CN103336133A - 一种用于检测抗mda5抗体的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，提供了一种用于检测抗MDA5抗体的试剂盒及其检测方法。本发明通过重组MDA5蛋白的功能片段，寻找到抗原优势表位蛋白片段，以此作为底物通过免疫印迹方法进行检测。本发明提供了检测试剂盒及相应的检测方法，能够高效特异性且低成本的检测到抗MDA5抗体。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地说，涉及一种用于检测抗MDA5抗体的试剂盒及其检测方法。
背景技术
特发性炎性肌病(idiopathic inflatnmatory myopathy，IIM)是一种以侵害骨骼肌为主的全身性疾病，临床特点为骨骼肌无力、皮肤病变、系统性器官损害以及有特异性抗体的产生。多发性肌炎和皮肌炎是最常见的2种类型。间质性肺疾病(ILD)是多发性肌炎/皮肌炎常见的一种并发症，分为2个亚类：急性/亚急性间质性肺炎(acute/subacute interstitialpneumonia，A/SIP)和慢性间质性肺炎(CIP)。其中A/SIP病情进展迅速，愈后差，有文献报道6个月的生存率仅为40.8％～45％。因此早期诊断及积极治疗A/SIP，对改善患者预后至关重要。
2005年，血清抗MDA5抗体由日本学者发现报道它与临床无肌病性皮肌炎(clinical amyopathic dermatomyositis，CADM)密切相关。随后经科研人员研究证实，该抗体所识别的自身抗原为黑素瘤分化相关基因5(melanomadifferentiation_associated gene5，MDA5)。人MDA5蛋白，由1025个氨基酸残基组成的IFIH1编码。N端包括2个串联重复的CARD（Caspase activation andrecruitment domain）域，中间为DExD/H解旋酶区（DExD/H helicases），C端为无活性的抑制域（repressor domain,CTD）。MDA5蛋白的三个功能结构域在识别病毒的过程中各司其职，CARD结构域与启动抗病毒信号级联有密切联系，DExD/H解旋酶结构域有6个高度保守基序（Motif），Motif III参与形成CARD、DExD/H解旋酶结构域以及CTD之间的联系。Motif IV和V在与RNA的结合中发挥重要作用。Motif V和VI与核苷酸的结合有关。C端存在CTD，具有结合RNA的重要功能，但其既不刺激也不阻碍IFN-β启动子的表达。
经研究人员通过抗体与皮肌炎临床相关性的进一步研究发现表明，抗MDA5抗体更多见于皮肌炎合并A/SIP患者，在A/SIP诊断病例中检测的敏感性及特异性可分别高达85%及92%。由此可见，研究抗原MDA5蛋白的抗原表位并对抗MDA5抗体进行检测，可以有效的帮助临床预判A/SIP，具有重要意义。
目前国内市场上还未出现市场化的抗MDA5抗体检测试剂盒，因此，鉴于检测抗MDA5抗体的重要性，开发一种可以广泛应用，高效灵敏的抗MDA5抗体检测试剂盒以及相应的检测方法就显得尤为紧要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测抗MDA5抗体的试剂盒及其相应的检测方法，可以高效灵敏且特异性检测待测样品中的抗MDA5抗体。
本发明是这样实现的，一种用于检测抗MDA5抗体的试剂盒，包含由抗MDA5抗体识别的SEQ ID:1所示的MDA5蛋白或其片段。
进一步的，所述抗MDA5抗体识别的MDA5蛋白片段包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的至少一种。
其中，所述试剂盒通过免疫印迹法检测抗MDA5抗体。
进一步的，所述试剂盒包含：
（1）抗原，所述抗原包含MDA5蛋白或其片段；
（2）连接试剂，用于连接待测样品与（1）所述抗原之间的反应；
（3）显示试剂，用于标记（2）中待测样品与抗原的反应产物；
（4）对照样品，不含抗MDA5抗体，用于进行对照试验。
其中，所述对照样品包含阳性对照样品或阴性对照样品。
本发明还提供了利用上述试剂盒检测抗MDA5抗体的检测方法，使待测样品与所述试剂盒中的MDA5蛋白或其片段进行反应，得到反应产物。
其中，所述待测样品为血液、血清或血浆中的任意一种。
进一步的，所述待测样品中的抗MDA5抗体通过免疫印迹法检测。
更进一步的，所述检测反应包含以下步骤：
（1）电泳：利用MDA5蛋白或其片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到蛋白电泳胶；
（2）电转移：将蛋白电泳胶通过电转移装置转移至固相载体上，得到固定蛋白产物；
