CN103278640A - 一种抗BP180 NC16A IgE抗体的酶联免疫检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗BP180 NC16A IgE抗体的酶联免疫检测试剂盒及检测方法，属于IgE检测方法技术领域。该试剂盒包括检测试剂，检测试剂的制备方法包括表达、提纯、浓缩抗BP180 NC16A蛋白；将浓缩的抗BP180 NC16A蛋白稀释至500μg/mL，得到抗原包被液；对抗原包被液进行包被后封闭，得到检测试剂。该检测方法以该试剂盒为基础，包括一抗孵育，二抗孵育，显色，显色终止后以酶标仪读取各样本试剂盒在波长为450nm、参考波长为620nm处的吸光度，根据吸光度得出检测结果。该试剂盒及检测方法灵敏度高且具有特异性。该试剂盒及检测方法能够确诊大疱性类天疱疮（BP）、妊娠疱疹、瘢痕性类天疱疮、大疱性扁平苔藓、线状IgA大疱性皮病。

Description

一种抗BP180 NC16A IgE抗体的酶联免疫检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及IgE检测方法技术领域，特别涉及一种抗BP180NC16A IgE抗体的酶联免疫检测试剂盒及检测方法。 

背景技术

现有技术中，对抗BP180 NC16A IgE抗体进行检测时，受到标本采集途径，抗原包被浓度，标本稀释浓度，二抗稀释液浓度和反应温度等条件的限制，不仅灵敏度较低，而且，正确性无法得到保障。 

发明内容

为了解决上述问题，本发明提出了一种灵敏度高且具有特异性的种抗BP180NC16A IgE抗体的酶联免疫检测试剂盒及检测方法。 

本发明提供的抗BP180 NC16A IgE抗体的酶联免疫检测试剂盒，包括检测试剂，所述检测试剂的制备方法包括以下步骤： 

步骤11：向E.coli DH5α感受态细胞悬液中加入重组质粒pGEX-2T抗BP180NC16A的DNA，表达抗BP180 NC16A蛋白； 

步骤12：对所述抗BP180 NC16A蛋白进行提纯，得到纯化的抗BP180 NC16A蛋白； 

步骤13：对所述纯化的抗BP180 NC16A蛋白进行浓缩，得到浓缩的抗BP180  NC16A蛋白； 

步骤14：向所述浓缩的抗BP180 NC16A蛋白中加入PBS，使其稀释至500μg/mL，得到抗原包被液； 

步骤15：对所述抗原包被液进行包被后封闭，得到所述检测试剂。 

本发明提供的抗BP180 NC16A IgE抗体的酶联免疫检测方法包括以下步骤： 

步骤21：向权利要求1所述的试剂盒的反应孔中加入反应样本，在30℃恒温条件下一抗孵育，2h后用PBST第Ⅰ次洗板； 

步骤21’：用BSA封闭液将HRP标记的IgE抗体原液稀释1000倍，得到二抗稀释液； 

步骤22：向经过第Ⅰ次洗板的试剂盒的反应孔中加入所述二抗稀释液，在30℃恒温条件下二抗孵育，1h后用PBST第Ⅱ次洗板； 

步骤23：向经过第Ⅱ次洗板的试剂盒的反应孔中加入显色液，在30℃恒温条件下显色，得到样本试剂盒； 

按照步骤21、步骤21’、步骤22、步骤23，同时得到待测样本试剂盒和至少3个阴性对照样本试剂盒； 

步骤24：显色终止后以酶标仪分别读取待测样本试剂盒和阴性对照样本试剂盒在波长为450nm、参考波长为620nm处的吸光度，若待测样本的吸光度＞阴性对照样本吸光度均值+2SD，则检测结果为阳性，若待测样本吸光度＜阴性对照样本吸光度均值+2SD，则检测结果为阴性。 

作为优选，所述待测样本为经过PBS以1∶10稀释的血清或者水疱。 

本发提供的抗BP180 NC16A IgE抗体的酶联免疫检测试剂盒及检测方法的有益效果在于，灵敏度高且具有特异性。 

具体实施方式

为了深入了解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。 

本发明提供的抗BP180 NC16A IgE抗体的酶联免疫检测试剂盒包括检测试剂，检测试剂的制备方法包括以下步骤： 

步骤11：向E.coli DH5α感受态细胞悬液中加入重组质粒pGEX-2T抗BP180NC16A的DNA，表达抗BP180NC16A蛋白。其中，将该重组质粒pGEX-2T导入到E.coli DH5α感受态细胞的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏日期为2012年12月11日，保藏编号为CGMCC No.6976，其分类命名的中文为大肠埃希氏菌，拉丁文为Escherichia coli。 

