KR101299753B1

KR101299753B1 - 소 코로나바이러스 항원 결정기를 포함하는 스파이크 재조합 단백질 및 이에 대한 항체

Info

Publication number: KR101299753B1
Application number: KR1020100115856A
Authority: KR
Inventors: 박종배; 이남형; 한승구; 김홍철; 안준영
Original assignee: 주식회사 단바이오텍
Priority date: 2010-11-19
Filing date: 2010-11-19
Publication date: 2013-08-23
Also published as: KR20120054465A

Abstract

본 발명은 소 코로나바이러스의 항원 결정기를 포함하는 스파이크 재조합 단백질 및 이의 제조방법, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 단백질을 이용하여 제조된 난황항체 및 이의 제조방법, 상기 단백질을 포함하는 백신, 약학 조성물 및 사료조성물, 그리고 상기 백신 및 약학 조성물을 이용하여 소 코로나바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 소 코로나바이러스의 항원 결정기를 포함하는 스파이크 재조합 단백질 및 이에 대한 난황항체는 소 코로나바이러스에 대한 감염증을 보다 효율적으로 치료 또는 예방하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

소 코로나바이러스 항원 결정기를 포함하는 스파이크 재조합 단백질 및 이에 대한 항체 {Recombinant Spike Protein Comprising Bovine Coronavirus Epitope and Antibody}

본 발명은 소 코로나바이러스의 항원 결정기를 포함하는 스파이크 재조합 단백질 및 이의 제조방법, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 단백질을 이용하여 제조된 난황항체 및 이의 제조방법, 상기 단백질을 포함하는 백신, 약학 조성물 및 사료조성물, 그리고 상기 백신 및 약학 조성물을 이용하여 소 코로나바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

코로나바이러스는 1968년에 Tyrrell등(Tyrrel DA, Almeida J, Berry J. 1968. Coronavirus. Nature . 220 : 650)에 의해서 처음 발견되어 형태학적으로 구분되는 하나의 그룹으로 정해졌다. 코로나바이러스과(Coronaviridae)에는 하나의 속(genus)이 있는데, 이는 척추동물에 감염을 일으키는 11개의 바이러스로 구성되어 있다. 바이러스 입자는 107~160nm정도의 크기를 가지며 엔블로프에는 11nm의 꽃잎 모양의 돌기를 가지고 있다. 코로나바이러스는 4개의 주요한 단백질인 transmembrane(M), spike(S), nucleocapsid(N) 및 hemagglutinin-esterase(HE) 단백질로 구성되어 있다. 이들의 분자량은 120~140 KDa이며, S와 HE 단백질은 엔블로프 표면에 각각 길고 짧은 돌기를 형성하는데 이들 두 단백질은 혈구응집을 일으키며 중화와 관련된 항원 결정기(epitope)를 가지고 있다. 코로나바이러스의 게놈은 감염성이 있으며 양의 극성(positive polarity)을 갖는 단일가닥 RNA로 구성되어 있다.

소 코로나바이러스(Bovine Coronavirus, BCV)는 생후 3~30일령의 신생 송아지에 심한 설사를 일으켜 탈수와 산성증으로 폐사를 일으키며, 또한 장세포와 호흡기 상피세포에서 증식하여 장관에서뿐만 아니라 상부 호흡기도의 감염을 일으키는 것으로 알려져 있다. 송아지에서의 감염은 대부분 1~3주령에 일어나며 상부호흡 기도를 통한 지속감염 및 재감염이 일어난다. 30일령 이상의 송아지는 BCV의 감염에 의하여 혈청 중의 항체가가 상승하는데, 로타바이러스(rotavirus)나 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus) 또는 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus) 타입 3(PI-3)에 감염되어 이들의 항체가 존재할 때에는 코로나바이러스의 항체반응이 저하된다는 보고가 있다(Heckert RA, Saif LJ, Myers GW. 1991. Mucosal and systemic isotype-specific antibody responses to bovine coronavirus structural proteins in naturally infected dairy calves. Am J Vet Res 52 : 852-867). Benfield 등(Benfield DA, Saif LJ. 1990. Cell culture propagation of a coronavirus isolated from cows with winter dysentery. J Clin Microbiol 28 : 1454-1457)은 동계 이질(winter dysentery)에 감염된 송아지의 설사분변에서 코로나바이러스 파티클을 발견하였고, 이 바이러스를 송아지에 인공감염 시킨 결과 설사 증세가 나타남을 확인하였으며, 이 설사분변에서 코로나바이러스를 분리하였다. 국내에서도 BCV가 송아지 설사증의 주요한 원인체로 보고된 바가 있다(윤용덕, 박남용, 강문일 등. 1991. 소 코로나바이러스 감염증의 병리학적 연구. 시험연구보고서. 159-163)(손성완, 장정호, 박봉균 등. 1991. 소 코로나바이러스 감염증 발생조사. 시험연구보고서. 111-112).

현재 소 코로나바이러스의 감염을 예방하기 위한 효과적인 치료방법은 알려져 있지 않으며, 백신으로 미리 예방접종을 하거나 조기진단과, 철저한 위생관리 및 방역을 통해 감염을 방지하는 것이 최선의 방법으로 알려져 있다. 이러한 바이러스 감염을 예방하기 위한 가장 기초적인 방법은 충분한 양의 초유를 빠른 시간에 신생동물에게 제공하는 것이다. 동물은 사람과 달리 임신기간 동안 모체의 면역글로블린이 태아에 전이되지 못하므로 면역글로블린은 반드시 어미의 초유를 통해서만 공급된다. 모체유래 항체를 이용한 수동면역, 즉 동일 축종 또는 다른 축종의 초유나 면역글로블린의 급여는 신생가축에 있어서 설사 방지는 물론 각종 질병의 예방에 매우 효과적이지만, 초유를 통한 모체이행 항체는 지속시간이 짧으며 이유시까지 충분한 방어력을 제공하지 못한다는 문제가 있다.

