JPH01500640A - 組織型及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子インヒビターをコードする遺伝子 - Google Patents

組織型及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子インヒビターをコードする遺伝子

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組織型及びウロキナーゼ型のプラスミノーゲン活性化因子のインヒビターの診断 法と、そのインヒビターをコードする遺伝子（関連出願） 本出願は１９８４年６月２２日に登録された、出願番号６２３．３５７号の継続 出願であり、その公開は参考文献として、本出願に組込んでいる。
（技術的分野） 本発明は、プラスミノーゲン活性化因子を認識し、そして、選択的に結合するレ セプター及び指示手段を含む生化学的試薬システム、及びさらに特別な場合には 、実質的に純粋な形の、ヒトのベータ移動性内皮細胞プラスミノーゲン活性化因 子インヒビターに対してと同様、血液又は、その他の生物学的試料における、ベ ータ移動性内皮細胞プラスミノーゲン活性化因子インヒビターの検出及び定量の ための生化学試薬及び診断システム及びその遺伝子に関するものである。
（本発明の背景） 内皮細胞は、血管のルミノール面に配列し、局所的に存在するフィブリンの特異 的タンパク質分解に活発な役割を果すと考えられている、トッド（Ｔｏｄｄ）　 、ジャーナル・オフ・バンロンカル・バクテリオロジ−（Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、７８巻、２８１頁（１９５９年）、アストラップ（Ａ ｓｔｒａｐ、　）プログレス・イン・ケミカル・フィブリツリシス　アンド　ス ロムボリシス（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙ ｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｓｂｏｌｙｓｉｓ）、ダビッドソン（Ｄａｖｉｄｓｏ ｎ）等線、３巻、１〜５７頁、シーペン・プレス（ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ）、ニ ューヨーヨ（１９７８年）。このプロセスを開始し、そして制御する、内皮細胞 の能力とは、プラスミノーゲン活性化因子（ＰＡｓ）を合成し、そしてこれを放 出する能力で代表され（ロスコトフ（Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ）等、プロシーディン グ・イン・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　５ｃｉ）ＵＳＡ、７４巻、３９０３頁（１９７７年）ニジニブｏ 　（Ｓｈｅｐｒｏ）、等、ＸＯンボ・リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、）　 １８巻、６０９頁（１９８０年）；モスカテリ（Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ）等、セ ル（Ｃｅ１１）、２０巻、３４３頁（１９８０年）；ラウグ（Ｌａｕｇ）　、ス ロンボ・ヘモスタシス　（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）、４５巻 、２１９頁（１９８１年）；ボーイス（Ｂｏｏｙｓｅ）等、スロンボ・リサーチ （Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、）、２４巻、４９５頁（１９８１年））、組織型及 びウロキナーゼ型の分子が含まれている（レビン（Ｌｅｖｉｎ）等、ジャーナル ・オフ・セル・バイオロジー（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）、９４巻、６３１ 頁（１９８２年）；ロスクトフ（Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ）等、ブラッド（Ｂｌｏｏ ｄ）　、６２巻、６２頁（１９８３年）。また内皮細胞は、繊維素溶解のインヒ ビターを産生ずる（ロスクトプ（Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ）等、プロシーディング・ イン・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、５ｃｉ）　Ｕ　Ｓ　Ａ、　７４巻、３９０３頁（１９７７年）；レビ ン（Ｌｅｖ　ｉｎ）等、スロツプ、リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂ。
Ｒｅｓ、　）、１５巻、８６９頁（１９７９年）；ロスクトフ（Ｌｏｓｋｕｔｏ ｆｆ）等、ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、　）、２５６巻、４１４２頁（１９８１年）；ドスネ（口ｏｓｎｅ） 等、スロツプ、リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、）、１２巻、３７７頁（１ ９７８年）；エミイス（εｍｅｉｓ）等、バイオケム・バイオロジー・レス・コ ミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。
Ｃｏｍ５ｕｎ、　）、１１０巻、３９２頁（１９８３年）：ロスクトフ（Ｌｏｓ ｋｕｔｏｆｆ）等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オフ・ サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ）　Ｕ　Ｓ　Ａ、　８０ 巻、２９５６頁（１９８３年）；レビン（Ｌｅｖｉｎ）プロシーディング・イン ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、５ｃｉ）Ｕ　Ｓ　Ａ、　８０巻、６８０４頁（１９８３ 年）。
これらインヒビターは、おそらく、血管壁の繊維素溶解システムの制御において 、重要な制御的役割を果たしているのであろうが、それらの特異性、作用モード 、又は生化学的性質はほとんど知られていない。これらのインヒビターが内皮細 胞によって、実際に合成されるという結論は、培養細胞が血清含有培養培地由来 −ションを起こすという最近の報告により、いくぶん不明瞭なものになった（シ ーエン（Ｃｏｈｅｎ）　、ジャーナル・オフ・クリニカル・インペスチゲーショ ン（Ｊ、　Ｃｈｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　）　５２巻、２７９３頁（１９７３年 ）；パスタン（Ｐａ５ｔａｎ）等、セル（Ｃｅｌｌ）　、１２巻、６０９頁（１ ９７７年）：ローリッチ（Ｒｏｈｒｌｉｃｈ）等、ジャーナル・オフ・セル・フ ィジオロジ−（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）　１０９巻、１頁（１９８ １年）：マクファーソン（Ｍｃｐｈｅｒｓｏｎ）等、ジャーナル・オフ・バイオ ロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、）２５６巻、１１ ３３０頁（１９８１年）。
１９８３年１１月２３日公開された英国特許出願ＧＢ２、１１９．８０４号で報 告されている、組換えＤＮＡ技術による組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ −ＰＡ）を比較的に無制限量産生する可能性は、臨床的にも商業的にも興味深い 。相対的に不活性な分子を、フィブリン自体により、非常に有効なトロンポリチ ック試剤への転換は、フィブリン−血小板血栓それ自体に局在化するときのみ、 ｔ−ＰＡが活性酵素として存在しうることを示している。このようにｔ−ＰＡは 、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びストレプトキナーゼよりも、 より時異性の高いトロンポリチック試剤であると考えられている。
