DE602004004312T2

DE602004004312T2 - Allergenes Kautschuk-Protein

Info

Publication number: DE602004004312T2
Application number: DE602004004312T
Authority: DE
Inventors: Siti Arija Malaysian Rubber Board Mad Arif; Nyu Ping Malaysian Rubber Board Chew; Hoong Yeet Malaysian Rubber Board Yeang
Original assignee: Malaysian Rubber Board
Current assignee: Malaysian Rubber Board
Priority date: 2003-02-28
Filing date: 2004-02-27
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2024-02-28
Also published as: US7732566B2; US20080292635A1; EP1481991A1; DE602004004312D1; MY139558A; EP1481991B1; US20110081349A1; ES2280905T3; US7329512B2; PT1481991E; US20040171812A1

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen ein Protein.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Bis zu den späten 1980er Jahren und bis in die 90er Jahre hinein begann man in Europa und Amerika mit zunehmender Häufigkeit Berichte über allergische Reaktionen zu erhalten, die unter Benutzern von aus Latex hergestellten chirurgischen und Untersuchungshandschuhen und unter Spina-bifida-Patienten auftraten. Die bedeutsame Zunahme in der Anzahl von Berichten über Latex-Allergie in der letzten Dekade ist auch dem vermehrten Gebrauch von Latexhandschuhen in der Gesundheitsvorsorge im Zusammenhang mit den steigenden Fällen von Aids zugeschrieben worden. Sensibilisierung gegen Latex unter im Gesundheitswesen Beschäftigten ist klar arbeitsbedingt, wobei die Hauptursache Latexhandschuhe, oder genau gesagt das allergene Protein in Latexhandschuhen, sind. Nichtsdestotrotz sind zahlreiche Kreuzempfindlichkeiten zwischen Latexprotein-Allergenen und verschiedenen Nahrungsmittel- und Pollen-Allergenen bekannt. Es ist deshalb nicht unwahrscheinlich, daß viele Latex-allergische Patienten am Anfang nicht nur durch Proteine aus Latexprodukten, sondern auch durch Proteine aus anderen Quellen sensibilisiert worden sein können.
Es gibt Hunderte von Proteinen, die in natürlichem Kautschuk-Latex gefunden werden. Von diesen ist nur eine kleine Handvoll allergen (fähig, Allergie zu induzieren). Es hat viel Interesse an der Identifizierung der Proteine in Hevea-Latex, verantwortlich für Latex-Allergie, gegeben, und beträchtliche Anstrengung wird für das Isolieren und Reinigen der allergenen Proteine aus Hevea-Latex oder Latexprodukten aufgewendet. Außer vom akademischen Standpunkt würde Aufklärung der Hauptallergene in Latex ermöglichen, daß Antikörper gegen diese Proteine entwickelt werden. Die Verfügbarkeit der Antikörper würde die Entwicklung von Latex-Immunoassays, sowohl für Laboratoriums- als auch für kommerzielle Verwendung, erleichtern. Es gibt zwei Haupttypen von Latex-Immunoassays.
Immunoassays für die Diagnose von Latex-Allergie
Diese Diagnostik wird verwendet, um zu bestimmen, ob jemand gegen Latex allergisch oder sensibilisiert ist. Die Assays können entweder vom in-vitro-Format (gewöhnlich ein serologischer Test) oder vom in-vivo-Format (Hautstich-Tests) sein. Diese Assays werden in der Forschung und in der Gesundheitsvorsorge verwendet.
Immunoassays für die Quantifizierung von Latex-Allergenen in fabrikmäßig hergestellten Produkten
Diese quantitativen Assays bestimmen die Menge von allergenen Proteinen, die in Latexprodukten vorhanden sind. Sie werden zum Testen von Latexprodukten wie beispielsweise Latexhandschuhen verwendet, um den Gehalt an extrahierbaren Latex-Allergenen zu bestimmen. Solche Immunoassays würden bei der Latexproduktherstellung, insbesondere unter den Aspekten von Standardisierung und Qualitätskontrolle und Qualitätssicherung, sehr wertvoll sein. Die voraussichtlichen Käufer für solche Immunoassays würden Hersteller von Latexprodukten und Überwachungsanstalt, betraut mit der Verantwortung, die Erfüllung der Produktspezifizierung zu sichern, sein.
Die Identifizierung der hauptsächlichen Latex-Allergene dient einer weiteren nützlichen Funktion in der Gesundheitsvorsorge. Gereinigte Latex-Allergene können in der Immunotherapie verwendet werden, um Latex-allergische Patienten zu desensibilisieren. Wenn das erfolgreich unternommen worden ist, entwickelt der Patient nicht länger eine allergische Reaktion gegen Latex. Dies ist besonders wichtig, wo der Patient in einer Umgebung (z.B. in der Gesundheitsvorsorge) arbeitet, wo Latexprodukte allgegenwärtig sind.
Heute werden von der International Union of Immunological Societies (IUIS) zehn Latex-Allergene, Hev b 1 bis Hev b 10, anerkannt. (Es gibt andere Latexproteine, die von der IUIS in Betracht gezogen werden). Obwohl Anstrengungen unternommen werden, um nach signifikanten Latexprotein-Allergenen zu suchen, glauben viele Forscher, daß die meisten von den hauptsächlichen Latexprotein-Allergenen ausgemacht worden sind.
1995 kündigte Dr. Donald Beezhold in seinem Vortrag, vorgestellt auf der Int Conf an Latex Protein Allergy: The Latest Position, ein neues Latex-Allergen an, das partielle Proteinhomologie zu Patatin, dem Hauptvorratsprotein der Kartoffeln, hat. Diesem 43-kDa-Protein wird später der WHO/IUIS-Name Hev b 7 zugewiesen. Als eine rekombinante Version von Hev b 7 verfügbar wurde, wird gefunden, daß sie reaktiv mit IgE von Latex-allergischen Patienten ist. Jedoch ist der Anteil von Patienten, die gegen rekombinante Hev b 7 sensibilisiert sind, viel niedriger als erwartet. Western-Blots, die eine aktive Proteinbande um das 43-kDa-Protein herum zeigten, begegnet man viel häufiger, als durch IgE-Bindung an Hev b 7 erklärt werden könnte. Deshalb konnte das rekombinante Hev b 7 nicht für das sehr häufige Auftreten von Latexüberempfindlichkeit gegen ein Protein von etwa 43 kDa verantwortlich sein. Es ist deshalb möglich, daß ein anderes unbekanntes Latex-Allergen von rund 43 kDa existiert. Die Suche nach diesem neuen und unbekannten Protein gipfelte in der vorliegenden Erfindung. Dieses Protein ist von Natur allergen, insofern als Kontakt mit allergenem Latexprotein (ALP) eine allergische Reaktion bei Personen induzieren kann, die gegen dieses Protein sensibilisiert sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein, das aus Latex stammt, der eine allergische Reaktion bei Personen induzieren kann, die gegen das Protein sensibilisiert sind.
So stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein allergenes Latexprotein (ALP) bereit, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein mindestens 80% Sequenzidentität mit SEQ ID NO. 12 hat.
Vorzugsweise ist das Protein oder seine molekulare Variante dadurch gekennzeichnet, daß das Protein die folgenden Eigenschaften hat:

a) ein Molekulargewicht von etwa 42000 Dalton hat;
b) einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,7 hat;
c) mit IgE von Patienten, sensibilisiert gegen das Protein, bindet; und
d) die Aminosäuresequenz wie in 2 (SEQ ID NO. 12) oder kleinere Variationen dieser Aminosäuresequenz enthält, die nicht dazu führen, daß die allergenen Eigenschaften des Proteins wesentlich verändert werden.

Der zweite Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum Erhalt eines Proteins oder seiner molekularen Variante bereit, wo das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

a) Zentrifugieren des Latex zum Erhalt der Bodenfraktion;
b) Gefrier-Auftauen der Bodenfraktion zum Erhalt des Latex-B-Serums; und
c) Isolieren und Reinigen des Proteins aus dem B-Serum, erhalten in (b).

Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz, codierend das Protein oder einen Teil des Proteins, wo die DNA-Sequenz wie in 1 ist, oder kleinere Variationen dieser Sequenz bereit.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung eines Proteins oder seiner molekularen Varianten in rekombinanter Form bereit, indem die DNA, codierend das Protein oder eine Variante des Proteins, in einen geeigneten Vektor insertiert wird und der Vektor induziert wird, rekombinantes Protein oder in rekombinanter Form, der Variante des Proteins zu exprimieren, wodurch in diesem Fall die Aminosäuresequenz der vorstehenden translatierten DNA-Sequenz wie in 2 (SEQ ID NO. 12) ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die DNA-Sequenz von dem cDNA-Klon voller Länge, der das ALP codiert. 1 ist auch in SEQ ID NO. 11 gezeigt.
2 zeigt die Aminosäuresequenz von dem ALP, abgeleitet von der Translation des cDNA-Klons, der das ALP codiert. 2 ist auch in SEQ ID NO. 12 gezeigt.
3 zeigt das Spektrum der Matrix-gestützten Laser-Desorptions-Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-MS) des allergenen Latexproteins, ALP.
4 zeigt einen Western-Blot von ALP nach Trennung des Proteins durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese. Das Protein ist mit Coomassie Blue gefärbt, um das Vorhandensein und die elektrophoretische Wanderung von ALP zu zeigen (Bahn 2). Bindung von humanem IgE von Patienten, sensibilisiert gegen ALP, auf dem Western-Blot (Bahn 3), polyklonale Antikörper, entwickelt gegen ALP (Bahn 4), und ein monoklonaler Antikörper, entwickelt gegen ALP (Bahn 5).
5 zeigt einen Western-Blot von ALP nach Trennung des Proteins durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese. Das Protein ist mit Coomassie Blue gefärbt, um das Vorhandensein und die elektrophoretische Wanderung von ALP zu zeigen (Bahn 2). Eine Reaktion, die spezifisch für das Vorhandensein von Kohlenhydraten ist, wird ausgeführt, um die Glycosylierung von ALP zu zeigen (Bahn 3).
6 zeigt einen Western-Blot des rekombinanten MBP-ALP-Fusionsproteins nach Trennung durch SDS-PAGE. Das Protein ist mit Coomassie Blue gefärbt, um die elektrophoretische Wanderung des rekombinanten ALP-Fusionsproteins zu zeigen (Bahn 3). Bindung von rekombinantem ALP an monoklonale (Bahn 4) und polyklonale Antikörper (Bahn 5), entwickelt gegen natives ALP, wird ebenfalls gezeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein, das aus dem B-Serum von zentrifugiertem Latex isoliert wird, der durch Anzapfen des Kautschukbaums Hevea brasiliensis erhalten wird. Die folgende Beschreibung stellt ausführlich dar, wie das Protein isoliert, gereinigt und charakterisiert werden kann und wie es beim Klonieren der das Protein codierenden cDNA verwendet werden könnte, wie rekombinante Versionen des Proteins erhalten werden können, wie Antikörper aus dem Protein entwickelt werden könnten und wie das Protein in Immunoassay und Immunotherapie verwendet werden kann.
Die Erfindung erstreckt sich auf ein beliebiges Peptid oder Polypeptid, welche Begriffe hier austauschbar verwendet werden, außer wo es anderweitig erforderlich ist, welches wesentliche Identität mit dem Vorläufer- oder reifen ALP hat. Polypeptide mit wesentlicher Identität schließen Varianten, wie beispielsweise allelische Varianten, ein.
Eine „Variante", wie der Begriff hier verwendet wird, kann sich auf ein Polynucleotid oder Polypeptid beziehen, das sich von einem Referenzpolynucleotid bzw. -polypeptid unterscheidet, aber wesentliche Eigenschaften behält. Eine typische Variante eines Polynucleotids unterscheidet sich in der Nucleotidsequenz von einem anderen, dem Referenzpolynucleotid. Änderungen in der Nucleotidsequenz der Variante können die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, codiert durch das Referenzpolynucleotid, ändern oder nicht. Nucleotidänderungen können zu Aminosäuresubstitutionen, -additionen, -deletionen, -fusionen und -trunkationen in dem Polypeptid, codiert durch die Referenzsequenz, führen, wie nachstehend diskutiert wird. Eine typische Variante eines Polypeptids unterscheidet sich in der Aminosäuresequenz von einem anderen, dem Referenzpolypeptid. Im allgemeinen sind die Unterschiede begrenzt, so daß die Sequenzen des Referenzpolypeptids und die der Variante sich überall sehr ähnlich und in vielen Regionen identisch sind. Eine Variante und das Referenzpolypeptid können sich in der Aminosäuresequenz um eine oder mehrere Substitutionen, Additionen, Deletionen in irgendeiner Kombination unterscheiden. Ein substituierter oder insertierter Aminosäurerest kann einer, codiert durch den genetischen Code oder nicht, sein. Eine Variante eines Polynucleotids oder Polypeptids kann eine natürlich vorkommende, wie beispielsweise eine allelische, Variante sein, oder sie kann eine Variante sein, von der nicht bekannt ist, daß sie natürlich vorkommt. Nicht natürlich vorkommende Varianten von Polynucleotiden und Polypeptiden können durch Mutagenesetechniken oder durch direkte Synthese hergestellt werden.
