CN107384942A - 一种表达新型鸭呼肠孤病毒s σB重组蛋白的方法 - Google Patents

一种表达新型鸭呼肠孤病毒s σB重组蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种表达新型鸭呼肠孤病毒sσB重组蛋白的方法，包括以下步骤：1)编码σB重组蛋白S3基因序列密码子优化；2)扩增优化后的S3基因序列；3)重组质粒的构建；4)蛋白的诱导表达；5)蛋白纯化。该方法通过优化新型鸭呼肠孤病毒编码σB重组蛋白S3基因片段的密码子，使其在原核表达时能够得到产量高、纯度高的σB重组蛋白。

Description

一种表达新型鸭呼肠孤病毒s σB重组蛋白的方法
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，特别涉及一种表达新型鸭呼肠孤病毒s σB重组蛋白的方法。
背景技术
“新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)”是自2005年在福建、浙江等省突发的新的重大疫病，发病率5％～32.5％，病死率差异较大，为4％～ 20％，鸭日龄愈小，发病率、病死率愈高，该病主要引起肝脏不同程度点/斑块状出血和坏死、脾脏肿大坏死、心脏和法氏囊出血等。NDRV 目前有关其蛋白的研究主要集中在S组基因编码的的核衣壳(σC、σB)蛋白和内衣壳(σA)蛋白。σB蛋白由S3基因编码，为外衣壳的主要组分，研究表明其与鸭呼肠孤病毒(duckreovirus，DRV) 的感染、致病性和免疫保护等方面相关，且携带群特异性中和抗原决定簇，能诱导细胞融合并产生群特异性中和抗体。现行针对NDRV XX 株的σB蛋白进行的原核表达及其多克隆抗体制备方法，其制备的σ B重组蛋白表达形式是融合蛋白(His-σB)，主要以包涵体存在，分子量约为55kU。但外源基因在大肠杆菌中表达时，可能含有大肠杆菌的转录终止信号或稀有密码子影响目的蛋白的正确表达或表达量，尤其是当目的蛋白主要以包涵体存在的时候。
发明内容
本发明旨在分析NDRV XX株基因序列，在不改变其氨基酸序列的前提下，将其中的密码子由大肠杆菌稀有密码子优化成大肠杆菌常用密码子，进而原核表达出NDRV XX株的特异性的σB重组蛋白，期望与传统原核表达相比能得到产量高、纯度高的σB重组蛋白。
本发明所采取的技术方案是：
一种表达新型鸭呼肠孤病毒s σB重组蛋白的方法，包括以下步骤：
1)新型鸭呼肠孤病毒编码σB蛋白的S3基因序列进行密码子优化后得到优化的S3基因序列，将此基因序列编码的σB重组蛋白命名为s σB重组蛋白；
2)扩增所述优化后的S3基因序列，获得扩增产物；
3)用KpnⅠ和SacⅠ酶切所述扩增产物后连接到同一双酶切的原核表达载体pET-32a(+)上，连接产物转化至感受态细胞DH5α，筛选重组质粒并测序；
4)测序正确的重组质粒命名为pET-32a(+)-s σB，转化至感受态细胞BL21，挑阳性单菌落于含Amp的新鲜LB培养基，以28～42℃、 220r/min振荡过夜培养,然后再以1:100的比例取过夜菌液接种到含Amp的新鲜LB培养基，以28～42℃、220r/min振荡培养至OD600为0.6，添加终浓度为0.25～1.5mmol/L的IPTG，培养1～6h；
5)菌体裂解后收集包涵体，纯化后经蛋白复性，获得纯化的s σB重组蛋白。
优化后的S3基因序列如SEQ ID No.1所示。
其中，步骤5)所述菌体裂解是通过超声波裂解，以4℃、12000 r/min离心10min，收集菌体，经PBS洗涤2次后，用原液10％体积的破菌液重悬菌体于冰浴中进行超声波裂解，超声条件：600W，工作3S，间隔5S，持续至菌液变清亮。所述包涵体在纯化前需进一步处理：包涵体用PBS洗涤2次，然后溶解于含8M尿素的PBS溶液，室温静置1h，随后以4℃、12000r/min离心20min，收集上清，先用滤纸粗过滤一遍，再经0.45μm孔径的过滤器过滤，-80℃保存。所述纯化为镍柱亲和层析，层析介质为Ni-NTA，以10倍预装柱体积上样缓冲液平衡预装柱后上样，包涵体溶液在4℃下静置30min；再用10倍预装柱体积洗杂缓冲液清洗预装柱；最后分别用含60、100、 200、300mM的咪唑的洗脱缓冲液梯度洗脱预装柱，各浓度洗脱缓冲液为2倍预装柱体积，收集洗脱液，获得纯化的s σB重组蛋白。所述蛋白复性包括步骤：将纯化后的蛋白液分别置于含6M、4M、2M、 0M尿素的TE缓冲液中进行尿素浓度梯度脱盐复性，各浓度梯度透析 1d，隔12h换一次新鲜的TE缓冲液。
