CN108431025A - 用于抗禽呼肠孤病毒亚单元疫苗的优化多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了分离的多肽，其包含对应于形成禽呼肠孤病毒sigma C蛋白的完整或部分α‑螺旋结构域、铰链结构域、β‑三螺旋结构域和完整或部分球状头部结构域的氨基酸残基的氨基酸序列，并且缺失所述α‑螺旋结构域的N‑末端氨基酸序列。此外，提供了包含至少一种本发明的分离多肽的疫苗，或者表达至少一种本发明的分离多肽的病毒载体。
Description
技术领域
本发明一般涉及抗禽呼肠孤病毒的疫苗。
背景技术
禽呼肠孤病毒(ARV)是呼肠孤病毒科中正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)的成员。它与许多疾病相关，最突出的是病毒性关节炎综合征(腱鞘炎)，其特征在于跗关节肿胀和腓肠肌腱损伤，并且给家禽业带来相当大的经济损失。对ARV的易感性主要发生在幼鸡(1-2周龄)中。肉鸡中病毒性腱鞘炎的控制由抗体赋予，所述抗体在母体鸡群接种疫苗后转移至后代。可供使用的针对ARV的减毒活疫苗和灭活疫苗是基于s1133毒株(van der Heide etal.1983)，以及属于单一血清型的分离毒株(Goldenberg et al.2010)。然而，这些疫苗对于野生发现(found in the field)的多种ARV无效(Jones 2000；Goldenberg et al.2010；Lublin et al.2011)。
用于遗传表征的ARV分离株的sigma C(SC)蛋白的测序能够将它们划分为基因型(Kant et al.2003；Lublin et al.2011；Goldenberg et al.2010；Troxler et al.2013)。基于四种ARV基因型代表的混合物的疫苗接种由四种基因型赋予针对所有测试病毒的保护[Lublin et al.2011；WO 2009/093251]。由S1基因编码的ARV的外衣壳细胞附着蛋白SC是326个氨基酸的相对较小的蛋白质(Benavente&Martínez-Costas 2007)，是具有由两个结构域：位于蛋白质的C末端的“头部(head)”、位于N末端的“轴”组成的三级结构的同源三聚体。已经解析了C末端结构域和残基117-326的晶体结构(Guardado Calvo et al.2005；Guardado-Calvo et al.2009)。SC引发呼肠孤病毒特异性中和抗体(Shapouri etal.1996；Grande et al.1997)，使其成为重组亚单位疫苗的合适候选者。
实际上，过去已经为许多病毒开发了有效的重组疫苗，包括用于人类的乙型肝炎疫苗(McAleer et al.1984)和乳头瘤病毒疫苗(Valentino&Poronsky 2015)以及传染性法氏囊病(IBD)(Pitcovski et al.2003)的疫苗，用于鸡的产蛋下降综合征(egg dropsyndrome)疫苗(Fingerut et al.2003)和用于火鸡的出血性肠炎病毒疫苗(Pitcovski etal.2005)。SC已经在各种表达系统中表达，包括细菌、杆状病毒、酵母、植物和哺乳动物细胞。重组SC蛋白已用于诊断以区分毒株。已显示抗SC抗体可中和细胞系中的病毒[28,31]。在先前的研究中，在细菌中表达的SC仅显示弱免疫原性(Goldenberg et al.2011；Vasserman et al.2004)。因此，仍然非常需要抗ARV的有效疫苗。
发明内容
一方面，本发明涉及分离的多肽，其包含如下氨基酸序列或基本上由如下氨基酸序列构成，所述氨基酸序列对应于形成禽呼肠孤病毒sigma C蛋白的完整或部分α-螺旋结构域、铰链结构域、β-三螺旋结构域和完整或部分球状头部结构域的氨基酸残基的氨基酸序列，并且缺失所述α-螺旋结构域的N-末端氨基酸序列。
又一方面，本发明提供了核酸分子，其包含编码至少一种本文定义的分离多肽的核酸序列。
另一方面，本发明提供了表达载体，其包含与本文定义的所述核酸分子可操作地连接的控制元件，例如启动子，其中所述表达载体被设计为在例如细菌、酵母或昆虫细胞中复制和表达相关基因。
再一方面，本发明提供了疫苗，其包含至少一种本文定义的分离的多肽。
更再一方面，本发明提供了疫苗，其包含哺乳动物表达载体，例如pcDNA3，其包含与本文定义的核酸分子可操作地连接的控制元件，例如启动子。
还又一方面，本发明提供了病毒载体，例如重组马立克氏病(MD)病毒，其包含与本文定义的核酸分子可操作地连接的控制元件，例如启动子。
还另一方面，本发明涉及本文定义的任何一种疫苗或病毒载体，其用于对禽类物种进行的疫苗接种或用于诱导禽类免疫应答以赋予针对禽呼肠孤病毒的保护。
还又一方面，本发明涉及针对禽呼肠孤病毒对禽类物种进行疫苗接种或者诱导禽类免疫应答以赋予针对禽呼肠孤病毒的保护的方法，其包括将本文定义的任何一种疫苗或病毒载体施用于鸟。
附图简要说明
图1A-B显示了ARV分离株的Sigma C的有效表达；带His标签的残基122-326在大肠杆菌BL21中表达。考马斯亮蓝染色(A)显示具有预期分子大小的蛋白质的强烈(robust)表达。通过蛋白质印迹(B)使用小鼠抗His单克隆抗体确认它们的身份。泳道1：可溶性SC1133，泳道2：可溶性SC528，泳道3：可溶性SC5223，泳道4：可溶性SC5215，泳道5：不溶性SC1133，泳道6：不溶性SC528，泳道7：不溶性SC5223，泳道8：不溶性SC5215，泳道9：阴性对照(Sigma C残基1-326，无his标签，在大肠杆菌中产生)。泳道10：分子量标记。箭头表示sigma C蛋白。
图2描绘了显示用重组蛋白SC1-326、SC122-326和SC192-326(所有这些都是ARVs1133的序列)接种后的抗体滴度的条形图。对照：N.C-阴性对照(用佐剂中的PBS接种疫苗的鸟)，P.C-阳性对照(用ARV s1133注射)。***P<0.001，有显著差异。
图3描绘了显示蛋白质注射后产生的抗体检测病毒的条形图。注射SC1-326、SC122-326和SC192-326后抗ARV抗体的相对水平表示为测试样品(S)和在KIT中提供作为阳性对照的抗ARV 1133抗体(P)的OD之间的比率，(S/P)。大于0.2的值被认为是阳性的(识别病毒)。N.C-阴性对照(用佐剂中的PBS接种疫苗的鸟)。***P<0.001，有显著差异。
图4描绘了条形图，其显示用ARV刺激后，源自用佐剂中的PBS作为阴性对照(NC)，ARV疫苗株s1133作为阳性对照(PC)、SC1-326或SC122-326接种疫苗的鸟脾脏的淋巴细胞的增殖。用伴刀豆球蛋白A(ConA)或脂多糖(LPS)处理的细胞作为非特异性抗原(Ag)细胞增殖的对照，ARV用于特异性Ag增殖，或培养基本身作为阴性对照(N.C.)。测量的吸光度与活细胞的数量成比例。结果表示为刺激指数(SI)，表示刺激细胞和未刺激细胞之间的比率。***，**分别在P<0.001和0.01时有显着差异。结果表示为刺激指数(SI)，表示刺激细胞和未刺激细胞之间的比率。***，**分别在P<0.001和0.01时有显著差异。
图5描绘了显示用SC122-326初次接种疫苗对ARV的二次应答的影响的线图。结果表示为通过ELISA(在450nm处测量的光密度(OD))测试的稀释终点。阴性对照-用PBS和佐剂接种疫苗。圆形-对ARV疫苗株s1133的初级免疫应答；方块-SC122-326初次接种疫苗后对ARV的免疫应答；正三角形-ARV初次接种疫苗后对ARV的免疫反应；-倒三角形-阴性对照。***P<0.001，有显著差异。
图6描绘了禽呼肠孤病毒毒株s1133的sigma C(SC)蛋白的部分结构(氨基酸117-326)的模型。数字代表蛋白质结构中的氨基酸位置。采用自Guardado-Calvo[18]。
具体实施方式
禽呼肠孤病毒(ARV)变异相对较快，并且在全世界野生范围内(in the fieldworldwide)存在许多变体。对抗一种基因型进行保护的疫苗对其他基因型是低效的(Lu etal.2015；Vasserman et al.2004；Goldenberg et al.2010；Shapouri et al.1995)。减毒疫苗的生产是漫长的过程，并且在高度突变的病毒的情况下效率低下。使疫苗适应野生病毒中的改变是通过使用灭活疫苗，所述灭活疫苗是通过在细胞培养物或含胚卵中繁殖强毒分离株及其随后的灭活而产生的。在分子生物学时代，亚基疫苗可以通过基因工程生产。该方法中，在表达系统中仅产生用于诱导中和抗体的相关更新蛋白质。如前所述[26,27]，其326个氨基酸完整形式的sigma C蛋白(SC)可在细菌表达系统中表达。然而，虽然针对s1133(ARV的病毒株)的抗体确实鉴定了重组SC，但是响应于用该蛋白质的免疫获得了低滴度的抗体。
根据本发明鉴定和测试三种不同的蛋白质片段—残基1-326、122-326和192-326(图5)—作为亚单位疫苗的候选物，其将引发最高水平的抗ARV中和抗体。本发明基于以下发现：当SC1-326诱导低滴度的抗体时，另外两个片段诱导具有高抗体滴度的免疫应答，最突出的是SC122-326(图2)。进一步发现，在从用不同SC多肽接种疫苗的鸟中分离的脾细胞的刺激后，只有暴露于SC122-326多肽的鸟的细胞增殖到与用全病毒接种疫苗的阳性对照相同的程度(图4)。
由于SC122-326产生最高水平的抗体，因此对其进一步分析。用SC122-326引发后获得针对ARV的二次免疫应答的能力表明SC122-326和完整病毒诱导相同的B和T淋巴细胞(图5)。这使得能够在幼雏时用SC122-326进行接种疫苗并克服了母体抗体的破坏以引发完全应答。
通过病毒中和试验进一步测试SC122-326作为抗ARV疫苗的功效。针对SC蛋白产生的抗体显示在细胞系统中成功中和[28,45]。然而，中和试验在成鸟中预测病毒中和方面更为准确。因此根据本发明已经发现，注射SC122-326蛋白后产生的抗体是保护性的，消除了毒性株对鸟胚胎的感染，其程度与对整个病毒产生的抗体相同(表5)。值得注意的是，注射完整SC蛋白(SC1-326)后产生的抗体不具有保护性。因此不言而喻的是，分离的多肽SC122-326具有与整个蛋白质背景下的对应物明显不同的特征。
鉴于上述，在一个方面，本发明涉及分离的多肽，其包含如下氨基酸序列或基本上由如下氨基酸序列构成，所述氨基酸序列对应于如图6所示的形成禽呼肠孤病毒sigma C蛋白的完整或部分α-螺旋结构域、铰链结构域、β-三螺旋结构域和完整或部分球状头部结构域的氨基酸残基的氨基酸序列，并且缺失所述α-螺旋结构域的N-末端氨基酸序列。
术语“分离的多肽”是指如下事实，即氨基酸序列是全长sigma C蛋白的片段，其在全长sigma C蛋白的自然环境之外表达，并且在本文中可与术语“重组多肽”、“合成多肽”或“全长sigma C蛋白的片段”互换使用。
Sigma C蛋白的不同结构域已经得到很好地表征，如Guardado-Calvo,2009所教导；当考虑整体结构时，观察到轴(氨基酸残基117-191)和球状头部结构域(氨基酸残基196-326)之间的明显区分。轴结构域可以进一步细分为α-螺旋三重卷曲螺旋(氨基酸残基117-154)、连接区(氨基酸残基155-159)和两个重复的三重β-螺旋(氨基酸残基160-191)。
在某些实施方案中，所示分离的多肽包含或基本上由对应于如SEQ ID NO:1所示的ARV毒株S1133的sigma C蛋白的氨基酸残基70-326、117-326或特别是122-326的氨基酸序列组成，在本文中称为“S1133的内部蛋白序列”或“内部氨基酸序列”。特别地，所述内部氨基酸序列具有与对应于SEQ ID NO:1所示的ARV毒株S1133的sigma C蛋白的氨基酸残基70-326、117-326或122-326的氨基酸序列至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95、96、97、98或99％的同一性。
在进一步特定的实施方案中，上文定义的任何一种分离的多肽阻断或减少感染性禽呼肠孤病毒与禽呼肠孤病毒的sigma C蛋白的天然受体的结合。测量配体与蛋白质结合的方法是本领域熟知的，例如，如Barton Erik S,J.Craig Forres,Jodi L Connolly,James D Chappell,Yuan Liu,Frederick J Schnell,Asma Nusrat,Charles A Parkos,Terence S Dermody.Junction Adhesion Molecule Is a Receptor for Reovirus.Cell,Vol.104,441-451,February 9,2001所述的表面等离子体共振(SPR)。
在甚至更具体的实施方案中，当在任选与佐剂组合以施用于鸟时，上文定义的任何一种分离的多肽诱导针对感染性禽呼肠孤病毒的保护性免疫应答。在某些实施方案中，当将任何一种上文定义的分离的多肽施用于鸟时，与将ARV毒株S1133的全长sigma C蛋白施用于鸟后获得的所述抗体的全身水平相比，诱导产生显著更高全身水平的中和抗sigmaC蛋白抗体。测量鸟中保护性免疫应答的诱导的方法是本领域熟知的。例如，如以下实施例中所教导的，通过ELISA测试可以容易地在接种疫苗的鸟的血清中测量抗体滴度，并且通过监测接种活病毒后胚胎死亡率的抑制，可以很容易地完成血清中和强毒性呼肠孤病毒的能力。
在某些实施方案中，以上定义的任何一种分离的多肽包含具有与选自表1中公开的组的sigma C蛋白的内部氨基酸序列至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95、96、97、98或99％的同一性的氨基酸序列，所述内部氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1所示的ARV毒株S1133的sigma C蛋白的氨基酸残基70-326、117-326或122-326。
在某些实施方案中，上文定义的任何一种分离的多肽包含对应于选自表1中公开的sigma C蛋白的氨基酸序列内的内部氨基酸序列的氨基酸序列，所述内部氨基酸序列对应于如SEQ ID NO:1所示的ARV毒株S1133的sigma C蛋白的氨基酸残基70-326、117-326或122-326。
在特定实施方案中，分离的多肽包含或基本上由选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5(即分别为S1133、ISR5223、ISR5215和ISR528的内部蛋白序列)组成的组的氨基酸序列，例如SEQ ID NO:2组成。
在某些实施方案中，上文定义的任何一种分离的多肽还包含用于鉴定和/或纯化的标签，例如多组氨酸标签(例如His6)，但它也可以是(His-Asn)6标签、Flag标签，或可以促进多肽纯化的任何其他标签。可以使用单个标签或其多个拷贝，或者可以组合使用不同的标签。标签可以与多肽的C末端或N末端融合。例如，所述分离的多肽，具有在SEQ ID NO:1和6-34，例如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中任一个所示的蛋白质中的内部氨基酸序列，可以进一步包含用于鉴定和/或纯化的标签，例如上述那些。
为了表达上述多肽，可以用核酸分子转化细菌或真核细胞，例如酵母或植物细胞，并且可以使用插入多肽中的纯化标签和/或通过本领域熟知的其他蛋白质纯化方法来纯化表达的多肽。优选地，多肽在细菌细胞中表达，更优选在大肠杆菌中表达。
为了用于免疫原性组合物/疫苗，可以将上文定义的任何一种多肽与载体蛋白例如但不限于大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)、牛血清白蛋白和鞭毛蛋白组合。所述载体蛋白可以与多肽的N-末端或C末端融合，或者可以在两端与多肽侧接(flank)。所述载体蛋白可以通过重组技术与多肽融合，即多肽和载体蛋白由单个核酸序列编码并表达为连续多肽。或者，多肽和载体蛋白可以分开产生，然后彼此化学连接。
