DE69738653T2

DE69738653T2 - Klonierung und charakterisierung von napsin, einer aspartat-protease

Info

Publication number: DE69738653T2
Application number: DE69738653T
Authority: DE
Inventors: Gerald Oklahoma City KOELSCH; Xinli Edmond LIN; Jordan J. Edmond TANG
Original assignee: Oklahoma Medical Research Foundation
Current assignee: Oklahoma Medical Research Foundation
Priority date: 1996-11-20
Filing date: 1997-11-20
Publication date: 2009-06-04
Anticipated expiration: 2017-11-21
Also published as: JP2008118996A; AU5459298A; US6225103B1; ES2308791T3; AU734220B2; DK0948630T3; EP0948630B1; WO1998022597A2; JP2001503643A; CA2271294A1; DE69738653D1; WO1998022597A3; EP0948630A2; ATE393227T1; PT948630E

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine bisher unbekannte, in humaner Leber vorhandene Aspartatprotease, die durch Klonierung eines Gens aus einer cDNA-Bibliothek von humaner Leber isoliert wurde.
Mitglieder der Aspartatproteasefamilie sind durch das Vorhandensein von katalytischen Asparaginsäureresten in deren aktivem Zentrum gekennzeichnet. Es ist bekannt, dass fünf Aspartatproteasen im humanen Körper vorhanden sind. Pepsin und Gastrizin werden in den Magen zur Nahrungsverdauung sezerniert. Gastrizin ist auch in Samenflüssigkeitsplasma vorhanden. Cathepsin D und Cathepsin E sind intrazellulär zur Durchführung von Proteinkatabolismus vorhanden. Renin, das in Plasma vorhanden ist, ist das Schlüsselenzym, das das Angiotensinsystem und letztendlich den Blutdruck regelt.
Eukaryotische, einschließlich humaner Aspartatproteasen sind in Bezug auf Protein- und Gensequenzen homolog, weisen jedoch verschiedene Aminosäure- und Nucleotidsequenzen auf. Die cDNA und die Gene von allen fünf humanen Aspartatproteasen wurden kloniert und sequenziert. Sie werden als einzelkettiges Zymogen von etwa 380 Resten synthetisiert, die entweder sezerniert werden oder auf intrazelluläre Vakuolen gerichtet sind. Bei Aktivierung durch einen autokatalysierten Prozess (mit Ausnahme von Prorenin) wird ein N-terminales Pro-Segment von etwa 45 Resten unter Bil dung reifer Enzyme abgespalten (Tang und Wong, J. Cell. Biochem. 33, 53–63 (1987)). In einigen Fällen werden, beispielsweise bei Cathepsin D und Renin, reife Proteasen des weiteren in zwei Ketten geschnitten. Die dreidimensionalen Strukturen der Aspartatproteasen sind sehr ähnlich. Jedes Enzym enthält zwei intern homologe Lappen (Tang et al., Nature 271, 618–621 (1978)). Der Spalt des aktiven Zentrums, der acht Substratreste aufnehmen kann, und zwei katalytische Asparaginsäuren befinden sich zwischen den Lappen.
Diese Proteasen weisen deutliche und wichtige physiologische Rollen auf. Zusätzlich zu ihrer Bedeutung in physiologischen Funktionen sind diese Enzyme auch mit pathologischen Zuständen verbunden. Beispielsweise sind humanes Pepsin und Gastrizin diagnostische Indikatoren für Magen-ulkus und -krebs (Samloff, Gastroenterology 96, 586–595 (1989); Miki et al., Jpn. J. Cancer Res. 84, 1086–1090 (1993)). Cathepsin D ist im Lysosom lokalisiert. Dessen Hauptfunktion ist der Katabolismus von Gewebeproteinen. Jüngere Beweismittel von Mäusen ohne ein funktionales Cathepsin-D-Gen zeigen jedoch, dass dieses Enzym eine Rolle bei der Darmentwicklung in neugeborenen Tieren spielt. Cathepsin D steht auch in Verbindung mit humanen Brustkrebsmetastasen (Rochefort, Acta Oncologica 31, 125–130 (1992)). Cathepsin E ist im endoplasmatischen Retikulum von einigen Zellen, wie Erythrocyten und Magenschleimhautzellen, lokalisiert. Es wird bei der Prozessierung von Antigenen in den Immunzellen verwendet.
Humane Aspartatproteasen weisen wichtige medizinische Verwendungsmöglichkeiten auf. Die Konzentrationen der Proenzyme von humanem Pepsinogen und Progastricin, die im Blutstrom vorhanden sind, und das Verhältnis zwischen den zwei Konzentrationen wird beim diagnostischen Screening von humanem Magenkrebs (Defize et al., Cancer 59, 952–958 (1987); Miki et al., Jpn. J. Cancer Res. 84, 1086–1090 (1993)) und Ulkus (Miki et al., Adv. Exp. Med. Biol. 362, 139–143 (1995)) verwendet. Die Sekretion von Procathepsin D ist in Brustkrebsgewebe erhöht. Daher wird die Konzentration von Procathepsin D bei Brustkrebs zur klinischen Prognose verwendet (Rochefort, Acta Oncologica 31, 125–130 (1992)). Die Analyse von Renin bei der Diagnose von Hypertonie ist ein klinisches Routineverfahren (Brown et al., Handbook of Hypertension 1, 278–323, Robertson, Hrsg. (Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1983)).