ｔ−ＰＡ及びフィブリンの相互作用は、ｔ−ＰＡの天然のインヒビターがこのシ ステムを制御するのに必要ない、すなわち、その制御は、フィブリンの生成／分 解を通して行なわれ、ｔ−ＰＡは存在しないという議論を引き起こした。ヒトの 血液中に、そのようなインヒビターが存在することは、天然の及び遺伝子工学的 に作ったｔ−ＰＡに基づく、特異的、有効な、そして安全なトロンボリチフクプ ログラムの設計する試みを複雑なものにしている。
最小限の、これらの投与量、治療時間及び治療の効果を、予想、そして、または 、モニターするのが困難となっている。この問題は、そのインヒビターレベルが 個人個人具なる場合、特に厳しいものとなる。血漿中にｔ−ＰＡの特異的インヒ ビターが存在するということについては、議論の余地がある（コレン（Ｃｏｌｌ ｅｎ）、スロンボ、ヘモスタス（Ｔｈｒｏｓｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　）　 ４３巻、７７頁（１９８０年））、事実血漿に入れたｔ−ＰＡの活性の寿命は、 生体中での寿命２分間に対しくシーニンガ−（Ｋｏｒｎｉｎｇｅｔ）等、スロム ボ、ヘモスタス（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、）　、４６巻、６５８ 頁（１９８１年））、９０分間であることが報告されている（シーニンガー（Ｋ ｏｒｎｉｎｇｅｒ）等、スロムボ、ヘモスタス（Ｔｈｒｏｓｂ。
Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、）　、４６巻、６６２頁（１９８１年）、これらの観察に 基づいて、これらの著者等は、血漿によるｔ−ＰＡの阻害は、生理学的に重要な ものではないと結論づけた。
この結論は最近、クルイソフ（Ｋｒｕｉｔｈｏｆ）等（プログレス・イン・フィ ブリツリシス（Ｐｒｏｇ、　ｉｎ　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）　６巻、３６２ 頁（１９８３年））によって挑戦を受けた。クミエレウスカ（Ｃｈｓｉｅｌｅｗ ｓｋａ）等（スロムボ・リサーチ（Ｔｈｒｏｓ＋ｂ、　Ｒｅｓ、）　３１巻、４ ２７頁（１９８３年））の報告において、血漿におけるｔ−ＰＡの迅速な阻害の 存在の直接的証拠が報告された。全ての場合において、この抗−ｔ−ＰＡ活性は 、患者の血漿中に検出され、血栓症の問題へと発展していく、すなわちほとんど の患者がｔ−ＰＡ治療を受けたいのである。この知見は、シーニンガー等が、“ 正常な”個体の細胞質のみを試験したので、そのような活性を検出できなかった ことを説明している（シーニンガ−（Ｋｏｒｎｉｎｇｅｔ）等、スロンボ、ヘモ スタス（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅａ＋ｏｓｔａｓ、）　、４６巻、６６２頁（１ ９８１年）、ｔ−ＰＡインヒビターに関するこれらの報告は、何人かの個体の血 液中に検出される“活性”の定量的記述については、何もふれていない。
最近、培養したウシの内皮細胞における、抗ｗＡ維素溶解試剤が検出された（ロ スクナフ（Ｌｏｓｋｎｔｏｆｆ）等、プロシーディング・イン・ナシヨナル・ア カデミ−・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、　５ｃｉ）ＵＳＡ、　８　ＯＳ、　２９５６頁（１９８３年）、この インヒビターは主要な内皮細胞産物であり、それがフィブリン・独立（ウロキナ ーゼ型）及びフィブリン依存（組織型）の両方のプラスミノーゲン活性化因子（ ＰＡｓ）を中和できることから、プラスミノーゲン活性化因子のインヒビターで ある。ヒトの血小板は、生理学的に関連した刺激、例えば、スロツビンに応答し て、それらから、他の血小板タンパク質、（例えば、血小板ファクター４）と平 行して放出される免疫学的に同じインヒビターを含む（エリクソン（Ｅｒｉｃｋ ｓｏｎ）等、ヘモスタシス（Ｈａｅｓｏｓｔａｓｉ）、１４巻（１）、６５頁（ １９８４年）及びジャーナル・オフ・クリニカル・インベスチゲーシコン（Ｊ、 　Ｃｈｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、）　？　４＠、１４６５頁（１９８４年）という 観察は、ヒトの生物学におけるこのインヒビターの潜在的な重要性を強調してい る。ウシの大動脈の内皮細胞（ＢＡＥｓ）由来のプラスミノーゲン活性化因子イ ンヒビター（ＦＡＩ）に対する抗血清は、ヒトの内皮ＰＡＩが、細胞質、血清、 血小板由来のものと同様、免疫学的に同じであることを示すのに用いられてきた （エリクソン（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ）等、プロシーディング・イン・ナシヨナル・ アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、　８２巻、８７１０頁（１９８ ５年）。
ロスクトフ（Ｌｏｇｋｎｔｏｆｆ）等（プロシーディング・イン・ナシヨナル・ アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、）ＵＳＡ、８０巻、２９５６頁（１９８３年））により発見されたインヒビタ ーは、コンカナバリンＡアフィニティークロマトグラフィーと、分取ドデシル硫 酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を組合せ ることにより、ウシの大動脈内皮細胞培養培地から精製し、等電点４．５〜５の 、分子量ｓｏ、ｏｏｏダルトンを有する一本鎖のグリコプロティンであることが 示された（ヴアン・モウリク（ｖａｎ　Ｍｏｕｒｉｋ）等、ジャーナル・オフ・ バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｍ、）　２５９巻 、１４９１４頁（１９８４年））。
最近、三種の免疫学的に異なるプラスミノーゲン活性化因子インヒビターが存在 することが証明された。第１のものは、内皮細胞から始めて誘導された、先に議 論したものである。第２のものは、アステッド（Ａｓｔｅｄｔ）等（スロンボ、 ヘロスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ。
Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ　）　５３巻、１２２頁（１９８５年）により報告され た、胎盤から単離したものである。第３のものは、スコツト（Ｓｃｏｔｔ）等（ ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｗ、）　２６０巻、７０２９頁（１９８５年））により報告されたプロテアーゼ ・ネキシンである。
内皮細胞型のＰＡＩは、免疫学的なものに加え、これが、ウロキナーゼ型プラス ミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）と同様、１本鎖及び２本鎖の組織型プラスミ ノーゲン活性化因子も阻害し、一方、プロテアーゼ・ネキシン及び胎盤ＦＡＩは 、生理学的濃度で実質的なｔ−ＰＡ阻害を示さない点で、胎ＱＡＰＩ及びプロテ アーゼネキシンと異なる。後者の二つのインヒビターは、生理学的濃度では、ｕ −ＰＡ活性を阻害しない、さらに、アガロース・ゾーン電気泳動で分析すると、 内皮ＰＡＩはベーター移動を示すが、他の２つのＦＡＩは示さない、加えて、内 皮細胞ＦＡＩが、低ｐｉ値（例えばｐＨ３）及び５ＤＳ（０，１％）に対し安定 である一方、他の２つのインヒビターは、これらいずれの処理においても、すみ やかに失活する（ヴアン・モウリク（ｙＨＭｏｕｒｉｋ）等（ジャーｆ）し・オ フ・バイオロジカｌし・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ鍋、）２５９ 巻、１４９１４頁（１９８４年））。
