CN116083544A - 一种m6A依赖型限制性内切酶、其突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种m6A依赖型限制性内切酶、其突变体及其应用，属于微生物核酸内切酶技术领域。本发明提供了一种野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I的应用方法，会提供了其两个突变体ΔSRA和K197A。这三种限制性内切酶都能特异性地识别并且切割含有m6A修饰的DNA，且野生型HHPV4I和突变体ΔSRA可以特异性识别Gm6ATC修饰位点，并在修饰位点两侧的位置切割DNA。利用其特殊的限制性内切功能，能够应用于基因工程、基因分析、基因编辑、基因检测、表观遗传学研究等技术领域。

Description

一种m6A依赖型限制性内切酶、其突变体及其应用
技术领域
本发明属于微生物核酸内切酶技术领域，特别是一种m6A依赖型限制性内切酶、其突变体及其应用。
背景技术
修饰依赖型限制性内切酶(Modification-dependent restrictionendonucleases，MDREs)普遍存在于原核生物中，并通过靶向含有修饰碱基的噬菌体基因组来介导抗病毒免疫，例如5-甲基胞嘧啶(5mC)，5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，葡萄糖基-5-羟甲基胞嘧啶(g5hmC)和N6-甲基腺嘌呤(m6A)。迄今为止，业内已对许多MDREs进行了表征，这些酶包含不同的DNA结合结构域和催化结构域，可识别不同的修饰碱基，并显示出不同的切割特性(Loenen et al.,2014；Lutz et al.,2019；Weigele et al.,2016)。在这些已鉴定的MDREs中，大多数是含有识别修饰胞嘧啶的SRA结构域。SRA结构域在哺乳动物中表征为5mC依赖型的DNA结合结构域，它也普遍存在于细菌中，通常与催化结构域(如PD-(D/E)XK或HNH)融合而发挥切割DNA的作用(Unoki et al.,2004；Arita et al.,2004；Han et al.,2015)。近年来，包含SRA结构域的MDREs备受关注，多种包含SRA结构域的限制性内切酶已被表征，例如SRA-PD-(D/E)XK核酸内切酶MspJI，AspBHI和LpnPI(Zheng et al.,2010；Cohen-Karni et al.,2011)，PD-(D/E)XK-SRA核酸内切酶PvuRts1I和AbaSI(Wang et al.,2011)，SRA-HNH核酸内切酶ScoA3IV和TagI(Kisiala et al.,2018)。这些酶都会在距修饰胞嘧啶一定距离处切割DNA，但不同的内切酶对修饰碱基的具体要求也不同。比如MspJI和TagI可以切割5mC和5hmC修饰的DNA，但不切割g5hmC修饰的DNA；而PvuRts1I能切割5hmC和g5hmC修饰的DNA，但不能切割5mC修饰的DNA(Kisiala et al.,2018)。此外，SRA结构域属于PUA超家族，这个家族还包含有其他的DNA或RNA修饰结合结构域，例如EVE结构域和YTH结构域(Pastor et al.,2021；Hosford et al.,2020)。这些结构域也可以与核酸内切酶融合，并且大多数融合蛋白作为胞嘧啶修饰依赖型内切酶发挥作用。
然而，现有技术中，与已经有很多详细的生化鉴定的5mC修饰依赖型限制性内切酶相比，很少有m6A修饰依赖型限制性内切酶被鉴定出来，仅有DpnI一个。DpnI的催化特性不同于包含SRA结构域的MDREs，它识别Gm6ATC位点并有效地将完全甲基化的DNA切割(Gm6A|TC)，留下一个平末端，同时它还能较低程度的切割半甲基化DNA。DpnI由N端的PD-(D/E)XK催化结构域和C端winged helix(wH)结构域组成，这两个结构域对识别位点Gm6ATC都有特异性作用(Lacks et al.,1975；Siwek et al.,2012；Mierzejewska et al.,2014)。
通常，限制性内切酶(Restriction endonucleases,REases)广泛存在于原核生物中，然而，在一些小球藻病毒和巨型病毒中也发现了REases(Xia et al.,1986；Zhang,etal.,1998；Jeudy et al.,2020)。与原核生物中的限制性内切酶的抗病毒功能不同，病毒中的酶可能有助于降解宿主基因组以回收脱氧核苷酸用于病毒自身DNA的复制，或在多重感染的情况下排除其他病毒(Jeudy et al.,2020；Agarkova et al.,2006)。然而，迄今为止，尚未在病毒中发现MDREs。
m6A是脊椎动物和植物基因组中重要的表观遗传变化之一，它在调控基因表达、染色质结构控制，逆转录子抑制、应激反应、肿瘤发生和早期胚胎发育中发挥关键作用(Schübele et al.,2015；Meissner et al.,2013)。目前检测真核生物中m6A的方法主要包括以下三种：
(1)基于质谱的检测法，液相色谱-质谱联用技术(Huang et al et al.,2015；Liuet al.,2017)，其灵敏度非常高，但必须排除微生物污染的影响，避免产生假阳性。因此，准备样品时确保无污染是关键。
(2)抗体依赖的检测方法，如免疫印迹和免疫荧光的灵敏度低，被广泛的应用于研究m6A。但是由于无法区分DNA m6A和RNA m6A，而RNA m6A的丰度通常远高于DNA 6mA，因此，去除DNA中的RNA污染对该方法是必要的。抗体还可用于DIP-seq来检测m6A在基因组中的分布，m6A DIP-seq在DNA丰度太低情况下会产生很多的非特异性信号(Douvlatanioti etal.,2020)，因此此方法不适用于丰度低的样品。
(3)非抗体依赖的检测方法，第一种方法是利用甲基化敏感的限制性内切酶切割DNA检测m6A(Luo et al.,2016；Luo et al.,2018)。但是甲基化敏感的限制性内切酶依赖于特定的DNA序列(GATC，CATG等)，而现有的m6A DIP-seq和SMRT-seq没有在哺乳动物基因组中检测到类似的m6A修饰序列(Xie et al.,2018；Zhu et al.,2018)，因此这类方法很难用于检测哺乳动物的m6A。另一种方法是第三代测序技术，SMRT-seq通过DNA聚合酶复制时动力学特性的变化来检测6mA(Flusberg et al.,2010)，但是也有报道显示SMRT-seq在m6A丰度很低的时候会产生假阳性。因此，极低丰度的m6A的SMRT-seq检测需要富集m6A和很高的测序覆盖度。另外一种极具潜力的三代测序技术——纳米孔测序也被报道能用于检测m6A，但是目前还只被用于检测原核生物或单细胞真核生物的m6A(Rand et al.,2010；McIntyre et al.,2018)。