用于本发明所有方面的优选载体蛋白是LT蛋白。它赋予载体功能，并且也已知为注射和口服施用中的强效佐剂，其能够引发强烈的全身性IgG和局部IgA应答以及细胞毒性辅助性T细胞应答。由于呼肠孤病毒是粘膜抗原，因此优先刺激粘膜系统的免疫应答。通过口腔疫苗接种在粘膜组织中产生的IgA抗体是抵抗粘膜抗原提供的攻击的主要威慑物(deterrent)。LT蛋白是六聚体，其由两个亚基组成：27kDa催化A结构域(LTA)锚定在五个相同的11.6-kDa B亚基(LTB)的环中。A1片段是有毒的并且催化ADP-核糖从NAD转移到G蛋白的刺激性α-亚基(Gsα)。为了在动物中使用LT作为免疫刺激剂，其毒性可以通过突变中和(Vasserman,Y.and Pitcovski,J.,2006)。A和B亚基中的任何一个可以与本发明的多肽结合使用。
多肽还可以连接到生理学上可接受的微珠上，除了多肽之外，微珠还可以携带增强子分子如LT。或者，多肽可以通过抗体间接结合到载体上，或者生物素化的多肽可以通过抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白与载体结合。
用于本发明的微粒优选具有10nm至200μm的尺寸。为特定微粒选择的尺寸将取决于待递送的活性剂和预期的施用途径。对于口服递送，微粒的尺寸通常为0.5至5.0μm。对于皮下递送，合适的尺寸小于100μm。用于肠胃外递送的微粒通常具有小于200μm的尺寸，优选小于150μm。
又一方面，本发明提供了核酸分子，其包含编码至少一种上文定义的分离多肽的核酸序列。
另一方面，本发明提供了表达载体，其包含与上文定义的核酸分子可操作地连接的控制元件，例如启动子，其中所述表达载体被设计为在例如细菌、酵母或昆虫细胞中复制和表达相关基因。
本发明还涉及包含和/或表达上文定义的任何一种表达载体的细胞。适于表达本发明多肽的细胞的实例是细菌细胞例如大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
还一方面，本发明提供了疫苗，其包含至少一种上文定义的分离的多肽。
再还一方面，本发明提供了疫苗，其包含哺乳动物表达载体，例如pcDNA3，其包含与上文定义的任何一种核酸分子可操作地连接的控制元件，例如启动子。
再又一方面，本发明提供了病毒载体，例如重组马立克氏病(MD)病毒，其包含与上文定义的任何一种核酸分子可操作地连接的控制元件，例如启动子。
WO2009/093251，通过引用并入本文如同在本文中完全公开，则公开了高度可变和免疫原性的禽呼肠孤病毒sigma C蛋白氨基酸序列含有在以色列和其他地方鉴定的所有禽呼肠孤病毒分离株中常见的保守和免疫原性结构域。鉴定的保守序列位于对应于如SEQ IDNO:1所示的ARV毒株S1133的sigma C蛋白的氨基酸残基170和323的氨基酸残基之间。
术语“保守结构域”在本文中是指病毒变体中保守的结构域；即，结构域的氨基酸序列相似但无需彼此完全相同。
WO2009/093251进一步公开了根据分离株表达的sigma C蛋白的氨基酸序列的可变性，可以将以色列和其他地方感染鸟类的遗传上可变的禽呼肠孤病毒株或分离株分成四组。其中一组中的一个成员仅代表自然界中禽呼肠孤病毒分离株的一小部分；然而，四组中每一组中的一个成员在一起则代表了自然界中存在的许多(如果不是大多数)变体。四组呼肠孤病毒分离株(RI)在本文中称为RI组I至IV(表2)。
每个RI组的定义特征是所述RI组的不同sigma C蛋白的氨基酸序列具有至少75％的同一性。根据用于分析序列的算法和软件，组的组成可以略微变化。重要的概念是每组代表病毒群体的一小部分，并且从每组中取得的单个代表一起代表了整个病毒群体。
由于在本发明的分离的多肽中发现了保守的免疫原性结构域，因此WO 2009/093251中公开的概念可用于产生改进的疫苗，其包含代表整个病毒群体的本发明的分离的多肽。
根据本发明已经发现，四种不同的禽呼肠孤病毒变体的sigma C蛋白的内部多肽，其中每一种对应于SEQ ID NO:1所示的ARV毒株S1133的sigma C蛋白的氨基酸残基122-326，可以在体外有效表达。
在某些实施方案中，疫苗包含至少两种不同的重组多肽；或者，在包含哺乳动物表达载体或病毒载体的疫苗的情况下，核酸分子编码至少两种不同的重组多肽；所述至少两种不同的重组多肽中的每一种衍生自两组、三组或四组不同的sigma C蛋白中的一组的代表，其中每组的定义特征是所述组的不同sigma C蛋白的氨基酸序列具有至少75％的同一性，任选地如表2中所定义并且如WO2009/093251(通过引用并入如同在本文中完全公开)中所教导的那样。本文所用的术语“衍生自”是指重组多肽是包含对应于如SEQ ID NO:1所示的ARV毒株S1133的sigma C蛋白的氨基酸残基70-326、117-326或122-326的氨基酸序列的代表性sigma C蛋白的片段。可以通过将作为一组的代表的一种多肽用来自相同组的另一种多肽替换从而修饰疫苗。
表2.来自以色列的呼肠孤病毒分离株(RI)分类在四个RI组中，并且sigma C蛋白(SCP)的SEQ ID NO(SIN)分类在四个相应的SCP组中
1粗体：表达与其所在组最具有同一性的sigma C蛋白变体的分离株。
2SIN，SEQ ID NO:
例如，至少两种不同的分离的多肽之一可以是衍生自具有与SEQ ID NO:6-11(组I)至少75％的同一性的sigma C蛋白的分离的多肽；衍生自具有与SEQ ID NO:12-16(组II)至少75％的同一性的sigma C蛋白的多肽；衍生自具有与SEQ ID NO:17-22(组III)至少75％的同一性的sigma C蛋白的多肽；或衍生自具有与SEQ ID NO:1和23(组IV)至少75％的同一性的sigma C蛋白的多肽。疫苗还包括一种、两种、三种或更多种如上定义的另外的不同多肽。在具体的实施方案中，在上述相关组合的每一个中，所示不同多肽具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在另一个实例中，至少两种不同多肽中的两种可以是衍生自具有与SEQ ID NO:6-11(组I)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第一多肽，和衍生自具有与SEQ ID NO:12-16(组II)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第二多肽；衍生自具有与SEQ ID NO:6-11(组I)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第一多肽，和衍生自具有与SEQ ID NO:17-22(组III)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第二多肽；衍生自具有与SEQ ID NO:6-11(组I)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第一多肽，和衍生自具有与SEQ ID NO:1和23(组IV)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第二多肽；衍生自具有与SEQ ID NO:12-16(组II)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第一多肽，和衍生自具有与SEQ ID NO:17-22(组III)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第二多肽；衍生自具有与SEQ ID NO:12-16(组II)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第一多肽，和衍生自具有与SEQ ID NO:1和23(组IV)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第二多肽；或者衍生自具有与SEQ ID NO:17-22(组III)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第一多肽，和衍生自具有与SEQ ID NO:1和23(组IV)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第二多肽。疫苗还包括一种、两种或更多种如上定义的另外的不同多肽。
在具体的实施方案中，在上述相关组合的每一个中，所述两种不同的多肽具有SEQIDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
或者，至少两种不同多肽中的三种可以是衍生自具有与SEQ ID NO:6-11(组I)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第一多肽，衍生自具有与SEQ ID NO:12-16(组II)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第二多肽，和衍生自具有与SEQ ID NO:17-22(组III)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第三多肽；衍生自具有与SEQ ID NO:6-11(组I)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第一多肽，衍生自具有与SEQ ID NO:12-16(组II)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第二多肽，和衍生自具有与SEQ ID NO:1和23(组IV)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第三多肽；衍生自具有与SEQ ID NO:6-11(组I)至少75％的同一性的sigmaC蛋白的第一多肽，衍生自具有与SEQ ID NO:17-22(组III)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第二多肽，和衍生自具有与SEQ ID NO:1和23(组IV)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第三多肽；衍生自具有与SEQ ID NO:12-16(组II)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第一多肽，衍生自具有与SEQ ID NO:17-22(组III)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第二多肽，和衍生自具有与SEQ ID NO:1和23(组IV)至少75％的同一性的sigma C蛋白的第三多肽。在具体的实施方案中，在上述相关组合的每一个中，所示三种不同的多肽具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。疫苗还包括一种、两种或更多种如上定义的另外的不同多肽。
在某些实施方案中，疫苗包含四种不同的多肽；或包含哺乳动物表达载体或病毒载体的疫苗包含编码四种不同多肽的核酸分子，其中所述四种不同多肽中的第一种衍生自具有与SEQ ID NO:6-11(组I)至少75％的同一性的sigma C蛋白；所述四种不同多肽中的第二种衍生自具有与SEQ ID NO:12-16(组II)至少75％的同一性的sigma C蛋白；所述四种不同多肽中的第三种衍生自具有与SEQ ID NO:17-22(组III)至少75％的同一性的sigma C蛋白；以及所述四种不同多肽中的第四种衍生自具有与SEQ ID NO:1和23(组IV)至少75％的同一性的sigma C蛋白。
在特定实施方案中，所述四种不同多肽中的第一种衍生自具有与SEQ ID NO:8(组I)至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95、96、97、98或99％的同一性的sigma C蛋白；所述四种不同多肽中的第二种衍生自具有与SEQ IDNO:16(组II)至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95、96、97、98或99％的同一性的sigma C蛋白；所述四种不同多肽中的第三种衍生自具有与SEQ ID NO:19(组III)至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95、96、97、98或99％的同一性的sigma C蛋白；以及所述四种不同多肽中的第四种衍生自具有与SEQ ID NO:23(组IV)至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95、96、97、98或99％的同一性的sigma C蛋白。
在特定实施方案中，所述四种不同多肽中的第一种衍生自选自SEQ ID NO:6-11(组I)的多肽；所述四种不同多肽中的第二种衍生自选自SEQ ID NO:12-16(组II)的多肽；所述四种不同多肽中的第三种衍生自选自SEQ ID NO:17-22(组III)的多肽；所述四种不同多肽中的第四种衍生自选自SEQ ID NO:1和23(组IV)的多肽。在更具体的实施方案中，所述四种不同多肽具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的任何一种疫苗包含药学上可接受量的药学上可接受的稀释剂或载体。适用于本发明疫苗的药理学上可接受的稀释剂和载体可以是适用于兽药组合物的任何常规液体载体，例如适用于组织或细胞培养基的平衡盐溶液，诸如无菌磷酸盐缓冲盐水或蒸馏水。其他合适的介质可包括乳液。脱脂奶粉可在配制用于通过饮用水施用的疫苗中用作载体。
在某些实施方案中，本发明的任何一种疫苗，无论其是否包含药学上可接受量的药学上可接受的稀释剂或载体，还包含佐剂，例如热不稳定肠毒素(LT)、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、氢氧化铝；和/或防腐剂，例如硫柳汞或例如使用Marcol 52矿物油(ESSO，France)的20％油包水乳液。
在另一方面，本发明涉及上文定义的任何一种疫苗或病毒载体，其用于对禽类物种进行的疫苗接种，或者用于诱导禽类免疫应答以赋予针对禽呼肠孤病毒的保护。疫苗或病毒载体可以与药学上可接受量的如上所述的药学上可接受的稀释剂或载体和/或佐剂一起使用。
在又一方面，本发明涉及对禽类物种进行疫苗接种或者诱导禽类免疫应答以赋予针对禽呼肠孤病毒的保护的方法，包括将上文定义的任何一种疫苗或病毒载体施用于鸟。在特定的实施方案中，所述疫苗包含如上所述的四种分离的多肽的组合。所述疫苗或病毒载体可以与药学上可接受量的如上所述的药学上可接受的稀释剂或载体和/或佐剂一起施用。
在某些实施方案中，可以使用本文所述的任何一种疫苗和方法进行接种的禽类物种是商业上生产的任何鸟类物种，例如家禽，诸如鸡、火鸡、鸭、鹅、野鸡、鸽子或珍珠鸡。
在某些实施方案中，与将ARV毒株S1133的全长sigma C蛋白施用于鸟后获得的所述抗体的全身水平相比，上文公开的用途或方法诱导产生显著更高，例如统计学上显著更高的全身水平的中和抗sigma C蛋白抗体。
在某些实施方案中，疫苗可以通过任何合适的施用途径进行施用，例如通过皮内或皮下注射；或通过饮用水口服。
现在通过以下非限制性实施例说明本发明。
实施例
材料和方法
SC蛋白的表达