In die Varianten schließen wir geänderte Polypeptide und Polynucleotide ein. „Geänderte" Nucleinsäuresequenzen, codierend ALP, schließen diejenigen Sequenzen mit Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von verschiedenen Nucleotiden ein, die zu einem Polynucleotid, das das gleiche wie ALP ist, oder einem Polypeptid mit mindestens einer funktionellen charakteristischen Eigenschaft von ALP führen. Eingeschlossen in diese Definition sind Polymorphismen, die unter Verwendung einer speziellen Oligonucleotidsonde von ALP leicht nachweisbar sein können oder nicht, und unrichtige oder unerwartete Hybridisierung zu allelischen Varianten, mit einem Locus, der anders als der normale chromosomale Locus für die ALP codierende Polynucleotidsequenz ist. Das codierte Protein kann ebenfalls „geändert" sein und kann Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten enthalten, welche eine stumme Änderung erzeugen und zu einem funktionell äquivalenten ALP führen. Vorsätzliche Aminosäuresubstitutionen können auf der Basis von Ähnlichkeit in Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie und/oder in der amphipathischen Natur der Reste ausgeführt werden, solange wie die biologische oder immunologische Aktivität von ALP erhalten wird. Zum Beispiel können negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure einschließen, können positiv geladene Aminosäuren Lysin und Arginin einschließen und können Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophiliewerten Leucin, Isoleucin und Valin; Glycin und Alanin; Asparagin und Glutamin; Serin und Threonin; sowie Phenylalanin und Tyrosin einschließen.
Fragmente von ALP können verschiedenartige Formen annehmen und sind in der Beschreibung ebenfalls offenbart. Ein Fragment ist ein Polypeptid mit einer Aminosäurefrequenz, die vollständig die gleiche ist wie ein Teil, aber nicht alles, von der Aminosäuresequenz von ALP oder einer Variante davon. Fragmente können „freistehend" sein oder innerhalb eines größeren Polypeptids enthalten sein, von welchem sie einen Teil oder eine Region, am meisten bevorzugt als einzelne zusammenhängende Region, bilden. Zu repräsentativen Beispielen von Polypeptidfragmenten gehören zum Beispiel Fragmente von etwa der Aminosäurenummer 1–20, 21–40, 41–60, 61–80, 81–100 und 101 bis zum Ende des ALP-Polypeptids. In diesem Zusammenhang schließt „etwa" die speziell angeführten Bereiche größer oder kleiner um mehrere, 5, 4, 3, 2 oder 1 Aminosäure an einem äußersten Ende oder an beiden äußersten Enden ein.
Zu bevorzugten Fragmenten gehören zum Beispiel Trunkationspolypeptide mit der Aminosäuresequenz des ALP-Polypeptids, ausgenommen die Deletion einer kontinuierlichen Reihe von Resten, die den Aminoterminus einschließt, oder einer kontinuierlichen Reihe von Resten, die den Carboxylterminus einschließt, oder die Deletion von zwei kontinuierlichen Reihen von Resten, wobei eine den Aminoterminus einschließt und eine den Carboxylterminus einschließt. Ebenfalls bevorzugt werden Fragmente, die durch strukturelle oder funktionelle Attribute gekennzeichnet sind, wie beispielsweise Fragmente, die alpha-Helix und eine alpha-Helix erzeugende Regionen, β-Blatt und β-Blatt-erzeugende Regionen, Drehung und Drehung-erzeugende Regionen, Knäuel und Knäuel-erzeugende Regionen, hydrophile Regionen, hydrophobe Regionen, alpha-amphipathische Regionen, beta-amphipathische Regionen, flexible Regionen, Oberfläche-erzeugende Regionen, Substrat-bindende Regionen und Regionen mit hohem antigenen Index umfassen. Andere bevorzugte Fragmente sind biologisch aktive Fragmente. Biologisch aktive Fragmente sind diejenigen, die Rezeptoraktivität vermitteln, einschließlich derjenigen mit einer ähnlichen Aktivität oder einer verbesserten Aktivität oder mit einer verminderten unerwünschten Aktivität. Gleichfalls eingeschlossen sind diejenigen, die antigen oder immunogen in einem Lebewesen, insbesondere in einem Menschen, sind, wenn zum Beispiel gewünscht wird, ALP-Bindung zu blockieren.
Vorzugsweise behalten alle diese Polypeptidfragmente die biologische Aktivität von ALP, einschließlich der antigenen Aktivität. Varianten der definierten Sequenz und der Fragmente bilden ebenfalls einen Teil der vorliegenden Beschreibung. Bevorzugte Varianten sind diejenigen, die von den Referenzen durch konservative Aminosäuresubstitutionen variieren – d.h. diejenigen, die einen Rest mit einem anderen mit ähnlichen charakteristischen Eigenschaften substituieren. Typische derartige Substitutionen gibt es zwischen Ala, Vat, Leu und Ile; zwischen Ser und Thr; zwischen den sauren Resten Asp und Glu; zwischen Asn und Gln; und zwischen den basischen Resten Lys und Arg; oder den aromatischen Resten Phe und Tyr. Besonders bevorzugt werden Varianten, bei denen mehrere, 5–10, 1–5 oder 1–2 Aminosäuren in irgendeiner Kombination substituiert, deletiert oder addiert sind.
Im wesentlichen identische Polypeptide bilden eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung und schließen diejenigen mit Variation in mindestens einem Teil des Moleküls mit der Option, einen anderen Teil unverändert zu behalten, ein. Wenn so zum Beispiel das im wesentlichen identische Polypeptid die Aktivität von ALP nachahmen soll, dann kann es vorzuziehen sein, spezielle Subregionen unverändert zu behalten, während Änderungen in einer oder mehreren von den anderen Subregionen, wenn gewünscht, angenommen werden. Die Änderungen können Deletion solcher Subregionen einschließen, wodurch sich aktive Fragmente ergeben.
Die Polypeptide mit wesentlicher Identität haben vorzugsweise mindestens 80% Identität mit einem entsprechenden Polypeptid, welches Vorläufer- oder reifes ALP ist. Stärker bevorzugt gibt es mindestens 90% Identität, wie beispielsweise mindestens 95% oder mindestens 98% Identität. Sequenzidentität wird geeigneterweise mit einem Computerprogramm bestimmt, obwohl andere Verfahren verfügbar sind. Wir bevorzugen, daß die Identität unter Verwendung des Gap-Programms von Genetic Computer Group (1994) beurteilt wird (siehe Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, (Programmhandbuch für das Wisconsin-Paket, Version 8), Madison, Wisconsin, USA).