Diese Beispiele zeigen, dass humane Aspartatproteasen mit humanen Erkrankungen in Verbindung stehen und es wahrscheinlich ist, dass weitere, bisher nicht identifizierte Aspartatproteasen klinische Anwendungsmöglichkeiten aufweisen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Antikörpers, der spezifisch immunreaktiv mit einer Aspartatprotease ist, wie in Anspruch 1 angegeben ist.
Wir charakterisieren und klonieren die Aspartatprotease.
Wir identifizieren die Gewebe, in denen die Aspartatprotease exprimiert wird, und Anwendungsmöglichkeiten in der klinischen Chemie und Diagnostik.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine bisher unbekannte Aspartatprotease, die zur Spaltung von Proteinen durch Hydrolyse fähig ist, die hierin als "Napsin" bezeichnet wird, wurde aus einer humanen Leberbibliothek kloniert. Zwei cDNA-Klone wurden kloniert, se quenziert und exprimiert. Diese codieren für Isozyme der Protease, die als "Napsin A" und "Napsin B" bezeichnet werden. Ein Klon ist ungewöhnlich insofern, als er kein Stoppcodon umfasst, jedoch zur Expression eines Proteins verwendet werden kann. Das Gen wurde ebenfalls erhalten und partiell sequenziert. Ein Verfahren zur raschen Reinigung des Enzyms unter Verwendung von immobilisiertem Pepstatin wurde ebenfalls entwickelt und das Enzym wurde aus humanem Nierengewebe isoliert. Polyklonale Antikörper für die Enzyme wurden hergestellt, die ebenfalls zur Isolierung und Detektion des Enzyms verwendbar sind.
Ähnlichkeiten zu anderen Aspartatproteasen, insbesondere Cathepsin D, zeigen die Verwendbarkeit des Enzyms in diagnostischen Ansätzen sowie eine Protease. Die Menge und/oder Art eines in einem speziellen Gewebe exprimierten Napsins kann unter Verwendung von markierten Antikörpern oder Nucleotidsonden gegenüber dem Napsin bestimmt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A–1D sind die cDNA- und vermutliche Aminosäuresequenz von humanem Napsin A. Charakteristische Elemente des aktiven Zentrums (DTG) und Tyr75 sind unterstrichen. Das RGD-Integrin-Bindungsmotiv ist ebenfalls unterstrichen. Lysine am Carboxyterminus entsprechen der Poly-A-Region.
Die 2A–2C sind ein Vergleich der humanen Napsin-A-Aminosäuresequenz mit den Aminosäuresequenzen des aspartatproteaseähnlichen Proteins von Mäusen (Mori et al., 1997) und humanem Cathepsin D ("cath D").
2D ist eine schematische oder Dendrogrammdarstellung der Sequenzverwandtschaft zwischen Napsin und anderen hu manen Aspartatproteasen.
Die 3A–3E sind die genomische DNA von humanem Napsin A. Introns sind in Kleinbuchstaben, Exons in Großbuchstaben angegeben. Eine vermutliche Aminosäuresequenz gibt die Position von Intro-Exon-Verbindungen an. 3F ist eine schematische Darstellung des humanen Napsin A. Die Exons sind als senkrechte Balken mit Nummerierung darüber angegeben. Die Doppelspitzenpfeile stellen die Bereiche, in denen die Sequenz bestimmt wurde, dar. Die Buchstaben sind Positionen von Restriktionsstellen, wobei X für Xhol, B für BamHI und E für EcoRI steht.
Die 4A–4E sind die cDNA- und vermutliche Aminosäuresequenz von humanem Napsin B. Charakteristische Elemente des aktiven Zentrums (DTG) und Tyr75 sind unterstrichen. Das RGD-Integrin-Bindungsmotiv ist ebenfalls unterstrichen. Lysine am Carboxyterminus entsprechen der Poly-A-Region.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Klonierung und Expression von Napsinisoformen
A. Humanes Napsin A
1. Klonierung von cDNA mit Codierung für Napsin A
Klone, die durch eine Homologierecherche der Datenbank humaner cDNA-Sequenzen des Institute for Genome Research identifiziert wurden (Adams et al., Science 252, 1651–1656 (1991), für die berichtet wurde, dass sie Bereiche von Cathepsin D codieren, wurden von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, erhalten. Diese werden als ATCC Klonnummer 559204, 540096, 345769, 351669 und 314203; Genbank-Nummern W19120, N45144, R18106, R11458 bzw. T54068 bezeichnet. Die Analyse der Sequenzen zeigte, dass diese Cathepsin D nicht codierten und keine cDNAs voller Länge waren. Um zusätzliche Klone zu erhalten, wurden Primer gestaltet und mit PCR verwendet, wobei eine cDNA-Bibliothek von humaner Leber als Templat verwendet wurde. Die Klone, die erhalten wurden, umfassen in den ATCC-Klonen nicht vorhandene Regionen.