通过聚合酶链反应(PCR)用特别设计的寡核苷酸产生编码SC残基1-326、122-326和192-326的三个来自疫苗毒株s1133的SC的cDNA片段(表3)。片段122-326和192-326用限制酶切割BamHI和EagI并在合成期间引入引物中，并克隆到表达载体pET28a(Novagen,Darmstadt,Germany)中，其包括在N末端含有六个连续组氨酸残基的纯化标签。通过DNA序列分析(Hy-Labs,Rehovot,Israel)确认插入序列。为了表达，用质粒新转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)。培养物在37℃需氧生长至0.6-0.8的600nm光密度(OD)。将培养物冷却至25℃以下，加入1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，并在25℃下培养3小时以诱导表达。将收获的细胞重悬于40ml冷重悬浮缓冲液(4.29mM Na2HPO4，1.47mM KH2PO4，2.7mM KCl，137mM NaCl，0.1％v/v Tween-20)中并在-20℃冷冻(Guardado-Calvo et al.2009)。通过超声处理将细菌裂解三次，每次10分钟(Sonics,Taunton,MA,USA)，离心(10,000×g，4℃下15分钟)，弃去沉淀。如前所述表达SC残基1-326(Goldenberg et al.2011)。根据制造商的说明书(Qiagen,Hilden,Germany)，在Ni-NTA琼脂糖柱中纯化表达的SC122-326蛋白片段。将纯化的蛋白质在4℃下用磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析过夜。通过12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测表达的SC蛋白。通过与在相同凝胶上跑胶的已知量的牛血清白蛋白的标准曲线进行比较来估计SC蛋白的量。
表3.用于扩增sigma C(SC)片段的设计寡核苷酸
a设计寡核苷酸以扩增编码SC122-326和SC192-326部分蛋白的基因；设计寡核苷酸的5'末端以在PCR扩增后分别产生限制酶位点BamHI-EagI、BamHI-EagI和EcoRI-EcoRI(下划线)。
毕赤酵母(Pichia pastoris)中SC的克隆与表达
用特别设计的寡核苷酸通过PCR产生编码SC残基1-326的DNA片段(表3)。该片段被限制酶EcoRI(GAATTC)切割，其在合成期间由引物引入。如前所述如前所述(Pitcovski etal.2003)将分离的片段连接到巴斯德毕赤酵母试剂盒(P.pastoris kit)(Invitrogen,SanDiego,CA,USA)中提供的质粒pHILD2中。简而言之，将连接的DNA构建体转化到大肠杆菌XL1-蓝细胞中，在含有氨苄青霉素(100μg/ml)、X-Gal至终浓度为80μg/ml和IPTG至终浓度20mM的LB(luria-bertani)平板上生长的白色菌落被分离。表征后，如下将含有具有正确序列的SC的质粒克隆到巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中。
将载体线性化并导入巴斯德毕赤酵母细胞，导致转基因插入AOX1基因座。培养阳性菌落，通过加入甲醇诱导重组蛋白质的产生。诱导后，通过用玻璃珠涡旋裂解细胞，离心，并通过SDS-PAGE分析含有可溶性SC的上清液。
(ELISA)酶联免疫吸附试验(ELISA)
为了确定抗SC抗体滴度，在ELISA中使用SC作为抗原。将抗原在包被缓冲液(0.397g Na2CO3，0.732g NaHCO3，250ml双蒸水pH 9.6)中稀释，并于4℃在ELISA板(Nunc,Rochester,NY,USA)中温育24小时。每个顺序步骤之后用0.05％Tween-20的PBS溶液洗涤三次。将用测试的蛋白质或对照接种的鸡血清在封闭缓冲液(5％w/v脱脂乳，0.05％Tween-20的PBS溶液)中连续双倍稀释(1:100-1:800,000)并温育1小时。加入1:7000稀释的二抗，过氧化物酶缀合的兔抗鸡IgG(Sigma,Rehovot,Israel)，将混合物温育1小时。然后加入底物邻苯二胺二盐酸盐(Sigma)。通过ELISA读数器(Thermo Scientific Multiskan RC,Vantaa,Finland)在450nm下测量OD。终点滴度被确定为OD仍为阳性(相对于ELISA中的阴性对照)的最后稀释度。
根据制造商的说明，通过商业ELISA(Laboratories,USA)测定接种鸟类血清中抗ARV抗体的水平。OD值在650nm下测量。大于0.2的样品-阳性(S/P)比率被认为是ARV阳性(S/P比＝样品平均OD)-阴性对照平均OD/阳性对照平均OD-阴性对照平均OD)。
细胞增殖试验
在疫苗接种后42天从鸟收集脾脏，并用注射器柱塞通过筛网筛分以获得PBS中的单细胞悬浮液。将脾细胞悬浮于补充有2％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、青霉素(100U/ml)和链霉素(10ng/ml)的RPMI 1640中(Biotech Industry,Bet Haemek,Isarel)。将细胞(每孔1×106)接种在96孔培养板中。将伴刀豆球蛋白A(ConA；5μg/ml)、脂多糖(LPS；5μg/ml)或ARV(5μl/孔，滴度为106.6)(Sigma Aldrich)作为刺激物一式三份加入并温育48小时。通过向每个孔中加入20μl CTB试剂(Promega,Madison,WI,USA)来进行细胞滴度蓝(CTB)测定。然后将细胞在37℃，5％CO2下温育6小时。通过荧光计分别在560nm和590nm的激发/发射波长下定量CTB试剂的颜色强度。测量的吸光度与活细胞数成比例。计算结果并表示为刺激指数(SI)，表示刺激细胞和未刺激细胞之间的比率。
毒性ARV株s1133的中和试验
通过在接种(inoculation)后3-7天监测胚胎死亡率的抑制来测试血清中和毒性呼肠孤病毒的能力。将测试的血清过滤并在56℃下加热30分钟以使补体活性失活。用PBS以一系列10倍稀释液稀释病毒。将等体积稀释的病毒和血清的混合物(或作为阴性对照的PBS)在室温下温育40分钟。将每种混合物接种到5个可育的7日龄SPF含胚卵中。
为了证实指示病毒(indicator virus)的毒性潜力，用未稀释的病毒接种10个卵，所述未稀释的病毒与PBS以1:1混合。此外，在几个实验中，将无病毒血清接种到含胚卵中以证实不存在由于血清成分所致的非特异性死亡。每天在暗室中照射所有卵以确定胚胎活力，并记录活胚胎和死胚胎的数量。
中和指数(NI)被确定为杀死至少95％(累积)胚胎的最高病毒稀释度与在抗体存在下杀死相同百分比的胚胎的病毒稀释度之间的比率。NI值表示为稀释度(dilution)对数之间的比率。抗血清中的NI为2或更高则被认为已经中和病毒。
表4.疫苗接种计划
a日龄；b阳性对照；c阴性对照
统计
通过单因素方差分析(ANOVA)和Tukey检验分析ELISA、中和和细胞增殖结果。所有分析均使用GraphPadPrism5软件进行。
实施例1.SC蛋白表达
在分析SC蛋白结构后，产生、克隆并在大肠杆菌中表达编码三个多肽残基：1-326、122-326、192-326的cDNA片段。在5'末端添加多组氨酸标签以允许检测和纯化表达的蛋白质。将得到的蛋白质部分纯化。在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上测定，表达的SC片段分别为预期大小的36kD、23kD和15kD。
图1显示了四种不同呼肠孤病毒分离株的122-326片段的有效表达：SC1133、SC528、SC5223和SC5215。
实施例2.抗体对疫苗接种的反应
接种疫苗后，通过ELISA测试SC蛋白的免疫原性和产生的抗体检测病毒的能力。使用SC122-326作为抗原，在用蛋白质SC122-326和SC192-326疫苗接种后获得的抗体以1:800,000的高滴度检测抗原。该组中鸟类滴度的平均值显著高于阴性对照组(P<0.001)，而疫苗接种SC1-326蛋白后获得的抗体滴度的平均值与阴性对照相似(图2)。
接种SC192-326或阴性对照后针对全病毒的抗体水平达到0.2或更低，而接种SC1-326或SC122-326后获得的抗体为阳性(分别为0.25和0.5)(图3)。SC122-326组的S/P显著高于其他组。
类似地，接种疫苗后，通过ELISA测试四种不同RI组(SEQ ID NO:2、3、4和5)的SC122-326片段的免疫原性和产生的抗体检测病毒的能力。
实施例3.细胞增殖
检查来自接种疫苗的鸡的脾细胞的抗原特异性细胞增殖。细胞用ConA处理作为T细胞增殖的对照，用LPS处理作为T细胞增殖的对照(阳性对照)，用PBS处理(阴性对照)以及用ARV(特异性抗原)处理。在CTB测定中，测量的吸光度与活细胞的数量成比例。结果表示为SI(有丝分裂原或抗原刺激的/非刺激的细胞)。
阳性对照处理在刺激后表现出增殖。用ARV刺激的细胞在治疗组中显示出显著差异。与阴性对照相比，用病毒或SC122-326免疫组的细胞显示出显著的增殖(P<0.01)，而注射SC1-326的组中的增殖显著低于SC122-326或阳性对照组(P<0.05)(图4)。
类似地，检查来自用包含SEQ ID NO:2、3、4和5的多肽的组合疫苗接种的鸡的脾细胞的抗原特异性细胞增殖。
实施例4.SC122-326在引发针对ARV的应答中的作用
测试了疫苗接种SC122-326与用全病毒疫苗接种相比作为针对ARV的初级应答的诱导物的效果。一组鸡注射ARV株s1133疫苗，另一组注射SC122-326。两周后，ARV s1133被注射到两组。用ARV或SC122-326初次疫苗接种，在用完整ARV进行二次疫苗接种后诱导类似的显著升高(图5)。
类似地，测试了用包含SEQ ID NO:2、3、4和5的多肽的组合疫苗接种与用全病毒疫苗接种相比作为针对ARV的初级应答的诱导物的效果。
实施例5.病毒中和
测试来自接种疫苗的鸟类的血清对SPF含胚卵中的毒性病毒的中和能力。阴性对照鸟类或注射SC1-326(NI＝0)的组产生的血清不赋予保护作用。相反，注射了蛋白质SC122-326的鸟类产生的血清赋予了保护(中和能力)，其与用全病毒(NI<4)接种后产生的抗体所获得的保护相似(表3)。
类似地，测试了来自于用包含SEQ ID NO:2、3、4和5的多肽的组合疫苗接种的鸟类的血清对SPF含胚卵中的毒性病毒的中和能力。
表5.通过抗ARV或SC片段的抗体中和病毒
a中和指数(NI)值为2或更高被认为是对该病毒的中和。
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Met Ala Gly Leu Asn Pro Ser Gln Arg Arg Glu Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Leu Ser Leu Thr Ser Asn Val Asn Ile Ser His Gly Asp Leu Thr Pro
20 25 30
Ile Tyr Glu Arg Leu Thr Asn Leu Glu Ala Ser Thr Glu Leu Leu His
35 40 45
Arg Ser Ile Ser Asp Ile Ser Thr Thr Val Ser Asn Ile Ser Ala Asn
50 55 60
Leu Gln Asp Met Thr His Thr Leu Asp Asp Val Thr Ala Asn Leu Asp
65 70 75 80
Gly Leu Arg Thr Thr Val Thr Ala Leu Gln Asp Ser Val Ser Ile Leu
85 90 95
Ser Thr Asn Val Thr Asp Leu Thr Asn Arg Ser Ser Ala His Ala Ala
100 105 110
Ile Leu Ser Ser Leu Gln Thr Thr Val Asp Gly Asn Ser Thr Ala Ile
115 120 125
Ser Asn Leu Lys Ser Asp Ile Ser Ser Asn Gly Leu Ala Ile Thr Asp
130 135 140
Leu Gln Asp Arg Val Lys Ser Leu Glu Ser Thr Ala Ser His Gly Leu
145 150 155 160
Ser Phe Ser Pro Pro Leu Ser Val Ala Asp Gly Val Val Ser Leu Asp
165 170 175
Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Gln Arg Val Ser Leu Thr Ser Tyr Ser
180 185 190
Ala Glu Ala Gln Leu Met Gln Phe Arg Trp Met Ala Arg Gly Thr Asn
195 200 205
Gly Ser Ser Asp Thr Ile Asp Met Thr Val Asn Ala His Cys His Gly
210 215 220
Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Ser Thr Gly Asn Leu Thr Val Thr
225 230 235 240
Ser Asn Val Val Leu Leu Thr Phe Asp Leu Ser Asp Ile Thr His Ile
245 250 255
Pro Ser Asp Leu Ala Arg Leu Val Pro Ser Ala Gly Phe Gln Ala Ala
260 265 270
Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Asp Ser Ala Thr His Ala
275 280 285
Tyr Gln Ala Tyr Gly Val Tyr Ser Ser Ser Arg Val Phe Thr Ile Thr
290 295 300
Phe Pro Thr Gly Gly Asp Gly Thr Ala Asn Ile Arg Ser Leu Thr Val
305 310 315 320
Arg Thr Gly Ile Asp Thr
325
<210> 2
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
Asp Gly Asn Ser Thr Ala Ile Ser Asn Leu Lys Ser Asp Ile Ser Ser
1 5 10 15
Asn Gly Leu Ala Ile Thr Asp Leu Gln Asp Arg Val Lys Ser Leu Glu
20 25 30
Ser Thr Ala Ser His Gly Leu Ser Phe Ser Pro Pro Leu Ser Val Ala
35 40 45
Asp Gly Val Val Ser Leu Asp Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Gln Arg
50 55 60
Val Ser Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Glu Ala Gln Leu Met Gln Phe Arg
65 70 75 80
Trp Met Ala Arg Gly Thr Asn Gly Ser Ser Asp Thr Ile Asp Met Thr
85 90 95
Val Asn Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Ser
100 105 110
Thr Gly Asn Leu Thr Val Thr Ser Asn Val Val Leu Leu Thr Phe Asp
115 120 125
Leu Ser Asp Ile Thr His Ile Pro Ser Asp Leu Ala Arg Leu Val Pro
130 135 140
Ser Ala Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr
145 150 155 160
Arg Asp Ser Ala Thr His Ala Tyr Gln Ala Tyr Gly Val Tyr Ser Ser
165 170 175
Ser Arg Val Phe Thr Ile Thr Phe Pro Thr Gly Gly Asp Gly Thr Ala
180 185 190
Asn Ile Arg Ser Leu Thr Val Arg Thr Gly Ile Asp Thr
195 200 205