步骤12：对抗BP180 NC16A蛋白进行提纯，得到纯化的抗BP180 NC16A蛋白。 

步骤13：对纯化的抗BP180 NC16A蛋白进行浓缩，得到浓缩的抗BP180 NC16A蛋白。 

步骤14：向浓缩的抗BP180 NC16A蛋白中加入PBS，使其稀释至500μg/mL，得到抗原包被液。 

步骤15：对抗原包被液进行包被后封闭，得到检测试剂。 

本发明提供的抗BP180 NC16A IgE抗体的酶联免疫检测方法包括以下步骤： 

步骤21：向权利要求1的试剂盒的反应孔中加入反应样本，在30℃恒温条件下一抗孵育，2h后用PBST第Ⅰ次洗板； 

步骤21’：用BSA封闭液将HRP标记的IgE抗体原液稀释1000倍，得到二抗稀释液； 

步骤22：向经过第Ⅰ次洗板的试剂盒的反应孔中加入二抗稀释液，在30℃恒温条件下二抗孵育，1h后用PBST第Ⅱ次洗板； 

步骤23：向经过第Ⅱ次洗板的试剂盒的反应孔中加入显色液，在30℃恒温条件下显色，得到样本试剂盒； 

按照步骤21、步骤21’、步骤22、步骤23，同时得到待测样本试剂盒和至少3个阴性对照样本试剂盒； 

步骤24：显色终止后以酶标仪分别读取待测样本试剂盒和阴性对照样本试剂盒在波长为450nm、参考波长为620nm处的吸光度，若待测样本的吸光度＞阴性对照样本吸光度均值+2SD，则检测结果为阳性，若待测样本吸光度＜阴性对照样本吸光度均值+2SD，则检测结果为阴性。 

其中，待测样本为经过PBS以1∶10稀释的血清或者水疱，从而减少血清或者水疱的采集量。 

实施例 

（一）材料 

1.标本： 

1)血清样本（或水疱样本） 

待测样本:来源于待检测的BP患者或疑诊BP患者 

阴性对照血清：经免疫印迹（western blot）确定的不含有抗抗BP180NC16AIgE抗体的患者的血清 

2)E.coli DH5α 

3)质粒pGEX-2T抗BP180NC16A 

2.主要试剂： 

3.所需耗材： 

4.所需器材： 

（二）实验试剂的配置： 

1.大肠杆菌LB培养基： 

配每升培养基，应在950毫升去离子水中加入： 

胰化蛋白胨    10g 

酵母提取物    5g 

NaCl          10g 

琼脂粉        15g（固体培养基） 

摇动容器至溶质溶解，用5M NaOH(约0.2mL)调pH至7.0。用去离子水定容至1L。在1.5psi高压下蒸汽灭菌20min。 

2.0.1M CaCl₂溶液 

称取0.56g CaCl₂，溶于50mL蒸馏水中，定容至100mL,高压灭菌。 

3.含15%甘油的0.05M CaCl₂： 

称取0.28g CaCl₂,溶于50mL蒸馏水中，加入15mL甘油，定容值100mL，高压灭菌。 

4.50mM Tris HCl pH 8.0 

Tris 3.6342g 

溶于500mL蒸馏水，浓盐酸调pH至8.0，最后定容至600mL，存于4℃备用。 

5.100mM PMSF 

PMSF0.0871g溶于5mL异丙醇中，分装于1mL离心管中，-20℃保存。 

6.细菌裂解液 

使用时每毫升加入100mM PMSF 10μL。 

7.5mg/mL BSA 

称取5mgBSA溶于1mL蒸馏水中，保存于-20℃冰箱，使用时1：10稀释。 

8.洗脱缓冲液 

50mM Tris HCl pH 8.0 5mL 

Glutathione Reduced 0.0307g 

混匀备用，现用现配。 

9.封闭液（1% BSA/PBS） 

0.3g BSA溶于30mL PBS,混匀备用，现用现配。 

本发明提供的抗BP180 NC16A IgE抗体的酶联免疫检测试剂盒所使用的检测试剂的制备方法具体步骤如下： 

1.原核表达抗BP180NC16A： 

1）感受态细胞的制备： 

①LB固体培养及高压灭菌后，冷却至60℃左右，加入氨苄青霉素使终浓度达到100μg/mL，摇匀后铺板。 

②重新活化的E.coli DH5α平板上挑取单一菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃，220rmp震荡培养至对数生长（分光光度计测量A600 0.6～0.8，约12h)。 