进一步，所述破菌液的配方为：20mM Tris-HCl、250mM NaCl， 1mM PMSF，pH7.4。所述上样缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl、250mM NaCl、8M尿素，pH7.4。所述洗杂缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl、 250mM NaCl、8M尿素、20mM咪唑，pH7.4。
本发明的有益效果是：通过优化新型鸭呼肠孤病毒编码σB蛋白 S3基因片段的密码子，使其在原核表达时能够得到产量高、纯度高的s σB重组蛋白。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：诱导时间的优化
将测序正确的重组质粒命名为pET-32a(+)-s σB，转化至感受态细胞BL21，挑阳性单菌落于含Amp的新鲜LB培养基，以32℃、 220r/min振荡过夜培养,然后再以1:100的比例取过夜菌液接种到含Amp的新鲜LB培养基，以37℃、220r/min振荡培养至OD600为 0.6，分别加IPTG至终浓度为1.0mmol/L，然后37℃、220r/min 诱导培养0、1、2、3、4、5和6h，收集菌体，样品处理后经SDS-PAGE 电泳检测蛋白表达情况。电泳结果显示诱导时间最优值为3h。
实施例2：IPTG诱导浓度的优化
操作步骤与实施例1近似，区别点在于诱导时间为3h，IPTG终浓度为0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25和1.5mmol/L，收集菌体，样品处理后经SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。电泳结果显示 IPTG诱导浓度的最优值为0.75mmol/L。
实施例3：诱导温度的优化
操作步骤与实施例1近似，区别点在于诱导时间为3h，IPTG终浓度为0.75mmol/L，分别于28、32、37和42℃下最佳诱导培养时间后，收集菌体，样品处理后经SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。电泳结果显示诱导温度的最优值为32℃。
实施例4：以优化后的S3基因序列原核表达s σB重组蛋白，包括以下步骤：
1)新型鸭呼肠孤病毒编码σB蛋白的S3基因序列进行密码子优化后得到优化的S3基因序列，将此基因序列编码的σB重组蛋白命名为s σB重组蛋白；
2)扩增所述优化后的S3基因序列，获得扩增产物；
3)用KpnⅠ和SacⅠ酶切所述扩增产物后连接到同一双酶切的原核表达载体pET-32a(+)上，连接产物转化至感受态细胞DH5α，筛选重组质粒并测序；
4)测序正确的重组质粒命名为pET-32a(+)-s σB，转化至感受态细胞BL21，挑阳性单菌落于含Amp的新鲜LB培养基，以32℃、 220r/min振荡过夜培养,然后再以1:100的比例取过夜菌液接种到含Amp的新鲜LB培养基，以32℃、220r/min振荡培养至OD600为 0.6，添加终浓度为0.75mmol/L的IPTG，培养3h；