（3）免疫杂交：使待测样品与固定蛋白产物进行反应，得到反应产物，加入显示试剂标记该反应产物；
（4）显色：利用显示试剂进行底物显色或放射自显影，使得反应产物显现出来。
其中，所述固相载体为硝酸纤维素薄膜（NC膜）。
本发明以MDA5蛋白及其各功能片段作为抗原优势表位，以此为底物，利用免疫反应检测待测样品中抗MDA5抗体，具有高效灵敏且特异性强的优势。
附图说明
图1是本发明一个实施例中构建的MDA5-1克隆蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳结果图；
图2是本发明一个实施例中构建的MDA5-2克隆蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳结果图；
图3是本发明一个实施例中构建的MDA5-3克隆蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳结果图；
图4是本发明一个实施例中构建的MDA5-4克隆蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳结果图；
图5是本发明中利用IB法，以MDA5克隆蛋白及构建的不同抗原优势表位片段对抗MDA5抗体阳性血清样品及阴性对照样品检测的结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
本发明试剂盒以MDA5蛋白或其片段是通过重组并明确抗原优势表位得到的，然后以所得到的MDA5抗原优势蛋白片段作为底物，利用免疫反应检测待测样品中的抗MDA5抗体。通过重组蛋白片段代替天然抗原进行自身抗体的检测，具有更为广泛的应用前景；同时，以抗原优势表位进行抗体检测，可以提高检测的高效灵敏性以及特异性。
人MDA5蛋白是由1025个氨基酸残基组成的IFIH1编码，其N端包括2个串联重复的CARD（Caspase activation and recruitment domain）域，中间为DExD/H解旋酶区（DExD/H helicases），C端为无活性的抑制域（repressor domain,CTD）。本发明根据MDA5的功能结构划分，先期研究利用蛋白重组方式，构建得到SEQ ID NO:1的MDA5蛋白，其对应的编码碱基序列为SEQ ID NO:6；然后通过构建不同功能片段，寻求获取得到带有SEQ ID NO:2（对应的编码碱基序列为SEQ ID NO:7）、SEQ ID NO:3（对应的编码碱基序列为SEQ ID NO:8）和SEQ ID NO:4（对应的编码碱基序列为SEQ ID NO:9）的抗原优势表位片段。在保持上述抗原优势表位片段的基础上，还可以构建在其非表位区域具有一个或多个氨基酸缺失、替代、添加或插入的修饰的MDA5蛋白或蛋白片段。与此同时，在上述抗原优势表位片段中，应存在与抗MDA5抗体作用的优势表位。该优势表位应有6至10个氨基酸组成，可通过将抗原优势表位片段分解合成特定数量的肽段，由肽段与抗MDA5抗体作用的结果判断优势表位所在区域。当优势表位确定后，上述抗原优势表位片段可以进一步缩短，更短的抗原优势表位片段可以更易于获取。因此，在本发明的基础上，可进一步进行抗原优势表位片段的优选，如50个或更少的氨基酸肽段、40个或更少的氨基酸肽段、……特别是6至10个氨基酸肽段是优选的。
此外，由于编码氨基酸的碱基存在简并性，因此本发明试剂盒中的MDA5蛋白或其抗原优势表位片段可以由编码其氨基酸序列的任何简并性碱基序列编码，这些编码的简并性碱基序列也应包含在本发明的MDA5蛋白或其抗原优势表位片段范围之内。
上述重组蛋白或抗原优势表位蛋白片段，可通过本领域内任何可行方式得到，常见为基因克隆表达方式或化学合成方式。当抗原优势表位片段较长时，优选通过基因克隆表达方式得到，此时可以更为简便得到所需的抗原优势表位片段。当抗原优势表位片段较短，如由优选的50个或更少的氨基酸肽段、40个或更少的氨基酸肽段，特别是6至10个氨基酸肽段组成时，优选通过化学合成方式（固相或液相合成）获取。
用于检测抗MDA5抗体的待测样品，可以为含有抗MDA5抗体的任何样品，如人体血液、血浆、血清、脑脊液、组织淋巴液等，优选血液、血浆和血清。
本发明用于检测抗MDA5抗体的试剂盒除包含有MDA5蛋白或其片段之外，还可以包含有：用于抗MDA5抗体检测发生反应的连接试剂，包括但不限于反应缓冲液如PBS或TBST、反应封闭液如BSA、脱脂乳或IgG白蛋白；用于标记抗原与待检测抗体形成的反应产物的显示试剂，此类显示试剂通常是行业内常用的标记抗人免疫球蛋白抗体，所述标记包括但不限于辣根过氧化物酶（HRP）标记、地高辛标记、荧光素标记和纳米荧光材料标记，如白半乳糖昔酶、碱性磷酸酶和荧光素酶的酶标记，又如FITC(异硫氨酸荧光素)和RITC(异硫氰酸四甲基罗丹明)的荧光标记，又如量子点和纳米金等的荧光纳米材料标记，或任何其他合适的标记；对照样品，是不含有抗MDA5抗体的阴性样品，包括但不限于正常健康体的血液、血清和血浆样品。