Da diese Klone zusammen nur etwa 600 bp der cDNA ergaben, wurde ein längerer cDNA-Klon unter Verwendung von 5'-RACE-PCR (Polymerasekettenreaktion) gesucht, wobei DNA von zwei getrennten cDNA-Bibliotheken von humaner Leber, die in λgt10 kloniert war, als Templat verwendet wurde und die Primer auf der dem 5'-Ende nahen Sequenz (AGGGCACACTGAAGAAGTGGCATCTCC) und der ausgehend vom Insert in Vorwärtsrichtung stromaufwärtigen Sequenz des λgt10-Vektors (CTTTTGAGCAAGTTCAGCCTGGTTAAG) basierten. Zwei Klone, pHL-1 (154 bp) und pHL-2 (288 bp) wurden erhalten, von denen einer (pHL-2) die Sequenz des 5'-Endes in die Leaderpeptidregion verlängerte (1A–1D).
Der cDNA-Sequenz von humanem Napsin A fehlt ein Stoppcodon von allen erhaltenen Klonen, wobei dennoch alle anderen Merkmale eine funktionale Aspartatprotease anzeigen, wobei diese intakte Elemente des aktiven Zentrums, ein konserviertes Tyr75 (Pepsinnummerierung) und ein Pro-Peptid von etwa 40 Aminosäuren umfassen. Abweichend von Pepsin, der charakteristischen Aspartatprotease, enthält Napsin A eine C-terminale Verlängerung, eine sehr große Menge an Prolinresten und ein RGD-Motiv (Integrin-Bindungsmotiv) nahe der Oberfläche der 3-D-Struktur von Napsin nach der Beurteilung durch homologe Kristallstrukturen von Säuger-Aspartatproteasen (d. h. Pepsin und Cathepsin D).
Mehrere verwandte cDNA-Klone von Napsin wurden durch Screening einer cDNA-Bibliothek von humaner Leber erhalten und die Nucleotidsequenzen wurden bestimmt. Diese Klone stellen verschiedene Teile von Napsin-Messenger-RNA dar. Unter Zusammenspleißen ist die Nucleotidsequenz mit Codierung für Napsin A mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz in den 1A–1D gezeigt.
2. Expression von rekombinantem Napsin A
Die cDNA von Napsin A, die das Leaderpeptid und die 3'-nichttranslatierte Region und eine Polyadeninstrecke umfasst, wurde mit den Primern PLHNAP-FWD (5'-AAGCTTATGTCTCCACCACCGCTGCTGCTACCCTTGCTGC) und PLHNAP-REV (5'-AAGCTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTCAATGGAAATATTGG) PCR-amplifiziert und in die HindIII-Stelle des Vektors pLNCX zur Expression ausgehend von dem CMV-Promotor (Dusty Miller) kloniert. Isoliertes Plasmid wurde in humane Nieren-293-Zellen (ATCC) transformiert. Die Zellen wurden gewonnen (8–120 mg) und mit 50 mM NaOAc, 20 mM Zwittergent, pH 3,5 (NAZ-Puffer) unter Verwirbeln lysiert. Das Lysat wurde 1 h auf Eis inkubiert. Der Überstand nach einer Zentrifugation mit 14000 × g wurde direkt zur Detektion von exprimiertem Napsin A durch Zugabe eines 40-μl-Aliquots von Pepstatin-A-Agarose (Sigma) verwendet. Die Probe wurde in einem konischen Röhrchen von 50 ml bei 4°C 1 Woche rotiert. Die Matrix wurde absetzen gelassen und zweimal mit 20 ml NAZ-Puffer und dreimal mit 20 mM Tris-HCl, 0,5 M KCl, pH 8,2 (TK-Puffer) gewaschen. Letzte Waschvorgänge wurden mit 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl und 20 mM Zwittergent, pH 9,5 durchgeführt. Die abgesetzte Pepstatin-A-Agarose (etwa 40 μl) wurde mit 40 μl SDS-β-Mercaptoethanol-Probenpuffer (NOVEX) gemischt und 10 min auf 70°C erhitzt. Aliquots wurden auf 10% Tricine SDS-PAGE (NOVEX) appliziert und auf PVDF-Membranen unter Verwendung eines Tris-Tricin-Puffersystems durch Blotting übertragen. Die Membranen wurden zur immunchemischen De tektion entweder mit Amidoschwarz angefärbt oder mit einer 5%-igen entrahmten Milchlösung blockiert. Mit Amidoschwarz angefärbte Membranabschnitte wurden ausgeschnitten und in sterilem H₂O zur aminoterminalen Sequenzanalyse in einem automatischen Proteinsequenzierer gewaschen.
3. Klonierung von genomischer DNA
Genomklone von humanem Napsin wurden durch Screening einer humanen Genom-DNA-Bibliothek, die in künstliche Bakterienchromosome kloniert war (pBELO-BAC11) (Kim et al., Nucl. Acids Res. 20, 1083–1085 (1992)), erhalten. Die Quelle für genomische DNA für die Bibliothek stammte von 978SK und humanen Spermazelllinien und sie enthielt über 140 000 Klone. Synthetische Oligonucleotidsonden wurden mit ³²P markiert:
zum primären Screening von Nap-3' (GAGGGCGAGCGCGCGCCAGTCCCACTCGTGCGCCGCTCTTCATG TCCCCG)
und zum sekundären Screening von Nap-5' (CCATCCCCTCAGTAGGTTCAGGGTCCTGCGTCCAGGGTGGACTT GACGAA).
