ES2308791T3

ES2308791T3 - Clonacion y caracterizacion de napsina, una proteasa aspartica.

Info

Publication number: ES2308791T3
Application number: ES97948546T
Authority: ES
Inventors: Gerald Koelsch; Xinli Lin; Jordan J. N. Tang
Original assignee: Oklahoma Medical Research Foundation
Current assignee: Oklahoma Medical Research Foundation
Priority date: 1996-11-20
Filing date: 1997-11-20
Publication date: 2008-12-01
Anticipated expiration: 2017-11-20
Also published as: AU734220B2; WO1998022597A3; DE69738653D1; PT948630E; DE69738653T2; EP0948630B1; ATE393227T1; JP2001503643A; EP0948630A2; CA2271294A1; AU5459298A; WO1998022597A2; US6225103B1; JP2008118996A; DK0948630T3

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE AL CLONADO, A PARTIR DE UN BANCO DE HIGADO HUMANO, DE UNA PROTEASA ASPARTICA DESCONOCIDA ANTERIORMENTE, CAPAZ DE LLEVAR A CABO UNA FISURA DE PROTEINAS POR HIDROLISIS Y QUE SE LLAMA A CONTINUACION "NAPSINA". SE HAN CLONADO, SECUENCIADO Y EXPRESADO DOS CLONES DE ADN COMPLEMENTARIO QUE CODIFICAN ISOENZIMAS DE LA PROTEASA LLAMADAS "NAPSINA A" Y "NAPSINA B". TAMBIEN SE HA OBTENIDO Y SECUENCIADO PARCIALMENTE EL GEN. SE HA DESARROLLADO TAMBIEN UN PROCEDIMIENTO DE PURIFICACION RAPIDA DE LA ENZIMA GRACIAS A UNA PEPSTATINA INMOVILIZADA Y SE HA AISLADO UNA ENZIMA PROCEDENTE DEL TEJIDO RENAL HUMANO. SE HAN PRODUCIDO ANTICUERPOS POLICLONALES CONTRA LAS ENZIMAS, PERMITIENDO ESTOS ANTICUERPOS TAMBIEN AISLAR Y DETECTAR LA ENZIMA. SIMILARIDADES CON OTRAS PROTEASAS ASPARTICAS, ESPECIALMENTE LA CATEPSINA D, DEMUESTRAN LA UTILIDAD DE LA ENZIMA EN PROCEDIMIENTOS DIAGNOSTICOS, ASI COMO PROTEASA. SE PUEDE DETERMINAR LA CANTIDAD Y/O EL TIPO DE NAPSINA EXPRESADA EN UN TEJIDO PARTICULAR UTILIZANDO SONDAS DE NUCLEOTIDOS O ANTICUERPOS MARCADOS CONTRA LA NAPSINA.

Description

Clonación y caracterización de napsina, una proteasa aspártica.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a una proteasa aspártica antes desconocida que esta presente en el hígado humano, aislada por clonaje de un gen desde una librería de ADNc del hígado humano.

Los miembros de esta familia de proteasa aspártica son caracterizados por la presencia de residuos de ácido aspártico catalítico en su centro activo. Existen cinco proteasas aspártica conocidas que están presente en el cuerpo humano. Pepsina y gastricsina son secretados en el estómago para la digestión de las comidas. Gastricsina está también presente en el plasma seminal. Catepsina D y E están presentes intracelularmente para llevar a cabo el catabolismo de proteínas. Renina, está presente en el plasma, y es la enzima clave que regula el sistema de angiotensina y en última instancia la presión sanguínea.

En eucariotas, incluyendo el ser humano, las proteasas aspárticas son homologas en la secuencias de genes y de proteína, pero tienen diferentes aminoácidos y secuencias de nucleótidos. El ADNc y los genes de las cinco proteasas aspárticas humana han sido clonados y secuenciados. Son sintetizados como cimógenos de simple cadena de aproximadamente 380 residuos, que son secretados o dirigidos a la vacuola intracelular. En la activación por un proceso autocatalizado (excepto prorenina), un segmento pro del N terminal de aproximadamente 45 residuos esta anclado para producir enzimas maduras (Tang y Wong, J Cell. Biochem. 33, 53-63 (1987)). En algunos casos, por ejemplo, con catepsina D y renina, las proteasas maduras son cortadas posteriormente en dos cadenas. Las estructuras tridimensionales de las proteasas aspárticas son muy similares. Cada enzima contiene dos lóbulos interiormente homólogos (Tang et al., Nature 271, 618-621 (1978)). El sitio activo cortado, puede acomodar ocho residuos de sustrato, y dos ácidos aspárticos catalíticos están localizados entre los lóbulos.

Estas proteasas tienen papeles fisiológicos distintos e importantes. Además de su importancia en las funciones fisiológicas, estas enzimas también están relacionadas con estados patológicos. Por ejemplo, pepsina humana y gastricsina son indicadores de diagnósticos para las úlceras del estómago y el cáncer (Samloff, de Gastroenterology, 96 586-595 (1989); Miki et al., Jpn. J. Cancer Res. 84, 1086-1090 (1993)). Catepsina D está localizado en el lisosoma. Su función principal es el catabolismo de proteínas del tejido. Pruebas recientes en estudios de ratones sin el gen de catepsina D funcional, sin embargo, indican que esta enzima tiene un papel en el desarrollo del intestino en animales recién nacidos. Catepsina D también se refiere a metástasis de cáncer de mama en humanos (Rochefort, Acta Oncologica 31, 125-130 (1992)). Catepsina E está localizada en el reticulum endoplasmático de algunas células, como eritrocitos y células de la mucosa del estómago. Esta ha sido aplicada en el procesamiento de antígenos en células inmunizadas.

