DE102006059574A1

DE102006059574A1 - Verfahren und Reagenzien zur spezifischen Detektion von Autoantikörpern bei Patienten mit blasenbildenden Autoimmundermatosen

Info

Publication number: DE102006059574A1
Application number: DE200610059574
Authority: DE
Inventors: Christian Probst; Winfried STÖCKER; Wolfgang Schlumberger; Detlef Zillikens; Lars Komorowski; Cornelia DÄHNRICH; Cassian Sitaru; Christian Rose
Original assignee: Euroimmun AG
Current assignee: Universitaetsklinikum Schleswig-Holstein De; Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Priority date: 2006-12-16
Filing date: 2006-12-16
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2026-12-17
Also published as: DE102006059574B4

Abstract

Die Erfindung beschreibt Verfahren zur Verbesserung der Bindung von Autoantikörpern gegen das Protein BP180, wodurch die Diagnose und Therapie blasenbildender Hauterkrankungen, insbesondere bei bullösem Pemphigoid, verbessert wird. Die Erfindung basiert auf einem künstlich geschaffenen Peptid-Oligomer aus mehr als einer Kopie der NC16A1-5-Domäne, welches gentechnologisch produziert und anstelle des aus dem Stand der Technik bekannten monomeren NC16A1-5-Antigens im Rahmen von Immuntests oder zur Abtrennung gegen das PB180-Protein gerichteter Antikörper eingesetzt wird. Durch die Herstellung eines multimeren NC16A1-5-Antigens entfällt die Notwendigkeit der Herstellung eines heterologen Fusionsproteins, wodurch die Herstellung des Antigens vereinfacht, die spezifische Reaktivität des Antigens mit den zu bestimmenden Autoantikörpern erhöht und die Zugänglichkeit von Epitopen, beispielsweise im diagnostischen Test verbessert wird. Durch den Einsatz des multimeren NC16A1-5-Antigens im BP180-Autoantikörpertest der 2. Generation wird die Spezifität gegenüber den Testsystemen der 1. Generation auf der Basis von monomerem NC16A1-5 erhöht.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein aus mehreren Kopien der NC16A1-5-Domäne des BP180-Proteins zusammengesetztes Fusionsprotein, ein auf diesem Polypeptid basierendes Verfahren zum Nachweis von Autoantikörpern für die serologische Diagnostik des bullösen Pemphigoids und entsprechende Testreagenzien sowie ein Verfahren zur Abtrennung BP180-spezifischer Autoantikörper aus Probenmaterialien.
Die Erfindung trägt dazu bei, die unterschiedlichen Formen entzündlicher blasenbildender Dermatosen voneinander abzugrenzen und krankheitsspezifische Therapiekonzepte anzuwenden.
Stand der Technik:
Das bullöse Pemphigoid (BP) wurde 1953 durch Lever (Lever, W. F. 1953. Pemphigus. Medicine. 32: 1–123) als eine subepidermale blasenbildende Hauterkrankung beschrieben. Bei Patienten mit BP lösen sich die Keratinozyten von der Basalmembran, wodurch flüssigkeitsgefüllte Bläschen auf der Haut entstehen. Durch direkte und indirekte Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, dass BP-Patienten zirkulierende und gebundene Autoantikörper gegen die Basalmembran-Zone (BMZ) der Haut aufweisen (Jordon et al. 1967. J. Am. Med. Assoc. 200: 751–758.). Eines der Ziele für diese Autoantikörper ist das Collagen 17A (= BP180) (Diaz et al. 1990. J. Clin. Invest. 86: 1088–1094).
Im Jahre 1990 wurde die für das BP180 kodierende cDNA-Sequenz publiziert (Diaz et al. 1990. J. Clin. Invest. 86: 1088–1094.). Beim BP180 (Swissprot-Zugriffsnummer für das humane Genprodukt: Q9UMD9) handelt es sich um ein von Keratinozyten exprimiertes, in den Hemidesmosomen lokalisiertes Transmembranprotein. Die nichtkollagene aminoterminale BP180-Domäne ist Bestandteil des intrazellulären hemidesmosomalen Plaque. Die carboxyterminale extrazelluläre Domäne vermittelt die Interaktion mit der BMZ und enthält 15 Kollagen-Domänen.
