CN102532315A

CN102532315A - 人脑胶质瘤标志物gfap自身抗体及其用途

Info

Publication number: CN102532315A
Application number: CN2010105949503A
Authority: CN
Inventors: 施前; 危平; 张伟; 杨柳松
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2010-12-16
Filing date: 2010-12-16
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明属生物技术和医学领域。涉及人脑胶质瘤标志物，具体涉及一种能区分人脑胶质瘤的蛋白标志物GFAP自身抗体的检测及其用途。本发明应用纯化的GFAP蛋白进行ELISA分析，检测正常人和各级脑胶质瘤病人血清中的GFAP自身抗体水平，结果显示GFAP自身抗体水平在正常血清中最低，并随肿瘤等级提升而依次升高；线性回归显示GFAP自身抗体水平与脑胶质瘤等级的相关性达到显著水平；T测试表明三级和四级脑胶质瘤的GFAP自身抗体水平与正常对照相较均达显著水平。实验表明，本发明的GFAP自身抗体可作为人脑胶质瘤的标志物，用于脑胶质瘤的早期检测和诊断。

Description

人脑胶质瘤标志物GFAP自身抗体及其用途

技术领域

本发明属生物技术和医学领域。涉及人脑胶质瘤标志物，具体涉及一种能区分人脑胶质瘤的蛋白标志物GFAP(glial fibrillary acidic protein，GFAP)自身抗体及其检测方法和用途。

背景技术

脑胶质瘤是一种起源于神经胶质细胞的肿瘤，它在脑部肿瘤中最为常见。现有的影像诊断技术因其高昂费用而无法得到广泛应用，因而发展基于临床血液样本且价格相对低廉的脑胶质瘤早期检测手段成为本领域技术人员的关注热点。自身抗体是一类免疫系统产生的针对集体自身蛋白、细胞、组织或是器官的抗体，其与自身免疫疾病密切相关。与此同时，有关研究在许多不同类型癌症病人中也鉴定到了肿瘤相关自身抗原导致的抗体产生。据推测，肿瘤自身抗体由肿瘤细胞自身抗原的非正常表达引发，它可能直接影响肿瘤生长，也可能通过激活免疫活性细胞诱导可溶性介导因子释放来促进炎症反应。研究人员认为，肿瘤可能在可检出之前就已诱发自身抗体反应，自身抗体被认为可作为肿瘤检测的早期标志物。

研究显示，多种肿瘤自身抗原相关的自身抗体已被发现，其中包括在多种肿瘤中广泛存在的cAMP-dependent protein kinase A和p53；乳腺癌中的Annexin XI-A，ASB-9，SERAC 1和RELT；前列腺癌中的HIP-1；肺癌中的Annexin T，14-3-3theta，Tim，MnSOD，LAMR1，CAGE和GBU4-5以及结肠癌中的LGR6，hCG1989951，C6orf192，PDE4A和AGBL5。虽然p53自身抗体在多种癌症中被检出，p53突变也在脑胶质瘤的发生中起着重要作用，Rainov的研究却表明脑胶质瘤病人血清中不存在p53自身抗体。脑胶质瘤病人血清里被鉴定出存在GLEA2，PHF3和Survivin自身抗体，而它们却未经证实是否适用于临床检测，例如以临床上常用的ELISA方式检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种人脑胶质瘤标志物，具体涉及一种能区分人脑胶质瘤的蛋白标志物GFAP(glial fibrillary acidic protein，GFAP)自身抗体。

本发明的另一目的是提供该蛋白标志物GFAP的检测方法；尤其涉及脑胶质瘤自身抗体能用于ELISA检测。

本发明的另一目的是提供该蛋白标志物GFAP的用途，具体涉及GFAP自身抗体可作为人脑胶质瘤的标志物的用途，尤其用于脑胶质瘤的早期检测和诊断。

本发明的目的通过下述技术方案实现，

本发明采用健康人和不同分级的脑胶质瘤病人的血清为样本，其相关临床信息如表1所示。通过使用2D-Western在脑胶质瘤中鉴定出12个自身抗原，采用图1所示的技术路线，通过2D-Western应用于血清蛋白组学研究鉴定可能用于脑胶质瘤检测、诊断及预后的自身抗体。用20个病人血清及其对应健康血清配对进行免疫印迹检测以筛选有用的自身抗原(如表1所示)；经分析比对，仅出现在病人血清中的蛋白点被选中用于进一步分析。