Las proteasas aspárticas humanas tienen usos médicos importantes. Los niveles de las proenzimas pepsinógenas y progastricisinas humanas presentes en el flujo de sangre y la proporción entre los dos niveles se usan en el diagnóstico selectivo del cáncer de estómago humano (Defize, et al., Cancer 59, 952-958 (1987); Miki, et al., Jpn. J. Cancer Res. 84, 1086-1090 (1993)) y en úlcera (Miki, et al., Adv. Exp. Med. Biol. 362, 139-143 (1995)). La secreción de procatepsina D se eleva en el tejido de cáncer de mama. Por lo tanto, el nivel de procatepsina D en el cáncer de mama es usado para el pronóstico clínico (Rochefort, Acta Oncologica 31, 125-130 (1992)). El análisis de renina en el diagnóstico de la hipertensión es un procedimiento clínico rutinario (Brown et al., Handbook of Hypertension 1, 278-323 Robertson, editor (Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1983).

Estos ejemplos establecen que las proteasas aspárticas humanas están relacionadas con enfermedades humanas y además previamente las proteasas aspárticas no identificadas, es probable que tengan aplicaciones clínicas.

Por lo tanto un objeto de la presente invención es el de proporcionar un anticuerpo inmunoreactivo específicamente con una proteasa aspárticas como se establece en la reivindicación 1.

Se caracteriza y clona la proteasa aspárticas, se identifican los tejidos en los que la proteasa aspárticas se expresa y las aplicaciones en la química clínica y el diagnóstico.

Sumario de la invención

Una proteasa aspártica antes desconocida capaz de cortar las proteínas por hidrólisis, referida aquí como "Napsina", ha sido clonada de una librería de hígado humano. Dos clones de ADNc han sido clonados, secuenciados y expresados. Estas codifican isoenzimas de la proteasa, referidas como " Napsina A " y "Napsina B". Un clon que es inusual, en lo que respecta a que no incluye un codon de parada, pero que puede ser usado para expresar las proteínas. El gen también se ha obtenido parcialmente secuenciado. Un proceso para la purificación rápida de la enzima usando pepstatina inmovilizada también ha sido desarrollado, y la enzima aislada del tejido de riñón humano. Anticuerpos policlonales a las enzimas han sido hechos para que sean también útiles para el aislamiento y la detección de la enzima.

Las semejanzas a otras proteasas aspárticas, especialmente catepsina D, establecen la utilidad de la enzima en los ensayos de diagnósticos como una proteasa. Cualquier tipo de napsina ó cantidad, ó ambos, expresadas en un tejido en particular pueden ser determinados usando anticuerpos marcados o sondas de nucleótidos a la napsina.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A-1D son secuencias de aminoácidos putativas y la del ADNc de Napsina A humana. Elementos del sitio activo característico (DTG) y Tyr75 son subrayados. El patrón de unión RGD integrina está también subrayado. Las lisinas en el extremo carboxi le corresponden a la región poli-A.

Las figuras 2A-2C son una comparación de la secuencia de aminoácidos de la napsina A humana con las secuencias de aminoácidos de una proteína como la proteasa aspártica de ratón (Mori, et al., 1997) y la catepsina D humana ("cath D"). La figura 2D es un esquema o la presentación de un dendrograma de secuencia relacionada entre la napsina y otras proteasas aspárticas humanas.

Las figuras 3A-3E son el ADN genómico humano de la Napsina. El intron se indica en letra minúscula, en el caso del exón en letra mayúscula. La secuencia de aminoácidos putativa indica la posición de los cruces intro/exón. La figura 3F es una presentación esquemática de la napsina A humana. Los exones son mostrados como barras verticales con la numeración más arriba. Las flechas dobles encabezadas representan las áreas donde la secuencia fue determinada. Las letras son posiciones de sitios de restricción donde X es XhoI, B es BamHI, y E es EcoRI.

Las figuras 4A-4E son el ADNc y la secuencia de aminoácidos putativa de la Napsina B humana. Elementos de sitios activos característicos (DTG) y Tyr75 son subrayados. El patrón de unión de integrina RGD está también subrayado. Las lisinas en el extremo carboxi le corresponde a la región poli-A.

Descripción detallada de la invención I. Clonación y expresión de Isoformas de Napsina A. Napsina A humana 1. Clonaje de ADNc que codifica para Napsina A

Los clones identificados por una búsqueda de homología de las bases de datos de secuencias de ADNc humana del Instituto para investigación de Genoma (Adams et al., Science 252, 1651-1656 (1991), reporta que la porción que codifica para catepsina D, fue obtenida desde American Type Culture Collection, Rockville, MD. Estas están referido como clon ATCC número 559204, 540096, 346769, 351669, y 314203; Genbank números W19120, N45144, R18106, R11458, y T54068, respectivamente. El análisis de las secuencias indica que éstos no codifican a catepsina D, y no son ADNcs de longitud completa. Las plantillas fueron diseñadas y usadas con PCR para obtener clones adicionales, usando una librería de ADNc de hígado humano como plantilla. Los clones que fueron obtenidos incluyen regiones no presente en los clones ATCC.