综上可以得出结论，目前用于DNA甲基化检测的主要方法都存在各种缺陷。因此，需要开发更多新颖的m6A修饰依赖型限制性内切酶，以克服上述的问题。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种m6A依赖型限制性内切酶、其突变体及其应用。本发明中，首次提供了来自嗜盐多形古菌病毒(Haloarcula hispanicapleomorphic virus 4，HHPV4)的独特MDRE(命名为HHPV4I)。HHPV4病毒是多脂病毒科中唯一一个含有MDRE的基因组；其基因组是环状双链DNA，大小为15010bp，含有24个开放阅读框(ORFs)。HHPV4I蛋白由ORF6编码(Atanasova et al.,2018；Demina et al.,2020)，然而该文献仅仅公开了这种蛋白的来源，并未对其功能进行深入研究。ORF6编码蛋白质具体功能经本发明发明人研究确认并命名为HHPV4I。HHPV4I蛋白由N端的SRA结构域，中间的wH结构域和C端HNH结构域(SRA-wH-HNH类型的核酸内切酶)组成。本发明申请人经过基因克隆，表达纯化和酶学性质分析，发现HHPV4I的催化特性不同于DpnI或其他已表征的含SRA结构域的核酸内切酶，是一种独特的m6A修饰依赖型限制性内切酶。具体通过技术内容如下。
一种m6A依赖型限制性内切酶的应用，所述m6A依赖型限制性内切酶为野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I(以下简称“野生型HHPV4I”)，或野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I突变体ΔSRA(以下简称“突变体ΔSRA”)，或m6A依赖型限制性内切酶突变体K197A(以下简称“突变体K197A”)；应用于基因工程、基因分析、基因编辑、基因检测、表观遗传学研究技术中。
优选地，上述的m6A依赖型限制性内切酶的应用，野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I包括N端的SRA结构域，中间的wH结构域和C端的HNH结构域，所述SRA结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述wH结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述HNH结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述m6A依赖型限制性内切酶突变体ΔSRA是由野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I的SRA结构域发生缺失突变后获得的；
所述m6A依赖型限制性内切酶突变体K197A是由野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I的K197位点发生突变后获得的。具体为K197位点的关键氨基酸残基K突变成A。
优选地，所述野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述m6A依赖型限制性内切酶突变体ΔSRA的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述m6A依赖型限制性内切酶突变体K197A的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
更优选地，用于表达SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；用于表达SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；用于表达SEQID NO.6所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
优选地，上述m6A依赖型限制性内切酶，可以用于区分甲基化和非甲基化DNA，检测切割位点；提纯不含有m6A修饰的DNA；
使用野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I或m6A依赖型限制性内切酶突变体ΔSRA时，对DNA中含有甲基化位点Gm6ATC进行特异性切割，或者消化去除DNA样品中含有m6A修饰的DNA，或者分析DNA样品中GATC位点甲基化水平；
使用m6A依赖型限制性内切酶突变体K197A使用，对DNA中所有含m6A修饰的位点进行切割。
需要说明的是，本发明提供的m6A依赖型限制性内切酶包括野生型HHPV4I，和野生型HHPV4I的两个突变体ΔSRA、K197A。这三种限制性内切酶都能特异性地识别和切割含m6A修饰的DNA序列。不同之处在于，野生型HHPV4I和突变体ΔSRA，能够特异性地识别并且各包含有Gm6ATC位点的片段，特异性更高；而突变体K197A可以切割各种含m6A修饰的序列。因此，除了能够应用与上述领域以外，只要是需要使用能识别和切割m6A修饰的DNA序列，针对上述三种限制性内切酶的特异性差异，都可以从中选择合适的现实性内切酶进行使用。
本发明还提供了一种m6A依赖型限制性内切酶，同时含有SEQ ID NO.2所示的wH结构域和SEQ ID NO.3所示的HNH结构域；
或者，同时含有SEQ ID NO.1所示的SRA结构域，SEQ ID NO.2所示且K197位点突变的wH结构域和SEQ ID NO.3所示的HNH结构域。
优选地，为野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I，或m6A依赖型限制性内切酶突变体ΔSRA，或m6A依赖型限制性内切酶突变体K197A；
所述野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述m6A依赖型限制性内切酶突变体ΔSRA的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述m6A依赖型限制性内切酶突变体K197A的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明提供了上述野生型HHPV4I，是SRA-wH-HNH类型的核酸内切酶，它的催化特性不同于DpnI或其他已表征的含SRA结构域的核酸内切酶，能够特异性地识别DNA单链上的Gm6ATC修饰位点，即腺嘌呤被甲基化修饰的GATC位点，并进行切割。本发明还提供了野生型HHPV4I的突变体ΔSRA和K197A，突变体ΔSRA的切割。