本发明对抗MDA5抗体的检测试剂盒与检测方法，使用免疫检测方法，包括但不限于免疫印迹法（IB）、酶联免疫吸附法（ELISA）、酶免疫检测法（EIA）、荧光免疫测定（FIA）、化学发光免疫测定、蛋白印迹法、免疫染色法，或类似的检测方法。其中，优选IB、ELISA，更优选IB。
在进行免疫检测时，MDA5蛋白或其片段优选结合于固相载体上，所述固相载体包括但不限于硝酸纤维素薄膜、琼脂糖凝胶、滴定板、乳胶状颗粒、玻片；所述固相载体可以是规则平面状，也可以是非规则的曲状面。
利用本发明所述的检测试剂盒进行抗MDA5抗体的检测方法，是使待测样品与试剂盒中的MDA5蛋白或其抗原优势表位片段进行接触反应，以检测是否得到抗原-抗体反应产物。
上述接触反应，优选通过IB方法检测，其步骤包含如下：
（1）电泳：利用MDA5蛋白或其抗原优势表位片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到蛋白电泳胶；
（2）电转移：将蛋白电泳胶通过电转移装置转移至硝酸纤维素薄膜上，得到固定蛋白产物；
（3）免疫杂交：使待测样品与固定蛋白产物进行反应，得到反应产物，加入显示试剂标记该反应产物；
（4）显色：利用显示试剂进行放射自显影，检测是否得到抗原-抗体反应产物。
IB综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。利用本发明的试剂盒，结合IB检测方法，可以将被转移含有蛋白的NC膜切成小条，配合显示标记试剂，可更加便于检测到待测样品中是否含有抗MDA5抗体。
本发明给出了一个优选实施例，利用人工基因克隆表达的方式得到MDA5蛋白及其抗原优势表位片段，然后通过IB方法对待测样品进行了抗MDA5抗体的检测，具体过程如下。
设计分别用于扩增不同抗原优势表位片段cDNA的特异性引物：序列号为SEQ ID NO:2的MDA5-1片段的引物M1F（SEQ ID NO:11）和M1R（SEQ IDNO:12）、序列号为SEQ ID NO:3的MDA5-2片段的引物M2F（SEQ ID NO:13）和M2R（SEQ ID NO:14）、序列号为SEQ ID NO:4的MDA5-3片段的引物M3F（SEQ ID NO:15）和M3R（SEQ ID NO:16）、序列号为SEQ ID NO:5（对应的编码碱基序列为SEQ ID NO:10）的MDA5-4片段的引物M4F（SEQ ID NO:17）和M4R（SEQ ID NO:18）。
一、抗原优势表位片段基因序列的扩增
通过基因合成公司获取得到含有编码MDA5蛋白基因序列的人工克隆质粒，以其为模板进行相应基因序列的扩增。
利用上述抗原优势表位片段cDNA的特异性引物，对相应目标区域进行扩增，得扩增产物。各相应目标区域的扩增是分别进行的。反应体系如下：
PCR反应条件如下：
95℃ 2min；
94℃ 30s，60℃ 30s，68℃ Xmin（2min/kb）；重复22个循环；
68℃ 10min；
4℃ 1min。
利用目的片段回收试剂盒（QIAGEN QIAquickGel Extraction Kit），分别对四种不同的扩增产物进行电泳跑胶回收，得到纯化的扩增产物。
二、构建目的克隆质粒
1.扩增产物的连接
构建连接体系为：
16℃连接过夜，得到连接产物。
利用感受态细胞将连接产物进行热转化，然后转接入带有相应抗生素的LB培养平板进行过夜培养，转化得到菌落筛选板；挑取单菌落再次转接到含有相应抗生素的LB培养基中进行培养5h，然后取2μL进行PCR鉴定；通过鉴定后，将含有目的片段的样品接入LB培养基过夜旋转培养。
培养得到的菌液利用Axygen小抽试剂盒，按照试剂盒的标准步骤进质粒抽提，并将得到的质粒通过测序鉴定是否为目的克隆质粒。
三、目的抗原优势表位片段的表达及纯化
得到的目的克隆质粒转染至HEK293细胞中，将转染后含有目的克隆质粒的细胞接入相应的培养基中培养48～72h，然后收集培养得到的细胞。
将收集后的细胞通过超声破碎方式进行裂解，然后高速离心收集裂解上清，通过亲和纯化的方法将裂解上清液进行纯化得到纯化蛋白。将不同的分离产物及纯化蛋白通过SDS-PAGE电泳进行检测，得到如图1～图4所示的电泳结果图。以图1为例，图中所示泳道分别代表：CL为细胞裂解液的电泳条带；M为标准样品Marker的电泳条带；W0为清洗液的电泳条带；E1～E8是利用咪唑稀释不同倍数的纯化蛋白样品电泳条带。图2～图4的电泳图中，相应的电泳泳带与图1类似。由电泳结果图可以清楚地看到，相应抗原优势表位片段蛋白已被顺利克隆表达得到。