Das Screening wurde bei Research Genetics, Huntsville, Alabama, durchgeführt. Zwei unabhängige Klone wurden isoliert, beide einer Länge von etwa 30 kbp, und mit einem Restriktionsenzym geschnitten und durch Pulsfeld-Agarosegelelektrophorese analysiert. Interessierende Fragmente wurden durch Southern Blotting identifiziert, in pBlue subkloniert und sequenziert. Die genomische DNA von humanem Napsin A ist in den 3A–3E gezeigt.
Das humane Napsin-A-Gen ist in 9 Exons codiert (3F). Die Exon/Intron-Verbindungsstellen sind durch sowohl die cDNA-Sequenz als auch die Verbindungsstellenmotive klar definiert. Die humanes Napsin A codierende Region enthält ein offenes Leseraster ausgehend von dem Initiationscodon ATG (Nucleotid 1 in den 1A–1D), über etwa 1,2 kb bis zu einer Poly-A-Strecke in den cDNA-Sequenzen. Wie in der cDNA-Sequenz von Napsin A enthält die genomische Exonsequenz von Napsin A kein In-frame-Stoppcodon in der Beamten Codierungsregion vor der Poly-A-Strecke. Das Fehlen eines Stoppcodons in Napsin A ist bestätigt. Das Fehlen eines Stoppcodons wurde für das Gen anderer Säugerproteine nicht beobachtet. Die cDNA (daher die mRNA) von Napsin A ist in verschiedenen humanen Geweben vorhanden. Es war von Interesse zu sehen, ob das Napsin-A-Gen zur Expression eines Proteinprodukts fähig ist. Diese Ergebnisse sind im folgenden beschrieben.
B. Humanes Napsin B
1. cDNA und Genstruktur
Die humanes Napsin B exprimierenden Klone 559204 und 163167 wurden von ATCC erhalten und wie oben beschrieben partiell sequenziert. Die 4A–4E zeigen die erhaltene DNA-Sequenz voller Länge mit Codierung für Napsin B und die vorhergesagte Aminosäuresequenz. Die Nucleotide 1-1191 wurden von Genomklonen (oben für Napsin A beschrieben) und von 1192-1910 von ATCC-cDNA-Klonen erhalten. Die Napsin-B-Gensequenz ist zu 92% identisch mit der von Napsin A und die vermutliche Proteinsequenz von jeder zeigt 91% Identität. Ähnlich Napsin A besitzt die abgeleitete Napsin-B-Proteinsequenz typische Aspartatproteasemotive und die gleiche C-terminale Verlängerung, ein RGD-Motiv, und prolinreiche Regionen wie in der cDNA von Napsin A (4A–4E). Im Gegensatz zu dem Napsin-A-Gen weist das Napsin-B-Gen ein In-frame-Stoppcodon auf.
II. Isolierung und Charakterisierung von Napsinprotein
Der Vergleich der Napsin-A-Sequenz mit drei anderen humanen Aspartatproteaseproenzymen ist in den 2A–2C gezeigt. Es ist klar, dass Napsin mit humanem Cathepsin D verwandt ist und ähnlich dem aspartatproteaseähnlichen Protein von Mäusen ist, doch sind die Unterschiede ohne weiteres offensichtlich. Die Verwandtschaft zu anderen humanen Aspartatproteasen wird ferner in 2D analysiert, die ein Diagramm des Verwandtschaftsgrades ist und auch den Prozentsatz identischer Reste zeigt. Aufgrund beider Kriterien unterscheidet sich Napsin klar so weit von anderen Aspartatproteasen, wie sich diese voneinander unterscheiden.
Zusätzlich zur Sequenzähnlichkeit zu den anderen humanen Aspartatproteasen wird die Folgerung, dass Napsin eine Aspartatprotease ist, aufgrund der folgenden Beobachtungen gezogen. (a) Die kritischen Aspartatreste des aktiven Zentrums an den Positionen 32 und 215 sind in den konservierten DTG-Sequenzen vorhanden. (b) Das Vorhandensein von Tyr-75 (Y) und einigen konservierten Resten um dieses zeigen eine funktionale "Klappe" an, die für Aspartatproeasen charakteristisch ist. (c) Die den Resten 1p bis 44p entsprechende Pro-Region ist in Napsin vorhanden, was anzeigt, dass sie ein Proenzym der Aspartatprotease ist und zur Aktivierung fähig ist.
Eine RGD-Sequenz findet sich an Position 315 bis 317 (gemäß Konvention Schweinepepsinrestnummern). Es wurde gezeigt, dass dieses Motiv von Bedeutung bei der Integrinbindung ist, die mit der Regulation zellulärer Funktionen, wie Zellzyklus, Hämostase, Entzündung und Zellprolifation in Verbindung steht. Diese Sequenz kann für Napsin eine spezielle funktionale Bedeutung haben.