<210> 3
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
Gln Ala Leu Leu Val Glu Val Ser Asn Leu Lys Ser Ser Val Ser Ser
1 5 10 15
Gln Gly Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Arg Arg Val Gln Ala Leu Glu
20 25 30
Gly Gly Ser Ser Thr Thr Leu Ser Phe Ala Asp Pro Leu Lys Leu Glu
35 40 45
Asp Gly Thr Val Ser Leu Glu Leu Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Val Ser
50 55 60
Arg Asn Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln
65 70 75 80
Trp Ser Val Lys Gly Glu Asp Gly Ala Ala Asn Ser Ile Asp Met Asp
85 90 95
Val Asn Ala His Ser His Gly Pro Arg Thr Asp Tyr Leu Met Ser Thr
100 105 110
Lys Gln Ser Leu Thr Val Thr Thr Ser Pro Ala Thr Leu Val Phe Glu
115 120 125
Leu Asp Arg Ile Thr Ser Leu Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu Ile Pro
130 135 140
Cys His Gly Phe Gln Gln Ala Thr Phe Pro Val Asp Ile Ser Phe Gln
145 150 155 160
Arg Asp Gly Val Ser His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly Lys Tyr Ser Ser
165 170 175
Ser Arg Val Phe Thr Ile Thr Phe Pro Thr Gly Gly Asp Gly Thr Ala
180 185 190
Asn Ile Arg Ser Leu Thr Val Arg Thr Gly Ile Asp Thr
195 200 205
<210> 4
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
Asn Gly Asn Ser Ser Ala Ile Ser Asn Leu Arg Asn Asp Val Ser Ala
1 5 10 15
Ser Gly Leu Asn Ile Thr Asp Leu Gln Asn Arg Val Lys Ser Leu Glu
20 25 30
Ser Asp Thr Ser His Gly Leu Ser Phe Ser Pro Pro Leu Ser Val Ala
35 40 45
Asp Gly Val Val Ser Leu Asp Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Gln Arg
50 55 60
Val Ser Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Glu Ala Arg Leu Met Gln Phe Gln
65 70 75 80
Trp Val Ala Lys Gly Thr Ser Gly Ser Ser Asp Thr Ile Asp Met Thr
85 90 95
Val Asn Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Ser
100 105 110
Thr Gly Gly Leu Thr Val Thr Ser Asn Ala Val Ser Leu Thr Phe Asp
115 120 125
Leu Ser Tyr Ile Thr Asn Met Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu Ile Pro
130 135 140
Ser Ala Gly Phe Gln Val Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr
145 150 155 160
Arg Glu Ser Ser Thr His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly Ala Tyr Ser Ser
165 170 175
Ala Arg Val Phe Thr Ile Thr Phe Pro Thr Gly Gly Asn Gly Thr Ser
180 185 190
Asn Ile Arg Phe Leu Thr Val Arg Thr Gly Ile Asp Thr
195 200 205
<210> 5
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
Asn Ala Asn Val Thr Asp Ile Ala Asn Leu Lys Gly Ser Val Thr Thr
1 5 10 15
Leu Ser Leu Thr Val Thr Asp Leu Glu Lys Arg Leu Lys Val Val Glu
20 25 30
Ser Gly Ser Ser Ser Ser Leu Glu Phe Thr Ser Pro Leu Ser Leu Thr
35 40 45
Asp Gly Val Val Ser Leu Asn Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Asp Asn
50 55 60
His Ala Leu Thr Ser Tyr Ser Ser Asp Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln
65 70 75 80
Trp Leu Ala Arg Gly Asp Asp Gly Ser Ala Gly Ser Val Glu Met Leu
85 90 95
Val Asn Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Thr
100 105 110
Thr Glu Asn Leu Thr Val Thr Gly Asn Ser Thr Ser Leu Val Phe Ser
115 120 125
Leu Asp Tyr Ile Thr Lys Pro Pro Ser Asp Met Ser Arg Leu Val Pro
130 135 140
Arg Ala Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr
145 150 155 160
Arg Asp Thr Thr Thr His Ala Tyr Gln Val Tyr Gly Ala Tyr Ser Ser
165 170 175
Ser Arg Val Phe Thr Ile Thr Phe Pro Thr Gly Gly Asp Gly Thr Ala
180 185 190
Asn Ile Arg Ser Leu Thr Val Arg Thr Gly Ile Asp Thr
195 200 205
<210> 6
<211> 267
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 6
Gly Asp Leu Lys Ser Val Tyr Glu Arg Leu Thr Ser Leu Glu Ala Ser
1 5 10 15
Thr Glu Ser Leu Arg Gln Ser Val Ser Gly Met Ser Val Thr Leu Ser
20 25 30
Asp Leu Ser Ala Asp Leu Gln Asp Thr Thr Arg Ala Leu Asp Asp Val
35 40 45
Thr Val Thr Leu Asn Asn Leu Ser Ala Thr Ile Thr Ala Leu Gln Ser
50 55 60
Ser Val Thr Thr Leu Ser Ala Thr Val Asp Glu Leu Thr Asn Thr Ser
65 70 75 80
Ser Ala His Ser Gly Met Leu Ser Ser Leu Gln Thr Ile Ile Asn Gly
85 90 95
Asn Ser Ser Ala Ile Ser Asn Leu Arg Asn Asp Val Ser Ala Ser Gly
100 105 110
Leu Asn Ile Thr Asp Leu Gln Asn Arg Val Lys Ser Leu Glu Ser Asp
115 120 125
Thr Ser His Gly Leu Ser Phe Ser Pro Pro Leu Ser Val Ala Asp Gly
130 135 140
Val Val Ser Leu Asp Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Gln Arg Val Ser
145 150 155 160
Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Glu Ala Arg Leu Met Gln Phe Gln Trp Val
165 170 175
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180 185 190
Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Ser Thr Gly
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Gly Phe Gln Val Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Glu
245 250 255
Ser Ser Thr His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly Ala
260 265
<210> 7
<211> 268
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 7
Gly Asp Leu Lys Ser Val Tyr Glu Arg Leu Asn Ser Leu Glu Ala Ser
1 5 10 15
Thr Glu Ser Leu Arg Gln Ser Val Ser Gly Met Ser Val Thr Leu Ser
20 25 30
Asp Leu Ser Ala Asp Leu Gln Asp Thr Thr Arg Ala Leu Asp Asp Val
35 40 45
Thr Val Thr Leu Asn Asn Leu Ser Ala Thr Ile Thr Ala Leu Gln Ser
50 55 60
Ser Val Thr Thr Leu Ser Ala Thr Val Asp Glu Leu Thr Asn Thr Ser
65 70 75 80
Ser Ala His Ser Gly Met Leu Ser Ser Leu Gln Thr Ile Ile Asn Gly
85 90 95
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100 105 110
Phe Asp Ile Ser Asp Leu Gln Asn Arg Val Lys Ser Leu Glu Ser Asp
115 120 125
Thr Ser His Gly Leu Ser Phe Ser Pro Pro Leu Ser Val Ala Asp Gly
130 135 140
Val Val Ser Leu Asp Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Gln Arg Val Ser
145 150 155 160
Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Glu Ala Arg Leu Met Gln Phe Gln Trp Val
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195 200 205
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Gly Phe Gln Val Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Glu
245 250 255
Ser Ser Thr His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly Ala Tyr
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<211> 315
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 8
Ser Ser Gln Arg Arg Glu Val Val Ser Leu Ile Leu Ser Leu Asn Ser
1 5 10 15
Asn Val Thr Ile Asn Pro Gly Asp Leu Lys Ser Val Tyr Glu Arg Leu
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Asn Ser Leu Glu Ala Ser Thr Glu Ser Leu Arg Gln Ser Val Ser Gly
35 40 45
Met Ser Val Thr Leu Ser Asp Leu Ser Ala Asp Leu Gln Asp Thr Thr
50 55 60
Arg Ala Leu Asp Asp Val Thr Val Thr Leu Asn Asn Leu Ser Ala Thr
65 70 75 80
Ile Thr Ala Leu Gln Ser Ser Val Thr Thr Leu Ser Ala Thr Val Asp
85 90 95
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100 105 110
Gln Thr Ile Ile Asn Gly Asn Ser Ser Ala Ile Ser Asn Leu Arg Asn
115 120 125
Asp Val Ser Ala Ser Gly Leu Asn Ile Thr Asp Leu Gln Asn Arg Val
130 135 140
Lys Ser Leu Glu Ser Asp Thr Ser His Gly Leu Ser Phe Ser Pro Pro
145 150 155 160
Leu Ser Val Ala Asp Gly Val Val Ser Leu Asp Met Asp Pro Tyr Phe
165 170 175
Cys Ser Gln Arg Val Ser Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Glu Ala Arg Leu
180 185 190
Met Gln Phe Gln Trp Val Ala Lys Gly Thr Ser Gly Ser Ser Asp Thr