최근에는 각종 호흡기 및 소화기와 관련하여 질병을 일으키는 세균 및 바이러스에 대응하기 위한 수동면역 방법이 임상적으로 응용되고 있다. 즉 사람이나 동물 유래의 항체를 경구 투여하여 감염을 미리 예방하고 치료하는 방법이 점진적으로 시도되고 있다. 혈청이나 초유, 단일클론항체를 이용하여 항체를 경구 투여하는 것은 매우 효과적이지만, 다량의 항체를 얻기 위해서는 매우 많은 비용과 문제점이 발생한다(Kuhlman, R., V. Wiedimann, P. Schmidt, R. Wamke, E. Linckh, and U. Iosch. 1988. Chicken egg antibodies for prophylaxis and therapy of infectious intestinal diseases immunization and antibody determination. J. Vet . Med. 35 : 610-616).

따라서 포유동물의 혈액에서 면역글로블린을 추출하는 것보다 난황에서 면역글로블린을 추출하는 것이 더욱 경제적이고 간편하다. 태반과 모유가 없는 난생동물의 경우 모체가 획득한 항체는 난황 중에 축적되어 자손에게 전해지므로 이러한 성질을 이용하여 난황으로부터 특이항체를 얻을 수 있다. 난황항체는 시스템화된 면역이 가능하고 채란이 용이하며 간단한 처리로 항체의 분리가 가능하여 생산비용이 저렴하고 섭취시 안정성이 높다. 또한 포유동물 유래의 항원에 대해서는 포유동물의 경우보다 산란계에서 우수한 항체를 얻을 수 있다.

따라서 본 발명자들은 소 코로나바이러스에서 중요한 면역반응을 하는 스파이크 단백질에 대한 효율적인 면역원을 생산함으로써 저비용 고품질의 난황항체를 제조하고자 하였다.

본 발명은 소 코로나바이러스의 스파이크 단백질에 해당하는 항원유전자로부터 항원 결정기를 탐색하여, 소 코로나바이러스의 항원 결정기를 포함하는 스파이크 재조합 단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물을 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 소 코로나바이러스에서 중요한 면역반응을 하는 스파이크 단백질에 대한 난황항체 및 이의 제조방법을 제공과, 상기 난황항체를 포함하는 약학 조성물 및 사료 조성물을 제공하고자 한다.

상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 서열번호 1; 서열번호 3; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 9; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 15; 서열번호 17; 또는 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 재조합 단백질 및 이의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 스파이크 재조합 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 상기 스파이크 재조합 단백질을 산란계에 투여하여 면역화시키는 단계; 및 (b) 상기 면역화된 산란계로부터 산란된 알의 난황에서 스파이크 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 스파이크 재조합 단백질에 대한 난황항체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 난황항체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 스파이크 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 소 코로나바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 백신 조성물 및 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여함으로써 소 코로나바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 난황항체를 유효성분으로 포함하는 소 코로나바이러스 감염증의 치료 또는 예장을 위한 약학 조성물 및 사료 조성물을 제공하며, 상기 약학 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여함으로써 소 코로나바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 소 코로나바이러스의 항원 결정기를 포함하는 스파이크 재조합 단백질 및 이에 대한 난황항체는 소 코로나바이러스에 대한 감염증을 보다 효율적으로 치료 또는 예방하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 소 코로나바이러스의 전장 스파이크 1 (S1) 단백질을 코딩하는 유전자의 전기영동 사진이다.
도 2는 소 코로나바이러스의 전장 스파이크 2 (S2) 단백질을 코딩하는 유전자의 전기영동 사진이다.
도 3은 본 발명의 소 코로나바이러스의 스파이크 재조합 단백질을 코딩하는 유전자 단편을 PCR 증폭시킨 결과를 보여주는 사진이다.
도 4는 클로닝 벡터에 본 발명의 소 코로나바이러스의 스파이크 재조합 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되었음을 보여주는 전기영동 사진이다.
도 5는 본 발명의 소 코로나바이러스의 스파이크 재조합 발현 벡터를 나타낸 그림이다.
도 6은 재조합 발현 벡터에 본 발명의 소 코로나바이러스의 스파이크 재조합 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되었음을 보여주는 전기영동 사진이다.
도 7은 본 발명의 소 코로나바이러스의 스파이크 재조합 단백질(Sa~Sh)이 재조합 벡터를 통해 발현 가능함을 보여주는 Dot blot 결과이다.
도 8은 본 발명의 소 코로나바이러스의 스파이크 재조합 단백질(Si 및 Sj)이 재조합 벡터를 통해 발현 가능함을 보여주는 Dot blot 결과이다.
도 9는 본 발명의 소 코로나바이러스의 스파이크 재조합 단백질의 면역원성을 보여주는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 소 코로나바이러스의 스파이크 재조합 단백질을 투여받은 산란계의 난황 중 항체가의 변화를 시간 경과에 따라 나타낸 그래프이다.

본 발명은 서열번호 1; 서열번호 3; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 9; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 15; 서열번호 17; 또는 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 재조합 단백질을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 소 코로나바이러스 스파이크 재조합 단백질은 소 코로나바이러스를 동물세포에 감염시켜 이를 원심분리한 후, 수득한 소 코로나바이러스 DNA를 주형으로 하여 통상적으로 사용되는 PCR 증폭방법으로 스파이크 1 및 스파이크 2 단백질을 코딩하는 유전자를 제조한 다음, 상기 스파이크 유전자를 클로닝하여 전체 서열을 분석하고, 상기 분석된 스파이크 유전자를 주형으로 하여 PCR 증폭 방법으로 항원 결정기를 포함하도록 스파이크 단편 유전자를 설계하여 이를 발현시킴으로써 제조하였다. 이렇게 제조한 10개의 스파이크 재조합 단백질을 각각 BCV Sa(서열번호 1), BCV Sb(서열번호 3), BCV Sc(서열번호 5), BCV Sd(서열번호 7), BCV Se(서열번호 9), BCV Sf(서열번호 11), BCV Sg(서열번호 13), BCV Sh(서열번호 15), BCV Si(서열번호 17), BCV Sj(서열번호 19)로 간략하게 표기한다.