本发明还提供了上述m6A依赖型限制性内切酶的纯化方法，包括以下步骤：
S1、收集野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I，或m6A依赖型限制性内切酶突变体ΔSRA，或m6A依赖型限制性内切酶突变体K197A的基因诱导表达培养后的菌体，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体沉淀，重悬于裂解缓冲液中裂解；
S2、将步骤S1取得的细胞裂解液上清通过经裂解缓冲液预平衡的Ni-NTA填料，然后用10倍柱体积的杂蛋白洗脱缓冲液洗脱，最后用5倍柱体积的目的蛋白洗脱缓冲液洗脱出目的蛋白。
在进行纯化时，为了提高纯化效率，本领域技术人员还可以在限制性内切酶的端部上插入标签蛋白，常见的有各种组氨酸标签(例如组氨酸His的个数≥6)、FLAG标签、HA标签、SBP标签、Avi标签、Nus标签、V5标签等。
优选地，上述纯化方法中，步骤S1中，裂解条件为4℃，12000rpm离心1h。
优选地，上述纯化方法中，所述裂解缓冲液的组成为20mM Tris-HCl pH 8.0，300mM NaCl，20mM咪唑；
所述杂蛋白洗脱缓冲液的组成为20mM Tris-HCl pH 8.0，300mM NaCl，50mM咪唑；
所述蛋白洗脱缓冲液的组成为20mM Tris-HCl pH8.0，300mM NaCl，200mM咪唑。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：
1、本发明通过对来自嗜盐多形古菌病毒(Haloarcula hispanica pleomorphicvirus 4，HHPV4)的独特MDRE(即野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I)进行深入研究，发现这种HHPV4蛋白能够对DNA中含有甲基化位点Gm6ATC进行特异性切割的特殊功能，这种特性能够使其应用于基因工程、基因分析、基因编辑、基因检测、表观遗传学研究等广泛的基因技术领域；
2、本发明通过针对野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I的特异性切割功能进行深入挖掘研究，发现其SRA结构域发生缺失的突变体ΔSRA具有与野生型HHPV4I相同的功能，其wH结构域的K197位点发生突变的突变体K197A可以切割各种含m6A修饰的DNA序列，因此同样可以应用于相应的基因技术领域；
3、本发明提供的野生型HHPV4I，及其其突变体ΔSRA、K197A，具有特殊的潜在m6A修饰位点分析能力，为改造或开发新的m6A修饰依赖型限制性内切酶提供了方向。
附图说明
图1为本发明的野生型HHPV4I及其突变体ΔSRA和K197A的蛋白结构示意图；
图2为实施例2中SDS-PAGE电泳检测野生型HHPV4I，突变体ΔSRA和K197A的蛋白纯化效果图；
图3为实施例3中检测野生型HHPV4I的切割特异性的琼脂糖凝胶电泳效果图；
图4为实施例4中检测野生型HHPV4I，突变体ΔSRA和K197A的切割活性的琼脂糖凝胶电泳效果图；
图5为实施例5中鉴定野生型HHPV4I识别的修饰碱基的琼脂糖凝胶电泳效果图；
图6为实施例6中野生型HHPV4I的切割位点的Run-off测序结果图；
图7为实施例7中突变体ΔSRA的切割位点的Run-off测序结果图；
图8为实施例8中确定野生型HHPV4I的切割方式的琼脂糖凝胶电泳效果图；
图9为实施例9中突变体K917A对其他m6A修饰位点的切割活性检测的琼脂糖凝胶电泳效果图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中采用的野生型HHPV4I和突变体K197A蛋白，在SEQ ID NO.4、6公开的氨基酸序列，在利用核苷酸序列实际表达制备突变体ΔSRA蛋白时，为了便于纯化，还在SEQID NO.4、SEQ ID NO.6的氨基酸序列的N端的SRA结构域外，另外插入了组氨酸标签蛋白。组氨酸标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，相应的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。同时，还在相应的核苷酸序列SEQ ID NO.7、9的末端加入了终止密码子taa。
突变体ΔSRA蛋白在SEQ ID NO.5公开的氨基酸序列，以及相应的核苷酸序列SEQID NO.8的基础上，在利用核苷酸序列实际表达制备突变体ΔSRA蛋白时，为了便于纯化，还在SEQ ID NO.5公开的氨基酸序列的N端的wH结构域外，另外插入了标签蛋白和蛋氨酸M(密码子为atg)。组氨酸标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，相应的核苷酸序列如SEQID NO.19所示。因此，在N端的wH结构域外插入的氨基酸序列为组氨酸标签蛋白和蛋氨酸M，相应核苷酸序列为组氨酸标签蛋白的核苷酸序列和蛋氨酸M的密码子atg。同时，还在相应的核苷酸序列SEQ ID NO.8的末端加入了终止密码子taa。
实施例1：HHPV4I，ΔSRA和K197A蛋白结构研究
使用IBS工具绘制蛋白的结构域示意图，如图1所示。野生型HHPV4I由3个结构域组成，分别为N端的SRA结构域(1-143aa)，中间的wH结构域(144-223aa)，和C端的HNH结构域(224-381aa)。
突变体ΔSRA表示完全截掉SRA结构域，只剩余wH和HNH结构域；突变体K197A表示将wH结构域中的关键氨基酸残基K突变成A。
实施例2：HHPV4I，ΔSRA和K197A基因的克隆和蛋白的表达纯化
1、HHPV4，ΔSRA和K197A的基因克隆
从南京金斯瑞生物科技有限公司合成带有组氨酸标签的野生型HHPV4I基因，并通过无缝克隆的方法连接到带有N端6×His标签的pQE80L载体中，无缝克隆试剂盒购买自上海碧云天生物技术有限公司，操作方法严格按照试剂盒说明书进行。