195 200 205
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210 215 220
Met Met Ser Ser Thr Gly Gly Leu Thr Val Thr Ser Asn Ala Val Ser
225 230 235 240
Leu Thr Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Thr Asn Met Pro Ser Asp Leu Ser
245 250 255
Arg Leu Ile Pro Ser Ala Gly Phe Gln Val Ala Ser Phe Pro Val Asp
260 265 270
Val Ser Phe Thr Arg Glu Ser Ser Thr His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly
275 280 285
Ala Tyr Ser Ser Ala Arg Val Phe Thr Ile Thr Phe Pro Thr Gly Gly
290 295 300
Asn Gly Thr Ser Asn Ile Arg Phe Leu Thr Val
305 310 315
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<211> 301
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 9
Gln Arg Arg Glu Val Val Ser Leu Ile Leu Ser Leu Thr Ser Asn Ala
1 5 10 15
Thr Ile Asn Pro Gly Asp Leu Thr Ser Ile Arg Glu Arg Leu Thr Ser
20 25 30
Leu Glu Ala Ser Thr Glu Ser Leu Ser Arg Ser Ile Ser Ser Met Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Thr Leu Gln Asp Ser Val Ser Thr Leu Ser Thr Thr Val Thr Asp Leu
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130 135 140
Leu Glu Ser Ala Ser Ser His Gly Leu Ser Phe Ser Pro Pro Leu Ser
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Val Ala Asp Gly Val Val Ser Leu Asn Leu Asp Pro Tyr Phe Cys Ser
165 170 175
Gln Arg Val Ser Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Glu Ala Leu Leu Met Gln
180 185 190
Phe Gln Trp Met Ala Arg Gly Thr Asn Gly Ser Ala Asp Asn Ile Asp
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Ser Ser Thr Gly Gly Leu Thr Val Thr Gln Asn Ala Val Ser Leu Thr
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Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Thr Arg Phe Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu
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Ile Pro Ser Ala Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser
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Phe Thr Arg Gly Ser Thr Thr His Thr Tyr Gln Ala Tyr Gly Val Tyr
275 280 285
Ser Ser Ser Arg Ile Phe Thr Ile Thr Phe Pro Thr Gly
290 295 300
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<211> 316
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 10
Gln Arg Arg Glu Val Val Ser Leu Ile Leu Ser Leu Asn Ser Asn Val
1 5 10 15
Thr Ile Asn Pro Gly Asp Leu Lys Ser Val Tyr Glu Arg Leu Thr Ser
20 25 30
Leu Glu Ala Ser Thr Glu Ser Leu Arg Gln Ser Val Ser Gly Met Ser
35 40 45
Val Thr Leu Ser Asp Leu Ser Ala Asp Leu Gln Asp Thr Thr Arg Ala
50 55 60
Leu Asp Asp Val Thr Val Thr Leu Asn Asn Leu Ser Ala Thr Ile Thr
65 70 75 80
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Thr Asn Thr Ser Ser Ala His Ser Gly Met Leu Ser Ser Leu Gln Thr
100 105 110
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115 120 125
Ser Ala Ser Gly Leu Asn Ile Thr Asp Leu Gln Asn Arg Val Lys Ser
130 135 140
Leu Glu Ser Asp Thr Ser His Gly Leu Ser Phe Ser Pro Pro Leu Ser
145 150 155 160
Val Ala Asp Gly Val Val Ser Leu Asp Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser
165 170 175
Gln Arg Val Ser Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Glu Ala Arg Leu Met Gln
180 185 190
Phe Gln Trp Val Ala Lys Gly Thr Ser Gly Ser Ser Asp Thr Ile Asp
195 200 205
Met Thr Val Asn Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met
210 215 220
Ser Ser Thr Gly Gly Leu Thr Val Thr Ser Asn Ala Val Ser Leu Thr
225 230 235 240
Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Thr Asn Met Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu
245 250 255
Ile Pro Ser Ala Gly Phe Gln Val Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser
260 265 270
Phe Thr Arg Glu Ser Ser Thr His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly Ala Tyr
275 280 285
Ser Ser Ala Arg Val Phe Thr Ile Thr Phe Pro Thr Gly Gly Asn Gly
290 295 300
Thr Ser Asn Ile Arg Phe Leu Thr Leu Arg Thr Gly
305 310 315
<210> 11
<211> 318
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 11
Ser Gln Arg Arg Glu Val Val Ser Leu Ile Leu Ser Leu Thr Ser Asn
1 5 10 15
Ala Thr Ile Asn Pro Gly Asp Leu Thr Ser Ile Arg Glu Arg Leu Thr
20 25 30
Ser Leu Glu Ala Ser Thr Glu Ser Leu Ser Arg Ser Ile Ser Ser Met
35 40 45
Ser Thr Thr Val Ser Asp Leu Ser Ala Asp Leu Gln Asn Val Thr Arg
50 55 60
Ala Leu Asp Asp Val Thr Ala Asn Leu Asn Gly Ile Arg Val Thr Ile
65 70 75 80
Thr Thr Leu Gln Asp Ser Val Ser Thr Leu Ser Thr Thr Val Thr Asp
85 90 95
Leu Ser Arg Thr Ser Ser Ala His Ser Glu Ser Leu Ser Ser Leu Arg
100 105 110
Thr Ile Val Asp Gly Asn Ser Thr Ile Ile Gly Asn Leu Lys Ser Asp
115 120 125
Val Ala Ser Asn Gly Leu Ala Ile Thr Asp Leu Gln Ser Arg Val Lys
130 135 140
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Ser Val Ala Asp Gly Val Val Ser Leu Asn Leu Asp Pro Tyr Phe Cys
165 170 175
Ser Gln Arg Val Ser Leu Ala Ser Tyr Ser Ala Glu Ala Leu Leu Met
180 185 190
Gln Phe Gln Trp Met Ala Arg Gly Thr Asn Gly Ser Ala Asp Asn Ile
195 200 205
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Thr Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Thr Arg Phe Pro Ser Asp Leu Ser Arg
245 250 255
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260 265 270
Ser Phe Thr Arg Gly Ser Thr Thr His Thr Tyr Gln Ala Tyr Gly Val
275 280 285
Tyr Ser Ser Ser Arg Ile Phe Thr Ile Thr Phe Pro Thr Gly Gly Asp
290 295 300
Gly Pro Ala Asn Ile Arg Phe Leu Thr Val Arg Thr Gly Ile
305 310 315
<210> 12
<211> 267
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 12
Gly Asp Leu Met Gln Ile His Glu Arg Leu Ser Ala Leu Glu Leu Thr
1 5 10 15
Thr Thr Ser Leu Asn Asp Ser Val Asn Thr Ala Leu Ser Lys Val Thr
20 25 30
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50 55 60
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Val Thr His Gly Ser Ser Ile Ser Asp Leu Gln Lys Glu Gly Gln Ala
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100 105 110
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115 120 125
Ser Ser Thr Thr Leu Ser Phe Ala Asp Pro Leu Lys Phe Glu Asp Gly
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Thr Val Ser Leu Glu Leu Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Val Ser Arg Asn
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Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Ser
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Ser Leu Thr Val Thr Ser Leu Leu Ala Thr Leu Val Phe Glu Leu Gly
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Arg Ile Thr Ser Leu Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu Ile Pro Cys His
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Gly Phe Gln Gln Ala Thr Phe Pro Val Asp Ile Ser Phe Gln Arg Asp
245 250 255
Gly Val Ser His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly Lys
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<210> 13
<211> 305
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 13
Leu Ile Leu Ser Leu Thr Ser Ser Val Thr Ile Ser Pro Gly Asp Leu
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Leu Asn Asp Ser Val Asn Thr Ala Leu Ser Lys Val Thr Asp Leu Ser
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Gly Ser Ala Ile Ser Asp Leu Gln Lys Glu Gly Gln Val Leu Leu Val