"Identität" ist ein Maß der Identität von Nucleotidsequenzen oder Aminosäuresequenzen. Im allgemeinen sind die Sequenzen so ausgerichtet, daß die Übereinstimmung mit der höchsten Ordnung erhalten wird. „Identität" an sich hat eine auf dem Fachgebiet anerkannte Bedeutung und kann unter Verwendung veröffentlichter Techniken berechnet werden. Siehe: z.B.: (COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY (Molekularbiologie auf dem Computer), Lesk, A. M., Hrsg., Oxford University Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS (Biocomputing, Informatik und Genomprojekte), Smith, D. W., Hrsg.: Academic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART 1 (Computeranalyse von Sequenzdaten, Teil 1), Griffin, A. M., und Griffin, H. G., Hrsg., Humana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY (Sequenzanalyse in der Molekularbiologie), von Heinje, G., Academic Press, 1987; und SEQUENCE ANALYSIS PRIMER (Primer für die Sequenzanalyse), Gribskov, M., und Devereux, J., Hrsg., M Stockton Press, New York, 1991).
Obwohl es eine Anzahl von Verfahren gibt, um die Identität zwischen zwei Polynucleotid- oder Polypeptidsequenzen zu messen, ist den Fachleuten der Begriff „Identität" bekannt (Carillo, H., und Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48: 1073). Zu Verfahren, die gewöhnlich angewendet werden, um Identität oder Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen zu bestimmen, gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, diejenigen, die in dem Guide to Huge Computers (Leitfaden zu Riesencomputern), Marlin J. Bishop, Hrsg., Academic Press, San Diego, 1994, und Carillo, H., und Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48: 1073, offenbart sind. Verfahren zur Bestimmung von Identität und Ähnlichkeit sind in Computerprogrammen kodifiziert. Zu bevorzugten Verfahren von Computerprogrammen zur Bestimmung von Identität und Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen, gehört, ohne aber darauf begrenzt zu sein, das GCS-Programmpaket (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research (1984) 12(1): 387); BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al., J. Mol. Biol. (1990) 215: 403).
Als Veranschaulichung ist durch ein Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz mit mindestens, zum Beispiel, 95% „Identität" mit einer Referenznucleotidsequenz von SEQ ID NO: 11 hat, beabsichtigt, daß die Nucleotidsequenz des Polynucleotids identisch mit der Referenzsequenz ist, außer daß die Polynucleotidsequenz bis zu fünf Punktmutationen pro jeweils 100 Nucleotide der Referenznucleotidsequenz von SEQ ID NO: 11 einschließen kann. Mit anderen Worten können, um ein Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz zu erhalten, die zu mindestens 95% identisch mit einer Referenznucleotidsequenz ist, bis zu 5% der Nucleotide in der Referenzsequenz deletiert oder mit einem anderen Nucleotid substituiert sein, oder eine Anzahl von Nucleotiden bis zu 5% der gesamten Nucleotide in der Referenzsequenz kann in die Referenzsequenz insertiert sein. Diese Mutationen der Referenzsequenz können an der 5- oder 3-terminalen Position der Referenznucleotidsequenz oder irgendwo zwischen diesen terminalen Positionen, verstreut angeordnet entweder einzeln unter den Nucleotiden in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz, erfolgen.
In ähnlicher Weise ist durch ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit mindestens, zum Beispiel, 95% „Identität" mit einer Referenzaminosäuresequenz von SEQ ID NO: 12 hat, beabsichtigt, daß die Aminosäuresequenz des Polypeptids identisch mit der Referenzsequenz ist, außer daß die Polypeptidsequenz bis zu fünf Aminosäureänderungen pro jeweils 100 Aminosäuren der Referenzaminosäure von SEQ ID NO: 12 einschließen kann. Mit anderen Worten können, um ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz zu erhalten, die zu mindestens 95% identisch mit einer Referenzaminosäuresequenz ist, bis zu 5% der Aminosäurereste in der Referenzsequenz deletiert oder mit einer anderen Aminosäure substituiert sein, oder eine Anzahl von Aminosäuren bis zu 5% der gesamten Aminosäurereste in der Referenzsequenz können in die Referenzsequenz insertiert sein. Diese Änderungen der Referenzsequenz können an der Amino- oder Carboxy-terminalen Position der Referenzaminosäuresequenz oder irgendwo zwischen diesen terminalen Positionen, verstreut angeordnet entweder einzeln zwischen den Resten in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz, erfolgen.
Die Polypeptide dieser Erfindung können innerhalb einer längeren Sequenz in der Form von zum Beispiel einem Fusionsprotein eingebettet sein. So können die Polypeptide in der Form des „reifen" Proteins sein oder können Teil eines größeren Proteins wie beispielsweise eines Fusionsproteins sein. Es ist oft vorteilhaft, eine zusätzliche Aminosäuresequenz einzuschließen, die sekretorische oder Leader-Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die bei der Reinigung helfen, wie beispielsweise mehrfache Histidinreste, oder eine zusätzliche Sequenz für Stabilität während der rekombinanten Produktion enthält.
Die Polypeptide, die Fragmente sind, behalten vorzugsweise die gewünschte Funktion von ALP. Die Fragmente umfassen geeigneterweise mindestens 10 Aminosäuren, stärker bevorzugt mindestens 20 Aminosäuren und typischerweise mindestens 40 Aminosäuren.
BEISPIEL 1. ISOLATION UND REINIGUNG VON PROTEIN
Frischer Latex von Hevea-brasiliensis-Bäumen (Klon RRIM 600) wird in gekühlte Behälter gesammelt. Der Latex wird mit 19000 U/min (43000 g) auf einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge Sorvall RC 5C für 1 h bei 4–7°C zentrifugiert, um ihn in drei Hauptfraktionen zu trennen: die obere Fraktion, die der Kautschukrahm ist, die schwere Bodenfraktion und das C-Serum, das sich dazwischen befindet. Latex-B-Serum wird, basierend auf dem Verfahren von Hsia (1958) Trans Instn Rubb Ind, hergestellt. Die Latex-Bodenfraktion von zentrifugiertem Latex wird durch Resuspendierung in 0,4 M Mannitol gewaschen und durch Zentrifugation gewonnen. Die gewaschene Bodenfraktion wird dann wiederholtem Gefrieren und Auftauen unterworfen, um die Lutoide zu zerreißen, die ihre Hauptbestandteile sind. Die lutoidische Flüssigkeit, das B-Serum, wird als Überstand nach erneuter Zentrifugation gewonnen.