本发明采用质谱技术得到了35个高置信度的蛋白，该些蛋白可能在病人血清中产生自身抗体，经检测，其中的11个出现在不止一个病人的血清中，这11个蛋白，其中的大部分在20个病人血清中出现了两次，HSP70相应的自身抗体出现了三次，而GFAP相应自身抗体则出现了五次(如表2所示)。

本发明基于GFAP自身抗体在病人血清中出现的高频率，分析了GFAP自身抗体应用于临床的可能性。在使用大量病人样本进行确认之前，本发明通过使用鼠抗人GFAP抗体确认GFAP自身抗体的存在。该抗体在2D胶上检测到了GFAP蛋白点的存在，且其位置与病人血清样本孵育的2D-western膜上的GFAP自身抗体位置一致。GFAP经确认不存在于正常对照及阴性案例中(数据未显示)。

本发明进一步为确认GFAP自身抗体是否可作为脑胶质瘤标志物，应用纯化的GFAP蛋白进行ELISA分析，从而检测血清中的GFAP自身抗体水平，其包括步骤：克隆人源GFAP基因到pGEX-6p-1载体上，在细菌中表达该蛋白并行纯化；

本发明中，ELISA实验在96孔板上进行，使用该方法检测包括19个二级，17个三级，24个四级及21个正常血清在内的81个临床样本(如表1所示)，结果显示，GFAP自身抗体水平在正常血清中最低，并随肿瘤等级提升而依次升高；线性回归显示，GFAP自身抗体水平与脑胶质瘤等级的相关性达到显著水平(p＝0.002，R＝0.343)；T测试表明：三级和四级脑胶质瘤的GFAP自身抗体水平与正常对照相较均达显著水平(分别为p＝0.031和p＜0.001)。

本发明中，根据世卫组织分级标准，和根据其他临床因素如年龄、肿瘤体积、肿瘤位置、复发率等诊断指标及的p53、MIB-1、Olig2等分子标志物，检测了这些因素与GFAP自身抗体的相关性。结果显示，所检测指标中只有肿瘤体积与其显著相关(p＝0.017)，表1是研究样本的临床特征和统计分析结果。

为测验所述的标志物对于脑胶质瘤病人的检测能力，本发明将各等级的脑胶质瘤病人数据合并，通过脑胶质瘤病人组相对于正常对照组进行ROC分析，结果显示，曲线下区域为0.69(如图5所示)。

表1 研究样本的临床特征和统计分析结果

表2 MALDI-TOF质谱鉴定的自身抗体

结果表明，本发明提供的人脑胶质瘤的蛋白标志物GFAP(glial fibrillary acidicprotein，GFAP)自身抗体可作为人脑胶质瘤标志物，本发明提供了所述的蛋白标志物GFAP的检测方法；尤其是该脑胶质瘤自身抗体能用于ELISA检测；本发明提供的蛋白标志物GFAP可用于脑胶质瘤的早期检测和诊断。

附图说明

图1脑胶质瘤中自身抗体的技术路线。

图2血清标本的2D-免疫印迹检测结果，

其中，A为U251脑胶质瘤标本的2DE银染结果；B为A图中选中的方框区域的放大；C为正常对照血清的2DE-免疫印迹结果；D为脑胶质瘤病人血清的2DE-免疫印迹结果；箭头所指为自身抗体活性和相应的自身抗原。

图3脑胶质瘤自身抗体的筛选结果，

A.编号的蛋白点被鉴定为在扫描分析中出现2次以上的自身抗原；B为GFAP肽段的质谱鉴定结果。

图4免疫印迹验证GFAP的自身抗体，

A为2DE胶的银染结果；B为A图中选中的方框区域的放大；C用GFAP的抗体对2DE膜进行免疫印迹的结果；D.E.两例脑胶质瘤病人血清的2D免疫印迹结果；F为1例对照健康人血清的2D免疫印迹结果；