带有组氨酸标签和1个蛋氨酸的突变体ΔSRA和带有组氨酸标签的突变体K197A则通过全质粒PCR的方法构建，PCR反应体系为25μl：2X PrimeSTAR Max 12.5μl(购自TaKaRa公司)，质粒模板1ng，正向引物0.4μM，反向引物0.4μM，双蒸水补至25μl。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸10min，16℃保存2min。带有6×His标签的HHPV4I，突变体ΔSRA和K197A的氨基酸序列分别如序列表SEQID NO.4，SEQ ID NO.5，和SEQ ID NO.6所示。
表达SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列(野生型HHPV4I基因)如SEQ IDNO.7所示；用于表达SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的核苷酸序列(突变体ΔSRA)如SEQ IDNO.8所示；用于表达SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的核苷酸序列(突变体K197A)如SEQ IDNO.9所示；
2、蛋白HHPV4，ΔSRA和K197A的表达
(1)将得到的重组质粒转化于大肠杆菌JM110感受态细胞(来源于北京全式金生物技术股份有限公司)。由于大肠杆菌JM110缺少Dam甲基化酶基因和Dcm甲基化酶基因，所以大肠杆菌的基因组不会被甲基化，故而不会被m6A修饰依赖型限制性内切酶降解。因此，野生型HHPV4I蛋白能在其中表达。
(2)将上述菌接种于含有100mg/mL Amp的LB培养基(1g酵母提取液、2g胰蛋白胨和2g NaCl，原料均购自国药集团)中，放于摇床中37℃培养OD600值到1.0；然后将摇床温度降至25℃，加入终浓度为0.5mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，于25℃，220rpm摇床诱导表达5h。
突变体ΔSRA和K197A的表达过程与野生型一样。
3、野生型HHPV4、突变体ΔSRA和突变体K197A的纯化
(1)菌液裂解
将上述步骤得到的表达了m6A依赖型限制性内切酶的细菌培养物4℃，5000rpm离心10min，弃上清，收集菌体沉淀；将菌体重悬于裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0，300mMNaCl，20mM咪唑)中，将菌体溶解液放置于冰上并使用预冷的超声破碎仪裂解细胞，细胞裂解液4℃，12000rpm离心1h，取上清，冰上放置。
(2)镍柱纯化
表达的蛋白带有组氨酸标签，可以采用镍柱进行纯化。将取得的细胞裂解液上清通过裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0，300mM NaCl，20mM咪唑)预平衡的Ni-NTA填料(采购自Qiagen公司)；
然后使用10倍柱体积的杂蛋白洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0，300mM NaCl，50mM咪唑)洗脱出杂蛋白；
最后用5倍柱体积的目的蛋白洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0，00mM NaCl，200mM咪唑)洗脱出目的蛋白。将收集到的目的蛋白与考马斯亮蓝染液混匀或用紫外分析仪器检测280nm下的紫外吸光值，判断蛋白是否有纯化出来。
(3)蛋白透析
剪取一段10-15cm透析袋，底部用重力夹夹紧，将蛋白加入透析袋中后塑料夹封口，然后将透析袋放入装有1L透析缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.5，100mM NaCl，0.1mMEDTA，1mM DTT，0.1％TritonX-100，50％甘油)的烧杯中，将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌促进溶液交换，于4℃层析柜中透析4h，更换新鲜的透析缓冲液再透析4h，最后收集透析后的蛋白放置于-20保存。
突变体ΔSRA和K197A的纯化方法与野生型一样。
(4)SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化效果
透析后测定蛋白浓度，然后通过10％SDS-PAGE电泳检测蛋白大小及纯度，样品上样量为0.25mg/mL。10％SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒(产品货号：PG112)购自上海雅酶生物医药科技有限公司，凝胶配置严格按照试剂盒说明书进行，结果如图2所示。图2中蛋白N端均带有6×His标签，野生型HHPV4和突变体图K197A的大小约为45kDa，突变体ΔSRA的大小约为29kDa。M代表蛋白Marker。图2中观察到纯化出的蛋白条带单一，分子量大小一致，说明野生型HHPV4I，突变体ΔSRA和K197A经过以上纯化步骤后得到的蛋白纯度较高，达到在体外进行生化实验的要求。
实施例3：野生型HHPV4I的切割特异性验证
1、切割底物的制备
质粒pBR322(Dam-Dcm-)提取自缺少Dam甲基化酶基因和Dcm甲基化酶基因的大肠杆菌JM110菌株(采购自北京全式金生物技术股份有限公司)。
质粒pBR322(Dam+Dcm+)提取自带有Dam和Dcm甲基化酶基因的大肠杆菌DH5α菌株(采购自北京全式金生物技术股份有限公司)。
2、切割反应
(1)反应体系总体积为10mL：10×反应缓冲液(500mM Tris-HCl pH 7.9，1M NaCl，50mM MnCl2)1mL，DNA底物0.4mg，野生型HHPV4I浓度梯度，双蒸水补至10mL。
(2)将反应混合物充分混匀，37℃反应1h。反应结束后加入2mL 6×DNA LoadingDye终止反应。
(3)最后通过1％的琼脂糖凝胶电泳和EB染色对切割产物进行检测，结果如图3所示，野生型HHPV4I的切割活性依赖于甲基化修饰。使用不同浓度的HHPV4I分别与未甲基化的质粒pBR322(Dam-Dcm-)和甲基化的质粒pBR322(Dam+Dcm+)孵育，结果野生型HHPV4I不能有效的切割非甲基化的质粒，而能特异性的切割甲基化的质粒。
实施例4：检测野生型HHPV4I，突变体ΔSRA和K197A的切割活性
1、切割底物的制备
底物pBR322(Dam+Dcm+)分离自大肠杆菌DH5α菌株(采购自北京全式金生物技术股份有限公司)。
2、切割反应
(1)反应体系总体积为10mL：10×反应缓冲液(500mM Tris-HCl pH 7.9，1M NaCl，50mM MnCl2)1mL，DNA底物0.4mg，野生型HHPV4I或突变体ΔSRA或突变体K197A 0.5mM，双蒸水补至10mL；