Debido a que estos clones proporcionan solo aproximadamente 600 pb del ADNc, el clon ADNc más largo fue buscado usando 5' RACE PCR (reacción de cadena de polimerasa), en el que el ADN de dos librerías del ADNc de hígado humano se separan y clonan en el \lambdagt10 fue usado como plantilla y patrones basados en la secuencia cercana al extremo 5' (AGGGCACACTGAAGAAGTGGCATCTCC) y la secuencia del vector \lambdagt10 hacia arriba del inserto en la dirección delantera (CTTTTGAGCAAGTTCAGCCTGGTTAAG). Dos clones, pHL-1 (154 bp) y pHL-2 (288 bp) fueron obtenidos, uno (pHL-2) el que se extiende hasta la secuencia extremo 5' dentro de región del péptido líder (figuras 1A-1D).

La secuencia de ADNc de la napsina A humana carece de un codon de parada en todos los clones obtenidos, todavía todas las características demuestran una proteasa aspártica funcional, que incluye elementos de los sitios activos intactos, un Tyr75 conservado (pepsina numerada), y un polipéptido de aproximadamente 40 aminoácidos. Diferente de la pepsina, la proteasa aspártica característica, la napsina A contiene en su extensión C-terminal abundancia de residuos de prolina, y un patrón RGD (patrón de enlace a integrina) cerca de la superficie de la estructura terciaria de la napsina D como a juzgar por las estructuras de cristal homologas de proteasas aspártica de mamíferos (i.e., Pepsina y catepsina D).

Varios clones de ADNc relacionados de la napsina fueron obtenidos por selección desde librerías de ADNc de hígado humano y determinadas las secuencias de los nucleótidos. Estos clones representan partes diferentes del ARN mensajero de la napsina. Uniones juntas a la secuencia de los nucleótidos que codifican a la napsina A tienen una secuencia de aminoácidos deducida que se muestra en las figuras 1A-1D.

2. Expresión de Napsina A recombinante

El ADNc de la Napsina A, incluyen el péptido líder y la región sin traducir 3' y un strech de poliadenina que fue amplificado por PCR con PLHNAP – FWD (5'-AAGCTTATGTCTCCACCACCGCTGCTGCTACCCTTGCTGC) y PLHNAP-REV (5'- AAGCTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTCAATGGAAATATTGG) y clonado en el sitio HindIII del vector pLNCX para la expresión del promotor CMV (Dusty Miller). El plásmido aislado fue transformado en células de riñón 293 humanas (ATCC). Las células fueron recobradas (8-120 mg) y lisadas con 50 mM NaOAc, 20 mM de zwitergente, pH 3,5 (tampón NAZ) con vortex.

Los lisados fueron incubados en hielo durante 1 hora. El sobrenadante de la centrifugación a 14,000 x g fue empleado directamente para la identificación de la expresión de la Napsina A por la adición de una alícuota de 40 \mul de pepstatina - A agarosa (Sigma). La muestra fue girada en un tubo cónico de 50 ml a 4ºC por 1 semana. La matriz fue fijada y lavada dos veces con 20 ml de tampón NAZ y tres veces con 20 mM de Tris-HCl, 0,5 M de KCl, pH 8,2 (tampón TK). Los lavados finales fueron llevados a cabo con 20 mM de Tris-HCl, 50 mM NaCl, 20 mM zwitergente, pH 9,5. La agarosa pepstatina A fijada (aproximadamente 40 \mul) fue mezclada con 40 \mul de tampón de corrida SDS-\beta-mercaptoetanol (NOVEX) y calentado a 70ºC durante 10 minutos. Alícuotas fueron aplicadas a 10% Tricina SDS-PAGE (NOVEX) y transferido a membranas de PVDF usando un sistema tampón Tris-Tricina 10%. Las membranas fueron teñidas con amido negro o bloqueadas con solución 5% de leche descremada para identificación por inmunoquímica. Cortes transversales de la membrana teñida con amido negro fueron cortadas y lavadas en H_{2}O estéril para análisis de secuencia amino -terminal en un secuenciador de proteína automático.

3. Clonación de ADN Genómico

Clones Genómicos de napsina humana fueron obtenidos por selección de una librería de ADN genómico humano, clonado en cromosomas artificiales bacterianos (pBELO-BAC11) (Kim et al., Nucl. Acids. Res. 20, 1083-1085 (1992)). El origen de ADN genómico para la librería fue desde líneas de células de espermatozoides humanos 978SK, y contenían más de 140,000 clones. Sondas de oligonucleótidos sintéticas fueron marcadas con ^{32}P:

para selección primaria Nap-3'

(GAGGGCGAGCGCGCGCCAGTCCCACTCGTGCGCCGCTCTTCATGTCCCCG),

para selección secundaria Nap-5'

(CCATCCCCTCAGTAGGTTCAGGGTCCTGCGTCCAGGGTGGACTTGACGAA).

La selección fue llevada a cabo en Research Genetics, Huntsville, Alabama. Dos clones independientes fueron aislados, ambos aproximadamente de longitud de 30 kbp, y fueron cortados con enzima de restricción y analizados por electroforesis en gel de agarosa pulse field. Fragmentos de interés fueron identificados por Soutern Blotting, subclonado en pBlue y secuenciado. El ADN genómico de Napsina A humano se muestra en las figuras 3A-3E.