箭头所示：B为鉴定的GFAP蛋白点，C.D.E为GFAP蛋白的自身抗体。

图5GFAP自身抗体的ELISA结果分析

A.四组血清标本的GFAP自身抗体水平的盒须图；B.用正常对照和各级脑胶质瘤病人的GFAP自身抗体水平作ROC分析，ROC曲线下区域为0.69。

具体实施方式

实施例1：血清收集及其临床信息

不同等级的脑胶质瘤病人血清样本收集自上海华山医院，来自华山医院的41个相应年龄性别的健康人血清被用作正常人对照。所有样本均储藏于-80℃冰箱。病人血清样本依据各自组织病理学分析分为星形细胞瘤，间变性星形细胞瘤和多形胶母细胞瘤。使用蛋白组学手段，二十个多形胶母细胞瘤病人血清样本及其相应正常人血清样本被用于检测和筛选自身抗体。使用81个血清样品来检测和确认GFAP自身抗体的存在(此项研究已获复旦大学附属华山医院及生物医学研究院伦理委员会认可)。

实施例2：2D-Western分析

使用尿素缓冲液(8M urea，2.5M thiourea，65mM DTT，4％(w/v)CHAPS，0.5％(v/v)Biolytes pH 3-10，蛋白酶抑制剂混合物)裂解通过离心收集到的U251脑胶质瘤细胞，使用RC DC Protein Assay Kit(Bio-Rad)对其定量，取30微克蛋白稀释于重水化缓冲液(7M urea，2M thiourea，50mM DTT，4％(w/v)CHAPS，0.2％(v/v)BiolytespH 3-10)中，并装载于IPG胶条中。使用Protean IEF Cell(BioRad)进行等电聚焦，随即进行SDS-PAGE电泳。分离出的蛋白通过银染显示或者用100mA的电流过夜转移至PVDF膜上。同样的蛋白一次平行跑两块胶，一块使用病人血清进行免疫印迹，另一块膜的免疫印迹则使用正常人血清。在含有4％BSA的TBST中封闭两小时后，两块膜分别于1∶200稀释的病人及相应正常人血清中常温孵育一小时。TBST洗膜三次后，使用1∶10000稀释的goat anti-human IgG-HRP conjugated(Santa Cruz)作为二抗进行免疫检测。使用鼠单抗GFAP抗体(Clone GF-05，AbD Serotec，Oxford，UK)及相应HRP偶联的二抗检测2D膜上GFAP的存在。

实施例3：图像分析及蛋白鉴定

使用LAS-3000及配套软件Gauge V3.0 software(Fuji，Japan)分析并鉴定病人及相应正常人血清孵育的膜上免疫反应点的差异。通过比对经银染的2D胶和免疫印迹的图片确认各蛋白点的相应位置。将仅出现于病人血清人中的蛋白点切胶、脱色、胶内酶解并冻干。过程为将切下的胶条于50mM NH4HCO3，50％乙腈中脱色，之后于56度加入10mM DTT(Amersco，Solon，Ohio)进行还原，并通过加入55mM iodoacetamide(Bio-Rad)避光孵育使其烷基化。用乙腈使胶块脱水并于空气中风干。加入含0.01μg/ul胰酶(Promega)的25mM碳酸氢铵于37度进行16小时的胶内酶解，随后通过依次加入水，50％乙腈/0.1％TFA，和100％乙腈来提肽。将三次的提取液合并并通过离心冻干。

将冻干的肽段溶解于0.8μl α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid solution(CHCA，Sigma，St.Louis，MO，USA)in 0.1％TFA，50％CAN，随后上样并使用4700MALDI-TOF/TOF质谱仪(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)进行分析。在设置UV Laser工作波长为355nm，重复频率为200Hz，加速电压为20kV。使用胰酶酶解的肌球蛋白在内部校准模式下校准机器。所以接收到的光谱使用4700ExploreTM software(AppliedBiosystems)在默认模式下进行处理。使用峰值范围在700-3500Da间和minimum S/N 20的光谱进行tandem TOF/TOF分析。使用GPS Explorer software(V3.6，AppliedBiosystems)提交MS及MS/MS数据至MASCOT(V2.1，Matrix Science，London，U.K.)数据库中，并使用以下参数进行搜库：NCBInr database(release date：2007.6.27)，taxonomy of Homo Sapiens，trypsin digest with one missing cleavage，none fixedmodifications，MS tolerance of 150ppm，MS/MS tolerance of 0.6Da，and possibleoxidation of methionine.MASCOT protein scores (based on combined MS and MS/MSspectra)of greater than 64 were considered statistically significant(p≤0.05)。在多蛋白家族中挑选最高得分的蛋白作为代表，用以消除数据库中名称及登录号不同的冗余蛋白的影响。