③将该菌悬液以1：100～1：50转接于100mL LB液体培养基中，37℃，220rmp震荡培养3小时左右至A600=0.5左右。 

④将培养液转入离心管中（8mL/管），冰上放置10～20分钟，然后4℃下3000g离心10min。 

⑤弃去上清，没管加入预冷的0.1M的CaCl₂ 4mL，轻轻悬浮细胞，冰上放置30min后，4℃下3000g离心10min，重复一遍。 

⑥弃去上清，加入预冷的含15%甘油的0.05M CaCl₂，轻轻悬浮细胞，冰浴2h，即成感受态细胞悬液。 

⑦感受态细胞分装到100μL的EP管中，存于-80℃冰箱。 

2）细胞转化 

①取100μL感受态细胞悬液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作）置于1.5mL EP管中，加入10μL重组质粒DNA。 

②将以上样品轻轻摇匀，冰上放置30min，立即于42℃水浴中保温1.5min,然后迅速冰上冷却2min。 

③立即向上述管中加入0.9mL LB液体培养基（不需在冰上操作），该溶液成为转化反应原液，摇匀后于37℃震荡培养约45～60min，使受体菌恢复正常状态。 

3）E.coli DH5α表达蛋白质： 

①取15mL灭菌培养基，加入氨苄青霉素使其终浓度达到100μg/mL. 

②在其中加入转化大肠杆菌悬液1mL，37℃，220rmp过夜培养。 

③培养前在剩余培养基中加入氨苄青霉素使其终浓度达到100μg/mL。每500mL培养基中加入过夜培养的细菌悬液5mL，37℃，220rmp培养三小时后分光光度计测量A600，至0.6～0.8时（此时为细菌生长的对数期），停止培养。 

④加入IPTG，使培养基内终浓度达到0.1mM，温度改为30℃，继续培养3～4小时。 

⑤培养完成后，将含有大肠杆菌的培养基加入50mL离心管中，8500rmp4℃离心10min,弃去上清，在原离心管中再次加入50mL培养基，重复离心，每离心管可重复离心5～6次，即每管中最多可得倒250～300mL培养基中的大肠杆菌。 

⑥每管离心管加入20mL PBS，漩涡震荡使其悬浮后，再次8500rmp 4℃离心10min，如此洗涤2次。细菌沉淀可动存于-80℃冰箱或继续下一步处理。 

⑦按原菌液体积的1/5～1/10加入裂解液漩涡震荡重悬菌体。 

⑧将含有菌液的离心管至于碎冰中，以200W工作4s，间歇3s,裂解细菌40次，冰浴冷却后相同的条件下裂解20次，重复直到细菌悬液清澈透明、从枪头滴下不黏连。一般重复2次即可达到裂解完全。 

⑨裂解好的菌液8500rmp 4℃离心15min，收集上清液即为裂解蛋白。上清液分装后可存于-80冰箱中。 

4）纯化蛋白 

①轻摇混匀Glutathione Sepharose 4B，移液管将2mL混悬液移至层析柱中，打开下端盖子，使液体流出。 

②每管加入8～10mL PBS结合缓冲液，洗涤微珠，颠倒混匀，打开塞子，使PBS自下端流出。重复洗涤两次。 

③蛋白裂解物加入洗涤好的微珠中，室温下孵育0.5～1h。孵育时轻柔的 颠倒混匀。 

④打开层析柱下方盖子，使未结合蛋白裂解液流出。 

⑤层析柱中加入结合缓冲液，5～8mL，颠倒混匀后使其流出，如此洗涤三次。 

⑥每柱中加入1mL洗脱缓冲液以洗去结合蛋白，室温下孵育5～10min，孵育时轻柔混匀。 

⑦孵育完毕后收集洗脱缓冲液即为提纯蛋白。一般重复收集5次纯化蛋白，也可收集5～10次测量后分别测量每次蛋白浓度以确定洗脱次数。 

5）浓缩蛋白 

①将纯化蛋白混匀，取3.5mL加入超滤离心管中，3500rpm 4℃离心25min,取超滤管上层液体，置于-80℃冰箱保存。 

②用毕的离心管，0.1M NaOH浸泡1h后离心，再泡于无菌蒸馏水中，置于4℃冰箱保存，注意避免超滤膜干燥。 

2.酶联免疫荧光实验： 

6）蛋白浓度测定: 

①取蛋白标准品（0.5mg/mL BSA）按0、1、2、4、8、12、16、20μL加入96孔板中，加PBS补足到20μL，做复孔。 

②纯化蛋白以原液或1：2、1：5稀释后，取20μL加入空白孔中，做复孔。 

③各空加入200μL考马斯亮蓝G250染色液，混匀，室温放置3～5min. 