Die Mehrzahl der diagnostisch relevanten Epitope des BP180 befindet sich in der nichtcollagenen (NC) Domäne 16A (NC16A), die sich der Transmembrandomäne C-terminal direkt anschließt und zur Ektodomäne zählt (Liu et al. J. Immunol. 155: 5449–5454, 1995).
In einem Maus-Modellsystem wurde gezeigt, dass passiv übertragene BP180-Antikörper zur Induktion einer Blasenbildung der Haut führen und an der Pathogenese der Erkrankung ursächlich beteiligt sind (Zillikens et al. 1997. J Innest Dermatol. 109(4): 573–9).
Für den diagnostischen Einsatz wurde ein bakteriell exprimiertes Fusionsprotein aus Glutathion-S-Transferase (GST) aus Schistosoma japonicum und der NC16A1-5-Domäne sowie ein darauf basierender ELISA beschrieben (Zillikens et al. 1997. J. Innest. Dermatol. 109: 679–683). Die bevorzugt diagnostisch einsetzbare NC16A-Domäne setzt sich aus den jeweils 15 Aminosäureresten umspannenden Subdomänen 1–5 zusammen und wird in Anlehnung an die Publikation Zillikens et al. 1997. J. Innest. Dermatol. 109: 573–579 als NC16A1-5 bezeichnet. Die Aminosäuresequenz von NC16A1-5 ist in SEQ ID NO 1 dargestellt. Die Herstellung des rekombinanten Proteins muß aufgrund der geringen Größe als Fusionsprotein erfolgen. Der Nachteil dieses Vorgehens besteht darin, dass ein Großteil des rekombinanten Proteins aus dem heterologen Fusionspartner (bsp. GST) besteht, der regelmäßig in einem aufwendigen Verfahren vom gewünschten Protein abgetrennt werden muß.
Die Firma Novagen bietet zur rekombinanten Expression kleiner Peptide beispielsweise den Vektor pET31b an. Bei diesem Expressionssystem wird die für die Peptide kodierende Sequenz durch Hybridisierung phosphorylierter Oligos oder Polymerase Kettenreaktion (PCR) generiert und in mehreren Kopien gerichtet in den Expressionsvektor eingebaut. Das System ist für die Herstellung von Peptiden im Bereich von 20 Aminosäureresten optimiert, die durch chemische Spaltung aus dem rekombinanten Fusionsprotein freigesetzt werden können.
Von der japanischen Firma MBL (Medical and Biological Laboratories Co. Ltd., Nagoya, Japan) wird ein diagnostischer Testsatz zur Bestimmung von BP180-spezifischen Autoantikörpern unter der Bezeichnung „BP180 ELISA Kit", basierend auf bakteriell exprimiertem, monomeren NC16A1-5 kommerziell vertrieben. Zwei Studien bewerten die Leistungsfähigkeit dieses bisher einzigen kommerziellen Testsystems unterschiedlich. Während in der Publikation (Sakuma-Oyama et al. Br J Dermatol. 2004 151: 126–31.) eine Sensitivität von 89% und Spezifität von 98% des NC16A1-5-ELISA im Vergleich zur als Goldstandard angesehenen indirekten Immunfluoreszenz auf Spalthaut ermittelt wurde, wird in einer anderen Publikation (Agosto et al. 2004. July; 11(4): 762–765) bei einer Spezifität von 100% nur eine Sensitivät von 66,6% ermittelt. Die Autoren der letzgenannten Studie erklären die mangelnde Sensitivität des NC16A1-5-basierten ELISA dahingehend, dass außerhalb von NC16A1-5 weitere BP180-spezifische Epitope liegen, die durch NC16A1-5 nicht erfasst werden.
Beschreibung der Erfindung:
Dem Fachmann ist bekannt, dass die Herstellung rekombinanter Proteine mit weniger als 100 Aminosäureresten in E. coli in der Regel geringe Ausbeuten ergibt. Um so kleine Polypeptide trotzdem rekombinant zu produzieren, wird der Umweg einer Herstellung als heterologes Fusionsprotein mit einem vorzugsweise zur Affininätsaufreinigung einsetzbaren und vorzugsweise enzymatisch abspaltbaren Fremdproteinanteil eingeschlagen. Häufig wird als Fusionsproteinanteil Glutathion-S-Transferase (GST) eingesetzt. In Auswertung der vorliegenden Publikationen erfolgt die Herstellung des zur Autoantikörper-Bindung eingesetzten rekombinanten NC16A1-5-Polypeptids nach dieser Strategie.
Um den Umweg der Herstellung als heterologes Fusionsprotein und die damit verbundene aufwendige Aufreinigung des gewünschten Polypeptids zu vereinfachen, wurde ein aus vier NC16A1-5-Domänen zusammengesetztes rekombinantes autologes Fusionsprotein gemäß SEQ ID NO 2 rekombinant produziert, biochemisch aufgereinigt und im ELISA zur Bestimmung BP180-spezifischer Autoantikörper eingesetzt. Als Referenzsystem wurde der kommerziell erhältliche und auf rekombinantem, monomerem NC16A1-5 basierende ELISA der Firma MBL eingesetzt.
Mit dem neuen tetrameren Antigen wurde ein prototypischer ELISA produziert und im Rahmen einer Studie mit dem auf monomeren NC16A1-5 basierenden BP180-Autoantikörper-Test der Firma MBL verglichen. Dabei zeigte sich, dass mit diesem polymeren Antigen überproportional viel antigene Epitope an die feste Phase gebracht und der Antikörperbindung zugänglich gemachen werden können.
Überraschenderweise stellten wir fest, dass der auf tetramerem NC16A1-5 basierende und neu entwickelte ELISA im Vergleich zum auf monomeren NC16A1-5 basierenden ELISA der 1. Generation eine Steigerung der Spezifität bei nahezu unveränderter Sensitivität für das bullöse Pemphigoid zeigt. Diese Effekte waren in der Summe nicht vorhersehbar und ursprünglich nicht beabsichtigt.
Es gibt für die verbesserte Leistungsfähigkeit des auf tertamerem NC16A1-5 basierenden ELISA der 2. Generation mehrere Erklärungsmöglichkeiten. Es kann sein, dass bei direkter Kopplung des monomeren NC16A1-5-Epitope maskiert und der Antikörperbindung entzogen werden. Darüberhinaus ist anzunehmen, daß die mehrstufige Aufreinigung und Spaltung des heterologen Fusionsproteins zur teilweisen Zerstörung des Zielantigens führt.
Der auf tetamerem NC16A1-5 basierende Test der 2. Generation stellt somit eine gegenüber dem Stand der Technik deutliche Verbesserung der serologische Diagnostik des Bullösen Pemphigoids dar.
Beispiele
Beispiel 1: Klonierung von pET24d-N-(NC16A)₄
NC16A1-5 ist vollständig durch Exon 18 des BP180-Gens kodiert.
Als Template zur PCR-Amplifikation der für NC16A1-5 (Zillikens et al. 1997. J Invest Dermatol. 109(4): 573–579) kodierenden Genbereiche wurde humane chromosomale DNA aus HEK293-Zellen eingesetzt. Die vier aneinanderzusetzenden und jeweils für NC16A1-5 kodierenden Teilstücke wurden in separaten PCR-Ansätzen unter Verwendung der Primerkombinationen SEQ ID NO 3 und 4 (NC16A1-5-I), SEQ ID NO 5 und 6 (NC16A1-5-II), SEQ ID NO 7 und 8 (NC16A1-5-III) bzw. SEQ ID NO 9 und 10 (NC16A1-5-IV) hergestellt. Durch die PCR werden in die Amplifikate:
NC16A1-5-I eine NcoI und KpnI,
NC16A1-5-II eine KpnI und HindIII
NC16A1-5-III eine HindIII und BamHI bzw.
NC16A1-5-IV eine BamHI und XhoI jeweils am 5'- bzw. 3'-Ende des kodierenden Stranges integriert.
Die PCR wurde unter Verwendung des „High Fidelity PCR Enzyme Mix" (Fermentas) entsprechend den Herstellerangaben im 50 μl Maßstab durchgeführt. Es wurden 30 Reaktionszyklen, zusammengesetzt aus den Schritten 1 bis 3:

Schritt 1 30 Sekunden 94°C

Schritt 2 45 Sekunden 56°C

Schritt 3 30 Sekunden 72°C durchgeführt.
Die PCR-Fragmente wurden anschließend unter Verwendung des NucleoSpin^® Extract II-Aufreinigungssystems (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG) entsprechend den Angaben des Herstellers aufgereinigt und in jeweils 50 μl 5 mM Tris-HCl pH 8,5 aufgenommen. Anschließend wurden die Fragmente durch Restriktionsendonukleasen an den Enden gespalten. Die Restriktionsendonukleasen wurden von der Firma Fermentas bezogen und entsprechend den Angaben des Herstellers eingesetzt.
Die Amplifikate wurden folgendermaßen mit Restriktionsendonukleasen behandelt:
NC16A1-5-I NcoI und KpnI,
NC16A1-5-II KpnI und HindIII
NC16A1-5-III HindIII und BamHI
NC16A1-5-IV BamHI und XhoI.
Die PCR-Fragmente wurden anschließend unter Verwendung des NucleoSpin^® Extract II-Aufreinigungssystems entsprechend den Angaben des Herstellers aufgereinigt und in jeweils 50 μl 5 mM Tris-HCl pH 8,5 aufgenommen.
Die enzymatisch geschnittenen und aufgereinigten PCR-Fragmente wurden anschließend in NcoI/XhoI geschnittenes Plasmid gemäß SEQ ID NO 11 durch Ligation integriert. Zur Ligation wurde das Rapid DNA Ligation Kit der Firma Fermentas entsprechend den Angaben des Herstellers eingesetzt. Der Ligationsansatz wurde in E. coli RosettaBlue(DE3)pLacI (Stratagene) transformiert.
Positive Klone werden aufgrund der Kanamycin/Chloramphenicol [50/34 μg/ml] Resistenz selektiert. Aus diesen Klonen werden die enthaltenen Plasmide isoliert und durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung überprüft. Die Sequenz der zwischen die NcoI- und XhoI-Schnittstelle integrierten DNA ist in SEQ ID NO 12, die Sequenz des rekombinanten Proteins in SEQ ID NO 2 dargestellt. Korrekte Plasmide werden für die Durchführung der Expression ausgewählt, in 20 ml antibiotikahaltigem LB-Medium inokkuliert und bei 37°C bis zum Erreichen einer OD₆₀₀ (d = 1 cm) von 0,6 inkubiert. Durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration: 1 mM) wird die Proteinexpression induziert und anschließend für weitere 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach dieser Zeit werden die Zellen durch Zentrifugation bei 2.200 × g für 10 Minuten sedimentiert, in 20 ml PBS resuspendiert, erneut zentrifugiert und schließlich in 1 ml PBS resuspendiert.
Der Zellaufschluss erfolgt durch Zugabe von einem Drittel Volumen 4 × NuPAGE-LDS-Probenpuffer (Invitrogen), gefolgt von einer 10 minütigen Inkubation bei 70°C. Chromosomale DNA wird anschließend durch Ultraschallbehandlung (Branson Sonifier, Stufe 7, MicroTip) fragmentiert.
Das Zelllysat wird nach der Trennung durch SDS-PAGE auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Anschließend werden unabgesättigte Positionen der Membran durch eine 15 minütige Inkubation mit „Universalpuffer" (EUROIMMUN) mit 3% (w/v) Milchpulver blockiert. Anschließend wird 1 Stunde mit einem gegen den His-Tag gerichteten und 1:2000 in „Universalpuffer" mit 3% (w/v) Milchpulver verdünnten monoklonalen Antikörper aus der Maus (Merck Biosciences GmbH) inkubiert. Dann wird dreimal jeweils 5 Minuten