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Ser Asn Leu Glu Arg Arg Val Gln Ala Leu Glu Gly Gly Ser Ser Thr
130 135 140
Thr Leu Ser Phe Ala Asp Pro Leu Lys Leu Glu Asp Gly Thr Val Ser
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Leu Glu Leu Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Val Ser Arg Asn Leu Thr Ser
165 170 175
Tyr Ser Ala Gly Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Glu Asp Gly Ala Ala Asn Ser Ile Asp Met Asp Val Asn Ala His Ser
195 200 205
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210 215 220
Val Thr Thr Ser Pro Ala Thr Leu Val Phe Glu Leu Asp Arg Ile Thr
225 230 235 240
Ser Leu Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu Ile Pro Cys His Gly Phe Gln
245 250 255
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His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly Lys Tyr Val Ser Ser Arg Val Phe Lys
275 280 285
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290 295 300
Thr
305
<210> 14
<211> 312
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 14
Gln Arg Arg Glu Val Val Gly Leu Ile Leu Ser Leu Thr Ser Ser Val
1 5 10 15
Thr Ile Ser Pro Gly Asp Leu Thr Gln Ile His Glu Arg Leu Ser Ala
20 25 30
Leu Glu Leu Thr Thr Thr Ser Leu Asn Asp Ser Val Asn Thr Ala Leu
35 40 45
Ser Lys Val Thr Asp Leu Ser Gly Ser Leu Asp Asn Met Ala Val Ser
50 55 60
Leu Ala Glu Thr Lys Val Glu Leu Ser Ser Leu Ser Ser Ala Val Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Thr Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Glu Leu Ala Ser Leu
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115 120 125
Ser Ser Gln Gly Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Arg Arg Val Gln Ala
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Leu Glu Gly Gly Ser Ser Thr Thr Leu Ser Phe Ala Asp Pro Leu Lys
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Leu Glu Asp Gly Thr Val Ser Leu Glu Leu Asp Pro Tyr Phe Cys Ser
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Val Ser Arg Asn Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Gln Leu Met Gln
180 185 190
Phe Gln Trp Ser Val Lys Gly Glu Asp Gly Ala Ala Asn Ser Ile Asp
195 200 205
Met Asp Val Asn Ala His Ser His Gly Pro Arg Thr Asp Tyr Leu Met
210 215 220
Ser Thr Lys Gln Ser Leu Thr Val Thr Thr Ser Pro Ala Thr Leu Val
225 230 235 240
Phe Glu Leu Asp Arg Ile Thr Ser Leu Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu
245 250 255
Ile Pro Cys His Gly Phe Gln Gln Ala Thr Phe Pro Val Asp Ile Ser
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Pro Ala Val Val Gln Phe Leu Thr
305 310
<210> 15
<211> 260
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 15
Val Val Gly Leu Ile Leu Ser Leu Thr Ser Ser Val Thr Ile Ser Pro
1 5 10 15
Gly Asp Leu Met Gln Ile His Glu Arg Leu Ser Ala Leu Glu Ser Ala
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Leu Asp Ser Ser Ala Ser Glu Leu Ala Ser Leu Ser Ser Leu Val
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His Asp His Gly Ser Ser Ile Ser Asp Leu Gln Lys Gly Ser Arg Val
100 105 110
Leu Ser Val Glu Val Asp Asn Leu Lys Ser Ser Val Ser Ser Gln Gly
115 120 125
Leu Met Ile Ser Ser Leu Glu Ser Arg Val Gln Ala Leu Glu Gly Gly
130 135 140
Pro Gly Thr Asn Leu Ser Phe Ala Asp Pro Leu Lys Leu Glu Asp Gly
145 150 155 160
Thr Val Ser Leu Glu Leu Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Val Ser Arg Asn
165 170 175
Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Asp Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Ser
180 185 190
Ala Lys Gly Glu Asp Gly Ala Ala Asn Ser Ile Asp Met Asp Val Asn
195 200 205
Ala His Ser His Gly Ser Arg Thr Asp Tyr Leu Met Ser Thr Lys Gln
210 215 220
Ser Leu Thr Val Thr Thr Ser Pro Ala Thr Leu Val Phe Glu Leu Gly
225 230 235 240
Arg Ile Thr Ala Leu Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu Ile Pro Cys His
245 250 255
Gly Phe Gln Gln
260
<210> 16
<211> 254
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 16
Gln Arg Arg Glu Val Val Gly Leu Ile Leu Ser Leu Thr Ser Ser Val
1 5 10 15
Thr Ile Ser Pro Gly Asp Leu Met Arg Ile His Glu Arg Leu Ser Ala
20 25 30
Leu Glu Leu Thr Thr Thr Ser Leu Asn Asp Ser Val Asn Thr Ala Leu
35 40 45
Ser Lys Val Thr Asp Leu Ser Gly Ser Leu Asp Asn Met Ala Val Ser
50 55 60
Leu Ala Glu Thr Lys Val Glu Leu Ser Ser Leu Ser Ser Ala Val Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Thr Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Glu Leu Ala Ser Leu
85 90 95
Ser Ser Leu Val Arg Asn His Gly Ser Ala Ile Ser Asp Leu Gln Lys
100 105 110
Glu Gly Gln Ala Leu Leu Val Glu Val Ser Asn Leu Lys Ser Ser Val
115 120 125
Ser Ser Gln Gly Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Arg Arg Val Gln Ala
130 135 140
Leu Glu Gly Gly Ser Ser Thr Thr Leu Ser Phe Ala Asp Pro Leu Lys
145 150 155 160
Leu Glu Asp Gly Thr Val Ser Leu Glu Leu Asp Pro Tyr Phe Cys Ser
165 170 175
Val Ser Arg Asn Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Gln Leu Met Gln
180 185 190
Phe Gln Trp Ser Val Lys Gly Glu Asp Gly Ala Ala Asn Ser Ile Asp
195 200 205
Met Asp Val Asn Ala His Ser His Gly Pro Arg Thr Asp Tyr Leu Met
210 215 220
Ser Thr Lys Gln Ser Leu Thr Val Thr Thr Ser Pro Ala Thr Leu Val
225 230 235 240
Phe Glu Leu Asp Arg Ile Thr Ser Leu Pro Ser Asp Leu Ser
245 250
<210> 17
<211> 267
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 17
Gly Asp Leu Thr Thr Ile Tyr Glu Arg Leu Leu Lys Leu Asp Ser Ser
1 5 10 15
Val Glu Ser Leu Thr Ile Ser Val Gly Asp Leu Ser Arg Lys Leu Ser
20 25 30
Glu Leu Glu Val Asp Leu Gln Asn Ile Asp Ser Ser Met His Gln Leu
35 40 45
Thr Ser Ser Leu Thr Thr Leu Ser Glu Glu Val Arg Gln Leu Arg Ser
50 55 60
Ala Val Gly Asp Asn Thr Asp Ser Ile Ser Ser Leu Ser Thr Met Val
65 70 75 80
Ser Asp His Gln Gln Leu Leu Ala Asp Leu Arg Thr Ser Leu Asn Ala
85 90 95
Asn Val Thr Asp Ile Thr Asn Leu Lys Gly Gly Val Thr Thr Leu Ser
100 105 110
Leu Thr Val Thr Asp Leu Glu Lys Arg Leu Lys Val Val Glu Ser Gly
115 120 125
Ser Ser Ser Ser Leu Glu Phe Thr Ser Pro Leu Ser Leu Thr Asp Gly
130 135 140
Val Val Ser Leu Asn Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Asp Asn His Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Tyr Ser Ser Asp Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Leu
165 170 175
Ala Arg Gly Asp Asp Gly Ser Ala Gly Ser Val Glu Met Leu Val Asn
180 185 190
Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Thr Thr Glu
195 200 205
Asn Leu Thr Val Thr Gly Asn Ser Thr Ser Leu Val Phe Ser Leu Asp
210 215 220
Tyr Ile Thr Lys Pro Pro Ser Asp Met Ser Arg Leu Val Pro Arg Ala
225 230 235 240
Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Asp
245 250 255
Thr Thr Thr His Ala Tyr Gln Val Tyr Gly Ala
260 265
<210> 18
<211> 267
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 18
Gly Asp Leu Thr Thr Ile Tyr Glu Arg Leu Leu Lys Leu Asp Ser Ser
1 5 10 15
Val Glu Ser Leu Thr Ile Ser Val Gly Asp Leu Ser Arg Lys Leu Ser
20 25 30
Glu Leu Glu Val Asp Leu Gln Asn Ile Asp Ser Ser Met His Gln Leu
35 40 45
Thr Ser Ser Leu Thr Thr Leu Ser Glu Glu Val Arg Gln Leu Arg Ser
50 55 60
Ala Val Gly Asp Asn Thr Asp Ser Ile Ser Ser Leu Ser Thr Met Val
65 70 75 80