2. Immunchemische Detektion von Napsin A
Ein napsinspezifisches polyklonales Antiserum wurde unter Verwendung des im folgenden angegebenen Verfahrens produziert. Ein Epitop aus 18 Aminosäuren von Napsin A, das als multiples antigenes Peptid (MAP) auf einem Polylysingerüst durch die Molecular Biology Resource Facility (OUHSC) synthetisiert wurde, wurde verwendet. Dieses Epitop (MKSGARVGLARARPRG) war sowohl Napsin A als auch B gemeinsam und ausreichend verschieden von Cathepsin D, deren nächstem Homologen. Diese Region ist wahrscheinlich auf der Oberfläche von Napsin A lokalisiert, wie aufgrund der Cathepsin-D-Kristallstrukturkoordinaten bestimmt wurde (Erickson, 1993). Aliquots von 1 mg in 1 ml H₂O wurden zur Immunisierung von Ziegen verwendet (Hybridoma Lab, Oklahoma Medical Research Foundation). Gewonnenes Serum wurde mehrere Male einer Ammoniumsulfatfällung unterzogen (Antibodies Lab Manual) und unter Verwendung von an Affi-Gel 10 (BioRad) gekoppelten Napsin A MAP affinitätsgereinigt. Dieses Antiserum wurde mit einer Verdünnung von 1:5000 bei der Detektion von Napsin A auf PVDF-Membranen, die durch Transblotting ausgehend von SDS-PAGE-Gelen (NOVEX) erhalten wurden, verwendet. Das ECL-System (Pierce) wurde zur Detektion von primärem Antikörper verwendet.
Immunoblots einer Probe von rekombinantem Napsin A von humanen Nieren-293-Zellen, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, detektierten Napsin A. Diese Ergebnisse zeigen die Expression eines in einer immunspezifischen Bande produzierten Napsin-A-Gens, das bei SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese mit einer zu der von Napsin B ähnlichen Mobilität wanderte. Daher wird trotz des Fehlens eines Stoppcodons in Napsin A dessen Protein in einer humanen Zelllinie korrekt exprimiert. Die Tatsache, dass dieses Napsin-A-Protein aus der Pepstatin-Affinitätssäule gewonnen wurde, legt nahe, dass ein aktives Zentrum ähnlich allen Aspartatproteasen vorhanden ist.
3. Detektion von Napsin B in humanem Gewebe und Zelllinien
Schnitte von etwa 8 g von humaner Nierenrinde (Cooperative Human Tissue Network, National Cancer Institute, NIH) wurden in einem Waring-Blender in einem Puffer, der aus 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 20 mM Zwittergent und jeweils 1 μM von TPCK, TLCK und EDTA, pH 7,5 (Puffer TZ) bestand, homogenisiert. Das Homogenat wurde unter leichtem Rühren zu 40%-iger Ammoniumsulfatlösung gemacht und mit 10000 × g zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde zu einer 70%-igen Ammoniumsulfatlösung gemacht und mit 10000 × g zentrifugiert. Das in 70%-igem Ammoniumsulfat unlösliche Material (der 40–70%-Schnitt) wurde in 15 ml TZ-Puffer gelöst und mit 30 ml NAZ-Puffer auf pH 4,0 gebracht. Nach einer 1-stündigen Inkubation auf Eis wurde die Probe mit 14000 × g zentrifugiert. Zu dem erhaltenen Überstand wurde ein 0,1-ml-Aliquot von Pepstatin-A-Agarose (Sigma) gegeben. Die Detektion von Napsin B in Zelllinien folgte dem oben angegebenen Verfahren zur Detektion von rekombinantem Napsin A.
Napsin B wurde in Gewebeproben von humaner Nierenrinde und in der humanen Nierenzelllinie Hut-78 humane Niere (0–40%-Ammoniumsulfat-Schnitt); humane Niere (40–70%-Schnitt); Hut-78-Zellen, in offensichtlich vier Formen detektiert. In dem 0–40%-Ammoniumsulfat-Schnitt wurde eine einzelkettige Protease von 50–54 kDa mit einer heterogenen Aminoterminussequenz, die von der Proteinsequenz SPGDKPIFVPLSNYR (mit anderen Termin an Asp4 und Lys5) abgeleitet war, detektiert. Diese N-terminalen Sequenzen stimmten mit der vorhergesagten Aktivierungsspaltungsstelle in Pronapsin B durch Vergleich mit den Aktivierungsspaltungsstellen in homologem Procathepsin D und anderen Aspartatprotease-Zymogenen gut überein. In dem 40–70%-Ammoniumsulfat-Schnitt wurden drei Formen detektiert. Eine einzelkettige Form von 46–50 kDa und zwei Doppelkettenformen. Die 46–50-kDa-Bande produzierte die gleiche heterogene Sequenz der Napsin-B-Sequenz, wie sie für die Bande mit größerem Molekulargewicht in dem 40%-Ammoniumsulfat-Schnitt erhalten wurde. Die zwei Fragmente mit niedrigerem Molekulargewicht von etwa 8 und 4 kDa produzierten die gleiche aminoterminale Sequenz (VRLCLSGFQALDVPPPAGPF), die der C-terminalen Region von Napsin B entspricht. Eine prominente 40-kDa-Bande des durch Blotting übertragenen Präparats wurde sequenziert und produzierte die gleiche heterogene aminoterminale Sequenz wie die 46–50-kDa-Bande, was zwei Arten von doppelkettigem Napsin B: eine 8-kDa- und 40-kDa- sowie eine 4-kDa- und eine 40-kDa-Spezies, anzeigt.