B-Serum wird über Nacht gegen 0,3 mM Natriumborat und 0,016 M Borsäure pH 7 im Kühlraum dialysiert. Darauf folgt Filtration durch Whatman-Filterpapier Nr. 1. Zehn ml des filtrierten B-Serums werden auf eine Säule mit Carboxymethylzellulose CM32 (Whatman) (20 cm × 1,5 cm), äquilibriert mit 0,09 M Natriumborat und 0,016 M Borsäure, pH 8,6, aufgegeben. Proteine werden mit einem Gradienten von 150 ml von 0,09 M Natriumborat und 0,016 M Borsäure, pH 8,6, gegen 150 ml von 0,9 M Natriumborat und 0,16 M Borsäure, pH 8,6, eluiert. Zwei-ml-Fraktionen werden mit einer Geschwindigkeit von 2,6 min/Fraktion gesammelt. Die nicht retardierten Materialien (d.h. die Fraktionen 3 bis 11) werden in eine Säule DE 52 (Whatman) (12 cm × 1,5 cm), äquilibriert mit 0,1 M Tris-HCl, pH 8, eingegeben. Das Protein wird mit einem Gradienten von 0–0,5 M NaCl in dem gleichen Puffer eluiert. Fraktionen, die Proteine von etwa 43 kDa, wie durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese bestimmt, enthalten, werden mit Serumlatex-allergischen Patienten auf Immunoglobulin-IgE-Bindung getestet. Die ALP enthaltenden Fraktionen werden identifiziert und gepoolt. Das ungefähre Molekulargewicht von ALP, bestimmt durch Vergleichen der Wanderung von ALP mit der von verschiedenen Kalibrierungsmarkern, beträgt 42 kDa (4 Bahn 2).
BEISPIEL 2. BESTIMMUNG VON MOLEKULARGEWICHT UND ISOELEKTRISCHEM PUNKT UND AMINOSÄURESEQUENZIERUNG
Das genaue Molekulargewicht des allergenen Latexproteins, ALP, bestimmt durch Massenspektrometrie, beträgt 42975. Das Spektrum der Matrix-gestützten Laser-Desorptions-Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-MS) der Proteinprobe wird in 3 gezeigt.
Der isoelektrische Punkt (pI) von ALP wird durch isoelektrische Fokussierung (IEF) bestimmt. Die Wanderung des Proteins auf dem IEF-Gel wird gemessen und mit Protein-Kalibrierungsstandards von bekanntem pI verglichen. Es wird geschätzt, daß der pI von ALP 4,7 beträgt.
Es wird gefunden, daß das Protein an dem N-Terminal blockiert ist. In-situ-Digestion durch Trypsin führte zu mehreren Fragmenten. Partielle Aminosäuresequenzen werden für drei von diesen Fragmenten erhalten.
Sequenz 1 (SEQ ID NO. 1): YLDVQYSQFR
Sequenz 2 (SEQ ID NO. 2): YSLFSEPEK
Sequenz 3 (SEQ ID NO. 3): LPTTIIPAHGGFSSR
wobei die Buchstaben des Alphabets akzeptierte Abkürzungen für einzelne Aminosäuren sind.
Sequenz 1 ist von einem Peptid von 1319 Da abgeleitet. Die durch Massenspektrometrie erhaltenen Aminosäuresequenzdaten werden gegen die Proteinsequenz-Datenbank des National Centre for Biotechnology Information (NCBI), USA, verglichen, wobei der BLAST-Algorithmus verwendet wird. Die Suche enthüllte, daß die Aminosäuresequenzen partielle Homologie mit dem „frühen knöllchenspezifischen Protein" von Glycine max hatten.
Sequenz 2 ist von einem Peptid von 1100 Da abgeleitet. Die Sequenz zeigte partielle Homologie mit dem „frühen knöllchenspezifischen Protein" von Medicago truncatula.
Sequenz 3 ist von einem Peptid von 1556 Da abgeleitet. Die Sequenz zeigte partielle Homologie mit dem „frühen knöllchenspezifischen Protein" von Glycine max.
BEISPIEL 3. BESTIMMUNG DER GLYCOSYLIERUNG VON ALP
Um zu demonstrieren, daß ein Kohlenhydrat an das ALP-Protein gebunden ist (was ALP zu einem 'glycosylierten Protein' oder Glycoprotein macht), werden gereinigte Proteine durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) auf 15-%-Gelen getrennt und elektrophoretisch auf eine Nitrozellulose-Membran überführt, um einen Western-Blot zu erhalten. Die Membran wird mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und dann im Dunkeln für 20 min unter Rühren in 10 mM Natriumperiodat/EDTA eingetaucht. Im Anschluß daran wird die Membran drei Mal mit PBS für 10 Minuten in jedem Zyklus gewaschen. Die Membran wird als nächstes in eine Lösung, hergestellt aus Biotin-Hydrazid in Natriumacetat/EDTA, überführt und für 60 Minuten wird Rühren ausgeführt. Nachdem drei Zyklen mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) gewaschen worden sind, wird die Membran blockiert und dann über weitere drei Zyklen mit TBS gewaschen. Die Membran wird dann für 60 min in Streptavidin-alkalische Phosphatase eingetaucht. Nach weiteren drei Zyklen des Waschens mit TBS wird die Membran in eine Lösung von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat/Nitroblau-Tetrazolium-(BCIP/NBT)-Substrat eingetaucht. Das Erscheinen des gefärbten Reaktionsprodukts der alkalischen Phosphatase zeigte das Vorhandensein der Kohlenhydrat-Komponente des Glycoproteins an (5).
BEISPIEL 4. HERSTELLUNG VON ANTIKÖRPERN GEGEN ALP
Sowohl polyklonale Antikörper als auch monoklonale Antikörper werden erfolgreich gegen ALP entwickelt.
Polyklonale Antikörper gegen ALP
Eine reine Zubereitung von ALP (ungefähr 0,5 ml von 0,5 mg ALP/ml) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) wird mit einem gleichen Volumen von komplettem Freunds-Adjuvans gemischt und dieses Antigen-Gemisch wird subkutan in den Rücken von Kaninchen injiziert. Sieben Booster-Dosen der gleichen Antigen-Formulierung, aber mit inkomplettem Freunds-Adjuvans werden in zwei-Wochen-Intervallen verabreicht. Blut wird von den Kaninchen abgenommen, um das Antiserum zu erhalten, das polyklonale Antikörper gegen ALP enthielt.