④酶标仪测定595nm处的吸光度 

⑤以标准品蛋白浓度为横坐标，标准品蛋白吸光度为纵坐标做标准曲线，根据标准曲线计算出浓缩蛋白的浓度。 

7）包被抗原： 

①根据测得浓度，将浓缩蛋白用PBS稀释至500μg/mL。 

②每微孔中加入100μL 500μg/mL的纯化蛋白，封板膜封好后，4℃冰箱包被过夜（12h)。 

③包被完毕后每孔加入PBST 300μL，静置1min，甩干水分，在吸水卫生纸上用力拍干，重复5次。 

8）封闭： 

①每孔加入封闭液（1%BSA）200μL，封板膜封好，置于30℃温箱中封闭2h。 

②封闭结束后每孔加入PBST 300μL，静置1min，甩干水分，在吸水卫生纸上用力拍干，重复5次。 

经过上述步骤，即制得本发明提供的抗抗BP180 NC16A IgE抗体的酶联免疫检测试剂盒所使用的检测试剂。 

本发明提供的抗抗BP180 NC16A IgE抗体的酶联免疫检测方法的具体方法步骤如下： 

1）一抗孵育： 

①血清样本（或水疱样本）按顺序标号，每EP管中加入90μL PBS，10μL待测血清（疱液），达到1：10稀释。 

②按照排序，每个包被好的微孔中加入50μL稀释好的待测血清，必要时可做复孔。 

③每次实验均需加入3个同样稀释度的阴性对照血清。 

④封板膜封闭。置于30℃温箱中反应2h。 

⑤孵育结束后每孔加入PBST 300μL，静置1min，甩干水分，在吸水卫生 纸上用力拍干，重复5次。 

2）二抗孵育： 

①在一抗（即血清）在孵育时即可准备好二抗（HRP标记的鼠抗人IgE抗体）；每毫升封闭液中加入抗体原液1μL，即二抗1：1000稀释。根据标本量的多少确定二抗的量。 

②每孔加入100μL稀释好的IgE抗体，封闭好后30℃温箱中孵育1h。 

③孵育结束后，PBST洗涤5次，方法同前。 

3）显色： 

每孔加入100μL TMB/H₂O₂显色底物，30℃暗处孵育30min。 

4）终止： 

底物显色完毕后，立即每孔加入100μL终止液（1MH₂SO₄） 

5）读取OD450： 

酶标仪读取波长为450nm、参考波长为620nm处的吸光度，尽快进行。 

若待测样本的吸光度＞阴性对照样本吸光度均值+2SD，则检测结果为阳性，若待测样本的吸光度＜阴性对照样本吸光度均值+2SD，则检测结果为阴性。 

本发提供的抗BP180 NC16A IgE抗体的酶联免疫检测试剂盒及检测方法的有益效果在于，灵敏度高且具有特异性。 

该试剂盒及检测方法能够确诊大疱性类天疱疮（BP）、妊娠疱疹、瘢痕性类天疱疮、大疱性扁平苔藓、线状IgA大疱性皮病。 

病例1 

患者男，65岁，全身起水疱3周来就诊。3周前无明显诱因患者躯干、四肢出现红斑伴瘙痒，当地医院诊为湿疹，外用糠酸莫米松、口服氯雷他定效不佳，皮疹渐增多并出现水疱。 

既往体检，无家族遗传病史。 

个人史无特殊。 

体格检查：一般情况好，心肺腹检查未见异常。皮肤科情况：躯干四肢泛发水肿性红斑，其上散在绿豆至蚕豆大小水疱，尼氏征阴性。口腔、外生殖器黏膜未见异常。 

实验室检查：血常规：WBC 12.4×109/L,中性粒细胞77%，淋巴细胞13％，嗜酸性粒细胞10%。尿常规正常，肝肾功能正常。组织病理：表皮下水疱形成，疱液中可见大量嗜酸性粒细胞浸润和纤维蛋白网。抗抗BP180阳性，抗BP230阳性。直接免疫荧光示基底膜带IgG、IgM、C3线状沉积；间接免疫荧光：患者血清中存在IgG抗基底膜带抗体。诊断为大疱性类天疱疮。 