El gen de Napsina A humano se codifica en 9 exones (Figura 3F). Las uniones exón/intron se definen por ambos, en la secuencia de ADNc como el motivo de unión. La región que codifica a Napsina A humana contiene un marco de lectura abierto "open reading frame" que comienza desde el codon de iniciación ATG (nucleótido 1 en las figura 1A-1D) hasta aproximadamente 1,2 kb de una prolongación de polyA en la secuencia de ADNc. Como en la secuencia de ADNc de la Napsina A, la secuencia del exón genómico de la Napsina A no contiene codon de parada "in-frame" en la región de codificación completa antes de la prolongación del poli A. La falta de un codon de parada en la Napsina A es confirmada. La falta de un codon de parada no ha sido observada para el gen de otras proteínas mamíferas. El ADNc (por tanto, el ARNm) de la Napsina A está presente en los diferentes tejidos humanos. Esto fue de interés para ver si el gen napsina A es capaz de expresar el producto de proteína. Estos resultados son descritos más
adelante.

B. Napsina B humana 1. Estructura de gen y del ADNc

Clones 559204 y 163167 que expresan la napsina B humana fueron obtenidos desde ATCC y secuenciados parcialmente como se describe arriba. Las figuras 4A-4E indican la secuencia de ADN de longitud completa resultante que codifica para la Napsina B y la secuencia de aminoácidos pronosticada. Los nucleótidos del 1-1191 fueron obtenidos de clones genómicos (descrito arriba para la Napsina A) y de 1192-1910 desde clones de ADNc de ATCC. La secuencia de gen de la Napsina B es un 92% idéntico a la de la Napsina A, y la secuencia de proteína putativa de cada expuesta identifica un 91% de similitud. Similar a la napsina A, la secuencia de proteína de la napsina B deducida posee un motivo típico de proteasa aspártica, y la misma extensión en el extremo C, motivo RGD, y las regiones rica en prolina, como el ADNc de la Napsina A (Figura 4A-4E). A diferencia del gen napsina A, gen napsina B tienen un codon parada in-frame.

II. Aislamiento y caracterización de proteína napsina A

La comparación de la secuencia de la napsina A con otras tres proenzimas de proteasas aspárticas humanas se muestra en las figuras 2A-2C. Está claro que la napsina está relacionada con la catepsina D humana, y es similar para proteínas como proteasa aspártica de ratón, pero las diferencias son fácilmente evidentes. La relación para otras proteasas aspárticas humanas se analiza después en la figura 2D, que es una diagrama del grado de relación y los porcentajes de residuos idénticos presentes. Evidentemente, por ambos criterios, la napsina como muchas otras proteasas aspárticas es diferente como ellas son diferentes a otras.

Además la semejanza de secuencia a otras proteasas aspárticas humanas, la conclusión de que la napsina es una proteasa aspártica esta descrita por las siguientes observaciones. (a) los sitios críticos de residuos aspárticos activos en posición 32 y 215 están presente en las secuencias DTG conversa. (b) la presencia de Tyr-75 (Y) y algunos residuos conservados alrededor de él demuestran un "flap" funcional que es característico de las proteasas aspárticas. (c) la región pro que corresponde a los residuos 1p hasta 44p están presentes en la napsina, indicando que es una proenzima de la proteasa aspártica y es capaz de la activación.

Una secuencia RGD se encuentra en la posición 315 a 317 (número de residuo de pepsina porcina por convención). Este motivo ha sido demostrado que es importante para la unión integrina que esta relacionada a la regulación de las funciones celulares como el ciclo celular, hemostasis, la inflamación y la proliferación celular. Esta secuencia podría tener una función especial por medio de la napsina.

2. Detección Inmunoquímica de la Napsina A

Un suero policlonal específico a la napsina fue producido usando el siguiente procedimiento. Un epítope del aminoácido 18 de la Napsina A fue sintetizado como un péptido antigénico múltiple (MAP) sobre un nodo central poli-lisina por Molecular Biolgy Resource Facility (OUHSC). Este epítope (MKSGARVGLARARPRG) fue común tanto a Napsina A como B, y suficientemente diferente de la catepsina D, su homólogo más cercano. Esta región es muy probable que este ubicada sobre la superficie de la Napsina A, como esta determinada desde la estructura de cristal catepsina D coordinada (Erickson, 1993). Alícuotas de 1 mg en 1 ml de H_{2}O fue usado para inmunizar a cabras (Hybridoma Lab, Oklahoma Medical Research Foundation). Suero colectado fue precipitado con sulfato amonio múltiples veces (Antibodies Lab Manual) y purificada por afinidad usando la Napsina acoplada al MAP juntó con affi-gel 10 (BioRad). Este antisuero fue usado a la dilución 1: 5000 en la detección de Napsina A sobre membranas de PVDF transferidos de geles de SDS-PAGE (NOVEX). El sistema ECL (Pierce) fue usado para la detección del anticuerpo primario.

Manchas "Inmunoblots" de muestras de Napsina A recombinante de células 293 de riñones humanos son preparadas como se describe arriba y se detecta la Napsina A. Estos resultados demuestran la expresión de gen de la napsina A produciendo una banda inmunoespecífica que migra en la electroforesis SDS-poliacrilamida con una movilidad similar a la Napsina B. Por tanto, a pesar de la falta de un codon de parad en la Napsina A, la proteína esta correctamente expresada en la línea de célula humana. El hecho de que esta proteína Napsina A fue recobrada desde la columna de afinidad pepstatina sugiere que la presencia de un sitio activo es similar a todas las proteasas aspárticas.