본 발명에서 스파이크 재조합 단백질은 상기 서열번호에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 외에도 상기 서열들의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 본다. 변이체는 아미노산 서열은 변화되지만, 상기 서열번호에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 유사한 기능적 특성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 단백질이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 단백질은 상기 서열번호의 아미노산 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 스파이크 재조합 단백질은 소 코로나바이러스의 스파이크 단백질을 분석하여 항원 결정기를 포함하도록 절편화한 것이다.

본 발명에 있어서 “항원 결정기(epitope)"란 바이러스 및 세균 등의 항원에서 항체가 결합하는 부위를 의미하며, 일반적으로 항원 결정기는 폴리펩티드 단편들로 이루어져 있다.

바이러스나 세균 등의 항원 단백질은 당단백질(glycoprotein)인 경우가 많으며 이를 재조합 단백질로 생산할 경우, 당단백질로 발현하기 위해서는 번역 후 변형 등의 문제로 진핵세포시스템을 이용해야 원래의 항원성과 면역원성이 유지되는 항원 단백질을 생산할 수 있다. 그러나, 진핵세포시스템을 이용할 경우 당화 등의 번역 후 변형은 해결이 가능하나 단백질 생산비용이 매우 비싸며, 특히 세포배양에 의해 단백질을 생산할 경우 다른 동물 바이러스에 의한 감염 우려도 있다. 항원 결정기를 재조합 단백질로 생산할 경우 주로 대장균과 같은 원핵세포시스템을 이용하여 발현시켜 이를 동물체내에 주입하여도 원래의 항원단백질과 동일한 항원성과 면역원성을 나타낼 수 있다.

이러한 관점에서 본 발명은 소 코로나바이러스의 항원 결정기를 포함하는 스파이크 재조합 단백질을 제조함으로써, 이를 소 코로나바이러스 감염즈의 치료 또는 예방을 위한 백신이나 난황항체와 같은 항체의 개발에 유용하게 활용할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 스파이크 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

상기 스파이크 재조합 단백질을 코딩하는 유전자는 당해 유전자의 염기서열을 참조하여 핵산 합성기 등을 이용하여 인공적으로 합성하거나, 소 코로나바이러스의 게놈 DNA를 주형으로 목적한 스파이크 재조합 단백질을 코딩하는 유전자의 양 말단에 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하여 PCR을 수행함으로써 제조할 수 있다. 한편, 코돈의 축퇴성으로 인하여 본 발명의 스파이크 재조합 단백질을 코딩하는 유전자는 다양한 염기 서열로 존재할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명의 한 구체예에 따르면, 상기 스파이크 재조합 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 6; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 12; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 18 또는 서열번호 20 의 염기서열로 이루어진 유전자일 수 있다. 그러나 상기 서열번호에 기재된 염기서열로 이루어진 유전자 외에도 상기 서열들의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 본다. 변이체는 염기서열은 변화되지만, 상기 서열번호에 기재된 염기서열로 이루어진 유전자와 유사한 기능적 특성을 갖는 염기서열로 이루어진 유전자이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 단백질은 상기 서열번호의 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 스파이크 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 보유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 벡터는, 예를 들면 pUC8, pBR322, pET/Rb, pGEX, pET28a 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, pMAL-c2x를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용된 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

또한 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있으며, 유전자의 도입효율이 높고 도입된 유전자의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 예를 들어, 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 대장균을 사용하는 것이 바람직하다.

발현 벡터를 숙주 세포로 형질전환하는 방법은 통상의 형질전환 방법, 예를 들면, 칼슘 포스페이트 형질전환 (calcium phosphate transfection), DEAE-덱스트란 매개 형질전환 (DEAE-dextran mediated transfection), 이환(transvection), 미세주입 (microinjection), 양이온 지질-매개 형질전환 (cationic lipid-mediated transfection), 전기천공 (electroporation), 형질도입 (transduction), 스크래프 로딩 (scrape loading), 총알식 도입 (ballistic introduction), 감염 (infection) 등을 을 이용할 수 있다. 이외에도 당업계에 공지된 바를 참조하여 숙주 세포 및 발현 벡터 등의 종류에 따라 또다른 최적의 형질전환 방법을 이용할 수도 있다.

또한 본 발명은 (a) 전술한 스파이크 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 발현 벡터의 조절 서열에 작동 가능하게 연결시켜 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; (b)상기 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; (c) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및 (d) 배양물로부터 스파이크 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 스파이크 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.

이때 단계 (d)에서 배양물로부터 스파이크 재조합 단백질을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 방법에 따라 배양물로부터 분리할 수 있으며, 더 나아가 크로마토그래피 (이온 교환, 친화성 등), 전기영동, 분별용해도 (암모늄 설페이트 침전 등), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하는 공지된 방법을 통해서 정제될 수 있다.

또한 본 발명은 (a) 제1항에 따른 스파이크 재조합 단백질을 산란계에 투여하여 면역화시키는 단계; 및 (b) 상기 면역화된 산란계로부터 산란된 알의 난황에서 스파이크 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 스파이크 재조합 단백질에 대한 난황항체의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 스파이크 재조합 단백질에 대한 난황항체를 제공한다.