これまでに！ｉｉ論してきた結果は、ベータ移動を示す内皮細胞型ＰＡＩは、ア ステッド（Ａｓｔｅｄｔ）等（スロンボ、ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｓｂ、　Ｈａ ｅｍｏｓｔａｓｉｓ　）　、５３巻、１２２頁（１９８５年））により報告され た胎盤ＦＡＩと同様、ヒトの胎盤抽出物中にも存在する。２つの型のＦＡＩが、 胎盤から入′手できるので、内皮細胞ＦＡＩとこれまで呼んできたヒトのＰＡＩ は、通常、ベーターＰＡＩ、又は、内皮ＰＡＩ、又は内皮細胞型ＰＡＩと呼び、 一方、胎盤から初めに単離されたＦＡＩは、胎盤型ＰＡＩ又は胎盤ＰＡＩと呼ぶ 。
（発明の概要） 本発明は、生化学的試薬システム及びこれを調製及び利用する方法、その試薬シ ステムを利用した診断法、ＰＡＩの検出法、ヒトの内皮細胞型プラスミノーゲン 活性化因子インヒビターと免疫学的に同等で、ヒトのベータ移動、内皮細胞プラ スミノーゲン活性化因子インヒビターへ結合し、その活性を阻害する、実質的に 純粋な＆Ｉｌ換えタンパク質性分子及びその遺伝子について考えられている。
その生化学的試薬システムには（ａ）動物宿主において、内皮細胞プラスミノー ゲン活性化因子インヒビターに対し生じる抗体のようなレセプター、すなわち、 抗プラスミノーゲン活性化因子インヒビター及び−）、指示手段が含まれる０本 発明の一面において、その生化学試薬システムは、（ａ）動物宿主において生ず る、ポリクロナール抗体となりうるレセプター及び、伽）指示手段を含む、その 指示手段及びレセプターは単一の分子でもありうるし、また、個々の分子かた（ さん集ったものから成ることもある。そのレセプターは、それ自身組織型又はウ ロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に結合し、かつ阻害する内皮細胞（ベ ータ移動）プラスミノーゲン活性化因子インヒビターに結合する。その指示手段 はそのレセプターを標識し、そして、そうすることにより、血栓症の患者の血清 のような、検定する試料中にインヒビターが存在するかどうかを知らせる０本発 明の試薬システムのレセプターは、選択的に、組織型（ｔ−ＰＡ）又はウロキナ ーゼ型（ｕ−ＰＡ）のプラスミノーゲン活性化因子と結合する内皮細胞プラスミ ノーゲン活性化因子インヒビターと結合する。
本発明の別の一面では、生化学的試薬システムで使用するポリクローナルレセプ ターの生成法も考えている。その方法には、（ａ）動物宿主に、そのインヒビタ ーのレセプターとなる、抗体の産生を誘導するのに十分な量の内皮細胞型プラス ミノーゲン活性化因子インヒビター（ＦＡＩ）を投与し、−）その免疫化した動 物から、その抗体を含む抗血清を採集し、Ｉｃ）その抗血清からそのレセプター を回収する、ステップから成る。
また、本発明のもう１つの面は、生化学試薬システムを作る方法に関連している 。この方法には、上述の１Ｍ）〜（Ｃ１のポリクローナルレセプターの生成ステ ップに加え、そのレセプターを指示手段と合せるステップ（ｄ）から成っている 。
上述の両方法とも、ステップ（ａ）及び宿主の十分なインキエベーシッン、例え ば１〜２週間後で、しかも、ステップ（ｂｌ前に抗体の産生を誘導するための、 同インヒビターの二次接種を宿主に与えることも可能である。
また本発明は、上述の方法で産生ずるポリクローナルレセプターについても考え ている。
本発明の別の面では、検定試料中の内皮細胞型プラスミノーゲン活性化因子イン ヒビターの存否及び存在量を検出する固相検定法についても考えている。この方 法は、（ａｌ試料をその上で検定する固体マトリックスを準備する、偽）、ｔ− ＰＡ及びｕ−ＰＡ又は、上述のポリクローナルレセプターを含む群から選ばれた プラスミノーゲン活性化因子であり、そのインヒビターと結合（複合体形成）す る結合試薬をその固体マトリックスに固定し、固相サポートを作る、（Ｃ）、そ の固相サポートに、検定する液体試料の部分標本を加え、固液相混合物を作る、 （ｄｌその結合試薬が、試料中のプラスミノーゲン活性化因子インヒビターと結 合するのに十分な、予め決めた時間、その混合物を維持する、（ｅｌ、固相と液 相を分離する、（ｆ）その結合試薬に結合（と複合体形成）したインヒビターの 存在を測定する、ステップから成り立っている。
好ましい態様においては、その結合試薬に結合したインヒビターの量は、（ｉ） 、上述のステップ（ｅ）の後に得られる固相に、インヒビターと複合体を作り、 固体サポート上に結合したインヒビターと結合する第２の結合試薬の水溶液を混 合する、（ｉｉ　）その第２の結合試薬がインヒビターと結合（複合体を形成） するのに十分な、予め決められた時間（典型的には約２〜約４時間）、その第２ の固液混合物を維持する、（ｉｉ　）その第２の固−液相混合物を固相と液相に 分離する、（ｉｖ）、そのインヒビターに結合した第２の結合試薬の量を測定し 、それにより、インヒビターの量を決定する、ことにより測定する。
本発明は、キットとしての哺乳類診断システムを含んでいる。
そのキットは、活性成分として、本発明の生化学試薬システム及びｔ−ＰＡ又は ｕ−ＰＡを含む少なくとも１つのパフケージを含む、その生化学的試薬システム は、指示手段及び検定試料と混合したとき、試料中に存在する内皮プラスミノー ゲン活性化因子インヒビター（ＦＡＩ）と選択的に結合し、そのインヒビターの 存在及び存在量を指示する、乾燥、溶液、分散形のポリクローナルレセプターを 含んでいる。このシステムに含まれうる指示グループには、放射性元素、生物学 的に活性な酵素又は、ＮＭＲ活性元素が含まれる。
また診断システムは、−列に１２ウエルあるマイクロタイターストリップの固体 マトリックスも含まれる。存在するｔ−ＰＡ又はｕ−ＰＡも、その固体マトリッ クスに選択的に結合する。
さらにその診断システムは、ウェル洗浄用、試料希釈用、又は標識試薬希釈用の 乾燥又は液体型の種々のバッファと同様に、その検定結果を比較するための標準 物質も含んでいる。
本発明の生化学試薬システムの使用には、組織型又は、ウロキナーゼ型のプラス ミノーゲン活性化因子のようなプラスミノーゲン活性化因子と結合（複合体形成 ）する特異的なプラスミノーゲン活性化因子インヒビターの検出及び定量が含ま れている。このような試薬システムの特に好ましい使用は、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での操作法におけるプラスミノーゲン活性化因子インヒビターの検 出に関連している。
また、本発明のもう１つの一面としては、実質的に純粋な、組換えタンパク質性 分子である、ヒトの内皮細胞型プラスミノーゲン活性化因子インヒビターと免疫 反応を起こす抗体がある。さらに好ましくは、その組換え分子も、少なくともｔ −ＰＡに結合し、その活性を阻害し、最も好ましくは、ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡの 両方に結合し、それらの活性を阻害する。その組換え分子はプロテアーゼ・ネキ シン及び胎盤ＦＡＩと免疫学的に異なる。１つの態様においては、その組換え分 子は、実質的に、ポリペプチド結合のグリコジル基を含まず、別の態様において は、そのインヒビターは、ポリペプチド結合のグリコジル基を含む、１つの非グ リコジル化した態様においては、その組換え分子は、融合ポリペプチドとして、 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、約１８０キロダルトン（ｋｄａ）の見かけ上の相 対分子量（Ｍｒ）を示し、一方、他の非グリコジル化した態様においては、その Ｍｒは約４０ｋｄａであった。
上述の議論から、その組換え分子は、天然のヒトの内皮細胞型ＰＡＩの生物学的 全活性を有する必要でぼないことが分る。その分子は、本来のものと同等の活性 をもち、そして、少なくともｔ−ＰＡに結合し、その活性を阻害することが望ま れる一方、その組換え分子は、天然のタンパク質と免疫学的に同じこと及び天然 のタンパク質と交叉反応を起こすレセプター分子の分泌を誘導する能力（以後議 論する）のため、有用である。
本発明の別の一面としては、約１１４０〜約３０００ヌクレオチドから成り、そ して、ヌクレオチド部位１３から約１１５３の、図２２の式で表わした配列に対 応する、左から右へ、５′末端から３′末端のの方向に示したヌクレオチド配列 を、ヒトの内皮細胞型プラスミノーゲン活性化因子インヒビターをコードする読 み枠と一致して含んでいる、生物学的に純粋なりＮＡ分子がある。