5)所述菌体裂解是通过超声波裂解，以4℃、12000r/min离心10min，收集菌体，经PBS洗涤2次后，用原液10％体积的破菌液 (20mM Tris-HCl(pH7.4),250mM NaCl，1mMPMSF)重悬菌体于冰浴中进行超声波裂解，超声条件：600W，工作3S，间隔5S，持续至菌液变清亮。所述包涵体在纯化前需进一步处理：包涵体用PBS洗涤 2次，然后溶解于含8M尿素的PBS溶液，室温静置1h，随后以4℃、 12000r/min离心20min，收集上清，先用滤纸粗过滤一遍，再经0.45 μm孔径的过滤器过滤，-80℃保存。所述纯化为镍柱亲和层析，层析介质为Ni-NTA，以10倍预装柱体积上样缓冲液(20mM Tris-HCl(pH7.4),250mM NaCl，8M尿素)平衡预装柱后上样，包涵体溶液在4℃下静置30min；再用10倍预装柱体积洗杂缓冲液(20mM Tris-HCl(pH7.4),250mM NaCl，8M尿素，20mM咪唑)清洗预装柱；最后分别用含60、100、200、300mM的咪唑的洗脱缓冲液梯度洗脱预装柱，各浓度洗脱缓冲液为2倍预装柱体积，收集洗脱液，获得纯化的σB重组蛋白。所述蛋白复性包括步骤：将纯化后的蛋白液分别置于含6M、4M、2M、0M尿素的TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA(pH8.0))中进行尿素浓度梯度脱盐复性，各浓度梯度透析1d，隔12h换一次新鲜的TE缓冲液。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
<120> 一种表达新型鸭呼肠孤病毒s σB重组蛋白的方法
<130> 2017
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1116
<212> DNA
<213> 新型鸭呼肠孤病毒
<400> 1
ggtaccatgg aagtgcgtgt tccgaacttc cacagcttta tcgaaggtat taccaccagc 60
tacctgtgca gcccggcgtg ctggaacagc aagaccctgt gggacatcga ggaattccac 120
accccggatg tgattcgtgt tggtaacgcg tattgctgca cccaatgctg cggtgtgctg 180
tactatggtg cgccgccgag cgacggtaac tgctttccgc accacaagtg ccaccagcaa 240
cagtaccgta ccgagacccc gctgatgcgt tatatcaaag ttggccgtac caccgaacaa 300
ctgctggatc agtacgcgat cgcgctgcac gtgattgcgg actactatga tgaagttagc 360
aagcagccgc acgacatcgc ggagaccgaa agcatcgcgc cgttcgatat tgtgacccgt 420
accgaaagca ttcgtagcga ccgtgcggtt gatccggagt tttggaccta cccgctggaa 480
cgtcgtggtt atgacgcgcg tcacgagatc gcgcgtgcgg gttggaaaat gattgatgcg 540
agcctgcgta gccgtaccct gccggaatgc ctggttagca acatgctgca cacccgtcac 600
gttttcagcc aaatgctgac caccaccacc atttacgacg tggcggttac cggcaaggcg 660
gtgaaattta gcccgatggt tgcgaccatg ccgacccgtg gtgatggtgc ggtggcgctg 720
agccgtggta acctggacca cgatgttgag gactgctgga tggatggctt cgcgtttagc 780
ccgttcatcg gtggcgtgga cattaccggc cagttcgaac gtggcagctg ccacaacttt 840
ggccacccga tggttggtag cggcaagaaa gcgagccact atcgtaacct gttcatggag 900
agctggcgtg gttggagcaa gagctgcttt acctgcgcgg cgggtatgga accggcggag 960
tgcgaaagcc gtctgcgtgg tcacgcgcgt accatgttcg gccgtagcct gccggacatc 1020