III. Anwendungsmöglichkeiten von Napsin
Eine Vielzahl klinischer und diagnostischer Verwendungsmöglichkeiten für das Enzym kann auf der Basis der Analogie zu den Verwendungsmöglichkeiten der verwandten Aspartatproteasen gestaltet werden. Die Proteine, Nucleotidmoleküle und Verfahren zur Isolierung und Verwendung derselben weisen eine breite Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten, insbesondere in diagnostischen Anwendungen auf. Da sehr bekannt ist, dass Aspartatproteasen mit bestimmten Störungen, wie Brustkrebs und hoher Blutdruck, korreliert sind und Napsin in der Niere exprimiert wird, kann eine Messung der Konzentrationen und/oder Arten von Napsin, die in Gewebe, insbesondere den Nieren, exprimiert werden, mit dem Vorhandensein und der Schwere von Störungen korreliert werden. Die rekombinante DNA und davon abgeleitete Reagenzien können zum Testen der Napsinexpression in gesunden und von einer Krankheit betroffenen Personen verwendet werden. Napsinsequenzen können zum Verfolgen des Vorhandenseins von Napsingenen in Patienten auf mögliche Verknüpfungen mit Erkrankungen verwendet werden.
A. Diagnostische Anwendungsmöglichkeiten
Die Napsinmenge kann unter Verwendung von Standardscreeningtechniken, die von der Isolierung von Napsin aus dem Gewebe, der Verwendung von beispielsweise immobilisiertem Antinapsin (oder Antinapsin A oder Antinapsin B) oder Pepstatin reichen, zur Detektion und Quantifizierung mit markierten Antikörpern zur Bestimmung der in dem Gewebe transkribierten mRNA-Menge unter Verwendung von markierten Nucleotidsonden bestimmt werden.
Antikörperproduktion
Polyklonale Antikörper wurden unter Verwendung von Standardtechniken zur Immunisierung eines Tiers mit gereinigtem Protein in Kombination mit einem Adjuvans, wie Freundsches Adjuvans, produziert. Monoklonale Antikörper können auch unter Verwendung von Standardtechniken, beispielsweise durch Immunisieren von Mäusen, bis der Antikörpertiter ausreichend hoch ist, Isolieren der Milz und Durchführen einer Fusion und dann Screening der Hybridome auf die die interessierenden Antikörper produzierenden hergestellt werden. Diese können mit einem beliebigen Napsin reaktive Antikörper oder mit Napsin A, jedoch nicht B und umgekehrt reaktive Antikörper sein.
Humanisierte Antikörper für therapeutische Anwendungsmöglichkeiten und rekombinante Antikörperfragmente können ebenfalls unter Verwendung von Standardmethodik erzeugt werden. Ein humanisierter Antikörper ist einer, in dem nur die Antigenerkennungsstellen oder komplementaritätsbestimmenden hypervariablen Regionen (CDRs) von nichthumanem Ursprung sind, und alle Gerüstregionen (FR) variabler Domänen Produkte humaner Gene sind. Bei einem Verfahren der Humanisierung eines tierischen monoklonalen Antiidiotyp-Antikörpers wird RPAS mit dem CDR-Pfropfverfahren nach der Beschreibung bei Daugherty et al., Nucl. Acids Res., 19: 2471–2476 (1991), kombiniert. Kurz gesagt wird die DNA der variablen Region eines ausgewählten tierischen rekombinanten Antiidiotyp-ScFv nach dem Verfahren von T. Clackson et al., Nature, 352: 624–688 (1991), sequenziert. Unter Verwendung dieser Sequenz werden tierische CDRs von tierischen Gerüstregionen (FR) auf der Basis der Orte der CDRs in bekannten Sequenzen von tierischen variablen Genen unterschieden. H. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. Auflage (U.S. Dept. Health and Human Services, Bethesda, MD, 1987). Sobald die tierischen CDRs und FR identifiziert sind, werden die CDRs auf ein humanes Gerüst der variablen Region der schweren Kette durch die Verwendung von synthetischen Oligonucleotiden und Polymerasekettenreaktion (PCR) rekombination gepfropft. Codons für die tierischen CDRs der schweren Kette sowie das verfügbare Gerüst der variablen Region der humanen schweren Kette werden in vier (jeweils 100 Basen lange) Oligonucleotide eingebaut. Unter Verwendung von PCR wird eine gepfropfte DNA-Sequenz von 400 Basen gebildet, die für den rekombinanten Tier-CDR/humane schwere Kette-FR-Schutz codiert. Die Expression eines mit rekombinanter CDR gepfropften Immunglobulingens wird durch dessen Transfektion in humane 293-Zellen (transformierte primäre embryonale Nierenzellen, im Handel erhältlich von American Type Culture Collection, Rockville, MD 20852), erreicht, die vollständig gepfropften Antikörper sezernieren. Siehe bei spielsweise B. L. Daugherty et al., Nucl. Acids Res., 19: 2471–2476, 1991. Alternativ wird humanisiertes ScFv auf der Oberfläche eines Bakteriophagen exprimiert und in E. coli sowie in dem im folgenden beschriebenen RPAS-Verfahren produziert.