(2)将反应混合物充分混匀，37℃反应1h。反应结束后加入2mL 6×DNA LoadingDye终止反应。
(3)通过1％的琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖购自上海贝晶生物技术有限公司)及在0.5g/mL EB(EB购自北京索莱宝科技有限公司)中染色15min，检测切割产物，结果如图4所示，消化底物是甲基化的pBR322(Dam+Dcm+)，结果观察到ΔSRA的活性不受影响，仍保留有与野生型HHPV4I一样强的切割活性，而K197A的切割活性明显减弱。
实施例5：鉴定野生型HHPV4I识别的修饰碱基
1、切割底物的制备
(1)从缺少Dam甲基化酶基因和Dcm甲基化酶基因的大肠杆菌JM110菌株(采购自北京全式金生物技术股份有限公司)中提取质粒pBR322(Dam-Dcm-)，通过PCR扩增(委托XX公司制备获得)质粒pBR322(Dam-Dcm-)获得3kb DNA片段；
扩增引物如序列表SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示；
(2)在体外被Dam甲基化酶甲基化(Dam+)或Dcm甲基化酶甲基化(Dcm+)；Dam+表示GATC位点带有m6A修饰(Gm6ATC)；Dcm+表示CCWGG位点带有5mC修饰(C5mCWGG)。
Dam或Dcm甲基化酶反应体系如下：1mg DNA底物，1×甲基转移酶缓冲液(50mMTris-HCl pH 7.5，10mM EDTA，5mM 2-巯基乙醇)，160μM SAM，1mL Dam或Dcm甲基化酶，37℃反应1h；反应结束后65℃加热20min，使酶失去活性。
使用PCR纯化试剂盒(采购自Qiagen公司)对DNA甲基化产物进行纯化回收，具体纯化步骤按操作手册进行。
2、野生型HHPV4I的切割反应
(1)用HHPV4I切割未甲基化，Dam甲基化和Dcm甲基化的3kb DNA底物。
使用限制性内切酶DpnI和MspJI作为实验对照，因为DpnI能切割带有Gm6ATC修饰位点的DNA，而MspJI能切割带有C5mCWGG修饰位点的DNA。
反应体系总体积为10mL：10×反应缓冲液(500mM Tris-HCl pH 7.9，1MNaCl，50mMMnCl2)1mL，3kb DNA底物0.4mg，野生型HHPV4I 0.5mM，双蒸水补至10mL。将反应混合物充分混匀，37℃反应1h；反应结束后加入2mL 6×DNA Loading Dye终止反应。
对照组DpnI和MspJI的切割反应步骤按照NEB操作手册进行，而切割底物的使用量要求与野生型HHPV4I一样。最后通过1％的琼脂糖凝胶电泳和EB染色对切割产物进行检测，结果如图5所示，野生型HHPV4I分别消化未甲基化(non)，Dam甲基化酶甲基化(Dam+)，Dcm甲基化酶甲基化(Dcm+)的3kb PCR DNA底物；DpnI(识别Gm6ATC)和MspJI(识别C5mCWGG)消化作为实验对照。结果观察到HHPV4I仅切割Dam甲基化的DNA，不切割非甲基化和Dcm甲基化的DNA，说明野生型HHPV4I是一种m6A修饰依赖型限制性内切酶，可以识别Gm6ATC修饰位点。
实施例6：Run-off测序方法鉴定酶切位点
1、野生型HHPV4I对600bp DNA片段的切割
(1)底物制备
通过PCR扩增质粒pBR322(Dam-Dcm-)获得600bp DNA片段，这个片段中仅包含一个GATC位点，扩增引物如序列表SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示，然后通过Dam甲基化酶甲基化600bp DNA片段。
Dam甲基化酶甲基化反应体系如实施例5步骤1所示，即：1mg DNA底物，1×甲基转移酶缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.5，10mM EDTA，5mM 2-巯基乙醇)，160μM SAM，1mL Dam或Dcm甲基化酶，37℃反应1h；反应结束后65℃加热20min，使酶失去活性。
(2)使用野生型HHPV4I切割Dam甲基化的600bp DNA底物。限制性内切酶DpnI作为实验对照。已知DpnI的切割位点是在Gm6ATC修饰位点的中间，可根据DpnI Run-off测序结果验证用此方法鉴定HHPV4I酶切位点的可行性。
切割反应体系为50mL：10×反应缓冲液(500mM Tris-HCl pH 7.9，1M NaCl，50mMMnCl2)5mL，600bp DNA底物1mg，野生型HHPV4I 0.25mM，双蒸水补至50mL。
将反应体系混合好后置于37℃进行反应，分别反应15min，30min和60min。反应结束后取出5mL样品到另一干净的EP管中，加入2mL 6×DNA Loading Dye终止反应；
然后通过1％的琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖购自上海贝晶生物技术有限公司)及在0.5g/mL EB(购自北京索莱宝科技有限公司)中染色15min，对不同时间的切割产物进行检测，结果如图6的A图所示。
2、Run-off测序
将上述剩余的45mL样品通过PCR纯化试剂盒(采购自Qiagen公司)对DNA切割产物进行纯化回收，然后用NanoDrop(ThermoFisher Scientific)测定回收产物的质量浓度。
将回收产物送去测序公司(北京擎科生物科技有限公司)进行测序，测序引物如序列表SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示；
测序结果峰图用Chromas软件分析。Run-off测序的原理是利用Taq DNA聚合酶延伸时的特性来鉴定模板链的断裂位点。当模板链发生断裂时，延伸反应终止，由于Taq DNA聚合酶具有的不依赖与模板的末端核酸转移酶活性，使得Taq DNA聚合酶在延伸链的3’末端额外添加一个未配对的A。因此，当我们分析测序所得的峰图时，在模板切口处，会出现一个重叠的双峰(C/A、G/A、T/A)或增强的A峰且其后的峰急剧下降，从而推断出酶在模板链的切割位置。
图6A为琼脂糖凝胶电泳检测酶消化包含一个Gm6ATC位点DNA的产物，样品泳道分别表示不加酶(-)，HHPV4I消化15mim，30min和60min，DpnI用作对照；
图6B为空白对照，即没有消化的Run-off测序结果，峰图只有单一的峰；
图6C为DpnI消化的Run-off测序结果，经过DpnI消化，峰图出现增强的A峰(原本是T峰，但被A峰替换)且其后的峰中断了，说明在T碱基前有一个切口，从而推断出DpnI的切割位点，该结果与以前的文献报道的结果一致，即DpnI是在识别位点Gm6ATC中间进行切割。