mit „Universalpuffer" gewaschen. In einem zweiten Inkubationsschritt reagieren die im positiven Fall an die Proteine gebundenen Antikörper mit einer 1:2000 in „Universalpuffer” verdünnten Konjugat-Lösung, die als Konjugat ein alkalische Phosphatase-markierte Anti-Maus-IgG-Antikörper (Sigma) enthält. Anschließend wird wie nach der Seruminkubation gewaschen. In einem dritten Inkubationsschritt werden dann die gebundenen Antikörper mit einer NBT/BCIP-„Substrat-Lösung" (4-Nitrobluetetrazoliumchlorid/Chlorobromoindolylphosphate, EUROIMMUN) nachgewiesen.
Im Westernblot kann im Falle der Expression des (His)₈-(NC16A1-5)₄-Konstruktes ein His-Tag-reaktives Protein nachgewiesen werden, dessen Größe gut mit der auf Basis der Aminosäuresequenz vorhergesagten Masse von 36,6 kDa übereinstimmt. Zellen die den unveränderten Plasmidvektor enthalten, weisen kein entsprechendes Protein auf.
Beispiel 2: Aufreinigung von (His)₈-(NC16A1-5)₄ durch Affinitätschromatographie
Bei der Affinitätssäule handelt es sich um eine NiNTA-Spinsäule (Qiagen), die nach Empfehlungen des Herstellers gehandhabt wird.
Die gemäß Beispiel 1 geernteten Zellen werden erneut wie beschrieben zentrifugiert, in 1 ml „TNI-10-Puffer" (5 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol) resuspendiert und durch dreimalige, einminütige Ultraschallbehandlung (Branson Sonifier, Stufe 7, MicroTip) aufgeschlossen. Unlösliche Proteine werden durch Zentrifugation bei 21.250 × g für 10 Minuten abgetrennt und durch Resuspendierung des Sediments in 1 ml „TNUI-5-Puffer" (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 8 M Harnstoff, 5 mM Imidazol) in Lösung gebracht. Unlösliche Bestandteile werden durch erneute Zentrifugation abgetrennt und 0,5 ml des Überstandes auf eine mit „TNUI-Puffer" äquilibrierte NiNTA-Spinsäule aufgebracht.
Nicht- oder schwachbindende Proteine werden durch mehrmaliges Waschen mit 0,5 ml „TNUI-Puffer" von der Säule entfernt. Die Elution erfolgt mit 0,2 ml „AU-Puffer" (50 mM Natriumacetat pH 4,5, 8 M Harnstoff). Die Elutionsfraktion wird durch Westernblot wie in Beispiel 1 analysiert.
Die Eluate enthalten im Wesentlichen ein Protein, das nach Färbung der Westernblotmembran mit Ponceau-S-Färbelösung jeweils einer Bande entsprechend einer Größe von 36,6 kDa entspricht. Nach Westernblot ist eine Bande derselben Größe zu sehen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass das exprimierte Protein nach der Chromatographie im Wesentlichen frei von E. coli-Bestandteilen vorliegt.
Beispiel 3: ELISA zur Bestimmung von BP180-Autoantikörpern mit Hilfe des rekombinanten His-(NC16A1-5)₄.
Die ELISA-Mikrotiterplatten werden mit in PBS verdünntem His-(NC16A1-5)₄ nach SEQ ID NO 2 über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet. Anschließend werden die mit Antigen beschichteten Platten mit PBS(0,1% Tween 20) gewaschen und für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit PBS-10% fetalem Rinderserum geblockt. Danach werden die Mikrotiterplatten erneut mit PBS-0,l% Tween 20 gewaschen. Die Inkubation der Platten erfolgt wie in den EUROIMMUN-Arbeitsanleitungen beschrieben.