別のＢ様においては、そのＤＮＡ分子配列は、部位ｌから約１９６０のものに対 応している。また別の態様においては、そのＤＮＡ分子配列は、部位１から約１ １５３までのものに対応している。また他の態様においては、そのＤＮＡ配列は 、図２２に示されている、全ＤＮＡ配列に対応している。
複製／発現培地中でＤＮＡをクローニングするための非染色体ベクターは、その 培地にかなうレプリコンを含み、前述のＤＮＡ分子を含むことから、そのベクタ ーは、そのＤＮＡ分子を増殖することができる。さらに好ましいことにそのベク ターは、そのＤＮＡ分子の５′末端に隣接して、そのＤＮＡと機能的に結合し、 かつ、組換え、ヒト内皮細胞型プラスミノーゲン活性化因子インヒビターを含む ＤＮＡ分子によりコードされる産物を発現するための複製／発現培地にかなう転 写プロモーターを含む、さらに好ましくは、そのベクターは、各々含まれるＤＮ Ａ配列に隣接して５′末端及び３′末端に機能的に結合し、そのＤＮＡ分子によ りコードされる産物を発現するための複製／発現培地にかなう、翻訳開始コドン 及び翻訳終止コドンを含む。
検定試料中の、内皮細胞型ヒトプラスミノーゲン・活性化因子インヒビターの存 否及び存在量を検出する固相検定法は、本発明のもう１つの特徴を構成している 。ここで、固相サポートは、実質的に純粋な組換えタンパク質性分子（前述）を 固定化した固体マトリックスを含むよう作る。検定する液体試料の部分標本を、 固体サポートの組換え分子及び検定されるインヒビターの両方と結合（複合体形 成）する、予め決められた量の結合試薬と混合する。その混合物を、生物学的検 定条件下、その結合試薬が、試料中に存在するインヒビターと結合するのに十分 な、予め決められた時間維持する。そして、その混合物を、固体サポートと混ぜ 、固・液相混合物を作る。その後、固体及び液体相を分離し、固体サポートの組 換えインヒビターに結合した結合試薬量を測定する。
ある態様においては、その結合試薬は、組換えタンパク質性分子及びヒトの内皮 細胞型ＰＡＩの両方と免疫反応を起こすレセプター分子である。他の態様におい ては、その結合試薬はｔ−ＰＡ又はｕ−ＰＡである。
本発明は、いくつかの利点及び長所を提供している０本発明の利点の１つは、本 発明の生化学的試薬システム及び診断システムは、非常に特異性が高いことであ る。生物学的試料はしばしば多くの繊維素溶解インヒビターを含む、一般にこれ らの検定は、その試料の、プラスミノーゲン活性化因子又はプラスミンの活性を 減少する能力を測定するものなので、既存の検定法でそれらを区別することは困 難である。これに対し、本発明の好ましい診断システムは、特別なプラスミノー ゲン活性化因子に結合するインヒビターのみを検出し、そして、さらに、使用し た特異的抗血清により認識されるもののみを検出する。
本発明のもう１つの利点としては、本発明の試薬システムは、ＰＡに結合した機 能的に活性のあるインヒビター量を測定するもので、インヒビター活性を測定す るものではない、１つの態様が提供されているように、定量的であるということ である。それゆえ、その試薬システムは、例えば、酵素的検定のように、塩濃度 又はｐＨの変化で影響をうけを受けにくい０種々の病気において変化しやすいの は、機能的に活性のある型である。
内皮細胞及び胎盤から放出されるインヒビターには、２つの型、１つは活性型、 もう１つは不活性型がある。不活性型は、ＳＤＳ及びグアニジンのような変性剤 による処理により活性化することができる。このように、本発明の試薬及び診断 システムの長所には、それらが、種々の試料中の活性及び不活性型インヒビター の相対量を測定するのに用いることができることがある。
また本発明の利点として、それが、活性又は不活性の、存在する内皮細胞型プラ スミノーゲンインヒビターの全量を検定する手段を提供することがある。
また、本発明の長所には、本発明の診断システムは、マイクロプレートのウェル に結合した組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）又はウロキナーゼ型 プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）を用いることができ、そして、これに より、迅速で再現性のある、多数の試料をスクリーニングすることを容易にする ことがある。
本発明の他の長所及び利点は、本発明のひきつづく記述、図式及び特許請求の範 囲から、当業者にとって明白なものであろう。
（図面の簡単な説明） 図式は本発明の公開の一部を任っている。
図１は、調整培地（ＣＭ）のコンカナバリンＡ−セファロースによるアフィニテ ィークロマトグラフィーによる分画を示したグラフである。合せたウシの大動脈 内皮細胞（ＢＡＥｓ）由来のＣＭ１リットルをｌＯミリリットル（Ｉａｌ）のコ ンカナバリンＡ−セファロースカラムに、以後に詳しく述べるように通す。その カラムを、（ａ）　１　（−７１７（Ｍ　）　ＮａＣｊ！、（ｂ）０．００１Ｍ リン酸ナトリウム、（Ｃ）　０．５　Ｍアルファ・メチル・Ｄ・マンノシドを含 む０．０１Ｍリン酸ナトリウム及び（ｄ）　０．５　Ｍ・アルファ・メチル・Ｄ ・マンノンド及びＩＭＮａＣＩｌを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウムの順で洗浄 した。
挿入図は、貯留しておいた流出液（■）、アルファ・メチル・マンノシド低（Ｉ Ｉ）及び高（ＩＩ［）塩両分とともに、出発物質（ＣＭ）のタンパク質プロフィ ールを示したもので、全て、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル 電気泳動（５０５−ＰＡＧＥ）及びコマージ・ブリリアント・ブルー（バイオラ ド（ＢｉｏＲａｄ）　、リッチモンド、ＣＡ州）での染色の後、明らかになった ものである。
図２は、５ＤＳＰＡＧＥ後のコンカナバリンＡ画分■（上述）のインヒビター活 性の検出を示したグラフである。コンカナバリンＡピーク■物質（図１）を集め 、そして、以後に詳しく述べるチューブゲル中の５ＤＳ−ＰＡＧＥで分画した。
そのゲルをスライスし、各スライスを、パンノア中で溶出させ、その溶出物につ いて、１！Ｊ−フィブリンプレート法（後述）を用いて、ｕ−ＰＡ仲介繊維素溶 解活性の阻害能をテストした。挿入図は、スラブゲルの５ＤＳ−ＰＡＧＥで分画 し、コマージブリリアントブルーによる染色による分析、及びリバース・フィブ リン・オートグラフィーにより各々解析した、同試料のタンパク質プロフィール （レーン１）及びインヒビター活性を示している。
図３は、５ＤＳ−ＰＡＧＥによる精製したインヒビターの分析を示すリバース・ フィブリン・オートグラ′ムのフォトコピーである。インヒビター活性の大部分 １図２に示されているように両分４９〜５２）を含むゲル抽出物を集め、そして 、以後詳しく述べるように、７．５−２０パーセントの勾配スラブゲルで分析し た。
電気泳動後、そのゲルを、コマージ・ブリリアント・ブルー（レーン１）及び過 ヨウ素酸−シンフ試薬（レーン２）で染色し、もしくは、リバース・フィブリン ・オートグラフィーによりそのインヒビター活性を調べた（レーン３）。
図４は、ＢＡＥインヒビターによるＰＡ−活性の阻害を示すグラフである。精製 したインヒビターを増やしながら、ヒトのＵ−ＰＡ（０）又はｔ−ＰＡ　（・） ミリリットル当り２．５ユニツトと、３７℃、５分間プレインキュベートする　 ＋ｚｓ１−プラスミノーゲンを加え、そして、さらに６０分間インキュベートを 続ける。
その反応は、３パーセン１−３ＤＳ及び５パーセントの２−メルカプトエタノー ル存在下、その試料を１００℃、３分間加熱することで停止する　ｌ冨Ｊ−プラ スミノーゲンを、特徴的なヘビー及びライト鎖に切断する種々の試料の能力を、 ムソニ（Ｍｕｓｓｏｎｉ）等（トロンボ・リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、 ）　３４＠、２４１頁（１９８４年））の方法と同様に、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び オートラジオグラフィーで検定した。定量は、乾燥ゲルからＩｔＪ−プラスミノ ーゲン及びプラスミン鎖を切り出し、それらをガンマ計数器で計数することによ り行った。データは、インヒビター存否条件での、プラスミノーゲン切断率で表 わした。