본 발명에 따른 난황항체는 소 코로나바이러스를 인식함을 특징으로 한다. 본 발명의 스파이크 재조합 단백질을 항원으로 하여 소 코로나바이러스에 특이적인 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 제조할 수 있다. 폴리클로날 항체는 일반적으로 포유동물을 적절한 양의 항원으로 1회 이상의 회수로 면역화시키고 항체가가 일정 수치에 이르렀을 때, 상기 포유동물의 항혈청으로부터 회수하여, 원하는 경우 공지된 공정을 이용하여 정제하고, 사용시까지 냉동 완충된 용액에 저장할 수 있다. 한편, 모노클로날 항체는 포유동물에 항원을 주입하여 생긴 B 림프구를 분리해서 마이엘로마 세포와 융합하여 하이브리도마 세포를 만들고 이를 배양하여 항체를 제조할 수 있다.

본 발명의 스파이크 재조합 단백질을 항원으로 사용하여 산란계에 면역화시키는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 기술에 따라 실시할 수 있다. 본 발명에 이용되는 산란계로는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 산란율이 높은 백색 레그혼계, 로드아일랜드계, 하이라인 브라운계 등을 이용할 수 있다. 산란계에 항원 단백질을 투여하는 경로로는 복강내, 근육내 또는 피하 주사 등이 포함된다. 본 발명의 항원 단백질은 어쥬번트, 예를 들어 프레운즈 컴플리트 또는 인컴플리트 어쥬번트를 사용하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.

추가항원접종(booster)은 충분한 항체가 얻어질 때까지 실시할 수 있다. 바람직하게는 약 2주 간격으로 3회 내지 4회 면역을 실시하고, 다음 접종은 약 8주 간격으로 실시한다. 면역화된 산란계로부터 알을 수집하고 이로부터 목적하는 단백질을 분리한 다음 유도된 단백질의 항체가를 측정하여 그 증가량이 정체 상태에 도달하면, 최종적으로 알을 회수한다. 제조된 난황항체는 항체가 측정을 통하여 분말형태의 항체 내에 스파이크 재조합 단백질에 대한 특이적 항체를 포함하고 있음을 확인한 후 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 스파이크 재조합 단백질 및 이에 대한 항체는 모두 소 코로나바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는데 이용될 수 있다. 스파이크 재조합 단백질은 능동 면역을 통하여, 스파이크 재조합 단백질에 대한 항체는 수동 면역을 통하여 소 코로나바이러스 감염증을 치료 또는 예방할 수 있다. 능동 면역은 병원체가 침입하였을 때 생체 스스로가 자기 몸 속에 항체가 생성되게 하여 면역되는 것을 의미하고, 수동 면역은 다른 생체에서 생성된 면역체를 자신의 체내에 받아들임으로써 얻어진 면역을 의미한다.

따라서 본 발명은 상기 스파이크 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 소 코로나바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 백신 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 스파이크 재조합 단백질에 대한 난황항체를 유효성분으로 포함하는 소 코로나바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 백신 조성물 또는 약학 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여함으로써 소 코로나바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

스파이크 재조합 단백질 및 이에 대한 항체를 백신 조성물 및 약학 조성물로 이용하는 경우, 상기 유효성분은 단독으로 이용되기 보다는 약학으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 이용하는 것이 적합하다. 여기서, 약학으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다.

본 발명의 백신 조성물과 약학 조성물에 이용할 수 있는 약제학적으로 허용된 담체는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 백신 조성물과 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 특히, 액상 제제의 경우에는 박테리아 포획 필터 등을 통한 여과에 의해 살균제 등을 혼입시켜 살균하는 것이 바람직하다. 이렇게 살균된 조성물은 예를 들면 동결건조에 의해 고형화시킬 수 있으며, 사용시에 이를 무균수 또는 무균 희석액에 용해시킨다.

본 발명에 따른 백신 조성물과 약학 조성물은 소, 쥐, 마우스, 가축, 개, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물과 약학 조성물의 투여량은 동물의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 동물에 면역보호반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 스파이크 재조합 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로 각각의 용량은 본 발명의 스파이크 재조합 단백질 또는 난황항체의 면역원량의 멸균용액 ㎖ 당 0.1 내지 1000㎍의 단백질, 바람직하게는 0.1 내지 100㎍을 함유한다. 백신 조성물의 경우에는 필요에 따라 초기 용량에 이어 임의로 반복된 항원자극을 수행할 수 있다.

또한 본 발명은 한편, 스파이크 재조합 단백질에 대한 난황항체를 유효성분으로 포함하는 소 코로나바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 사료 조성물을 제공한다.

즉 상기 난황황체를 통상의 사료와 혼합하여 소 코로나바이러스의 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 사료 조성물로 제조할 수도 있는데, 이 때 사료로는 돼지고기, 소고기 및 닭고기 등의 부산물을 비롯하여 옥수수, 쌀, 일반 볏짚, 야초, 목초, 앤시리지, 건초, 산야초 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가축의 사육에 사용되는 사료이면 무방하다. 이러한 사료에 본 발명의 스파이크 재조합 단백질에 대한 항체를 첨가하여 배합하는 방법으로는 기계적 혼합, 흡착, 흡장 등의 방법이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 바이러스 세포 및 벡터

소 코로나바이러스(BCV)를 증식시키기 위한 MDBK 세포는 Dulbeco's Modified Eagle medium(DMEM)에 10%의 fetal bovine serum(FBS) 및 1%의 페니실린-스트렙토마이신을 첨가하여 37℃, 5%CO₂ 조건에서 단층배양 하였다.

E.coli 균주 JM109(Promega)는 플라스미드 벡터 클로닝과 발현 벡터 클로닝 시 컴피턴트 세포(competent cell)로 사용 하였다. 클로닝 벡터로는 pGEM-T easy vector(Promega)를 사용하였으며, 발현 벡터로는 pMAL-c2X(New England BioLabs Co.,USA)를 사용하였다.

