Leu 245 250 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PCR <400> 3 tatggatccc ttgggatggc gggtctc 27 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for PCR <400> 4 gtaaagcttc acaccttagg tgtcgatgc 29

Claims

가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기(epitope)를 포함하며,
상기 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기는 서열번호 2번의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
삭제
청구항 1의 재조합 단백질을 코딩하는 유전자.
청구항 3항의 유전자를 포함하는 발현 벡터.
청구항 4에 있어서, 상기 발현 벡터가 하기 도 2a의 개열 지도를 갖는 pQE-30임을 특징으로 하는 발현 벡터.
[도 2a]
청구항 4 또는 청구항 5의 발현 벡터로 형질 전환되는 숙주 세포.
청구항 6에 있어서, 상기 숙주 세포가 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균 및 효모로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
⒜ 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기(epitope)를 포함하는 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를, 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에, 삽입시키는 단계;
⒝ 상기 ⒜단계로부터 형성된 발현 벡터로 숙주세포를 형질 전환시키는 단계;
⒞ 상기 ⒝단계로부터 생성된 형질 전환체를 배양시키는 단계; 및
⒟ 상기 ⒞단계로부터 얻어진 배양물로부터 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기(epitope)를 포함하는 재조합 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하며,
상기 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기는 서열번호 2번으로 이루어진 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 재조합 단백질의 제조 방법.
서열번호 2번의 아미노산 서열로 이루어진 가금 레오바이러스 시그마 C 단백질의 항원 결정기(epitope)를 인식하는 항체.
(a) 청구항 1의 재조합 단백질을 산란계에 투여하여 면역화시키는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계를 통해 면역화된 산란계로부터 산란된 알을 회수한 후, 회수된 알의 난황으로부터 재조합 단백질에 대한 난황 항체를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 가금 레오바이러스에 대한 항체 제조 방법.
청구항 1의 재조합 단백질을 유효 성분으로 포함하는 가금 레오바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 백신 조성물.
청구항 9의 항체를 유효 성분으로 포함하는 가금 레오바이러스 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물.
청구항 9의 항체를 유효 성분으로 포함하는 가금 레오바이러스 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 사료 조성물.
청구항 11의 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여함으로써 가금 레오바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법.
청구항 12의 약제학적 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여함으로써 가금 레오바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법.