Ser Asp His Gln Gln Leu Leu Ala Asp Leu Gln Thr Ser Leu Asn Ala
85 90 95
Asn Val Thr Asp Ile Thr Asn Leu Lys Gly Ser Val Thr Thr Leu Ser
100 105 110
Leu Thr Val Thr Asp Leu Glu Lys Arg Leu Lys Val Val Glu Ser Gly
115 120 125
Ser Ser Ser Ser Leu Glu Phe Thr Ser Pro Leu Ser Leu Thr Asp Gly
130 135 140
Val Val Ser Leu Asn Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Asp Asn His Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Leu
165 170 175
Ala Arg Gly Asp Asp Gly Ser Ala Gly Ser Val Glu Met Leu Val Asn
180 185 190
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195 200 205
Asn Leu Thr Val Thr Gly Asn Ser Thr Ser Leu Val Phe Ser Leu Asp
210 215 220
Tyr Ile Thr Lys Pro Pro Ser Asp Met Ser Arg Leu Val Pro Arg Ala
225 230 235 240
Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Asp
245 250 255
Thr Thr Thr His Ala Tyr Gln Val Tyr Gly Ala
260 265
<210> 19
<211> 267
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 19
Gly Asp Leu Thr Thr Ile Tyr Glu Arg Leu Leu Lys Leu Asp Ser Ser
1 5 10 15
Val Glu Ser Leu Thr Ile Ser Ala Gly Asp Leu Ser Arg Arg Phe Ser
20 25 30
Glu Leu Glu Val Asp Leu Gln Asn Val Asn Ser Ser Met His Gln Leu
35 40 45
Thr Ser Ser Leu Thr Thr Leu Ser Glu Glu Ala Arg Gln Leu Arg Ser
50 55 60
Ala Val Ser Asp Asn Thr Ala Ser Ile Ser Ser Leu Ser Thr Met Val
65 70 75 80
Ser Gly His Gln Gln Leu Leu Ala Asp Leu Gln Thr Ser Leu Asn Ala
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100 105 110
Leu Thr Val Thr Asp Leu Glu Lys Arg Leu Lys Val Val Glu Ser Gly
115 120 125
Ser Ser Ser Ser Leu Glu Phe Thr Ser Pro Leu Ser Leu Thr Asp Gly
130 135 140
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Leu Thr Ser Tyr Ser Ser Asp Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Leu
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225 230 235 240
Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Asp
245 250 255
Thr Thr Thr His Ala Tyr Gln Val Tyr Gly Ala
260 265
<210> 20
<211> 267
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 20
Gly Asp Leu Thr Thr Ile Tyr Glu Arg Leu Leu Lys Leu Asp Ser Ser
1 5 10 15
Val Glu Ser Leu Thr Ile Ser Ala Gly Asp Leu Ser Arg Arg Phe Ser
20 25 30
Glu Leu Glu Val Asp Leu Gln Asn Val Asn Ser Ser Met His Gln Leu
35 40 45
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100 105 110
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Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Asp
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Thr Thr Thr His Ala Tyr Gln Val Tyr Gly Ala
260 265
<210> 21
<211> 267
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 21
Gly Asp Leu Ala Ser Ile His Asp Arg Leu Leu Lys Leu Asp Ser Thr
1 5 10 15
Val Glu Ser Leu Thr Ala Ser Val Gly Asp Leu Ser Gln Lys Cys Ile
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Leu Thr Ser Tyr Ser Ser Asp Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Leu
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180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Asp
245 250 255
Thr Thr Thr His Ala Tyr Gln Val Tyr Gly Ala
260 265
<210> 22
<211> 296
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 22
Tyr Cys Ser Leu Thr Ser Xaa Arg Glu Tyr Lys Leu Trp Glu His Leu
1 5 10 15
Ala Ser Ile His Asp Arg Leu Leu Lys Leu Asp Ser Thr Val Glu Ser
20 25 30
Leu Thr Ala Ser Val Gly Asp Leu Ser Gln Lys Cys Ile Asp Leu Glu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Asp Ile Ala Ser Ser Met Ala Ser Leu Ser Thr Thr Val Ser Asp His
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100 105 110
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115 120 125
Ala Asp Leu Glu Lys Arg Leu Gly Val Val Glu Ser Gly Ser Ser Ser
130 135 140
Ser Leu Arg Phe Ser Ser Pro Leu Ser Leu Asn Asn Gly Val Val Ser
145 150 155 160
Leu Asp Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Asp Asn His Ser Leu Thr Ser
165 170 175
Tyr Ser Ser Asp Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Leu Ala Arg Gly
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Val Thr Gly Asn Ser Thr Ser Leu Val Phe Ser Leu Asp Tyr Ile Thr
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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Leu Arg Phe Leu Thr Gly Gly Thr
290 295
<210> 23
<211> 267
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 23
Gly Asp Leu Thr Pro Ile Tyr Glu Arg Leu Thr Asn Leu Glu Ala Ser
1 5 10 15
Thr Glu Leu Leu His Arg Ser Ile Ser Asp Ile Ser Thr Thr Val Ser
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65 70 75 80
Ser Ala His Ala Ala Thr Leu Ser Ser Leu Gln Thr Thr Val Asp Gly
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Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Asp
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Ser Ala Thr His Ala Tyr Gln Ala Tyr Gly Val
260 265
<210> 24
<211> 267
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 24
Gly Asp Leu Thr Thr Ile Tyr Glu Arg Leu Leu Lys Leu Asp Ser Ser
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Val Glu Ser Leu Thr Ile Ser Val Gly Asp Leu Ser Arg Lys Leu Ser
20 25 30
Glu Leu Glu Val Asp Leu Gln Asn Ile Asp Ser Ser Met His Gln Leu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Asp His Gln Gln Leu Leu Ala Asp Leu Gln Thr Ser Leu Asn Ala
85 90 95
Asn Val Thr Asp Ile Thr Asn Leu Lys Gly Ser Val Thr Thr Leu Ser
100 105 110
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115 120 125
Ser Ser Ser Ser Leu Glu Phe Thr Ser Pro Leu Ser Leu Thr Asp Gly
130 135 140
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145 150 155 160
Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Leu
165 170 175
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225 230 235 240
Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Asp
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260 265
<210> 25
<211> 267
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 25
Gly Asp Leu Thr Thr Ile Tyr Glu Arg Leu Leu Lys Leu Asp Ser Ser
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Val Glu Ser Leu Thr Ile Ser Ala Gly Asp Leu Ser Arg Arg Phe Ser
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35 40 45
Thr Ser Ser Leu Thr Thr Leu Ser Glu Glu Ala Arg Gln Leu Arg Ser
50 55 60
Ala Val Ser Asp Asn Thr Ala Ser Ile Ser Ser Leu Ser Thr Met Val
65 70 75 80
Ser Gly His Gln Gln Leu Leu Ala Asp Leu Gln Thr Ser Leu Asn Ala
85 90 95
Asn Val Thr Asp Ile Ala Asn Leu Lys Gly Ser Val Thr Thr Leu Ser
100 105 110
Leu Thr Val Thr Asp Leu Glu Lys Arg Leu Lys Val Val Glu Ser Gly
115 120 125
Ser Ser Ser Ser Leu Glu Phe Thr Ser Pro Leu Ser Leu Thr Asp Gly
130 135 140
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145 150 155 160
Leu Thr Ser Tyr Ser Ser Asp Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Leu
165 170 175
Ala Arg Gly Asp Asp Gly Ser Ala Gly Ser Val Glu Met Leu Val Asn
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Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Thr Thr Glu
195 200 205
Asn Leu Thr Val Thr Gly Asn Ser Thr Ser Leu Val Phe Ser Leu Asp
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Tyr Ile Thr Lys Pro Pro Ser Asp Met Ser Arg Leu Val Pro Arg Ala