실시예 2: BCV 게놈 RNA 추출 및 cDNA 합성

3일간 배양한 바이러스는 Viral gene-spin^TM Viral DNA & RNA extraction kit(INtRON Biotechology Inc., Korea)를 사용하여 BCV 게놈 RNA를 추출하였다. 1.5㎖ 마이크로튜브에 배양한 시료 150㎕를 넣은 후 250㎕ 라이시스 버퍼를 넣고 15초 동안 혼합하였다. 이를 25℃에서 10분간 방치 한 후, 350㎕의 바인딩 버퍼를 혼합하여 2회 원심분리(1min,13,000rpm)한 후, 멤브레인 필터를 건조시켰다. RNase-free 마이크로튜브에 컬럼을 넣은 후 30㎕의 일루션 버퍼를 멤브레인에 분주하여 실온에서 1분간 방치한 후 원심분리하여 BCV 게놈 RNA를 추출하였다.

추출된 RNA에 DNase Ⅰ과 RNase inhibitor가 첨가된 반응액 50㎕를 이용하여 37℃에서 30분 반응시킨 후 DEPC 처리된 증류수를 50㎕ 첨가하였다. 페놀:클로로폼(1:1)을 동량 첨가하여 혼합한 후 원심 분리하여 상층액을 회수하였으며 회수한 상층액에 동량의 클로로폼을 첨가하여 혼합 후 원심 분리한 다음 상층액을 수거하였다. 확보된 상층액에 3M 소듐 아세테이트 10㎕와 100% 냉각 에탄올 250㎕를 첨가한 후 -70℃에서 20분 방치한 후 원심 분리하여 침전물을 획득하였다.

획득한 침전물을 70% 에탄올로 세척하여 건조 후 DEPC 처리된 증류수로 녹여서 DNase Ⅰ 처리를 한 RNA를 획득 하였으며, M-MLV 역방향 transcriptase(Invitrogen Co.)를 사용하여 first-strand cDNA를 합성하였다.

BCV 게놈 RNA 5㎕에 oligo(dT)₁₅ 1㎕, dNTP mix 1㎕를 첨가한 후 총 양을 20㎕로 맞추었다. 이를 65℃에서 5분간 열처리하여 RNA의 2차 구조를 변성시켜 얼음에서 1분간 안정화 시켰다. 그 후 5X first strand 버퍼 4㎕, 0.1M DTT 2㎕, RNase inhibitor 1㎕를 첨가하여 37℃에서 2분간 반응시켰다. M-MLV RT 1㎕를 첨가하여 37℃에서 50분간 반응시킨 후 70℃에서 15분간 불활성화시켜 최종적으로 BCV cDNA를 합성하였다.

실시예 3: 스파이크 단백질 유전자 증폭 및 플라스미드 벡터 클로닝

BCV 스파이크 단백질 유전자(서열번호 45)는 특이적 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였으며, 스파이크 단백질 1(S1)과 스파이크 단백질 2(S2)에 대한 특이적 프라이머는 GeneBank의 데이터를 기초로 하여 각각의 스파이크 단백질 유전자를 증폭할 수 있도록 제작하였다(표 1).

서열번호	프라이머 명칭	프라이머	사이즈(bp)
21	BCV S1F	ggc gga tcc gac cat aat cta aat cta aac atg	1300bp
22	BCV S1R	gac gtc gac tca gcc tat acc act att	1300bp
23	BCV S2F	cgg gga tcc gtt tat gca caa cat tgt	1100bp
24	BCV S2R	ggg gtc gac tca act tcg tct ttt tgt	1100bp

DNA 템플레이트 5㎕, 10X 버퍼 5㎕, 2.5mM dNTP 4㎕, EX Taq DNA 폴리머라제(5U/㎕) 0.5㎕, 각각의 단편에 대한 정방향 프라이머 1㎕, 역방향 프라이머 1㎕를 첨가 후 전체 반응용량이 50㎕가 되도록 증류수를 첨가하였다. 이를 각각의 PCR 조건으로 증폭시켰는데, S1의 경우 94℃에서 10분 동안 초기변성을 하고 94℃에서 2분 동안 변성(denaturation), 54℃에서 1분 동안 어닐링(annealing), 72℃에서 2분 동안 신장(extension)을 하는 과정을 각 35회 반복하였으며, 72℃에서 10분 동안 최종 신장을 하였다. S2의 경우 94℃에서 10분 동안 초기변성을 하고 94℃에서 2분 동안 변성, 56℃에서 1분 동안 어닐링, 72℃에서 2분 동안 신장을 하는 과정을 각 35회 반복하였으며, 72℃에서 10분 동안 최종 신장을 하였다. 이렇게 증폭된 PCR 생성물은 1.2% 아가로스 겔 상에서 100V로 30분간 전기영동 한 후, 에티디움 브로마이드로 염색하여 밴드를 확인하였다.

그 결과 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 각각 1.3 Kb 및 1.1 Kb에 해당하는 S1과 S2의 cDNA 밴드를 확인하였다.

확보된 스파이크 단백질 대한 PCR 산물을 pGEM T easy vector system(promega co.)을 이용하여 클로닝 한 후 GeneBank의 데이터베이스를 기초로 하여 염기서열을 확인하였고 분석된 염기서열의 상동성을 NCBI에서 제공하는 BLAST프로그램으로 비교하였다. 그 결과 BCV 스파이크 단백질 유전자와 99%의 유사성을 갖는 것으로 나타났다.

실시예 4: 스파이크 단백질 단편 유전자 증폭 및 플라스미드 벡터 클로닝

상기에서 확인된 pGEM T-easy vector 클로닝 샘플을 템플레이트로 하여 BCV 스파이크 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질을 코딩하는 10개의 유전자 단편을 얻기 위하여, 표 2에 개시된 10개의 스파이크 유전자 단편에 대한 특이적 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하였다.