3. Detección de Napsina B en Tejido humano y en Líneas celulares

Las secciones de aproximadamente 8 gramos de corteza de riñón humana (red de tejido humana cooperativa, Cooperative Human Tissue Network, National Cancer Institute, NIH) fueron homogeneizadas en una licuadora Waring en un tampón compuesto por 20 mM Tris HCl, 50 mM NaCl, 20 mM zwitergente, y 1 \muM cada uno de TPCK, TLCK, y EDTA, pH 7,5 (Tampón TZ). Al homogenizado se le adiciona sulfato de amonio 40% y se centrifuga a 10,000 x g con agitación ligera. El sobrenadante resultante se adiciona en sulfato de amonio 70% y se centrifuga a 10,000 x g. El material insoluble en el sulfato de amonio 70% (cortado entre 40-70%) fue disuelto en 15 ml Tampón TZ y se lleva a pH 4.0 con 30 ml de tampón NAZ. Luego de la incubación en hielo durante 1 hora, la muestra se centrifuga a 14,000 x g. El sobrenadante resultante, se le añade una alícuota de 0,1 ml de agarosa - pepstatina A (Sigma). La detección de Napsina B en líneas de células se realiza siguiendo el procedimiento argumentado arriba para la detección de Napsina A recombinante.

La napsina B fue detectada en muestras de tejidos de la corteza de riñón humana y en línea de célula Hut-78 de riñón humano: riñón humano (corte 0-40% sulfato de amonio) riñón humano (corte 40-70%); células Hut-78, en cuatro formas aparentemente. En el corte de sulfato de amonio entre 0-40%, una proteasa de simple cadena de 50-54 kDa con una secuencia del extremo amino heterogénea se detecta de una derivada de la secuencia de proteína SPGDKPIFVPLSNYR (con otros extremos en Asp4 y Lys5). Estas secuencias del extremo -N coinciden con el sitio de anclaje de la activación pronosticada en pronapsina B comparando con los sitios de anclaje de activación en procatepsina D homologa y en otras proteasas aspárticas de cimógenos. En el corte de sulfato de amonio 40-70%, tres formas fueron detectadas. Una forma de simple cadena 46-50 kDa, y dos forma de doble cadena. La banda de 46-50 kDa produce la misma secuencia heterogénea de la secuencia de Napsina B obtenida desde la banda de peso molecular más grande en el gradiente de sulfato de amonio 40%. Los dos fragmentos de peso molecular más bajos de aproximadamente 8 y 4 kDa producen la misma secuencia amino terminal (VRLCLSGFQALDVPPPAGPF) que se corresponde con la región C-terminal de Napsina B. Una banda de 40 kDa prominente de las preparaciones transferidas fueron secuenciadas, y produce la misma secuencia heterogénea amino terminal como la banda de 46-50 kDa, indicando dos especies de Napsina B de doble cadena: uno de 8 kDa y 40 kDa y también especies como 4 kDa y 40 kDa.

III. Aplicaciones de Napsina

Una gran variedad de usos clínicos y de diagnósticos para la enzima pueden ser diseñados sobre la base de la analogía con los usos de las proteasas aspárticas relacionadas. Las proteínas, las moléculas de nucleótidos, y los métodos para el aislamiento y uso de éstas tienen una gran variedad de aplicaciones, particularmente en las aplicaciones diagnósticas. Debido a que las proteasas aspárticas que son conocidas se correlacionan con ciertos trastornos, como el cáncer de mama y la hipertensión arterial, y la napsina se expresa en el riñón, la medición de los niveles y de los tipos de napsina que se expresan en los tejidos, especialmente el riñón, se pueden correlacionar con la presencia y la gravedad de los trastornos. El ADN recombinante y los reactivos derivados de ésta pueden ser usados para determinar la expresión de napsina en personas sanas y en personas que afectadas con la enfermedad. Las secuencias de Napsina pueden ser usadas siguiendo de forma paralela la presencia de genes de napsina en pacientes para el vínculo a posibles enfermedades.

A. Aplicaciones de diagnóstico

La cantidad de napsina puede ser determinada usando las técnicas de selección estándares, que se extienden desde el aislamiento de la napsina del tejido, usando por ejemplo la anti-napsina inmovilizada (anti-napsina A ó anti-napsina B) o pepstatina, para la detección y la cuantificación de anticuerpos marcados, la determinación de la cantidad de ARNm transcrito en el tejido, usando sensores de nucleótidos marcados.

Producción de anticuerpos

Los anticuerpos policlonales fueron producidos usando las técnicas estándares para la inmunización de un animal con proteína purificada en combinación con un adyuvante como adyuvante Freunds'. Anticuerpos monoclonales también pueden ser preparados usando técnicas estándares, por ejemplo, ratones inmunizados hasta que el título de anticuerpo sea suficientemente alto, aislando el bazo y haciendo una fusión, y luego seleccionando los hibridomas para aquellos que producen los anticuerpos de interés. Éstos pueden ser anticuerpos reactivos con cualquier napsina, o reactivo con Napsina A pero no B, y viceversa.