图6D是野生型HHPV4I消化15min的Run-off测序结果，可以在两条链的Gm6ATC位点下游观察到切割位点，正向引物和反相引物测序的峰图都出现重叠的双峰，并且都是在Gm6ATC位点的下游。
图6E是野生型HHPV4I消化30min的Run-off测序结果，在Gm6ATC位点的下游或上游都能观察到双峰(即切割位点)，说明此时切割已经较充分。
图6F是野生型HHPV4I消化60min的Run-off测序结果，只在Gm6ATC位点的下游观察到双峰(切割位点)，说明当前的DNA几乎完全被切割。
综上结果，表明野生型HHPV4I的切割位点是在识别位点Gm6ATC的两侧，与DpnI具有完全不同的切割方式。
实施例7：Run-off测序方法鉴定突变体ΔSRA的切割特性
本实施例与实施例6的方法基本相同，不同之处在于，使用的酶是突变体ΔSRA。对切割产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
图7为琼脂糖凝胶电泳检测ΔSRA的切割产物(切割底物与图4一样)；可以发现，突变体ΔSRA的SRA结构域缺失后仍能特异性切割Dam甲基化的DNA。
图7B、7C、7D分别对应突变体ΔSRA消化DNA底物15min、30min和60min的Run-off测序结果峰图。
结果发现突变体ΔSRA的切割位点与野生型HHPV4I的几乎完全一样，缺少SRA结构域并不影响其发挥作用，表明SRA结构域不负责识别Gm6ATC修饰位点和切割DNA，对修饰位点的识别与切割的关键在于wH结构域和HNH结构域。
实施例8：确定野生型HHPV4I的切割方式
1、切割底物的制备
从T7噬菌体基因组中PCR扩增出带有一个GATC位点的177bp的DNA片段，扩增引物如序列表SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示，PCR反应体系为25l：2X PrimeSTAR Max 12.5l(购自TaKaRa公司)，DNA模板1ng，正向引物0.4M，反向引物0.4M，双蒸水补至25l。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10s，72℃退火延伸合并2s，30个循环；72℃终延伸10min，16℃保存2min；然后在体外用Dam甲基化酶进行甲基化。
2、切割反应
切割反应体系总体积为10μL：10×反应缓冲液(500mM Tris-HCl pH 7.9，1MNaCl，50mM MnCl2)1μL，177bp DNA底物0.4μg，野生型HHPV4I 0.5μM，双蒸水补至10μL。
将反应混合物充分混匀，37℃分别反应15min，30min和60min。反应结束后加入2mL6×DNA Loading Dye终止反应。然后通过1％的琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖购自上海贝晶生物技术有限公司)及在0.5g/mL EB(EB购自北京索莱宝科技有限公司)中染色15min，对切割产物进行检测，结果如图8所示。
图8A是通过非变性PAGE胶分析HHPV4I的切割方式。HHPV4I消化不同的时间，P1和P4表示部分裂解产物，P2、P3和P5表示最终裂解产物，随着消化时间增加，切割终产物(P2、P4和P5)也在增加，在1h时可以清晰地看到一个非常小的片段(P5)，即包含有Gm6ATC位点的片段。DpnI用作对照。
图8B是HHPV4I和DpnI的裂解方式对比示意图。
实施例9：突变体K917A对其他m6A修饰位点的切割活性检测
1、切割底物的制备
从T7噬菌体基因组中PCR扩增出不含GATC位点的2kb DNA片段，扩增引物如序列表SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17所示，然后在体外用M.EcoGII进行甲基化，M.EcoGII甲基转移酶是非特异甲基转移酶，能对序列中任意腺嘌呤残基(N6)进行甲基化修饰。
M.EcoGII甲基化反应体系总体积50μL：1x rCutSmart缓冲液(50mM KAc，20mMTris-Ac，10mM Mg(Ac)2，100μg/mL BSA pH 7.9)，160μM SAM，1μg DNA底物，1μL M.EcoGII，补双蒸水至50μL。
将反应体系混匀，37℃反应1h，反应结束后65℃加热20min使酶失去活性。然后使用PCR纯化试剂盒(采购自Qiagen公司)对DNA甲基化产物进行纯化回收，具体纯化步骤按操作手册进行。
2、K197A的切割反应
切割反应体系总体积为10μL：10×反应缓冲液(500mM Tris-HCl pH 7.9，1MNaCl，50mM MnCl2)1μL，M.EcoGII甲基化的DNA底物0.4μg，野生型HHPV4I或突变体K197A0.5μM，双蒸水补至10μL。
将反应混合物充分混匀，37℃反应1h。反应结束后加入2mL 6×DNA Loading Dye终止反应。然后通过1％的琼脂糖凝胶电泳和EB染色对切割产物进行检测，结果如图9所示。
图9中，切割底物是M.EcoGII甲基化的不含GATC位点的DNA(M.EcoGII是非特异甲基转移酶，能甲基化任意A碱基)；与野生型HHPV4I相，比突变体K197A的切割效率高很多，几乎把DNA全切成小碎片，证明突变体K197A可以切割各种含m6A修饰的序列。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种m6A依赖型限制性内切酶的应用，其特征在于，所述m6A依赖型限制性内切酶为野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I，或野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I突变体ΔSRA，或m6A依赖型限制性内切酶突变体K197A；应用于基因工程、基因分析、基因编辑、基因检测、表观遗传学研究技术中。
2.根据权利要求1所述的m6A依赖型限制性内切酶的应用，其特征在于，野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I包括N端的SRA结构域，中间的wH结构域和C端的HNH结构域，所述SRA结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述wH结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述HNH结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述m6A依赖型限制性内切酶突变体ΔSRA是由野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I的SRA结构域发生缺失突变后获得的；