서열번호	프라이머 명칭	프라이머	사이즈(bp)
25	BCV Sa-F	ggc gga tcc gac cat aat cta aac atg	332bp
26	BCV Sa-R	ggg gtc gac tca ctt agc aaa aat acc	332bp
27	BCV Sb-F	gga tcc aat atg gca ctg aag gga act	266bp
28	BCV Sb-R	gga gtc gac tca gca cat agt ata ctg	266bp
29	BCV Sc-F	gtc gga tcc caa cca cat act acc aat	326bp
30	BCV Sc-R	gag gtc gac tca agg cag gac ata ata	326bp
31	BCV Sd-F	gga tcc tat gtc ctg cct ttg act tgt	281bp
32	BCV Sd-R	gtc gac tca atc att aag cca agc ctc	281bp
33	BCV Se-F	gga tcc ccc gat tgt aat tat gag gct	299bp
34	BCV Se-R	gtc gac tca ctg aca act tgc agc agt	299bp
35	BCV Sf-F	gga tcc ccc gat tgt aat ata gag gct	344bp
36	BCV Sf-R	gac gtc gac tca gcc tat acc act att	344bp
37	BCV Sg-F	cgg gga tcc gtt tat gca caa cat tgt	316bp
38	BCV Sg-R	gtc gac tca gca agt aca agg att acc	316bp
39	BCV Sh-F	gga tcc taa gtt ggc ata ggt gag cac	344bp
40	BCV Sh-R	gca gtc gac tca acc ata gag att acc	344bp
41	BCV Si-F	ggc gga tcc gcg act tat tat aat agt	230bp
42	BCV Si-R	gcg gtc gac tca ata gtt aat agg ttg	230bp
43	BCV Sj-F	gga tcc tcc gaa cca gca ttg cta ttt	206bp
44	BCV Sj-R	ggg gtc gac tca act tcg tct ttt tgt	206bp

DNA 템플레이트 1㎕, 25mM MgCl₂ 4㎕, 10X EX Taq 버퍼 5㎕, 2.5mM dNTP 4㎕, 각각의 단편에 대한 정방향 프라이머 1㎕, 역방향 프라이머 1㎕, EX Taq DNA 폴리머라제(5U/㎕)0.5㎕를 첨가한 후 전체반응 용량이 50㎕가 되도록 증류수를 첨가하였다. 이를 94℃에서 5분 동안 초기변성을 하고, 94℃에서 2분 동안 변성, 55℃에서 1분 동안 어닐링, 72℃에서 1분 동안 신장을 하여 각 사이클을 35회 반복하였으며, 72℃에서 10분 동안 최종 신장을 하였다. 이렇게 증폭된 PCR 생성물은 1.2% 아가로스 겔 상에서 100V로 30분간 전기영동 한 후, 에티디움 브로마이드로 염색하여 밴드를 확인하였다.

그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 각각 332, 266, 326, 281, 299, 344, 316, 344, 230, 206 bp (Sa, Sb, Sc, Sd, Se, Sf, Sg, Sh, Si, Sj) 에 해당하는 10개의 유전자 단편을 확인하였다(레인 1: 100bp 래더 마커, 레인 2: Sa, 레인 3:Sb, 레인 4: Sc, 레인 5: Sd, 레인 6: Se, 레인 10: Sf, 레인 11: Sg, 레인 12: Sh, 레인 13: Si, 레인 14: Sj).

확보된 10개의 스파이크 단백질 단편에 대한 PCR 산물은 pGEM T easy vector system(Promega co.)를 이용하여 클로닝한 후(도 4 참조), GeneBank의 데이터베이스를 기초로 하여 염기서열을 확인하였다. 분석된 염기서열의 상동성을 NCBI에서 제공하는 BLAST프로그램으로 비교한 결과, 스파이크 단백질의 유전자와 염기서열이 일치함을 확인하였다.

실시예 5: 발현 벡터 구축과 단백질 발현

<5-1> 발현 벡터 구축

10개의 PCR산물을 pGEM-T easy vector를 이용하여 E. coli JM109에 형질전환을 시킨 후 플라스미드 DNA를 분리하였다. 분리된 플라스미드 DNA를 제한효소 BamHⅠ과 salⅠ으로 절단하여 얻어진 332bp, 266bp, 326bp, 281bp, 299bp, 344bp, 316bp, 344bp, 230bp, 206bp의 DNA 단편을 인서트로 하여 발현 벡터 pMAL-c2x와 라이게이션을 실시하였다(도 5 참고). 이를 E. coli JM109에 heat shock 방법으로 형질전환 시켰다. 양성클론을 선택하여 이로부터 재조합 발현 벡터를 분리한 후 제한효소 BamH I과 Sal I 으로 절단하여 아가로스 겔을 이용하여 전기영동하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 재조합 스파이크 단백질을 코딩하는 10개의 유전자 절편을 확인하였다.

<5-2> 단백질 발현

양성클론을 취하여 100㎍/㎖ 앰피실린이 첨가된 5㎖의 LB broth에 접종한 후, 37℃에서 12~16시간 동안 진탕 배양하였다. 100㎍/㎖ 앰피실린이 첨가된 100㎖의 LB broth에 전배양 세포를 접종하여 흡광도(A₆₀₀)가 0.5~0.6이 되도록 37℃, 200rpm으로 배양 하였으며, 0.3mM의 isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside(IPTG)를 첨가한 후 3시간 30분~4시간 동안 배양한 다음 4℃, 6000rpm 조건으로 20분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 이를 컬럼 버퍼(20mM Tris-HCl(PH7.4), 200mM NaCl, 1mM EDTA)로 재부유 시킨 균체를 sonication한 후 4℃, 12000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 상층액을 회수하였다.