Los anticuerpos humanizados para aplicaciones terapéuticas, y fragmentos de anticuerpos recombinantes pueden también ser generados usando una metodología estándar. Un anticuerpo humanizado es aquel en el cual solamente los sitios de reconocimiento del antígeno ó de las regiones hipervariable (CDRs) determinan la complementariedad de que son de origen no humano, y que todas las regiones framework (FR) de dominios variables son productos de genes humanos. En un método de humanización de un anticuerpo monoclonal anti-idiotípico de animal, RPAS esta combinado con el método CDR injertado descrito por Daugherty et al., Nucl. Acids Res., 19: 2471-2476 (1991). Brevemente, la región de ADN variable de un ScFv anti-idiotípico recombinante del animal seleccionado se secuencia por el método Clackson, T., et al., Nature, 352: 624-688 (1991). Usando esta secuencia, CDRs en el animal se distinguen regiones framework del animal (FR) sobre la base de las localizaciones de los CDRs en las secuencias conocidas de genes variable del animal. Kabat, H.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed. (U.S. Dept. Health and Human Services, Bethesda, MD, 1987). En cuanto a los CDRs del animal y el FR son identificados, los CDRs se injertan en la cadena pesada de la región variable humana por el uso de los oligonucleótidos sintéticos y de la recombinación de reacción en cadena de polimerasa (PCR). Codones para los CDRs de cadena pesada del animal, también están disponibles en regiones variables framework de cadena pesada de humano, son construidas de cuatro oligonucleótidos (cada uno largo de 100 bases). Se usa PCR en la secuencia de ADN del injerto de 400 bases formadas, que codifica para la región FR de cadena pesada humana/CDRs de animal recombinante. La expresión del gen recombinante de inmunoglobulina del CDR injertado se logra por su transfección en células 293 humanas (células de riñón embrionarias primarias transformadas, comercialmente disponible desde, American Type Culture Collection, Rockville, MD 20852) que secretan el anticuerpo injertado completamente. Ver, por ejemplo, Daugherty, B.L., et al., Nucl. Acids. Res., 19: 2471-2476, 1991. Por otra parte ScFv humanizado se expresa aparentemente de bacteriófago y se produce en E. coli con el método RPAS descrito más adelante.

El sistema Pharmacia's (Pharmacia LKB Biotechnology, Sweden) "Recombinant Phage Antibody System" (RPAS) puede ser usado para éste propósito. En el RPAS, los genes de cadena pesada y ligera de anticuerpos variables son amplificados por separado del ARNm del hibridoma y clonados en un vector de expresión. Los dominios de cadena pesada y ligera son coexpresados sobre la misma cadena de polipéptidos después de unido con un enlace corto al ADN, el que codifica para un péptido flexible. Este ensamblaje genera un fragmento Fv de cadena simple (ScFv) el que incluye el dominio de unión antígeno completo al anticuerpo. Usando el sistema de selección dirigido al antígeno, se selecciona el ScFv con la característica de unión equivalente a aquel anticuerpo monoclonal original [ver, por ej. McCafferty, J, et al., Nature, 348: 552-554 (1990); Clackson, T., et al., Nature, 352: 624-688 (1991). El ScFv recombinante incluye un número de epítopes considerablemente más pequeño que el anticuerpo monoclonal intacto, y representa un estímulo inmunogénico mucho más débil cuando se inyecta en seres humanos. Una inyección intravenosa de ScFv en seres humanos, por tanto se espera que sea más eficiente e inmunológicamente tolerable en comparación con anticuerpos monoclonales enteros actualmente usados [Norman, D.J., et al., Transplant Proc., 25, suppl. 1: 89-93 (1993).

Sondas de Nucleótidos

Las sondas de nucleótidos pueden ser usadas para seleccionar la expresión de la napsina o los tipos y/o las proporciones de isoformas presentes. Estas pueden ser las secuencias de ADNc o de otras moléculas diseñadas sobre la base de las secuencias reportadas aquí, o las que son obtenidas usando técnicas estándares de librerías generadas de diferentes tipos de células o especie. Se comprende que mientras la secuencia reportada aquí sea de origen humano, las mismas proteasas estarán presentes en las otras especies de animales, y variarán hasta cierto punto en ambas secuencias de aminoácidos y en la secuencia de nucleótidos. La Napsina esta referida aquí, como una proteasa aspártica que tiene la secuencia de aminoácidos que ocurre de forma natural en el ser humano u otros animales, o una secuencia compuesta construida por la sustitución de aminoácidos de una especie dentro de otra, en la posición equivalente, u otro sitio activo, discutido arriba. Una molécula de nucleótidos que codifica para la napsina puede estar existiendo de forma natural, como se describe aquí, o diseñado y hecho sintéticamente sobre la base de la secuencia de aminoácidos. Además, debido a que al menos dos isoformas han sido identificadas, se espera que isoformas adicionales sean encontradas en tejidos aparte del riñón o el hígado. Estas isoformas son incluidas dentro del término "napsina".