所述m6A依赖型限制性内切酶突变体K197A是由野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I的K197位点发生突变后获得的。
3.根据权利要求2所述的m6A依赖型限制性内切酶的应用，其特征在于，所述野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述m6A依赖型限制性内切酶突变体ΔSRA的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述m6A依赖型限制性内切酶突变体K197A的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求3所述的m6A依赖型限制性内切酶的应用，其特征在于，用于表达SEQID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；用于表达SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；用于表达SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
5.根据权利要求1所述的m6A依赖型限制性内切酶的应用，其特征在于，用于区分甲基化和非甲基化DNA，检测切割位点；提纯不含有m6A修饰的DNA；
使用野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I或m6A依赖型限制性内切酶突变体ΔSRA时，对DNA中含有甲基化位点Gm6ATC进行特异性切割，或者消化去除DNA样品中含有m6A修饰的DNA，或者分析DNA样品中GATC位点甲基化水平；
使用m6A依赖型限制性内切酶突变体K197A使用，对DNA中所有含m6A修饰的位点进行切割。
6.一种m6A依赖型限制性内切酶，其特征在于，同时含有SEQ ID NO.2所示的wH结构域和SEQ ID NO.3所示的HNH结构域；
或者，同时含有SEQ ID NO.1所示的SRA结构域，SEQ ID NO.2所示且K197位点突变的wH结构域和SEQ ID NO.3所示的HNH结构域。
7.根据权利要求6所述的m6A依赖型限制性内切酶，其特征在于，为野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I，或m6A依赖型限制性内切酶突变体ΔSRA，或m6A依赖型限制性内切酶突变体K197A；
所述野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述m6A依赖型限制性内切酶突变体ΔSRA的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述m6A依赖型限制性内切酶突变体K197A的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
8.一种权利要求6所述的m6A依赖型限制性内切酶的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、收集野生型m6A依赖型限制性内切酶HHPV4I，或m6A依赖型限制性内切酶突变体ΔSRA，或m6A依赖型限制性内切酶突变体K197A的基因诱导表达培养后的菌体，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体沉淀，重悬于裂解缓冲液中裂解；
S2、将步骤S1取得的细胞裂解液上清通过经裂解缓冲液预平衡的Ni-NTA填料，然后用10倍柱体积的杂蛋白洗脱缓冲液洗脱，最后用5倍柱体积的目的蛋白洗脱缓冲液洗脱出目的蛋白。
9.根据权利要求8所述的纯化方法，其特征在于，步骤S1中，裂解条件为4℃，12000rpm离心1h。
10.根据权利要求8所述的纯化方法，其特征在于，所述裂解缓冲液的组成为20mMTris-HCl pH 8.0，300mM NaCl，20mM咪唑；
所述杂蛋白洗脱缓冲液的组成为20mM Tris-HCl pH 8.0，300mM NaCl，50mM咪唑；
所述蛋白洗脱缓冲液的组成为20mM Tris-HCl pH8.0，300mM NaCl，200mM咪唑。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115029333A (zh) * 2021-03-05 2022-09-09 武汉核圣生物技术有限公司 一种核酸内切酶及其纯化方法和应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020083488A1 (en) * 2000-08-04 2002-06-27 Atsushi Miyawaki Method for mutagenesis
US20080108073A1 (en) * 2001-11-19 2008-05-08 Affymetrix, Inc. Methods of Analysis of Methylation
CN101586138A (zh) * 2008-05-19 2009-11-25 河南农业大学 从大肠杆菌中制备纯化Exendin-4的工艺
CN101802183A (zh) * 2007-07-12 2010-08-11 新英格兰生物实验室公司 高保真度限制性内切核酸酶
US20120192315A1 (en) * 2011-01-13 2012-07-26 Southern Illinois University Carbondale Resistance genes and proteins active against fusarium root rots, cyst nematodes and soybean sudden death syndrome and methods employing same
CN103305498A (zh) * 2012-03-06 2013-09-18 中国科学院上海生命科学研究院 在双链dna片段末端产生预定粘性末端的方法
CN107384942A (zh) * 2017-07-20 2017-11-24 佛山科学技术学院 一种表达新型鸭呼肠孤病毒s σB重组蛋白的方法