회수한 상층액은 pMAL^TM protein fusion and purification system(NEB co., USA)를 사용하여 정제하였다. 회수한 단백질 수용액을 말토오스 레진을 첨가하여 4℃에서 3시간 동안 교반한 후 폴리프로필렌 튜브에 glass wool을 장착하여 컬럼을 세척한 후 말토오스 레진과 반응시킨 단백질 수용액을 컬럼에 부착하였다. 컬럼 용량의 12배에 해당하는 컬럼 버퍼로 세척한 후 일루션 버퍼(컬럼 버퍼 + 10mM 말토오스)를 이용하여 정제된 단백질을 획득하였고 -70℃에 보관하여 각 실험의 시료로 사용하였다.

<5-3> 단백질 분석

수득한 단백질의 농도를 측정하기 위하여 BCA 단백질 정량을 실시하였다. 수득한 단백질을 증류수에 100, 200, 400배로 희석한 후 96 플레이트에 각각 100㎕씩 분주한 후 Micro BCA^TM Reagent MA 5㎖과 Micro BCA^TM Reagent MB 4.8㎖, Micro BCA^TM Reagent MC 200㎕(Pierce., USA)를 혼합하여 100㎕씩 분주하여 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 microplate reader(EL-800 BIO-TEK Instrument Inc. USA)를 이용하여 562nm에서 측정하였다.

수득한 단백질이 BCV 스파이크 단백질 단편인지 확인하기 위해 Dot blot 분석을 실시하였다. 수득한 단백질의 농도를 각각 1mg/㎖, 100㎍/㎖, 10㎍/㎖, 1㎍/㎖이 되도록 희석하였다. 니트로셀룰로스 멤브레인에 샘플을 로딩하기 위하여 표시한 후, 샘플을 2㎕씩 분주하고 건조시킨 다음 5% BSA/TBST(20mM Tris-HCl(PH7.4), 150mM NaCl +0.05% Tween20)로 25℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, TBST로 세척하였다. 일차 항체로 코로나바이러스에 대한 마우스 모노클로날 5A4 (abcam co.)를 0.1% BSA/TBST에 1000배 희석하여 실온에서 30분간 반응시킨 후, 5분간 3번 TBST로 세척하였다. 이차 항체인 anti-goat mouse Ig-G AP congugation(sigma co.)를 0.1% BSA/TBST에 1000배 희석하여 실온에서 30분간 반응시킨 후, TBST로 세척하고, BCIP/NBT 용액으로 발색하여 확인하였다.

그 결과 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, 약 50 KDa 크기의 단백질들이 검출됨을 확인하였다. 이는 대장균에서 발현시킨 단백질이 마우스 모노클로날 5A4와 특이적으로 반응하여 나타난 결과이고, 이로써 대장균에서 유도되어 발현된 단백질은 스파이크 재조합 단백질 BCV Sa 내지 Sj임을 확인하였다.

실시예 6: 난황항체 생산

<6-1> 공시동물 및 시험장소

항체 생산을 위해 28주령의 ISA-brown 계통 산란계에 면역화를 수행하였으며, 사육은 단국대학교 동물자원학과 실험동물 사육동에서 수행하였다.

<6-2> 면역화 방법

산란계의 면역화는 김철 등(김철 등, 2000, 장관독성 대장균 K99(F5)의 섬모항원에 대한 특이 난황항체의 생산. 한국동물자원과학회지. 42 : 371-378)의 방법으로 접종하였다. 정제된 BCV 스파이크 재조합 단백질을 100㎍이 되도록 PBS로 희석한 후 Freund's complete adjuvant(Sigma Chemical co.)를 각각 동량으로 혼합 및 유화하여 면역원을 제조하였다. 유화액 1㎖을 산란계 흉근에 0.25㎖씩 4곳에 근육주사 하였으며, 추가 접종은 1차 접종 후 2주 간격으로 Freund's complete adjuvant(Sigma Chemical co.)로 유화하여 1차 접종과 동일한 방법으로 총 3회 실시하였다. 각 접종 전에 산란계의 익하정맥에서 채혈하여 혈정을 분리하고 이를 -20℃에 저장하였고, 면역란은 매일 회수하여 8℃의 저온실에 저장하여 실험에 이용하였다.

<6-3> 난황항체의 분리

면역 접종한 산란계로부터 수득한 알을 채집하여 김철 등의 방법에 의해 수용성 절편(water soluble fraction, WSF)을 분리하였다. 채집된 면역란에서 난황만을 분리하여 증류수로 10배 희석시킨 난황용액을 pH 5.0으로 조절한 후 -20℃에서 하룻밤 동안 동결시킨 다음 해동시킨 후 30분간 4℃에서 12000rpm로 원심분리하여 상층액을 수거하였으며 이를 여과하여 동결건조 하였다.

실시예 7: 면역원성 시험 및 난황항체가 확인

재조합 BCV 스파이크 단백질 단편들을 면역화하여 얻은 항혈청과 난황의 면역원성을 알아보고자 난황항체의 ELISA 분석(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)을 실시하였다. 코팅항원으로 정제된 BCV 스파이크 재조합 단백질을 5㎍/㎖ 되도록 carbonate-bicarbonate 버퍼(PH9.6)로 희석하여 Microtest Ⅲ flexible assay plate(Falcon 3911, BD Biosciences, USA)의 각 웰에 100㎕씩 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 코팅이 완료된 플레이트를 워싱 버퍼(PBST, 0.02M NaH₂PO₄, 0.13M NaCl, 0.05% Tween 20, PH 7.2)로 3회 세척한 후 3% BSA(bovine serum albumin, PH 7.3)/PBS을 각 웰에 175㎕씩 분주하여 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 PBST로 5회 세척하고 3% BSA/PBS와 워싱 버퍼(PBST, phosphate buffered saline-tween 20)를 동량으로 섞은 희석 버퍼를 이용하여 수득한 항혈청과 난황을 각각 단계희석한 다음, 상기 재조합 BCV 스파이크 단백질 단편들이 코팅된 웰에 분주하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이차 항체로는 alkaline phosphatase cohjugated rabbit anti-chicken IgG를 5,000배로 희석하여 37℃에서 2시간 동안 상기 플레이트의 웰에 분주하여 반응시켰다. 기판 버퍼로는 phosphate substrate tablets(p-nitrophenyl phosphate)를 0.5mM MgCl₂가 포함된 10% 디에탄올아민(PH 9.8) 용액을 사용하여 37℃에서 20분간 반응시켰다. 반응정지시약으로 5M NaOH를 사용하여 반응을 정지시킨 후 microplate reader(EL-800, BIO-TEK Instrument Inc. USA)를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.