Das "Recombinant Phage Antibody System" (RPAS) von Pharmacia (Pharmacia LKB Biotechnology, Schweden) kann für diesen Zweck verwendet werden. In dem RPAS werden Gene der variablen schweren und leichten Kette des Antikörpers ausgehend von der Hybridom-RNA getrennt amplifiziert und in einen Expressionsvektor kloniert. Die Domänen der schweren und leichten Kette werden auf der gleichen Polypeptidkette nach Verbindung mit einer kurzen Linker-DNA, die für ein flexibles Peptid codiert, co-exprimiert. Diese Anordnung erzeugt ein einzelkettiges Fv-Fragment (ScFv), das die gesamte antigenbindende Domäne des Antikörpers enthält. Unter Verwendung des antigengetriebenen Screeningsystems wird das ScFv mit Bindungseigenschaften, die zu denen des ursprünglichen monoklonalen Antikörpers äquivalent sind, ausgewählt [siehe beispielsweise J. McCafferty et al., Nature, 348: 552–554 (1990); T. Clackson et al., Nature, 352: 624–688 (1991). Das rekombinante ScFv umfasst eine beträchtlich kleinere Zahl von Epitopen als der intakte monoklonale Antikörper und es stellt daher einen viel schwächeren immunogenen Stimulus bei Injektion in Menschen dar. Es wird daher angenommen, dass eine intravenöse Injektion von ScFv in Menschen wirksamer und immunologisch tolerabel im Vergleich zu derzeit verwendeten vollständigen monoklonalen Antikörpern ist [D. J. Norman et al., Transplant Proc., 25, Anhang 1: 89–93 (1993).
Nucleotidsonden
Nucleotidsonden können zum Screening der Napsinexpresion oder der Arten und/oder Verhältnisse vorhandener Isoformen verwendet werden. Diese können cDNA-Sequenzen oder andere Moleküle sein, die auf der Basis der hierin angegebenen Sequenzen gestaltet sind oder die unter Verwendung von Standardtechniken aus von verschiedenen Zelltypen oder -spezies erzeugten Bibliotheken erhalten werden. Es ist klar, dass die hier berichtete Sequenz von humanem Ursprung ist, die gleichen Proteasen jedoch in anderen Arten von Tieren vorhanden sein können und in einem gewissen Grad sowohl im Hinblick auf die Aminosäuresequenz als auch die Nucleotidsequenz variieren können. Napsin wird hierin als Aspartatprotease mit der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz von Menschen oder anderen tierischen Lebewesen oder eine Verbundsequenz, die durch Substitution von Aminosäuren von einer Spezies in eine andere an der äquivalenten Position, die von dem aktiven Zentrum verschieden ist, das oben diskutiert wurde, konstruiert sind, angegeben. Ein Nucleotidmolekül mit Codierung für Napsin kann natürlich vorkommend sein, wie hierin beschrieben ist, oder auf der Basis der Aminosäuresequenz konstruiert und synthetisch hergestellt sein. Darüber hinaus wird angenommen, da mindestens zwei Isoformen identifiziert wurden, dass zusätzliche Isoformen in anderen Geweben als der Niere oder Leber gefunden werden können. Diese Isoformen sollen von dem Ausdruck "Napsin" umfasst werden.
Nucleotidmoleküle können zum Testen der Menge, des Typs oder einer Kombination derselben unter Verwendung von Standarddiagnosetechniken verwendet werden. Generell umfassen Sonden ein Segment einer DNA mit Codierung für Napsin von mindestens 14 Nucleotiden, was ausreichend sein sollte, um Spezifität unter Standardhybridisierungsbedingungen und um so mehr unter stringenten Bedingungen zu ergeben. Die Reaktionsbedingungen zur Hybridisierung einer Oligonucleotidsonde oder eines Primers mit einer Nucleinsäuresequenz variieren von Oligonucleotid zu Oligonucleotid in Abhängigkeit von Faktoren, wie der Oligonucleotidlänge, der Zahl von G- und C-Nucleotiden und der Zusammensetzung des in der Hybridisierungsreaktion verwendeten Puffers. Der Fachmann versteht generell unter mäßig stringenten Hybridisierungsbedingungen Bedingungen von etwa 25°C unter der Schmelztemperatur einer perfekt basengepaarten doppelsträngigen DNA. Eine höhere Spezifität wird generell durch die Verwendung von Inkubationsbedingungen mit höheren Temperaturen, mit anderen Worten stärker stringenten Bedingungen erreicht. Generell ist eine um so höhere Temperatur und/oder Salzkonzentration erforderlich, je länger die Sequenz oder je höher der G- und C-Gehalt sind. Kapitel 11 des Laborhandbuchs von Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1990) beschreibt Hybridisierungsbedingungen für Oligonucleotidsonden und Primer sehr detailliert, was eine Beschreibung der beteiligten Faktoren und des notwendigen Stringenzgrads, um eine Hybridisierung mit Spezifität zu garantieren, umfasst. Unter 10 Nucleotiden sind hybridisierte System nicht stabil und sie beginnen oberhalb von 20°C zu denaturieren. Bei über 100 000 Nucleotiden wurde erkannt, dass die Hybridisierung (Renaturierung) ein viel langsamerer und unvollständiger Prozess wird, was detaillierter in dem Text MOLECULAR GENETICS, G. S. Stent und R. Calender, S. 213–219 (1971) beschrieben ist. Idealerweise sollte die Sonde 20 bis 10000 Nucleotide aufweisen. Kleinere Nucleotidsequenzen (20–100) sind einer Produktion durch automatische organische Synthesetechniken zugänglich. Sequenzen von 100–10000 Nucleotiden können ausgehend von entsprechenden Restriktionsendonucleasebehandlungen erhalten werden. Die Markierung der kleineren Sonden mit relativ voluminösen chemilumineszierenden Einheiten kann in einigen Fällen den Hybridisierungsprozess stören.