四、利用抗原优势表位片段检测抗MDA5抗体
1、SDS-PAGE电泳
根据不同抗原优势表位片段蛋白分子量大小不同，分别利用12%～15%的PAGE电泳胶，对得到的纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳，得到相应的电泳胶。
2、电转移
利用Bio-Rad转膜仪，4℃冰浴中进行转膜1h，将电泳胶转移到NC膜上。
3、免疫杂交
将转移好的NC膜浸于5%的脱脂奶中进行30min封闭。将封闭好的NC膜浸入事先已利用TBST稀释适宜倍数的待测血清样品中，4℃过夜，然后以TBST清洗，将清洗后的NC膜浸入作为二抗的带有辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG中，室温1h后，以TBST清洗3次，得到免疫反应产物。
4、显色
直接使用Pierce显色试剂盒进行显色，其具体操作可根据产品说明书进行操作，将操作好的膜进行显影，定影后得到显色结果。
本发明利用上述基因克隆表达得到的MDA5蛋白及其抗原优势表位片段检测一例抗MDA5抗体阳性血清1以及已知抗MDA5阴性血清样品，得到如图5所示的IB结果图，其中左边标号泳道1～5分别代表MDA5克隆蛋白、MDA5-1克隆蛋白片段、MDA5-2克隆蛋白片段、MDA5-3克隆蛋白片段、MDA5-4克隆蛋白片段检测抗MDA5抗体阳性血清1样品的电泳结果；右半边标号则对应为检测抗MDA5抗体阴性血清样品的电泳结果。
从图中的结果可以清楚看到，本发明所构建的抗原优势表位片段中，MDA5-1、MDA5-2和MDA5-3片段可以检测到抗MDA5抗体。通过对检测结果的系统分析，本发明构建的抗原优势表位片段MDA5-1、MDA5-2和MDA5-3，利用IB检测方法检测的灵敏度和特异性分别为86%和99.8%。因此，上述检测结果可以清楚的表明本发明所提供的检测试剂盒及检测方法，可以高效灵敏且特异性检测抗MDA5抗体。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于检测抗MDA5抗体的检测试剂盒，其特征在于，包含由抗MDA5抗体识别的SEQ ID:1所示的MDA5蛋白或其蛋白片段。
2.根据权利要求1所述的用于检测抗MDA5抗体的试剂盒，其特征在于，所述抗MDA5抗体识别的MDA5蛋白片段包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的用于检测抗MDA5抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒通过免疫印迹法检测抗MDA5抗体。
4.根据权利要求1所述的用于检测抗MDA5抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：
（1）抗原，所述抗原包含MDA5蛋白或其片段；
（2）连接试剂，用于连接待测样品与（1）所述抗原之间的反应；
（3）显示试剂，用于标记（2）中待测样品与抗原的反应产物；
（4）对照样品，不含抗MDA5抗体，用于进行对照试验。
5.根据权利要求4所述的用于检测抗MDA5抗体的试剂盒，其特征在于，所述对照样品包含阳性对照样品或阴性对照样品。
6.一种利用权利要求1所述的试剂盒检测抗MDA5抗体的检测方法，其特征在于，使待测样品与所述试剂盒中的MDA5蛋白或其片段进行反应，得到反应产物。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品为血液、血清或血浆中的任意一种。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品中的抗MDA5抗体通过免疫印迹法检测。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述检测反应包含以下步骤：
（1）电泳：利用MDA5蛋白或其片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到蛋白电泳胶；
（2）电转移：将蛋白电泳胶通过电转移装置转移至固相载体上，得到固定蛋白产物；
（3）免疫杂交：使待测样品与固定蛋白产物进行反应，得到反应产物，加入显示试剂标记该反应产物；
（4）显色：利用显示试剂进行底物显色或放射自显影，使得反应产物显现出来。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述固相载体为硝酸纤维素薄膜。
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