図５は、１！５■標識したｔ−ＰＡのＢＡＥインヒビターへの結合を示すオート ラジオグラムのフォトコピーである　ＩＩＪＩＩＩしたｔ−ＰＡを精製したイン ヒビター（１マイクログラム／ミリリツトル）の非存在下（レーンｌ）又は存在 下（レーン２）で３７℃、３０分間インキュベートした０反応は、試料バッファ を加えることで停止し、そしてその試料を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオ グラフィーで分析した。
図６は、ＢＡＥインヒビターと、プロテアーゼネキシンの相対的安定性を示すグ ラフである。精製したインヒビター（２０マイクログラム／ミリリツトル）及び 精製したプロテアーゼ・ネキシン（１６０マイクログラム／ミリリツトル）を、 後で詳しく述べるように、（Ａ）ｐＨ２，７、又は（Ｂ）０．０２５パーセント のＳＤＳ検定検定バッファ存在下３７℃６０分間インキュベートする。その試料 を、３倍容の検定バッファを加えることにより中和し、検定バッファで希釈し、 １！５■−フィブリンプレート検定法（後述）により、残存するインヒビター活 性を調べた。コントロール実験として、ＰＢＳをグリシン及びＳＤＳと各々交換 して行った。データは、インヒビターを欠＜ｕ−ＰＡコントロールの割合として 表わしである。テストした試料は、未処理（○）及び処理済（・）プロテアーゼ ・ネキシン及び未処理（△）及び処理済（ム）　ＢＡＥインヒビターを含んでい る。
図７！ｔ、Ｌ　（３，４，５−”Ｈ）ロイシン標識コンカナバリン人分画■の５ ＤＳ−ＰＡＧＥを示すグラフである。そのコンカナバリンＡピーク■の部分標本 （２２５マイクロリツトル）を、チューブゲルの５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。電 気泳動後、そのゲルをスライスし、各スライスは、後に詳しく述べるように、バ ッファ中で抽出を行った。そのゲル抽出物について、Ｉｔ％ｌ−フィブリン・プ レート法によるインヒビター活性（・）及びシンチシーシッン計数による放射性 活性（○）について（後述）、テストを行った。
図８は、ＳＤＳゲルから抽出したＬ　（３，４，５−３Ｈ）ロイシン標識インヒ ビターのアルカリＰＡＧＥを示したグラフである。
５ＤＳ−ＰＡＧＥ後（図７に示したように、スライス抽出物５１〜５４）のイン ヒビター画分を集め、アルブミンを最終濃度１００マイクログラム／ミリリツト ルとなるように加え、そして、０．５パーセントのトリトンＸ−１００を含むＰ ＢＳに対して透析した。
それから、その試料をチューブゲルを用いたアルカリＰＡＧＥで分画し、図７で 述べたように放射性活性（０）及びインヒビター活性（・）の測定のための処理 を行った。
図９は、０Ｍ由来のインヒビターの免疫沈澱を示すオートラジオグラムのフォト コピーである。クローン化したＢＡＥ由来のＬ（３，４，５−’）Ｉ）ロイシン 標識ＣＮを、後で詳しく述べられているように、精製したインヒビターに対する 抗血清を含むプロティンＡ−セファロースビーズとインキュベートする。固定化 した複合体を、０．２５　Ｍ　）リス、２．２パーセントＳＤＳ、２．５パーセ ント（Ｖ／Ｖ）２−メルカプトエタノール、及び２０パーセントグリセリン（ｐ Ｈ６，５）を用い、３７℃、１時間インキュベーションして、そのビーズから抽 出した。その抽出物を、スラブゲルを用いた５ＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、オート ラジオグラフィーで調べた。レーン１は、出発物質（ＣＭ）、レーン２は免疫反 応上清、レーン３は、免疫沈澱を示している。矢印は、リバース・フィブリン・ オートグラフィーで明らかにされた、インヒビター活性の位置を示している。
１ｍ１Ｏは、種々の濃度のｔ−ＰＡでコートしたマイクロプレートウェルへの精 製したインヒビターの結合を示したグラフである。
ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）製プラスチックウェルをミリリットル当りマイクログ ラム単位で表わした、指示された濃度のｔ−ＰＡのリン酸８７７１食塩水（Ｐ　 Ｂ　Ｓ）溶液（ウェル当り５０マイクロリツトル）と、４℃で約１８時間インキ ュベートする、ウェルを洗浄し、子ウシ胸腺アルブミン（ＢＳＡ）でブロックし た後、希釈バッファ中の精製インヒビターと２時間インキュベートする；２０ナ ノグラム（ｎｇ）　／ａｔ、拳・・・・・・・；　５　Ｑｎｇ／ｍＡ！、　Ｏ・ ・・・・・Ｏ；　１００ｎｇ／ｓｊ、Δ・・・・・・Δ、ウェルを洗浄した後、 結合したインヒビターを、ウサギの抗インヒビターレセプター（ｌ：１００希釈 ）と３７℃で２時間インキュベートし、次いで、ｌ！８１−ヤギ抗ウサギＩｇＧ 　（１，５Ｘ　１０’　ｃｐｗｉ／ウェル）と、２時間インキュベートすること より検出した０個々のウェル中の結合した放射活性を、ガンマ線計数器で測定し 、結合したものの割合として示した。
図１１は、ｔ−ＰＡでコートしたウェルに結合するインヒビター速度論を示した ものである。ＰｖＣプラスチックウェルを、５０マイクロリツトルのｔ−ＰＡ（ ｌｏｇ／−ｆｆｉＰＢｓ、・・・・・・・・）又はＢＳＡ　Ｃｌｎｇ／ＩｌＩ　 ＰＢＳ、　Ｏ・・・−・−○）と、４℃で１晩インキュベートした。そのウェル を洗浄し、ＢＳＡでブロックし、そして希釈バッファ中、精製したインヒビター （１００ｎｇ／ｍｊｌ）と、示した時間、３７℃でインキュベートした。ウェル 洗浄後、結合したインヒビターは、図１０に示したように検出した。
図１２は、精製したインヒビターの検出に関する。第１もしくは、第２抗体のイ ンキュベーション時間の影響を示したグラフである。ｐｖｃプラスチックウェル を、ｔ−ＰＡ（黒）又はＢＳＡ（白）でコートし、洗浄、ブロック後、図１０に 述べたように、精製インヒビター（５０ｎｇ／ｍＡ）と１時間インキュベートし た。
そのウェルを、指示した時間、ウサギ抗インヒビターレセプター（Ｒｄ　α１ｎ ）（１：　１００希釈、○、・）とインキュベーションし、１ｇ５■−ヤギ抗ウ サギＩｇＧ　（”’Ｇｔ　αＲｂ　ＩｇＧ）　（１，５Ｘ　１０　’　ＣＰＳ／ ウェル）と、２時間インキ風ベーションした。別に、そのウェルを、ウサギ抗イ ンヒビターレセプターと２時間インキュベートし、そして、１２５１−ヤギ抗ウ サギＩｇＧ　（Δ、ム）のインキュベーション時間を変化させた。
図１３は、精製インヒビターの検出に関する、ウサギ抗インヒビターレセプター の量変化の影響を示すグラフである。ｐｖｃプラスチックウェルを、ｔ−ＰＡで コートし、洗浄、ブロック後、図１０で述べたような量のインヒビター（５０ｎ ｇ／ｓｊ）とインキュベートした。それから、ウェルを、種々に希釈した（ｌ： ５０、・、１ニア５、△；１：１００、■；　１　：　２００、口；１：５００ 、Ｏ）ウサギ抗インヒビターレセプターと、３７℃で２時間インキユベートした 。結合した抗体−インヒビター−ｔ−ＰＡ複合体を、図１０で述べたように検出 した。
図１４は精製したインヒビターの検出に関する、ＩＩＪ−ヤギ抗ウサギＩｇＧの 量変化の影響を示すグラフである。ｐｖｃプラスチックウェルをｔ−ＰＡでコー トし、洗浄、ブロック後、図１Ｏで述べたように、インヒビター（５０ｎｇ／ｓ ｊ）とインキユベートした。そのウェルを、３７℃で、ウサギ抗インヒビターレ セプター（１ニア５）と、２時間インキュベートした。洗浄後、そのウェルを、 ２．５Ｘ１０’（Δ）、５Ｘ１０’　（○）、ｌ×１ＯＳ（ロ）　、１．５ｘｌ Ｏ’　（ＩＩ）　、２Ｘ１０’　（Ａ）　、３ｘｌＯ’（・）　ｃｐｓ＋のｌｔ ｓ■−ヤギ抗ウサギＩｇＧと３７℃で２時間インキュベートした。
図１５は、図１Ｏ〜１４で確立した特に好ましい条件下で、インヒビター結合検 定法を用い、精製したインヒビター及びＢＡＥならし培地中に存在するインヒビ ターを検出するための投与一応答曲線を示すグラフである。ｔ−ＰＡでコートし たウェルを、指示した濃度の精製インヒビター（・）、もしくは連続的に希釈し たウシの大動脈内皮細胞（ＢＡＥ）ならし培地（○）と、３７℃で１時間インキ ュベートした。結合したインヒビターは、図１０で述べたように、ウサギ抗イン ヒビターレセプター（１：　７５）、ついで１ｓＩ−ヤギ抗ウサギＩｇＧ　（２ ，５Ｘ　Ｉ　Ｏ’　ｃｐｓ　）を用いて定量した。