Markierung
Sowohl Antikörper als auch Nucleotidmoleküle können mit Standardtechniken, beispielsweise mit radioaktiven Markierungen, fluoreszierenden Markierungen, chemilumineszierenden Markierungen, Farbstoffen, Enzymen und anderen Detektionsmitteln, wie magnetischen Teilchen, markiert werden. Beispielsweise kann eine selektive Markierung des aktiven Zentrums mit Fluorescein durch das Verfahren von Bock (P. E. Bock (1988) Biochemistry 27, 6633–6639) durchgeführt werden. Kurz gesagt wird ein Blockierungsmittel mit einem Enzym 1 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach der Dialyse wird das kovalent modifizierte Enzym bei Raumtemperatur 1 h mit 200 μM 5-(Iodacetamido)fluorescein (Molecular Probes) inkubiert. Freies Fluorescein wird durch Gelfiltration auf einer PD-10-Säule (Pharmacia) entfernt. Mit diesem Verfahren enthält jedes Molekül eines fluoresceinierten Enzyms einen einzigen Farbstoff am aktiven Zentrum und daher verhalten sich alle fluoreszierenden Moleküle identisch. Alternativ kann Iodogen (Pierce) zur radioaktiven Markierung eines Enzyms mit Na[¹²⁵I] (Amersham) nach dem Protokoll des Herstellers verwendet werden. Freies ¹²⁵I kann durch Gelfiltration auf einer Pd-10-Säule entfernt werden.
Rekombinantes Protein
Rekombinante Proteine und Fragmente derselben sind als Kontrollen in diagnostischen Verfahren verwendbar. Die cDNA- und Gensequenzen von Napsin A wurden bestimmt. Die DNA wurde in einem rekombinanten System (humane Zelllinie) exprimiert und die Aktivität des Enzyms wurde charakterisiert. Die cDNA- und Gensequenzen von Napsin B wurden be stimmt. Die Proteine können als Standards oder wie im folgenden diskutiert wird, therapeutisch als Aspartatproteasen und in Untersuchungen des Enzymverhaltens verwendet werden. Die Expression von rekombinanten Proteinen ausgehend von einer cDNA ohne Stoppcodon kann bestimmte Vorteile bieten.
Verfahren zur Isolierung von Napsin
Antikörper und Nucleotidsonden sind bei der Detektion von Napsin oder dessen Isoformen primär verwendbar. In einigen Fällen kann es auch günstig sein, das gereinigte Protein zu isolieren. Wie oben beschrieben ist, wurde ein Verfahren zur Bindung von Napsin A und Napsin B an eine Pepstatin-Affinitätssäule ersonnen. Immobilisiertes Pepstatin kann zur Reinigung von entweder natürlich vorkommendem oder rekombinantem Napsin aus Geweben, in denen es exprimiert wird, für diagnostische Anwendungsmöglichkeiten verwendet werden.
B. Enzymanwendungsmöglichkeiten
Die Aspartatproteasen können in Anwendungen, die ähnlich denen sind, für die Cathepsin D verwendet wird, verwendbar sein. Klinisch kann es vorteilhaft sein, das Gen mit Codierung für Napsin zur Behandlung von Störungen, bei denen das Individuum in Bezug auf die Protease defizient ist, selbst transient zu transfizieren oder ein zielgerichtetes Antisense-Ribozym oder eine Ribozymleitsequenz oder eine Dreifachhelix zur Verhinderung oder Verringerung der Enzymexpression in Individuen mit Störungen, die durch erhöhte Enzymspiegel charakterisiert sind, zu transfizieren. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Antikörper, der spezifisch immunreaktiv mit 1) einem Napsin mit der Aminosäuresequenz der Aminosäuren –64 bis 375 oder 1 bis 375 von H-Napsin von 2A bis 2C und/oder 2) einem Napsin mit der Aminosäuresequenz von 4A bis 4F oder den Aminosäuren von 4A bis 4F von der Sequenz SPGDKPIFVPLSNYR an ist, wobei der Antikörper zur Bindung an ein Epitop, das die Aminosäuresequenz MKSGARVGLARARPRG umfasst, fähig ist.
Antikörper nach Anspruch 1, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 1, wobei der Antikörper ein markierter Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 3, wobei der markierte Antikörper mit einer radioaktiven Markierung, Fluoreszenzmarkierung, Chemilumineszenzmarkierung, einem Farbstoff oder einem Enzym markiert ist.
Verfahren zur Detektion eines Napsins in einer Probe, das die Stufen (a) Inkontaktbringen der Probe mit dem Antikörper von Anspruch 3, (b) Ermöglichen der Bindung des Antikörpers an das Napsin und (c) Detektieren des markierten Antikörpers umfasst.
Verfahren zur Isolierung eines Napsins in einer Probe, das die Stufen (a) Inkontaktbringen der Probe mit dem Antikörper von Anspruch 1, (b) Ermöglichen der Bindung des Antikörpers an das Napsin und (c) Abtrennen des Antikörpers von der Probe umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, wobei die Probe eine humane Gewebeprobe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, wobei die Probe eine Zelllinienprobe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, wobei die Probe eine humane Zelllinienprobe ist.