225 230 235 240
Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Asp
245 250 255
Thr Thr Thr His Ala Tyr Gln Val Tyr Gly Ala
260 265
<210> 26
<211> 321
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 26
Leu Val Ile Ser Ser Gln Arg Arg Glu Val Val Ser Leu Ile Leu Ser
1 5 10 15
Leu Asn Ser Asn Val Thr Ile Asn Pro Gly Asp Leu Lys Ser Val Tyr
20 25 30
Glu Arg Leu Asn Ser Leu Glu Ala Ser Thr Glu Ser Leu Arg Gln Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Ala Thr Ile Thr Ala Leu Gln Ser Ser Val Thr Thr Leu Ser Ala
85 90 95
Thr Val Asp Glu Leu Thr Asn Thr Ser Ser Ala His Ser Gly Met Leu
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130 135 140
Asn Arg Val Lys Ser Leu Glu Ser Asp Thr Ser His Gly Leu Ser Phe
145 150 155 160
Ser Pro Pro Leu Ser Val Ala Asp Gly Val Val Ser Leu Asp Met Asp
165 170 175
Pro Tyr Phe Cys Ser Gln Arg Val Ser Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Glu
180 185 190
Ala Arg Leu Met Gln Phe Gln Trp Val Ala Lys Gly Thr Ser Gly Ser
195 200 205
Ser Asp Thr Ile Asp Met Thr Val Asn Ala His Cys His Gly Arg Arg
210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
Asp Leu Ser Arg Leu Ile Pro Ser Ala Gly Phe Gln Val Ala Ser Phe
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Gly
<210> 27
<211> 294
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 27
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Glu Ser Ser Ala Ser Glu Leu Ala Ser Leu Ser Ser Leu Val Arg Asn
85 90 95
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100 105 110
Val Glu Val Asn Asn Leu Lys Ser Ser Val Ser Ser Gln Gly Leu Thr
115 120 125
Ile Ser Asn Leu Glu Arg Arg Val Gln Ala Leu Glu Gly Gly Ser Ser
130 135 140
Thr Thr Leu Ser Phe Ala Asp Pro Leu Lys Leu Glu Asp Gly Thr Val
145 150 155 160
Ser Leu Glu Leu Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Val Ser Arg Asn Leu Thr
165 170 175
Ser Tyr Ser Ala Ser Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Glu Asp Gly Ala Ala Asn Ser Ile Asp Met Asp Val Asn Ala His
195 200 205
Ser His Gly Pro Arg Thr Asp Tyr Leu Met Ser Thr Lys Gln Ser Leu
210 215 220
Thr Val Thr Thr Ser Pro Ala Thr Leu Val Phe Glu Leu Asp Arg Ile
225 230 235 240
Thr Ser Leu Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu Ile Pro Cys His Gly Phe
245 250 255
Gln Gln Ala Thr Phe Pro Val Asp Ile Ser Phe Gln Arg Asp Gly Val
260 265 270
Ser His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly Lys Tyr Ala Ser Ser Arg Val Phe
275 280 285
Lys Ile Thr Phe Ser Pro
290
<210> 28
<211> 126
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 28
Asn Ile Lys Pro Gly Asp Leu Lys Ser Val Tyr Glu Arg Leu Thr Ser
1 5 10 15
Leu Glu Ala Ser Thr Glu Ser Leu Arg Gln Ser Val Ser Gly Met Ser
20 25 30
Val Thr Leu Ser Asp Leu Ser Ala Asp Leu Gln Asp Thr Thr Arg Ala
35 40 45
Leu Asp Asp Val Thr Val Thr Leu Asn Asn Leu Ser Ala Thr Ile Thr
50 55 60
Ala Leu Gln Ser Ser Val Thr Thr Leu Ser Ala Thr Val Asp Glu Leu
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Ser Ala Ser Gly Leu Asn Ile Thr Asp Leu Gln Asp Arg Val
115 120 125
<210> 29
<211> 116
<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 29
Asp Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Leu Ala Arg Gly Asp Asp Gly
1 5 10 15
Ser Ser Gly Ser Val Glu Met Leu Val Asn Ala His Cys His Gly Arg
20 25 30
Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Thr Thr Glu Asn Leu Thr Val Thr Gly
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Pro Thr Gly Arg
115
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<212> PRT
<213> 禽呼肠孤病毒
<400> 30
Gly Asp Leu Ile Pro Leu Tyr Glu Arg Leu Ser Ala Val Glu Lys Met
1 5 10 15
Cys Ala Thr Val Asn Asp Ser Leu Gly Arg Leu Thr Ser Leu Val Ser
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35 40 45
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Claims (25)
1.分离的多肽，其包含对应于形成禽呼肠孤病毒sigma C蛋白的完整或部分α-螺旋结构域、铰链结构域、β-三螺旋结构域和完整或部分球状头部结构域的氨基酸残基的氨基酸序列，并且缺失所述α-螺旋结构域的N-末端氨基酸序列。
2.权利要求1的分离的多肽，其包含对应于SEQ ID NO:1所示的ARV毒株S1133的sigmaC蛋白的氨基酸残基70-326、117-326或122-326的内部氨基酸序列。
3.权利要求2的分离的多肽，其中所述内部氨基酸序列具有与SEQ ID NO:1所示的ARV毒株S1133的sigma C蛋白的氨基酸残基70-326、117-326或122-326至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95、96、97、98或99％的同一性。
4.权利要求1至3中任一项的分离的多肽，其阻断或减少感染性禽呼肠孤病毒与禽呼肠孤病毒的sigma C蛋白的天然受体的结合。
5.权利要求1至4中任一项的分离的多肽，其在任选与佐剂组合以施用于鸟时，诱导针对感染性禽呼肠孤病毒的保护性免疫应答。
6.权利要求5的分离的多肽，在施用于鸟时，与将ARV毒株S1133的全长sigma C蛋白施用于鸟后获得的所述抗体的全身水平相比，诱导产生显著更高全身水平的中和抗sigmaC蛋白抗体。
7.权利要求3的分离的多肽，其包含具有与选自表1中公开的组的sigma C蛋白的内部氨基酸序列至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95、96、97、98或99％的同一性的氨基酸序列，所述内部氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1所示的ARV毒株S1133的sigma C蛋白的氨基酸残基70-326、117-326或122-326。
8.权利要求7的分离的多肽，其包含选自表3中公开的sigma C蛋白的内部氨基酸序列之内的氨基酸序列，所述内部氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1所示的ARV毒株S1133的sigmaC蛋白的氨基酸残基70-326、117-326或122-326。
9.权利要求8的分离的多肽，其包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5组成的组的氨基酸序列。
10.权利要求1至9中任一项的分离的多肽，其进一步包含用于鉴定和/或纯化的标签，例如多组氨酸标签。
11.核酸分子，其包含编码至少一种权利要求1至10中任一项的分离的多肽的核酸序列。
12.表达载体，其包含与权利要求11的所述核酸分子可操作地连接的控制元件，例如启动子，其中所述表达载体被设计为在例如细菌、酵母或昆虫细胞中复制和表达相关基因。
13.疫苗，其包含至少一种权利要求1至10中任一项的分离的多肽。
14.权利要求13的疫苗，还包含佐剂，例如热不稳定肠毒素(LT)、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、氢氧化铝；和/或防腐剂，例如硫柳汞或例如使用Marcol 52矿物油(ESSO，France)的20％油包水乳液。
15.疫苗，其包含哺乳动物表达载体，例如pcDNA3，其包含与权利要求11的所述核酸分子可操作地连接的控制元件，例如启动子。
16.病毒载体，例如重组马立克氏病(MD)病毒，其包含与权利要求11的所述核酸分子可操作地连接的控制元件，例如启动子。
17.权利要求13或14的疫苗，其包含至少两种不同的多肽；或者权利要求15的疫苗或权利要求16的病毒载体，其中所述核酸分子编码至少两种不同的多肽；所述至少两种不同的多肽中的每一种衍生自两组、三组或四组不同的sigma C蛋白中的一组的代表，其中每组的定义特征是所述组的不同sigma C蛋白的氨基酸序列具有至少75％的同一性。
18.权利要求13-15和17中任一项的疫苗，其包含四种不同的多肽；或者权利要求16或17的病毒载体，其包含编码四种不同多肽的核酸分子，
其中所述四种不同多肽中的第一种衍生自具有与SEQ ID NO:6-11(组I)至少75％的同一性的sigma C蛋白；所述四种不同多肽中的第二种衍生自具有与SEQ ID NO:12-16(组II)至少75％的同一性的sigma C蛋白；所述四种不同多肽中的第三种衍生自具有与SEQ IDNO:17-22(组III)至少75％的同一性的sigma C蛋白；以及所述四种不同多肽中的第四种衍生自具有与SEQ ID NO:1和23(第IV组)至少75％的同一性的sigma C蛋白。
19.权利要求18的疫苗或病毒载体，其中所述四种不同多肽中的第一种衍生自具有与SEQ ID NO:8至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95、96、97、98或99％的同一性的sigma C蛋白；所述四种不同多肽中的第二种衍生自具有与SEQ ID NO:16至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95、96、97、98或99％的同一性的sigma C蛋白；所述四种不同多肽中的第三种衍生自具有与SEQ ID NO:19至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95、96、97、98或99％的同一性的sigmaC蛋白；以及所述四种不同多肽中的第四种衍生自具有与SEQ ID NO:23至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95、96、97、98或99％的同一性的sigma C蛋白。
20.权利要求18的疫苗或病毒载体，其中所述四种不同多肽中的第一种衍生自选自SEQID NO:6-11(组I)的多肽；所述四种不同多肽中的第二种衍生自选自SEQ ID NO:12-16(组II)的多肽；所述四种不同多肽中的第三种衍生自选自SEQ ID NO:17-22(组III)的多肽；所述四种不同多肽中的第四种衍生自选自SEQ ID NO:1和23(组IV)的多肽。
21.权利要求20的疫苗，其中所述四种不同多肽具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4和SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
22.权利要求13至15和17至21中任一项的疫苗，或权利要求16至21中任一项的病毒载体，其用于针对禽呼肠孤病毒的对禽类物种进行的疫苗接种，或者用于诱导禽类免疫应答以赋予针对禽呼肠孤病毒的保护。
23.针对禽呼肠孤病毒对禽类物种进行疫苗接种或者诱导禽类免疫应答以赋予针对禽呼肠孤病毒的保护的方法，其包括将权利要求13至15和17至21中任一项的疫苗或权利要求16至21中任一项的病毒载体施用于鸟。
24.权利要求23的方法，与将ARV毒株S1133的全长sigma C蛋白施用于所述鸟后获得的所述抗体的全身水平相比，诱导产生显著更高全身水平的中和抗sigma C蛋白抗体。
25.权利要求23或24的方法，包括通过皮内或皮下注射；或通过饮用水口服将所述疫苗施用于鸟。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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