図１６は、図１５の精製インヒビターに対する標準投与・応答曲線の両対数グラ フである０図１５で示した精製インヒビターに対する結合データを用いた。
図１７は、リバース・フィブリン・オートグラフィーにより検出した、インヒビ ターの投与・応答曲線を示すオートダラムのコピーである０種々の濃度の精製イ ンヒビターを、後に詳しく述べる、リバース・フィブリン・オートグラフィー及 び５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。レーン１：０．５ｎｇ；レーン２．１　ｎ ｉｇ　：レーン３．２．５　ｎｇ　；レーン４．５　ｎｇ　：レーン５、ｌＯｎ ｇ、分子量マーカーを示した。
図１８は、固定化したｔ−ＰＡへのインヒビターの結合に関する外来ＰＡの影響 を示すグラフである。精製インヒビター（５０ｎｇ／ｍＡ）を指示した濃度のｔ −ＰＡ（・）　、ｕ−ＰＡ　（ＵＫ。
ム）又は、ストレプトキナーゼ（Ｓ　Ｋ、■）と、３７℃で１時間インキュベー トした。ｔ−ＰＡに対するインヒビターの結合は、後に述べるインヒビター結合 検定法で定量した。
図１９は、正常なヒトの血清及び血清のミリリフドル当りのインヒビター活性（ ｎｇ／■ｌ）を示すグラフである。健康な提供者から静脈穿刺により収集した血 液試料を酸−サイトレートデキストロース（Ａ　ＣＤ）中に入れた。血漿及び血 清は、各血液試料から調製し、そして、そのインヒビター活性を、後に詳しく述 べるインヒビター結合検定法で測定した。
図２０は、大腸菌の粗抽出物のウェスタンプロット分析の写真である。誘導され た溶層性大腸菌株から調製した抽出物を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、後に述 べるウェスタンブロッティングにより分析した。レーンＡ、Ｄ及びＦは、精製し たウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥ）ベーターＰＡＩ３００ナノグラム（ｎｇ）を含 んでいる。レーンＢ及びＥは、ヒトの内皮細胞型・ＰＡＩのｃＤＮＡ配列を挿入 した組換えラムダ（λ）ファージであるλ９．２で溶原化した大腸菌Ｙ１０８９ 株由来の抽出物５０マイクロリツトル（μｌ）を含む、レーンＣは、その挿入物 を欠く、ベクターλｇｊ＋　＋で溶原化したＹ１Ｇ８９株由来の抽出物５０ｐＨ を含む、レーンＡ−Ｃで示したウェスタンブロッティング実験のために、ＢＡＲ −ベータＰＡＩに対するアフィニティー精製した１、Ｇを一次抗体として用いた 。レーンＤ−Ｆのウェスタンブロッティングに対しては、用いた抗血清は、ニト ロセルロース紙に結合した種々のクンバク質について、アフィニティー精製を行 った。レーンＤに対しては、λ９．２由来の融合ポリペプチドでアフィニティー 精製した抗血清を用いた；レーンＥＳＢＡＥベーターＰＡＩでアフィニティー精 製した抗血清；及びレーンＦ、λｇＬ＋＋溶原体由来のＭｒ１５０〜２００キロ ダルトンのタンパク質でアフィニティー精製した抗血清、でそれぞれ行った。オ ートラジオグラムは、１６時間露光で行った。
図２１は、誘導した大賜菌溶原体由来の抽出物中のインヒビター活性の分析を示 す写真である。溶層性大腸菌株由来の抽出物を５ＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、そし てｕ−ＰＡ（レーンＡ−Ｃ）を用いたリバース・フィブリン・オートグラフィー （ＲＦ　Ａ）及びウェスタン・ブロッティングと、ひきつづくオートラジオグラ フィー（レーンＤ−Ｆ）により分析した。レーンＡ及びＤは、精製したウシ・ベ ーターＰＡＴ３００ｎｇを含む。レーンＢ及びＥは、λ９．２による溶層性株由 来の抽出物５０μｌを含む、レーンＣ及びＦは、λｇｊ＋　ｒによる溶層性株由 来の抽出物５０μｌを含む、レーンＤのオートラジオグラムは１６時間露光、一 方、レーンＥ及びＦのものは、２週間露光で行った。
図２２は、λ３のｃＤＮＡ挿入物の完全なヌクレオチド配列を示している。コー ド鎖のヌクレオチド配列及び、それに対応する予想されるアミノ酸配列を示した 。左に示した数字はヌクレオチドの位置を示し、右の数字はアミノ酸残基の位置 を示す０番号ｌのバリンは、コードされたベーターＰＡ［タンパク質のアミノ末 端であり、成熟したクンバク質に対応するアミノ酸残基は、１〜３７９番である 。シグナルペプチド領域に対応するアミノ酸残基配列は、逆方向のマイナス番号 で表わしである。
図２３は、ベーターＰＡＩｍＲＮＡの検出を示すオートラジオグラフの写真であ る。フィブロザルコーマ細胞系列ＨＴ１０８０由来の全ＲＮＡを単離し、ホルム アミド存在下アガロースゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロースへのプロッティ ングの後、３富Ｐ標議したλ３ｃＤＮＡをハイブリダイズした。左側のマーカー として、旧ｎｄｆ［［消化したλＤＮＡを用いた。真核性２８３及び１８Ｓリボ ゾームＲＮＡの相対移動度を示した。
閏２４は、ベーターＰＡＩ、アルファーアンチトリプシン（アルファＩ　ＡＴ） 　、及びアンチトロンビンＩＩＩ　（ＡＴＩＩりの比較のため、提唱されている アミノ酸残基配列の一部を提供している０反応中心付近の、ベーターＰＡＩ、ア ルファ、ＡＴ及びＡＴｕ［の配列は、−文字アミノ酸残基記号を用い、“ファー スト・プロティン・ホモロジー・プログラム１　（リップマン（Ｌｉｐｍａｎ） 　等（１９８５）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２′２７巻、１４３５−１ ４４１頁）に従って整列させた０反応部位のペプチドボンドを縦線で示し、Ｐ＋ 　Ｐ’＋反応部位残基の用語は、トラビス（Ｔｒａｖｉｓ）及びサルベセン（Ｓ ａｌｒｅｓｅｎ）　（（１９８３）アニュアル・レヴユー・オフ・バイオケミス トリー（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、）５２巻、６５５−７０９頁） のものを採用した６反応部位のメチオニンを下線で示し、ベーターＰＡＩのもの と相同的なアルファ。
−ＡＴ及びＡＴＩ［Ｉのアミノ酸残基をボックスで示した。
本発明の詳細な説明 （定義） ここで用いている“プラスミノーゲン活性化因子インヒビター（ＰＡＩ）　”と いう言葉は、プラスミノーゲン活性化因子の作用を阻害もしくはチェックするタ ンパク質を意味している。ここで有効なＦＡＩは、ウシの大動脈内皮細胞（ＢＡ Ｅ）　、内皮細胞、胎盤抽出物、血小板、血漿及び血清のようなヒト起源のもの 、形質転換又は、腫瘍細胞系列（例えばＨＧ１０８０）、もしくは、ここで述べ ている融合ポリペプチドなどのような組換え技術によって調製したものなど、多 種多様のものに由来する。用いるＦＡＩは、少なくとも、組織型プラスミノーゲ ン活性化因子に結合し、その活性を阻害することが望ましく、それゆえ、ここで 述べる内皮もしくはベータＦＡＩは、主として、ｕ−ＰＡを阻害する、いわゆる 胎盤ＦＡＩ又はプロテアーゼ・ネキシンに比較して、特に興味深く、秀れている ＦＡＩである。さらに好ましくは、その有効なインヒビターは、ここでも述べて いるように、ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡのいずれにも結合し、これを阻害する。
“プラスミノーゲン活性化因子”は、プラスミノーゲン、特に血漿中のものを活 性化し、それを血液、細胞、組織及び体液の繊維素溶解システムにおいて、プラ スミンに転換するタンパク質である０本発明で有効なプラスミノーゲン活性化因 子には、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）及びウロキナーゼ型プ ラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）が含まれる。ここで用いているように、 “ウロキナーゼ型”という言葉はヒト以外の哺乳類でみられるようなウロキナー ゼ及びその相同タンパク質を意味している。
ここで用いている“免疫学的に異なる３という語句は、ある分子で生じる抗体が 別の分子と免疫反応（交差反応）を起こさないことを意味する０例えば、ここで 議論している＆ｌｌ換えタンパク質性分子は、プロテアーゼ・ネキシンもしくは 、胎盤プラスミノーゲン活性化因子インヒビターと交差反応を起こさない。