Las moléculas de nucleótidos pueden ser usadas para determinar cantidad, el tipo o una combinación de esta, usando técnicas de diagnóstico estándares. En general, las sondas incluirán un segmento de un ADN que codifica al menos catorce nucleótidos de napsina, que deben ser suficientes para proporcionar la especificidad bajo las condiciones de hibridación estándares, y aun más bajo condiciones severas. Las condiciones de reacción para la hibridación de una sonda de oligonucleótidos o plantilla para una secuencia de ácido nucleicos que varía de oligonucleótido a oligonucleótido, dependiendo de los factores como la longitud del oligonucleótido, el número de nucleótidos G y C, y la composición del tampón utilizado en la reacción de hibridación. Las condiciones de hibridación medianamente severas son generalmente comprendidas por aquellos expertos como condiciones aproximadamente de 25ºC por debajo de la temperatura de fusión de un ADN doble hebra perfectamente pareado. La especificidad más alta se alcanza empleando condiciones de incubación que tienen más altas temperaturas, en otras palabras, condiciones más severas. En general, el largo de la secuencia o el mayor contenido de C y G, requiere la mayor temperatura y concentración de sal. Capítulo 11 del Manual del laboratorio de Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1990), describe las condiciones de hibridación para sondas de oligonucleótidos y plantilla en gran detalle, incluyendo una descripción de los factores y el nivel de severidad necesaria para garantizar la hibridación con la especificidad. Por debajo de 10 nucleótidos los sistemas hibridizados no son estables y empezarán a desnaturalizarse más arriba de 20ºC. Por arriba de 100,000 nucleótidos, uno descubre que la hibridación (renaturalización) se hace un proceso mucho más lento e incompleto, como se describe en el texto MOLECULAR GENETICS, Stent, G.S. and R. Calender, pp. 213-219 (1971). Idealmente, la sonda debe ser de 20 a 10,000 nucleótidos. Secuencias de nucleótidos más pequeñas (20-100) se prestan a la producción por técnica de síntesis orgánica automática. Las secuencias de nucleótidos de 100-10,000 pueden ser obtenidas desde tratamientos de endonucleasas de restricción adecuada. El marcaje de las sondas más pequeñas con la parte quimioluminicente relativamente voluminosa puede en algunos casos interferir el proceso de hibridación.

Marcajes

Ambas moléculas de nucleótidos y anticuerpos pueden ser marcadas con las técnicas estándares, por ejemplo, con marcadores radioactivos, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscente, tinturas, enzimas, y otros medios para la detección, como partículas magnéticas. Por ejemplo, marcaje selectivo del sitio activo con fluoresceína puede ser llevado a cabo por el método de Bock (Bock, P.E. (1988) Biochemistry 27, 6633-6639). En resumen, un agente bloqueador reacciona con la enzima durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la diálisis, la enzima covalentemente modificada se incuba a temperatura ambiente durante una hora con 200 \muM de 5-(iodoacetamido) fluoresceína (Sensores moleculares). Fluoresceína libre es eliminada por gel filtración en una columna P-10 (Pharmacia). Con este método, cada molécula de enzima fluoresceinada contiene una sola tintura en el sitio activo y por lo tanto todas las moléculas fluorescentes actúan de forma idéntica. Por otra parte, yodo gen (Pierce) puede usarse en la enzima radiomarcada con Na[^{125}I] (Amersham) de acuerdo con el protocolo del artículo de fabricación. El ^{125}I libre puede ser eliminado por gel filtración en una columna P-10.

Proteínas recombinantes

Proteínas recombinantes, y fragmentos de estas, son útiles como controles en los métodos de diagnósticos. El ADNc y las secuencias de genes de Napsina A fueron determinadas. El ADN fue expresado en un sistema recombinante (línea celular humana) y la actividad de la enzima caracterizada. El ADNc y la secuencia del gen de napsina B fueron determinadas. Las proteínas pueden ser usadas como estándares, o como fue discutido debajo, terapéuticamente como proteasas aspárticas y en estudios del comportamiento de la enzima. La expresión de proteínas recombinantes desde un ADNc sin codon de parada puede ofrecer ciertas ventajas.

Procedimientos de aislamiento de Napsina

Sondas de nucleótidos y anticuerpos son principalmente útiles en la detección de napsina, o sus isoformas. En algunos casos podría ser también útil para aislar la proteína purificada. Como se describe arriba, un procedimiento que fue creado para unir Napsina A y Napsina B a una columna de afinidad - pepstatina. Pepstatina inmovilizada puede ser usada para purificar napsina, natural, o recombinante, desde tejidos en los que se expresa, para aplicaciones diagnósticas.

B. Aplicaciones de enzima

Las proteasas aspárticas podrían ser útiles en aplicaciones similares a éstas en el que es usada Catepsina D. Clínicamente, podría ser ventajoso para transfectar, incluso temporalmente, el gen que codifica napsina para tratar los trastornos en los que la persona es deficiente en la proteasa, o transfectar a una antisonda, dirigida a ribozima o secuencia guía de ribozima, o triple hélice para prevenir o reducir la expresión de la enzima, en personas con los trastornos caracterizados por el elevado nivel de enzima.

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Referencias citadas en la descripción Este listado de referencias citadas por el solicitante tiene como único fin la conveniencia del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. Aunque se ha puesto gran cuidado en la compilación de las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP rechaza cualquier responsabilidad en este sentido. Documentos de patentes citados en la descripción

\bullet US 9721684 W

\bullet US 60031196 B

\bullet US 60046126 B

Literatura no relacionada con patentes citada en la descripción

\bulletTANG; WONG. J. Cell. Biochem., 1987, vol. 33,53-63

\bulletTANG et al. Nature, 1978, vol. 271, 618-621

\bulletSAMLOFF. Gastroenterology, 1989, vol. 96,586-595

\bulletMIKI et al. Jpn. J. Cancer Res., 1993, vol. 84,1086-1090

\bulletROCHEFORT. Acta Oncologica, 1992, vol. 31,125-130

\bulletDEFIZE et al. Cancer, 1987, vol. 59, 952-958

\bulletMIKI et al. Adv. Exp. Med. Biol., 1995, vol. 362,139-143

\bulletBROWN et al. Handbook of Hypertension. ElsevierScience Publishers, 1983, vol. 1, 278-323