Um die Bindung polyklonaler Antikörper an ALP zu demonstrieren, wird ein Western-Blot des Proteins auf Nitrozellulosemembran wie in Beispiel 3 hergestellt. Die Nitrozellulosemembran wird mit 5% fettfreier Milch in PBS blockiert und dann für 90 min mit polyklonalen anti-ALP-Antikörpern (verdünnt 1:800 in PBS-Milch) als dem primären Antikörper inkubiert. Nach drei Zyklen des Waschens mit PBS-Milch wird die Nitrozellulosemembran für 1 h mit dem sekundären Antikörper, anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, inkubiert. Nach weiteren drei Zyklen des Waschens mit PBS-Milch wird die Nitrozellulosemembran für 10 min in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) inkubiert, bevor sie in 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat/Nitroblau-Tetrazolium-(BCIP/NBT)-Substrat eingetaucht wird, um das gefärbte Reaktionsprodukt der alkalischen Phosphatase zu erzeugen. Die Bindung von polyklonalen Antikörpern an ALP auf einem Western-Blot des Proteins nach Trennung des Proteins durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese ist in 5 gezeigt (Bahn 4).
Monoklonale Antikörper gegen ALP
Milz-Zellen von einer Balb/c-Maus, immunisiert mit Latex-C-Serum, werden mit Mäuse-Myelom-Zellen fusioniert, indem Protokollen gefolgt wird, die früher von Kohler und Milstein beschrieben wurden (12, 13). Die resultierenden Hybridomzellen werden auf Antikörper gescreent, die spezifisch für C-Serum-Proteine sind. Ausgewählte Hybridome werden zweimal rekloniert und sekretierte monoklonale Antikörper werden entweder in ungereinigter Form in Hybridomzellüberständen oder als Zubereitungen, gereinigt durch Affinitätschromatographie, verwendet.
Um die Bindung monoklonaler Antikörper an ALP zu demonstrieren, wird ein Western-Blot des Proteins auf Nitrozellulosemembran hergestellt und verarbeitet wie für den polyklonalen Antikörper, außer daß monoklonaler Antikörper gegen ALP als primärer Antikörper verwendet wird, während Anti-Maus-IgG, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, als der sekundäre Antikörper verwendet wird. Die Bindung von monoklonalen Antikörpern an ALP auf einem Western-Blot des Proteins nach Trennung des Proteins durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese ist in 4 (Bahn 5) gezeigt.
Rekombinante monoklonale Antikörper gegen ALP
Eine erwartete Variation des herkömmlichen monoklonalen Antikörpers ist der rekombinante Antikörper, wodurch der Antikörper unter Verwendung eines spezifischen Segments der DNA erzeugt werden kann, das die Aminosäuresequenz des Antikörpers oder eines funktionellen Fragments des Antikörpers, wie beispielsweise ein variables Fragment mit einfacher Kette, codiert. Es gibt mehrere Herangehensweisen für die Entwicklung rekombinanter Antikörper, von denen hier ein Beispiel dargestellt wird. Antikörper-Genbanken werden zuerst zum Beispiel durch PCR-Amplifikation aus B-Lymphozyten-cDNA aufgebaut. Um diese Banken zu screenen, werden Antikörper auf der Oberfläche von Mikroorganismen, die das Gen des Antikörpers enthalten, angezeigt (Phagen-Display). Sie werden mit dem Antigen-Protein herausgefordert, um spezifische Klone zu identifizieren, die einen Antikörper erzeugen, der an dieses Protein bindet. Sobald der Organismus, der das Antikörper-Gen trägt, identifiziert ist, können dann spezifische Klone amplifiziert und verwendet werden, um das Antikörperfragment in E. Coli oder einem anderen geeigneten Organismus herzustellen.
BEISPIEL 5. DEMONSTRATION VON PROTEIN-ALLERGENIZITÄT
Ein Western-Blot des gereinigten Proteins wird mit Blutserum von Latex-allergischen Patienten inkubiert, um festzustellen, ob IgE (das Immunoglobulin, das die allergische Reaktion vermittelt) an das Protein gebunden ist. Bindung des IgE an das Protein zeigte an, daß das Protein allergen ist.
Um Protein-IgE-Bindung in Western-Blots nachzuweisen, wird einer ähnlichen Verfahrensweise wie in Beispiel 2 gefolgt, ausgenommen, daß die Nitrozellulosemembran über Nacht mit Serum, gepoolt von mehreren Latex-allergischen Patienten (verdünnt 1:5,25 in PBS-Milch und 0,05% Natriumazid), als dem primären Antikörper inkubiert wird. Antihumanes IgE, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, diente als der sekundäre Antikörper. Die Bindung von humanem IgE an ALP auf einem Western-Blot des Proteins nach Trennung des Proteins durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese wird in 4 (Bahn 3) gezeigt.
BEISPIEL 6. HERSTELLUNG UND KLONIEREN DER ALP CODIERENDEN cDNA
Die komplementäre DNA (cDNA), codierend die Aminosäuresequenz von ALP, kann in einem Wirt wie beispielsweise einem Mikroorganismus kloniert und multipliziert werden. Der Mikroorganismus kann aus der Gruppe, bestehend aus Bakterien, Hefe und Viren, ausgewählt werden. Höhere Pflanzenzellen können ebenfalls als Vektoren verwendet werden. Das ALP-Protein in rekombinanter Form kann dann in dem gleichen Wirt oder in einem alternativen Wirt synthetisiert werden. Das Folgende ist eine Beschreibung des Verfahrens, das verwendet wird, um die cDNA von ALP zu klonieren. Standardverfahren werden bei der Herstellung und Reinigung von DNA, Mini- und Maxipreps, DNA-Reinigung, Restriktionsendonuclease-Digestionen, Agarose-Gel-Elektrophorese, Ligationen, Transformationen und Poly(A)⁺-mRNA-Isolierung durch oligo(dT)-Zellulose-Säulenchromatographie verwendet.
Herstellung von Latex-mRNA
Latex wird durch Anzapfen des Hevea-brasiliensis-Baums gesammelt. Bevor der Baum angezapft wird, wird er mit einem sterilisierten Drainageabflußrohr ausgestattet. Unmittelbar nach dem Zapfen werden der Einschnitt und das Abflußrohr mit etwa 20 ml von 2 × RNA-Extraktionspuffer (0,1 mol Tris-HCl, 0,3 mol LiCl, 0,01 mol EDTA, 10% SDS, pH 9,5) gewaschen. Der Latex wird dann mit 100 ml RNA-Extraktionspuffer bis zu einem insgesamt gesammelten Volumen von 200 ml in einen sterilen Erlenmeyer- Kolben heruntergewaschen. Im Labor wird der Latex gut gemischt und in Polyallomerröhrchen mit 112700 g für 30 Minuten bei 15°C zentrifugiert. Die wässerige Phase wird behutsam in sterile Zentrifugenröhrchen dekantiert, und die anschließende Verarbeitung der wässerigen Phase, um die gesamte RNA zu isolieren, wird entsprechend dem Verfahren von Prescott und Martin (1987) Plant Mol Biol Rep durchgeführt.