直接采用抗抗BP180 NC16A IgE抗体的酶联免疫检测试剂盒及检测方法检测抗抗BP180NC16A IgE抗体，待测样本的吸光度为0.543，阴性对照样本吸光度均值为0.008003，标准差SD为0.0068948，阴性对照样本吸光度均值+2SD=0.0217926，由于待测样本的吸光度＞阴性对照样本吸光度均值+2SD，检测结果为阳性，与实验室检查结果相吻合。 

病例2 

患者女47岁,因双下肢红斑水疱1年,泛发全身1周就诊。1年前无明显诱因双下肢出现红斑水疱，当地医院行病理检查诊为大疱性类天疱疮，予皮质类固醇激素30mg/D治疗2周，皮损消退，激素渐减量至5mg/D时皮疹复发。遂来我院就诊。 

既往史：糖尿病2年，无肝炎结核等传染病史。 

个人史无特殊。 

体格检查:一般情况好，心肺腹检查未见异常。皮肤科情况：躯干四肢泛发 环状红斑，红斑边缘可见米粒大小水疱，尼氏征阴性。口腔生殖器黏膜未见异常。 

组织病理：表皮下水疱形成，疱液中可见中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润。直接免疫荧光示基底膜带IgA线状沉积，间接免疫荧光阴性。 

诊断：成人线状IgA大疱性皮病。 

直接采用抗抗BP180 NC16A IgE抗体的酶联免疫检测试剂盒及检测方法检测抗抗BP180NC16A IgE抗体，待测样本的吸光度为0.463，阴性对照样本吸光度均值为0.008003，标准差SD为0.0068948，阴性对照样本吸光度均值+2SD=0.0217926，由于待测样本的吸光度＞阴性对照样本吸光度均值+2SD，检测结果为阳性，与实验室检查结果相吻合。 

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

                        序列表

 

<110>  中国医学科学院北京协和医院

 

<120>  一种抗BP180 NC16A IgE抗体的酶联免疫检测试剂盒及检测方法

 

<160>  2

 

<210>  1

 

<211>  5185

 

<212>  DNA

 

<213>  质粒pGEX-2TBP180NC16A

 

<400>  1

 

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<210>  2

 

<211>  237

 

<212>  DNA

 

<213>  BP180 NC16A

 

<400>  2

 

gaggaggtgaggaagctgaaggcgcgtgtggatgagctggagaggatcaggaggagcatactgccctatggggacagcatggatagaatagaaaaggacc              100             

 

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aatgatggaacaggaaaatggaaatctccgaggatcc                                                                             237

 

Claims (3)

1.一种抗BP180NC16A IgE抗体的酶联免疫检测试剂盒，包括检测试剂，其特征在于，所述检测试剂的制备方法包括以下步骤：

步骤11：向E.coli DH5α感受态细胞悬液中加入重组质粒pGEX-2T抗BP180NC16A的DNA，表达抗BP180 NC16A蛋白；

步骤12：对所述抗BP180 NC16A蛋白进行提纯，得到纯化的抗BP180NC16A蛋白；

步骤13：对所述纯化的抗BP180 NC16A蛋白进行浓缩，得到浓缩的抗BP180NC16A蛋白；

步骤14：向所述浓缩的抗BP180 NC16A蛋白中加入PBS，使其稀释至500μg/mL，得到抗原包被液；

步骤15：对所述抗原包被液进行包被后封闭，得到所述检测试剂。

2.一种抗BP180 NC16A IgE抗体的酶联免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤21：向权利要求1所述的试剂盒的反应孔中加入反应样本，在30℃恒温条件下一抗孵育，2h后用PBST第Ⅰ次洗板；

步骤21’：用BSA封闭液将HRP标记的IgE抗体原液稀释1000倍，得到二抗稀释液；

步骤22：向经过第Ⅰ次洗板的试剂盒的反应孔中加入所述二抗稀释液，在30℃恒温条件下二抗孵育，1h后用PBST第Ⅱ次洗板；

步骤23：向经过第Ⅱ次洗板的试剂盒的反应孔中加入显色液，在30℃恒温条件下显色，得到样本试剂盒；

按照步骤21、步骤21’、步骤22、步骤23，同时得到待测样本试剂盒和至少3个阴性对照样本试剂盒；

步骤24：显色终止后以酶标仪分别读取待测样本试剂盒和阴性对照样本试剂盒在波长为450nm、参考波长为620nm处的吸光度，若待测样本的吸光度＞阴性对照样本吸光度均值+2SD，则检测结果为阳性，若待测样本吸光度＜阴性对照样本吸光度均值+2SD，则检测结果为阴性。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述待测样本为经过PBS以1∶10稀释的血清或者水疱。