\bulletADAMS et al. Science, 1991, vol. 252, 1651-1656

\bulletKIM et al. Nucl. Acids Res., 1992, vol. 20, 1083-1085

\bulletDAUGHERTY et al. Nucl. Acids Res., 1991, vol. 19,2471-2476

\bulletCLACKSON, T. et al. Nature, 1991, vol. 352,624-688

\bulletKABAT, H.A. et al. Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest. U.S. Dept. Health and HumanServices, 1987

\bulletDAUGHERTY, B.L. et al. Nucl. Acids Res., 1991, vol. 19, 2471-2476

\bulletMCCAFFERTY, J. et al. Nature, 1990, vol. 348,552-554

\bulletNORMAN, D.J. et al. Transplant Proc., 1993, vol. 25(1), 89-93

\bulletSAMBROOK et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORYMANUAL. Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1990

\bulletSTENT, G.S.; R. CALENDER. MOLECULAR GENETICS, 1971, 213-219

\bulletBOCK, P.E. Biochemistry, 1988, vol. 27, 6633-6639

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Oklahoma Medical Research Foundtion

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(ii): TITULO DE LA INVENCIÓN: Clonaje y caracterización de Napsina

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 14

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(iv): DIRECCIÓN CORRESPONDIENTE:

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(A): DIRECCIÓN: Patrea L. Pabst

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(B): CALLE: 2800 One Atlantic Center, 1201 W. Peachtree St.

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(C): CIUDAD: Atlanta

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(D): ESTADO: GA

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(E): PAÍS: USA

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(F): ZIP: 30309-3450

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(v): FORMA DE LECTURA EN COMPUTADORA:

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(A): TIPO MEDIO: disco Floppy

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(B): COMPUTADORA: PC compatible IBM

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Version #1.25

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NUMERO DE SOLICITUD: PCT/US 97/21684

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 20-NOV-1997

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(vii): DATOS DE LA SOLICITUD DE PRIORIDAD:

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(A): NUMERO DE SOLICITUD: US 60/031,196

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 20-NOV-1996

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(vii): DATOS DE LA SOLICITUD DE PRIORIDAD:

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(A): NUMERO DE SOLICITUD: US 60/046,126

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-MAY-1997

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(viii): INFORMACIÓN DEL AGENTE:

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(A): NOMBRE: Pabst, Patrea L.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 31,284

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(C): NÚMERO DE ROTULO REFERENCIA/: OMRF 166

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(ix): INFORMACIÓN TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 404-873-8794

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: 404-873-8795

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.1

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1353 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TRENZADO: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No.1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 451 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TRENZADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No:2:

3

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No.3

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1651 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TRENZADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO:3:

5

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1910 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TRENZADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

7

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No.5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 420 amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: amino ácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TRENZADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No.5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No.6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 419 amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: amino ácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TRENZADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No.6:

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No.7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 412 amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: amino ácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TRENZADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No.7:

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\vskip1.000000\baselineskip

13

14

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No.8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 445 amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: amino ácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TRENZADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No.8:

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No.9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TRENZADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N. 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGGCACACT GAAGAAGTGG CATCTCC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No.10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TRENZADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No. 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTTTGAGCA AGTTCAGCCT GGTTAAG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No.11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 pares bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TRENZADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No. 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGCTTATGT CTCCACCACC GCTGCTGCTA CCCTTGCTGC

\hfill

40

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No.12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 42 pares bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TRENZADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No. 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGCTTTTAT TTTTTTTTTT TTTTTTTTCAA TGGAAATATT GG

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No.13:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 50 pares bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TRENZADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No. 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGGGCGAGC GCGCGCCAGT CCCACTCGTGTG CGCCGCTCTT CATGTCCCCG

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No.14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 50 pares bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TRENZADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No.14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATCCCCTC AGTAGGTTCA GGGTCCTGCG TCCAGGGTGG ACTTGACGAA

\hfill

50

Claims

1. Un anticuerpo inmunoreactivo específicamente sea con una o ambas 1) una napsina que tiene la secuencia de aminoácidos de -64 a 375 ó de 1 a 375 de H-napsina de la figura 2A a 2C y 2) una napsina que tiene la secuencia de aminoácidos de la figura 4A a la 4F, o de los aminoácidos de la figura 4A a la 4F desde la secuencia SPGDK
PIFVPLSNYR hacia adelante, en el que el anticuerpo es capaz de unirse a un epítope que consta de la secuencia de aminoácidos MKSGARVGLARARPRG.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo marcado.

4. El anticuerpo de la reivindicación 3, en el que el anticuerpo marcado es marcado con radioactividad, con marca fluorescente, con marca quimioluminescente, tintura o enzima.

5. Un método para detectar una napsina en una muestra, método que consta de los pasos de:

(a): poner en contacto la muestra con el anticuerpo de la reivindicación 3;

(b): permitir que el anticuerpo se una a la napsina; y

(c): detectar el anticuerpo marcado.

6. Un método para aislar la napsina de una muestra, que consta de los pasos de:

(a): poner en contacto la muestra con el anticuerpo de la reivindicación 1;

(b): permitir que el anticuerpo se una a la napsina; y

(c): separar el anticuerpo de la muestra.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, en el que la muestra es una muestra de tejido humano.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, en el que dicha muestra es una muestra de línea celular.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, en el que dicha muestra es una muestra de una línea celular humana.