逆に、“免疫学的に同じ゛という語句は、他の分子と交差反応を起こす抗体の分 泌を誘導することができる分子を指して用いられ、それゆえ、２つの分子は免疫 学的に同じであるという０例えば、ここで議論している組換えタンパク質性分子 で生じる抗体は、ヒト及びウシの内皮細胞型プラスミノーゲン活性化因子インヒ ビターと交差反応を起こし、結果として、この三つの分子は免疫学的に同じであ るという。
“タンパク質性分子°という語句は、相対的な見かけの分子量が少なくとも４０ ．０００ダルトンの、比較的大きいポリペプチドを指して用いられる。この語句 は、ベクター由来のベータ・ガラクトシダーゼタンパク質の部分的融合体のよう な、ここで議論されている組換え分子や、図２２の配列のように、命名したゲノ ム配列から翻訳した分子も、含むと考えている。
“結合試薬”という語句は、他の分子と結合又は複合体形成する生物学的に活性 のある分子を意味して用いられている。それゆえ、結合試薬は、その各々のりガ ント（抗原）又はレセプター（抗体）と免疫反応を起こす抗原又は抗体のような レセプター及びそのリガンドでありうる。
ｔ−ＰＡ又はｕ−ＰＡを伴うベーターＰＡＩも、Ｓ、オーレウス（ａｎｒｅｕｓ ）コワン株タンパク質Ａと抗体Ｆｃ５ｌ域がそうであるように、互いに、結合試 薬を構成しうる。特異的な結合試薬と、それらが結合にあずかる領域は、後に示 される。しかし、このセクシ茸ンで使われているレセプターは、結合試薬に関し て定義されたほとんどの言葉を示している。
ここで用いられている“レセプター”という言葉は、抗原リガンドに結合する、 生物学的に活性な分子を示している０本発明のレセプター分子もしくはレセプタ ーは、抗体、免疫化した動物の腹水又は血清中にみられるような、実質的に精製 された形の、実質的に本来の抗体、もしくは、後に述べるようなＦａｂ及びＦ　 （ａｂ　’　）□抗体領域のような、抗体のイディオタイプ含有ポリペプチド領 域である。
レセプター分子又は他の結合試薬の生物学的活性は、水溶液中での混合及び、免 疫反応物形成に十分な約１０分から約１６〜２０時間の予め決められた時間、生 物学的検定条件に維持して、そのレセプターを、その抗原リガンドに結合させる ことにより示される。
生物学的検定条件とは、リガンド及びレセプター分子、もしくは、結合しつつあ る、及び結合した物体の生物学的活性を維持するものである。そのような検定条 件には、約り℃〜約４５℃の温度範囲、生理的ｐＨ値及びイオン強度が含まれる 。そのレセプター及び他の結合試薬も、約５〜約９のｐＨ値範囲でかつ、蒸留水 から、約１モル濃度の塩化ナトリウムのイオン強度範囲でその抗原リガンドに結 合することが望ましい、そのような条件を至適化する方法は、当業者にはよく知 られているところである。
抗体のイディオタイプ含有ポリペプチド領域（抗体結合部位）とは、そのイディ オタイプを含み、そのリガンドに結合する抗体分子であり、その抗体のＦａｂ、 　Ｆａｂ’及びＦ　（ａｂ　’　）　ｚｆ＋Ｉ域を含む。
抗体のＦａｂ及びＦ　（ａｂ　’　）ｚｓＪＩ域は当業者には、よく知られてい るもので、従来の方法により、実質的に本来の抗体に、パパイン及びペプシンを 各々作用させることにより調製する０例えば、セオフィロポラス及びジクソンに ついて米国特許第４．３４２，５６６号を参照せよ、抗体のＦａｂ’についても よく知られており、メルカプトエタノールによるような、Ｆ（ａｂ’）ｉのジス ルフィド結合の還元とひきつづく、そのようにしてできた還元されたシスティン 残基の、ヨードアセトアミドのような試薬によるアルキル化により調製する０本 来の抗体は好ましいレセプターであり、本発明のレセプター分子を説明するのに も使用されている。
抗体及びレセプター分子は、特別な免疫原に対して“生じる”ものとして、ここ で議論されている。イディオタイプ含有抗体領域は、抗体に関するヒトの作用の 結果の産物であり、そのように“生じる”ということにはならないが、“生じる １という言葉は、表現の便宜上そのようなレセプターと共に使用される。
本発明を説明するために用いているレセプターは、ポリクローナル・レセプター である。“ポリクローナルレセプター″　（Ｐａｂ）とは、免疫分子の多数のエ ピトープに対して、抗体を産生（分泌）する多くの異なる抗体産生（分泌）細胞 のクローンにより作られるレセプターである。１種の抗体分子しか分泌しないハ イブリドーマ細胞のクローンにより分泌されるようなモノクローナル抗体のこと も考えている。ハイブリドーマ細胞は、抗体産生（分泌）細胞と、ミエローマ又 は他の自己存続細胞′系列の融合により作る。
全抗体としてのそのようなレセプターは、参考文献にも掲げている、コラ−（Ｋ ｏｈｌｅｒ）及びミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）により最初に報告された（ ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、２５６巻、４９５−４９７頁（１９７５年） ）。
ポリクローナル・レセプターを生じさせるのに使う宿主としての、本発明に使用 できるヒト以外の温血動物には、家禽にワトリやハト）、扁胸、鳥類の一部（エ ミエ、ダチョウ、火喰鳥、モア）、及び哺乳類（犬、猫、猿、ヤギ、豚、牛、馬 、ウサギ、モルモット、ネズミ、ハムスター、マウス）が含まれる。好ましい宿 主動物はウサギである。
レセプター及び他の結合試薬は、インジケータ標識手段、又は“指示グループ１ 又は“標識゛と供に用いる。指示グループ及び！識は、特異的インヒビターがレ セプターに結合したことを知せる手段として、レセプターと共に用いられる。
“インジケータ標識手段゛、°指示グループ゛又は“標識”という言葉は、レセ プターに結合して、もしくは単独で用いられる原子又は分子を意味して用いられ 、それらの原子又は分子は、単独又は他の試薬とともに用いられる。それらの指 示グループ又は１ｓ識は、免疫化学において、よく知られているものであり、他 で、新しいレセプター、方法、そして、または、システムでそれらが用いられて いるように、本発明の一部を構成するものである。
使用されている信号提供標識は、一般に、後にｌＩ論されているように、他の分 子もしくは、ある分子の一部に結合している。このように、標識は、レセプター のような別の分子又は分子の一部に機能的に結合しており、その標識が結合して いる分子の結合は、その標識により実質的な妨害をおこさず、また、その標識に より与えられる、必要とされる信号も妨害をうけない。
インジケータ標識手段には、抗体又は抗原にそれらを、変性することなしに化学 的に結合し、有用な免疫螢光トレーサとなる螢光発色団（色素）を形成する、反 応性の螢光標識試薬がある。適当な反応性螢光標識試薬としては、フルオレセイ ン・イソシアネート（Ｆ　Ｉ　Ｃ）　、フルオレセインイソチオシアネー）　（ ＦＩＴＣ）、ジメチルアミノ−ナフタレン−５・スルホニル・クロライド（ＤＡ ＮＳＣ）　、テトラメチルローダミン・イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）　、 ＩＪサミン・ローダミン８２００スルホニルクロライド（ＲＢ２００ＳＣ）及び それに類する螢光色素がある。参考文献にも掲げているように、免疫螢光分析技 術の記述は、デル力（ＤｅＬｕｃａ）の“免疫螢光分析″（１９８２年、ジョン ・ウィリー・アンドサンズ社版（Ｊｏｈｎ　ｌ１ｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　Ｌｔ ｄ、　）マーカロニス（Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ）等線、１道具としての抗体” 、ｐ１８９〜２３１頁）。
インジケータ標識手段は、本発明のレセプター、ｔ−ＰＡ又はｕ−ＰＡのような 結合試薬又は有用な抗原に直接結合させることができ、また単独の分子を含むこ ともある。特に、そのインジケータ手段が本発明のレセプターへ結合する抗体の ような単独の分子である方が望ましい。