Zur Ermittlung der Sensitivität wurden Serumproben von 104 Patienten mit gesichertem bullösem Pemphigoid, 107 Serumproben von Patienten mit rheumatoider Arthritis, 50 Serumproben von Patienten mit progressiver Systemsklerose sowie 72 Serumproben von Patienten mit systemischem Lupus erythematodes sowohl im auf monomerem NC16A basierenden Anti-BP180-ELISA der Firma MBL als auch dem erfindungsgemäßen und auf tetramerem NC16A1-5 basierenden ELISA hinsichtlich des Vorhandenseins BP180-spezifischer Autoantikörper der Immunglobulinklasse G (IgG) analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Tabelle 1:

	n	EUROIMMUN (Tetramer)	MBL (Monomer)
	n	anti-BP180-positiv
Bullöses Pemphigoid	104	92	952
Sensitivität [%] für Bullöses Pemphigoid	104	89%	89%
Rheumatoide Arthritis	107	2 (2%)	5 (5%)
Progressive Systemsklerose	50	2 (4%)	4 (8%)
systemischer Lupus erythematodes	72	1 (1%)	3 (4%)
Spezifität [%]	229	98%	95%

Demnach ergibt sich bei nahezu gleichwertiger Sensitivität für das bullöse Pemphigoid eine Steigerung der Sensitivität um 3% auf etwa 98%.
In einer weiteren Studie wurden zusätzlich 494 Seren gesunder Blutspender im erfindungsgemäßen ELISA analyiert. In dieser Kontrollgruppe wurde ebenfalls eine Spezifität von 98% ermittelt.
In gleicher Weise lässt sich das erfindungsgemäße Polypeptid im Western- bzw. Linien- oder Dot Blot sowie im Immunfluoreszenztest mit den gleichen Vorteilen gegenüber der Verwendung des monomeren Polypeptides zur Bestimmung BP180-spezifischer Antikörper einsetzen.
Beispiel 4: Immunabsorbtion zur Entfernung von BP180-Autoantikörpern aus Blutplasma mit Hilfe des rekombinanten His-(NC16A1-5) 4-Polypeptides.
Das erfindungsgemäße Polypeptid wird vorzugsweise kovalent an ein zur Immunaffinitätschromatografie einsetzbares Material gekoppelt. Über diese Affinitätsmatrix wird anschließend beispielsweise Blutplasma eines Patienten mit abzutrennenden BP180-spezifischen Autoantikörpern geleitet und das von diesen Antikörpern befreite Blutplasma dem Patienten anschließend refundiert. Durch den Entzug der spezifischen Autoantikörper werden die krankheitsspezifischen Symptome abgeschwächt.
Entsprechende klinische Versuche wurden bislang nicht durchgeführt. Ein vergleichbares Verfahren wird aber zum Beispiel beim Lupus erythematodes seit Jahren erfolgreich eingesetzt.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Polypeptide, die spezifisch mit Autoantikörpern gegen BP180 reagieren, dadurch gekennzeichnet, dass sie mehr als ein Polypeptid gemäß SEQ ID NO 1 oder mehr als ein Polypeptid gemäß einer Teilsequenz von mindestens zehn in SEQ ID NO 1 aufeinanderfolgenden Aminosäuren enthalten.
Polypeptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie 2 bis 10 Polypeptide gemäß SEQ ID NO 1 oder 2 bis 10 Polypeptide gemäß einer Teilsequenz von mindestens zehn in SEQ ID NO 1 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten enthalten.
Polypeptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie genau 4 Polypeptide gemäß SEQ ID NO 1 oder genau 4 Polypeptide gemäß einer Teilsequenz von mindestens zehn in SEQ ID NO 1 aufeinanderfolgenden Aminosäuren enthalten.
Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die aneinanderfusionierten NC16A1-5-Domänen auf Aminosäureebene eine Homologie von mehr als 90% aufweisen.
Polypeptide gemäß Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie in E. coli, Insektenzellen, Hefezellen oder Zellen von Vertebraten hergestellt wurden.
Polypeptide gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einem Reportermolekül verbunden sind.
Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen ein Polypeptid gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, bei dem man eine biologische Probe mit dem Polypeptid gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 in Kontakt bringt und die Bindung dieser Antikörper an das Polypeptid nachweist.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Vorhandensein der Antikörper gegen das Polypeptid mit einem Immunfluoreszenztest, ELISA, Lumineszenztest, Western Blot, Linien Blot oder Dot Blot nachweist.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, das durch den Nachweis der Antikörperbindung gegen ein Polypeptid gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 blasenbildende Hauterkrankungen diagnostiziert werden.
Reagenzien und Verfahren zur Diagnose blasenbildender Hauterkrankungen gemäß den Ansprüchen 1 bis 9.
Verfahren zur Entfernung BP180-spezifischer Autoantikörper aus dem Blut, dadurch gekennzeichnet, dass als spezifischer Bindungspartner für die zu entfernenden Autoantikörper ein rekombinantes Protein gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 verwendet wird.