Synthese von ALP-cDNA
cDNA-Synthese des ersten Strangs wird durch umgekehrtes Transkribieren von 1 Mikrogramm der Gesamt-Latex-RNA in 20 μl Volumen unter Verwendung des GeneRacer^TM-Kits (Invitrogen, USA) nach den Anweisungen des Verkäufers hergestellt. Die Synthese von cDNA wird durch PCR-Amplifikation bewerkstelligt.
Die cDNA wird durch PCR ohne vorherige Reinigung amplifiziert. Jede Reaktion wird in einem 50-μl-Volumen, enthaltend 2 μl der vorstehenden Reaktion des ersten Strangs, 12,5 μM GeneRacer^TM-3'-Primer (5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3' (SEQ ID NO. 4), wo A, G, C und T die Abkürzungen für die Nucleotidbasen Adenin, Guanin, Cytosin bzw. Thymin sind), 12,5 μM des spezifischen Primers, 0,2 mMol dATP, 0,2 mMol dTTP, 0,2 mMol dCTP, 0,2 mMol dGTP, pH 7,5, 1 Einheit Taq High Fidelity (Roche Diagnostics GmbH), 10 mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, pH 8,3 und überschichtet mit 50 μl Mineralöl, durchgeführt. Die PCR-Reaktion fand in einem Thermocycler statt, wobei den Instruktionen des Herstellers gefolgt wurde. Eine zweite Runde von PCR wird wie zuvor durchgeführt, aber es werden 5 μl der PCR der ersten Runde als Templat verwendet. 20 μl des PCR-Amplifikationsprodukts werden für die Analyse auf einem 1,0-%-Agarose-Gel, gefärbt mit Ethidiumbromid, verwendet.
Klonieren von ALP-cDNA
Das PCR-Produkt (etwa 1,5 kb in der Größe) wird nach den Instruktionen des Verkäufers in den TOP^®-Vektor (Invitrogen, USA) ligiert. Das Ligat (2 μl) wird für die Transformation von One Shot^® TOP10 Chemically Competent Escherichia coli (Invitrogen, USA) gegen Ampicillin-Resistenz verwendet. Nach dem Inkubieren über Nacht bei 37°C in Agar-Medium, enthaltend Ampicillin (100 μg/ml), wurden Transformanten durch Farbauswahl mit Xgal (80 μg/ml)/IPTG (3 mmol/l) ausgesucht. Die ausgesuchten Klone werden durch Miniprep-Assay unter Verwendung des Wizard^® SV Minipreps DNA Purification System (Promega, USA) nach den Instruktionen des Verkäufers gescreent. 1 μg der ausgewählten Klone wird dann zur Nucleinsäuresequenzierung geschickt.
Die DNA-Sequenzen (1394 Basenpaare, 1 und SEQ ID NO. 11) werden in die Aminosäuren translatiert, die sie codiert haben (2 und SEQ ID NO. 12). Die Aminosäuresequenz umfaßte die folgenden Segmente:

1) ctaccaactactattatacctgctcatggtggatttagt (SEQ ID NO. 5: an Position 384 bis 422) codiert das Peptid LPTTIIPAHGGFS (SEQ ID NO. 6)
2) taccttgatgtccaatattcgcaattccgg (SEQ ID NO. 7: an Position 429 bis 458) codiert das Peptid YLDVQYSQFR (SEQ ID NO. 8)
3) tattctttattcagtgagccagaaaaa (SEQ ID NO. 9: an Position 897 bis 923) codiert das Peptid YSLFSEPEK (SEQ ID NO. 10)

BEISPIEL 7. ÜBEREXPRESSION VON REKOMBINANTEN ALP
Es gibt mehrere kommerzielle Kits, die für die Überexpression des allergenen Latexproteins verwendet werden können. In diesem Beispiel wird das pMAL-c2-Protein-Fusions- und -Reinigungssystem (New England Biolabs, USA) verwendet, um rekombinantes Protein aus seiner klonierten cDNA zu überexprimieren. Die Verfahrensweisen, verwendet für die Induktion der Überproduktion von Fusionsprotein, Reinigung durch Affinitätschromatographie, Spaltung von Fusionsprotein durch Faktor-Xa-Protease und Reinigung des Zielproteins durch Hydroxyapatit-Chromatographie, sind entsprechend den Instruktionen des Verkäufers. In diesem Beispiel wird Isopropylthiogalactosid (IPTG) als Inducer für das Expressionssystem verwendet.
Die ALP-cDNA wird in den Vektor pMAL-c2 in dem gleichen translationalen Leserahmen wie das malE-Gen des Vektors subkloniert. Die Bakterienzellen werden über Nacht bei 37°C auf einer LB-Indikatorplatte, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, 10 μmol Isopropylthiogalactosid (IPTG) und 10 μg/ml Xgal, gezüchtet. Weiße Kolonien werden ausgesucht und durch Miniprep-Assay auf das Vorhandensein des MBP-Fusionsplasmids gescreent. Ein positiver Klon wird dann für die Überproduktion des REF-Proteins genommen. IPTG-induzierte E.-coli-Zellen werden durch einen Gefrier (–20°C)/Auftau-Zyklus (Umgebungstemperatur) und Ultraschallbehandlung (Vibra Cell, Sonics & Materials Inc., USA) im Eiswasserbad mit 15-Sekunden-Pulsen für 3 Minuten aufgeschlossen. Die Freisetzung von Fusionsprotein, eluiert aus der Amylose-Säule, wird durch Prüfen auf Protein überwacht. In Anbetracht dessen, daß die Aminosäuresequenz des Peptids durch die cDNA-Sequenz in dem Expressionsvektor bestimmt wird, bemerken die Anmelder, daß kleinere Änderungen in der cDNA-Sequenz die charakteristischen Grundeigenschaften des rekombinanten Proteins nicht wesentlich ändern würden. 6 zeigt das exprimierte rekombinante Protein und seine Bindung an Antikörper, die gegen seinen nativen (natürlichen) Gegenpart, gereinigt aus natürlichem Kautschuklatex, entwickelt worden waren.