US20180245075A1 (en) * 2017-02-06 2018-08-30 Trustees Of Boston University Integrated system for programmable dna methylation
WO2021195519A1 (en) * 2020-03-27 2021-09-30 University Of Rochester Targeted destruction of viral rna by crispr-cas13
CN115029333A (zh) * 2021-03-05 2022-09-09 武汉核圣生物技术有限公司 一种核酸内切酶及其纯化方法和应用

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020083488A1 (en) * 2000-08-04 2002-06-27 Atsushi Miyawaki Method for mutagenesis
US20080108073A1 (en) * 2001-11-19 2008-05-08 Affymetrix, Inc. Methods of Analysis of Methylation
CN101802183A (zh) * 2007-07-12 2010-08-11 新英格兰生物实验室公司 高保真度限制性内切核酸酶
CN101586138A (zh) * 2008-05-19 2009-11-25 河南农业大学 从大肠杆菌中制备纯化Exendin-4的工艺
US20120192315A1 (en) * 2011-01-13 2012-07-26 Southern Illinois University Carbondale Resistance genes and proteins active against fusarium root rots, cyst nematodes and soybean sudden death syndrome and methods employing same
CN103305498A (zh) * 2012-03-06 2013-09-18 中国科学院上海生命科学研究院 在双链dna片段末端产生预定粘性末端的方法
US20180245075A1 (en) * 2017-02-06 2018-08-30 Trustees Of Boston University Integrated system for programmable dna methylation
CN107384942A (zh) * 2017-07-20 2017-11-24 佛山科学技术学院 一种表达新型鸭呼肠孤病毒s σB重组蛋白的方法
WO2021195519A1 (en) * 2020-03-27 2021-09-30 University Of Rochester Targeted destruction of viral rna by crispr-cas13
CN115029333A (zh) * 2021-03-05 2022-09-09 武汉核圣生物技术有限公司 一种核酸内切酶及其纯化方法和应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ATANASOVA, N.S.等: "登录号：YP_009799437", 《NCBI》, 12 October 2021 (2021-10-12), pages 1 - 2 *
KAROLINA MIERZEJEWSKA等: "Structural basis of the methylation specificity of R.DpnI", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》, vol. 42, no. 13, 25 June 2014 (2014-06-25), pages 8745 - 8754, XP055531682, DOI: 10.1093/nar/gku546 *
LIKUI ZHANG等: "Structural and functional characterization of deep-sea thermophilic bacteriophage GVE2 HNH endonuclease", 《SCIENTIFIC REPORTS》, vol. 7, 13 February 2017 (2017-02-13), pages 1 - 13 *
NINA S. ATANASOVA等: "The Unexplored Diversity of Pleolipoviruses: The Surprising Case of Two Viruses with Identical Major Structural Modules", 《GENES》, vol. 9, no. 131, 28 February 2018 (2018-02-28), pages 1 - 18 *
WOJCIECH SIWEK等: "Crystal structure and mechanism of action of the N6-methyladenine-dependent type IIM restriction endonuclease R.DpnI", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》, vol. 40, no. 15, 18 May 2012 (2012-05-18), pages 7563 *
XUELING LU等: "A Unique m6A-Dependent Restriction Endonuclease from an Archaeal Virus", 《MICROBIOLOGY SPECTRUM》, vol. 11, no. 2, 22 March 2023 (2023-03-22), pages 1 - 16 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115029333A (zh) * 2021-03-05 2022-09-09 武汉核圣生物技术有限公司 一种核酸内切酶及其纯化方法和应用
CN115029333B (zh) * 2021-03-05 2024-02-09 武汉核圣生物技术有限公司 一种核酸内切酶及其纯化方法和应用

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