그 결과 도 9에 나타난 바와 같이, anti-BCVsh와 anti-BCVsj가 높은 역가(500,000, 520,000)를 나타내었다. 또한 BCV 바이러스 자체를 면역화한 것은 210,000으로 나타났다. 따라서 불활성 시킨 anti-BCV 항혈청보다 anti-BCVsh 및 anti-BCVsj의 면역원성이 높은 것을 확인하였다.

또한 탐색된 항원 결정기를 면역원으로 하여 생산된 난황 항체가를 측정 한 결과 도 10에 나타난 바와 같이, 1차 면역 후 IgY 항체가가 증가하여, 6주에 가장 높은 항체가(500,000)을 나타냈으며, 6주 이후부터 IgY 항체가가 난황 내에서 일정한 수준으로 유지 되었다.

실시예 8: 중화테스트

재조합 BCV 스파이크 단백질 단편에 대한 난황항체의 중화테스트를 실시하기 위해 TCID50 실험과 혈구응집억제반응(hemagglutinin inhibition assay)을 실시하였다. 코로나바이러스의 숙주세포인 MDBK 세포를 배양한 후 배지를 제거하고, dPBS 1.5㎖로 세척한 후 제거하였다. Trysin 10㎍/㎖을 포함하는 0%FBS DMEM 배지 1㎖과 바이러스 100㎕를 첨가하여 1시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 바이러스를 감작시켰다. Trysin 제거 후, 1% FBS DMEM 배지 20㎖ 첨가하여 세포의 변성이 80~90%가 일어나도록 배양하였다. 96웰 플레이트에 0% DMEM 배지 100㎕을 2~12열까지 첨가한 후 배양된 코로나바이러스를 각1열에 150㎕씩 첨가한 후, 3배수씩 11열까지 희석하여 36℃에서 배양하였다.

TCID50 실험으로 바이러스를 1x10⁶으로 희석하여 중화시험을 실시하였다.

각 항혈청을 10배부터 2배씩 단계희석을 하여 분주한 96웰 플레이트에 소코로나바이러스를 동량 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 중화반응을 유도한 후 1% 적혈구를 50㎕ 첨가하여 잘 혼합한 후 다시 25℃에서 40분간 정치시킨 후 혈구응집반응을 조사하였다.

그 결과 하기 표 3에 나타난 바와 같이 항-BCV보다 항-rBCVsh, 항-rBCVsj의 중화항체가가 더 높았다.

혈청	GMT(1000)^a	중화 반응
Normal	NT	<40
Anti-BCV	250	160
Anti-rBCVsh	500	320
Anti-rBCVsj	520	320

^a면역화된 산란계에서 BCV 재조합 단백질에 대한 IgY 역가

실시예 9 : 난황 항체를 이용한 임상시험

<5-1> 시험동물 및 시험설계

난황 항체를 이용한 임상실험은 생후 직후 송아지 6수를 공시하여 7일간 사양시험을 실시하였다. 시험설계는 다음과 같이 하였다.

(1) 대조구 : 난황항체 무 투여군(3수)

(2) 처리구 : 난황항체 투여군(3수)

<5-2> 사양관리 및 난황 항체, BCV 의 투여

생후 직후 IgY 급여 24시간 후 BCV (6× 105 pfu/ml)를 경구 투여한 후 육안으로 기력상실, 설사정도, 폐사율을 점검하였다.

실험 결과는 하기 표 4에 기재된 바와 같다. 난황항체를 투여하지 않은 대조구의 경우 BCV 투여 후 2일째부터 연변활동이 저하되기 시작하였으며, 2일째에 1마리, 5일째에 1마리가 폐사하였다. 이에 반해 난황항체를 투여한 처리구는 7일이 지나도 정상적인 연변활동을 보였으며 폐사한 송아지도 없었다.

	0일	1일	2일	3일	4일	5일	6일	7일
대조구		바이러스 경구투여	연변활동 저하 폐사 1마리	연변활동 정상 폐사 무	연변활동 정상 폐사 무	연변활동 저하 폐사 무	연변활동 저하 폐사 1마리	연변활동 저하 폐사 무
처리구	IgY 급여	바이러스 경구투여	연변활동 정상 폐사 무	연변활동 정상 폐사 무	연변활동 정상 폐사 무	연변활동 정상 폐사 무	연변활동 정상 폐사 무	연변활동 정상 폐사 무

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(a) 서열번호 1; 서열번호 5; 서열번호 9 또는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 재조합 단백질을 산란계에 투여하여 면역화시키는 단계; 및
(b) 상기 면역화된 산란계로부터 산란된 알의 난황에서 스파이크 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 소 코로나바이러스에 대한 난황항체의 제조방법.
제9항의 방법으로 제조된 소 코로나바이러스에 대한 난황항체.
서열번호 1; 서열번호 5; 서열번호 9 또는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 소 코로나바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 백신 조성물.
제10항에 따른 난황항체를 유효성분으로 포함하는 소 코로나바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
제10항에 따른 난황항체를 유효성분으로 포함하는 소 코로나바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 사료 조성물.
제11항에 따른 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여함으로써 소 코로나바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법.
제12항에 따른 약학 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여함으로써 소 코로나바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법.