BEISPIEL 8. VERWENDUNG VON ALP IN IMMUNOASSAYS
Natives oder rekombinantes ALP oder seine molekulare Variante (ein Protein ähnlich ALP, aber sich leicht unterscheidend, zum Beispiel in einigen Aminosäuren) kann für sich allein oder in Kombination mit einem Antikörper, entwickelt gegen ALP oder seine molekulare Variante, in Immunoassays verwendet werden. Molekulare Varianten von ALP können natürlicherweise in Latex vorkommen oder können als Ergebnis von Laboratoriumsmanipulation existieren. Derartige Varianten von ALP mögen sich nur leicht voneinander unterscheiden (z.B. durch einige Aminosäuren) und sie haben im wesentlichen ähnliche Grundfunktionen oder charakteristische Eigenschaften einschließlich Allergenizität. Derartige Immunoassays können in vielen verschiedenen Formaten aufgebaut werden, aber sie stützen sich im Grunde auf die immunologische Reaktion zwischen einem Antikörper und seinem Antigen. Der Antikörper kann in diesem Fall ein Antikörper gegen ALP oder seine molekulare Variante oder humanes IgE sein. Sein Antigen kann natives oder rekombinantes ALP oder seine molekulare Variante oder ein Peptid sein, das die Epitop-Stelle von ALP oder seiner molekularen Variante verkörpert.
Der Immunoassay kann für die Diagnose oder für die Diagnose von Allergie gegen ALP oder Allergie gegen Latex im allgemeinen verwendet werden. In einem andersartigen Format kann der Immunoassay für den Nachweis von ALP in Latex oder Latexprodukten verwendet werden.
BEISPIEL 9. VERWENDUNG VON ALP IN DER IMMUNOTHERAPIE
Immunotherapie ist eine vorbeugende Behandlung für allergische Reaktionen, die ausgeführt wird, indem allmählich zunehmende Dosen des Allergens, gegen welches die Person allergisch ist, gegeben werden. Die inkrementellen Zunahmen des Allergens bewirken, daß das Immunsystem weniger empfindlich gegenüber der Substanz wird, wenn der Substanz in der Zukunft begegnet wird. Es gibt verschiedene Behandlungsprotokolle für Immunotherapie. Als Beispiel kann Immunotherapie mit ALP durch Injizieren einer gereinigten Probe von ALP in die Haut des Arms ausgeführt werden. Eine Injektion kann einmal in der Woche für etwa 30 Wochen gegeben werden, wonach Injektionen alle zwei Wochen verabreicht werden können. Schließlich können Injektionen alle vier Wochen gegeben werden. Die Dauer der Therapie kann drei oder vier Jahre, manchmal langer sein. An Stelle von nativem ALP kann Immunotherapie auch mit einem geeigneten rekombinanten ALP oder der molekularen Variante von ALP (ein Protein ähnlich ALP, aber sich leicht unterscheidend, zum Beispiel in einigen Aminosäuren) oder einem Peptid, darstellend einen Teil von ALP oder seiner molekularen Variante, ausgeführt werden.
Aus der vorstehenden Beschreibung kann der Fachmann leicht die wesentlichen charakteristischen Eigenschaften der vorliegenden Erfindung feststellen und kann, ohne von deren Geist und Umfang abzuweichen, verschiedene Änderungen und Modifizierungen der Erfindung machen, um sie an verschiedenartige Benutzung und Bedingungen anzupassen.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Allergenes Latexprotein (ALP), dadurch gekennzeichnet, daß das Protein mindestens 80% Sequenzidentität mit SEQ ID NO. 12 hat.
Allergenes Latexprotein (ALP) nach Anspruch 1 mit mindestens 90% Identität mit SEQ ID NO. 12.
Allergenes Latexprotein (ALP) nach Anspruch 2 mit mindestens 95% Identität mit SEQ ID NO. 12.
Allergenes Latexprotein (ALP) nach Anspruch 3 mit mindestens 98% Identität mit SEQ ID NO. 12.
Allergenes Latexprotein (ALP) nach Anspruch 4, bestehend aus der Sequenz von SEQ ID NO. 12.
Allergenes Latexprotein (ALP) nach einem vorhergehenden Anspruch, fähig, eine allergische Reaktion bei Personen, sensibilisiert gegen das Protein, zu induzieren.
Allergenes Latexprotein (ALP) nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die DNA-Sequenz, codierend das Protein, SEQ ID NO. 11 ist.
Allergenes Latexprotein (ALP) nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Protein die folgenden Eigenschaften hat: a. ein Molekulargewicht von etwa 42000 Dalton; b. einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,7; und c. mit IgE von Patienten, sensibilisiert gegen das Protein, bindet.
Protein nach einem vorhergehenden Anspruch, welches weiterhin eine zusätzliche Aminosäuresequenz umfaßt, welche sekretorische oder Leadersequenzen, Prosequenzen, Sequenzen, welche die Reinigung unterstützen, oder eine zusätzliche Sequenz für Stabilität während rekombinanter Produktion enthält.
Protein nach einem vorhergehenden Anspruch, welches ein Fusionsprotein ist.
Verfahren zum Erhalt eines Proteins nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: a) Zentrifugieren des Latex zum Erhalt der Bodenfraktion; b) Gefrier-Auftauen der Bodenfraktion zum Erhalt des Latex-B-Serums; und c) Isolieren und Reinigen des Proteins aus dem B-Serum, erhalten in Schritt (b).
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Isolierung und Reinigung des Proteins über eine Reihe von chromatographischen Trennungen ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die chromatographische Trennung Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltration ist.
DNA-Sequenz, codierend das Protein nach einem der Ansprüche 1–10, wobei die DNA-Sequenz die von SEQ ID NO. 11 oder eine Variante mit mindestens 95% Sequenzidentität damit ist.
Verfahren für die Herstellung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1–10 in rekombinanter Form, umfassend die Schritte: a. Insertieren der DNA, codierend das Protein, in einen geeigneten viralen Vektor oder in eine Wirtszelle; und b. Induzieren des viralen Vektors oder der Wirtszelle, um ein rekombinantes Protein zu exprimieren.
Verfahren für die Herstellung eines Proteins in rekombinanter Form nach Anspruch 15, wobei die DNA, codierend das Protein, SEQ ID NO. 11 ist.
Verfahren für die Herstellung eines Proteins in rekombinanter Form nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Wirtszelle ein Mikroorganismus, eine Pflanze oder ein Tier ist.
Verfahren für die Herstellung eines Proteins in rekombinanter Form nach Anspruch 17, wobei der Mikroorganismus ein Bakterium oder eine Hefe ist.
Verfahren für die Herstellung eines Proteins in rekombinanter Form nach Anspruch 18, wobei der Mikroorganismus Escherichia coli ist.
Verfahren für die Herstellung eines Proteins in rekombinanter Form nach Anspruch 15, wobei der Induktor vorzugsweise Isopropylthiogalactosid (IPTG) oder ein anderer geeigneter Induktor ist.
Natives Protein nach einem der Ansprüche 1–10 zur Verwendung in Immunoassay und Immunotherapie.