tgcgattttg aggaaaccac ccacgtgggt caaagcagcg cgccgctgaa gaaagcgacc 1080
aaactgagct ttctggagtg ccgttggtaa gagctc 1116

Claims (10)

1.一种表达新型鸭呼肠孤病毒sσB重组蛋白的方法，包括以下步骤：
1)新型鸭呼肠孤病毒编码σB蛋白的S3基因序列进行密码子优化后得到优化的S3基因序列，将此基因序列编码的σB重组蛋白命名为sσB重组蛋白；
2)扩增所述优化后的S3基因序列，获得扩增产物；
3)用Kpn Ⅰ和Sac Ⅰ酶切所述扩增产物后连接到同一双酶切的原核表达载体pET-32a(+)上，连接产物转化至感受态细胞DH5α，筛选重组质粒并测序；
4)测序正确的重组质粒命名为pET-32a(+)-sσB，转化至感受态细胞BL21，IPTG诱导重组蛋白表达；
5)菌体裂解后收集包涵体，纯化后经蛋白复性，获得纯化的sσB重组蛋白。
2.根据权利要求1所述表达新型鸭呼肠孤病毒sσB重组蛋白的方法，其特征在于，所述优化是将编码σB蛋白的S3基因序列中大肠杆菌稀有密码子替换成大肠杆菌常用密码子，优化后的S3基因序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述表达新型鸭呼肠孤病毒sσB重组蛋白的方法，其特征在于，步骤4)所述IPTG诱导重组蛋白表达具体包括：挑阳性单菌落于含Amp的新鲜LB培养基，以28～42℃、220r/min振荡过夜培养,然后再以1:100的比例取过夜菌液接种到含Amp的新鲜LB培养基，以28～42℃、220r/min振荡培养至OD600为0.6，添加终浓度为0.25～1.5mmol/L的IPTG，培养1～6h。
4.根据权利要求1所述表达新型鸭呼肠孤病毒sσB重组蛋白的方法，其特征在于，步骤5)所述菌体裂解是通过超声波裂解，以4℃、12000r/min离心10min，收集菌体，经PBS洗涤2次后，用原液10％体积的破菌液重悬菌体于冰浴中进行超声波裂解，超声条件：600W，工作3S，间隔5S，持续至菌液变清亮。
5.根据权利要求4所述表达新型鸭呼肠孤病毒sσB重组蛋白的方法，其特征在于，所述破菌液的配方为：20mM Tris-HCl、250mM NaCl，1mM PMSF，pH7.4。
6.根据权利要求1所述表达新型鸭呼肠孤病毒sσB重组蛋白的方法，其特征在于，步骤5)所述包涵体在纯化前需进一步处理：包涵体用PBS洗涤2次，然后溶解于含8M尿素的PBS溶液，室温静置1h，随后以4℃、12000r/min离心20min，收集上清，先用滤纸粗过滤一遍，再经0.45μm孔径的过滤器过滤，-80℃保存。
7.根据权利要求6所述表达新型鸭呼肠孤病毒sσB重组蛋白的方法，其特征在于，步骤5)所述纯化为镍柱亲和层析，层析介质为Ni-NTA，以10倍预装柱体积上样缓冲液平衡预装柱后上样，包涵体溶液在4℃下静置30min；再用10倍预装柱体积洗杂缓冲液清洗预装柱；最后分别用含60、100、200、300mM的咪唑的洗脱缓冲液梯度洗脱预装柱，各浓度洗脱缓冲液为2倍预装柱体积，收集洗脱液，获得纯化的sσB包涵体蛋白。
8.根据权利要求7所述表达新型鸭呼肠孤病毒sσB重组蛋白的方法，其特征在于，所述上样缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl、250mM NaCl、8M尿素，pH7.4。
9.根据权利要求7所述表达新型鸭呼肠孤病毒sσB重组蛋白的方法，其特征在于，所述洗杂缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl、250mM NaCl、8M尿素、20mM咪唑，pH7.4。
10.根据权利要求7所述表达新型鸭呼肠孤病毒sσB重组蛋白的方法，其特征在于，步骤5)所述蛋白复性包括步骤：将纯化后的σB包涵体蛋白分别置于含6M、4M、2M、0M尿素的TE缓冲液中进行尿素浓度梯度脱盐复性，各浓度梯度透析1d，隔12h换一次新鲜的TE缓冲液。
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