实施例4：GFAP的克隆及蛋白纯化

使用以下引物克隆GFAP：正向引物5′-GCGAATTCGAGAGGAGCGCATCACCTC-3′，反向引物5′-GCCTCGAGTCACATCACATCCTTGTGCT-3′。将GFAP基因克隆至pGEX-6p-1表达载体。使用蛋白纯化柱装载Glutathione Agarose Beads(Sigma)纯化BL21大肠杆菌菌株中表达的GST-GFAP蛋白。使用鼠单抗GFAP抗体(Clone GF-05，AbD Serotec，Oxford，UK)检测纯化出的GFAP蛋白抗原性。

实施例5：ELISA分析

使用蛋白定量试剂盒检测GFAP蛋白浓度。在96孔板(Greiner)中每孔加入0.1微克GFAP重组蛋白(溶于pH9.6的碳酸盐缓冲液)进行过夜包被。三次洗涤后，加入含5％BSA的PBST溶液于4度封闭六小时。随后加入1∶2000稀释的血清样品于4度孵育两小时。血清孵育完毕后洗涤，并加入1∶50000稀释的goat anti-humanIgG-HRP conjugatedantibody(Santa Cruz)在室温下孵育一小时。室温下加入TMB底物反应十五分钟以显色，随后加入2M硫酸以终止反应，在450nm波长下检测各孔吸光度。

数据分析

使用双尾学生t检验(SPSS 16.0)分析脑胶质瘤病人和正常对照间的GFAP自身抗体水平相对差异，小于0.05的p值被认为有显著差异。其他个临床指标如年龄、性别、肿瘤尺寸、p53、MIB-1水平亦使用双尾学生t检验进行分析。回归分析及ROC分析均使用SPSS16相应模块进行。

Claims

1.人脑胶质瘤标志物GFAP自身抗体，其特征在于，为下表所示的11个蛋白，其MALDI-TOF质谱鉴定的特征为：

2.按权利要求1所述的的人脑胶质瘤标志物GFAP自身抗体，其特征在于，所述的GFAP自身抗体通过下述方法获得：

采用健康人和不同分级的脑胶质瘤病人的血清样本，用2D-Western在脑胶质瘤中鉴定出自身抗原和自身抗体；配对进行免疫印迹检测筛选如权利要求1所示的自身抗原，经分析比对，仅出现在病人血清中的蛋白点被选中用于进一步分析；

采用质谱技术得到高置信度的蛋白，其中的11个确定为所述的GFAP自身抗体；

用鼠抗人GFAP抗体确认GFAP自身抗体的存在；

应用纯化的GFAP蛋白进行ELISA分析，从而检测血清中的GFAP自身抗体水平，确认GFAP自身抗体作为脑胶质瘤标志物。

3.一种检测权利要求1的人脑胶质瘤标志物GFAP自身抗体的方法，其特征在于，采用ELISA分析方法，使用蛋白定量试剂盒检测GFAP蛋白浓度，其包括步骤：在96孔板中每孔加入0.1微克GFAP重组蛋白，溶于pH9.6的碳酸盐缓冲液，过夜包被，洗涤后，加入含5％BSA的PBST溶液于4度封闭后，加入血清样品孵育；孵育完毕洗涤，加入1∶50000稀释的goat anti-human IgG-HRP conjugated antibody在室温下孵育；室温下加入TMB底物反应以显色，加入2M硫酸终止反应，在450nm波长下检测各孔吸光度。

4.权利要求1的人脑胶质瘤标志物GFAP自身抗体在制备早期检测脑胶质瘤制剂中的用途。

5.权利要求1的人脑胶质瘤标志物GFAP自身抗体在制备诊断脑胶质瘤制剂中的用途。