ここでしばしばタンパク質Ａと呼ぶ、スタフィロコッカス、オウレウス（Ｓｔａ ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）のコワン株のタンパク質Ａも、本来の 、又は本発明の実質的に本来のものである抗体レセプターを用いる場合の、分離 した分子インジケータ又はｍｌｓｓ手段として使用することができる。そのよう な使用の場合、タンパク質Ａ自身は、以後に述べるように、放射性元素又は螢光 性色素のような標識物を含む。
指示グループとして、ホースラディツシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はグル コース・オキシダーゼ又はその類のもののような、生物学的に活性な酵素も使用 される。“原則的指示グループがＨＲＰ又はグルコースオキシダーゼのような酵 素である場合、レセプター−リガンド複合体が形成したことを視覚化するのに付 加的試薬が必要である。ＨＲＰ、に対する付加的試薬には、過酸化水素及び、ジ アミノベンジジンのような酸化色素前駆体が含まれる。グルコース・オキシダー ゼに有用な付加的試薬は、２゜２′−アジド−ジー（３−エチルベンズチアゾリ ン−６−スルホニツク・アシッド＞（ＡＢＴＳ）。である。
放射性元素はもう１つの標識を提供し、典型的に有用な標識としてここで用いら れている０本発明で使用されうる典型的な放射性標識試薬が、ガンマ線発生を起 こす放射性元素である　１１４１．１！Ｊ、ＩＩＩ　１．１３１１．１２Ｊ及び ”Ｃｒ（７）ような、それ自身ガンマ線を発する元素は１つのガンマ線発生放射 性元素指示グループの代表となっている。特に１！ゝ■が望ましい、もう１つの 有用な指示グループは、それ自身が陽電子を発生する”Ｃ％　”Ｆ％ＩＳＯ及び ”Ｎのような元素である。そのように発生した陽電子は、分析培地中に存在する 電子と衝突してガンマ線を作る　Ｉ１１インジウムのようなベータ線発生物も有 用である。
よく知られているように、放射性モノクローナル・レセプターは、放射性アミノ 酸を含む培地中で、適当なハイブリドーマを培養することにより作ることができ る。モノクローナル及びポリクローナル・レセプターは両方とも、そのレセプタ ーを単離し、それらを、先に述べた放射性元素の１つで標識することにより調製 した。タンパク質の放射性標識は、この分野では、よく知られているものであり 、ここではこれ以上議論しない。
次にあげる略記及び記号を用いる。
ｂｐ　−塩基対 ｋｂ　−１０００塩基対 ｋｄａ　−キロダルトン Ｍ「　−見かけの相対分子量 ＤＮＡ　−デオキシリボ核酸 ｃ　ＤＮＡ　−相補的ＤＮＡ ＲＢＳ　−リボゾーム結合部位（シャイン・ダルガル／配列）ＲＮＡ　−リポ核 酸 レプリコン−複製の個々の作用をコントロールする単位；それには、複製を開始 するオリジンが含まれ、また、複製を停止する終止部位も含まれることがある。
ヌクレオチドコドン配列に関して、種々の文法型で用いられる“対応する”とい う言葉は、タンパク質の配列の特別なアミノ酸残基をコードする、保存的コドン 置換のみを含むヌクレオチドコドン配列を意味している。
上で用いた“保存的コドン置換”という言葉は、アミノ酸残基が、他の、生物学 的に同じ残基に置き換る、タンパク質の翻訳に導く、コドンの他のコドンへの置 換を意味する。アミノ酸残基（翻訳又は発現）レベルでの保存的置換の例には、 Ｉ　ｌｅＳＭａｌ、Ｌｅｕ又はＭｅｔのような、疏水的残基間の置換、又は、Ａ ｒｇとＬｙｓｓＧｉｎとＡｓｐ又はＧｌｎとＡｓｎの間でのような極性残基間の 置換、及びそれに類するものが含まれる。
いくつかの例においては、ＡｓｐとＬｙｓのような、あるイオン性残基の反対の 電荷のイオン性残基への置換が、それらのイオン性のグループが単に、熔解性を 生むとういことを考慮し、この分野では“保存的”という言葉で表わされている 。しかし、−ａに、イオン性残基の、反対電荷のイオン性残基への置換、ＰｈＣ ％Ｔｙｒ又はＴｒｐのような大きい残基及びＧｌｙ、　Ｉｌｅ及びＶａｌのよう な、より小さい残基への置換と同様に°ラジカルな置換”と考えられる。
通常の意味で、１非イオン性”及び“イオン性”残基という言葉は、生理学的ｐ Ｈ値において、それぞれ電荷をもたない、又は電荷をもつアミノ酸残基を意味し て用いられている０代表的な非イオン性残基にはＴｈｒ及びＧｌｎがあり、一方 代表的イオン性残基には、Ａｒｇ及びＡｓｐが含まれる。
ヌクレオチドレベルで、１対応する”という言葉は、コドンの第三ヌクレオチド が他のヌクレオチドと置換し、その置換が、未置換コドンと同じアミノ酸をコー ドすることを意味して用いられる。同じアミノ酸残基に翻訳される、異なるコド ンの縮退は、この分野では、よ（知られているものである。
ここで用いられている“実質的に純粋である”という言葉は、全ての異質の又は 外来の物質を実質的に含まない生物学的物質を指して使用されている。
ヌクレオチド配列を記述するのに用いる場合、ヌクレオチド配列をなすプリン又 はピリミジン塩基は次のように記述される。
Ａ−デオキシアデニル Ｇ−デオキシグアニル Ｃ−デオキシシトシル Ｔ−デオキシチミジル ヌクレオチド配列を記述する上で、先に示した塩基で構成される各三文字トリブ レ７）は、左に５′末端及び右に３′末端をもつＤＮＡのトリヌクレオチド（コ ドン）を示している。
ここで述べられるアミノ酸残基及びタンパク質のアミノ酸残基配列は、以下の対 応表で示され、関係づけられている三文字又は−文字記号で記述される。
対応表 アミノ酸の記号 三文字　−文字 アラニン　Ａｌａ　Ａ アルギニン　Ａｒｇ　Ｒ アスパラギン　Ａｓｎ　Ｎ アスパラギン酸　Ａｓｐ　［） システィン　ｃｙｓｃ グルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅ グルタミン　Ｇｌｎ　Ｑ グリシン　ｃｔｙ　Ｇ ヒスチジン　Ｈｉｓ　Ｈ インロイシン　Ｉｌｅ　Ｉ ロイシン　Ｌｅｕ　Ｌ リジン　Ｌｙｓ　Ｋ メチオニン　Ｍｅｔ　Ｍ フェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｆ プロリン　Ｐｒｏ　Ｐ セリン　Ｓｅｒ　Ｓ スレオニン　Ｔｈｒ　７ トリプトフアン　Ｔｒｐ　Ｗ チロシン　Ｔｙｒ　’／ バリン　Ｖａｌ　Ｖ タンパク質及びポリペプチドのアミノ酸は、天然のＬ型である。
■、一般的説明 本発明は、生化学的試薬システム及びその製造法及び使用法並びにその試薬シス テムを使用した診断に関するものである。この試薬システムは、（ａ）内皮細胞 型プラスミノーゲン活性化因子インヒビター又は、後に述べる実質的に純粋な組 換え分子に対して、動物宿主内で生ずるレセプター及び（ハ）指示手段を含む。
また本発明は、本発明のポリクローナルレセプター及び生化学的試薬システムの 生成方法についても考えている。
本発明の生化学的試薬システムにおいて使用するポリクローナルレセプターを生 成する方法は、動物宿主、好ましくは哺乳類（例えば、ウサギ、ヤギ又は馬）に 、内皮（ベータ）プラスミノーゲン活性化因子インヒビター（ＦＡ　Ｉ　）又は 、ここで述べている実質的に純粋な、組換え分子をそのインとビターに対する抗 体の産生を誘導するのに十分な量投与することを含んでいる。生じた抗体は、そ のインヒビターに対するレセプター分子を構成する。
その抗体を含む抗血清を、免疫化した宿主から採取し、そのようにしてできたレ セプターを回収する。
本発明の生化学的試薬システムは、先に述べたようにしてできたレセプター分子 を、指示手段と合せることにより作る。適当な指示手段は、先にここで述べられ たものである。その指示手段は、単独分子であることが特に望ましい。
本発明の態様には、検定試料中の内皮細胞型プラスミノーゲン活性化因子インヒ ビターの存在、望まれる場合には、その量を、直接検出する固相検定法がある。
その方法の１つの特徴には、（ａ）その上で試料の検定を行う固体マトリックス を提供する；う）インヒビターと結合（複合体形成）する結合試薬をその固体マ トリックスに固定し、固相サポートを形成する；（Ｃ）検定する液体試料の部分 標本を、その固相サポートと混合し、固液粗混合物を形成する；（社）その混合 物を、その試料中に存在する内皮細胞型プラスミノーゲン活性化因子インヒビタ ーと、その結合試薬が結合（複合体形成）するのに十分な、予め決めた時間（典 型的には約２〜４時間）、生物学的検定条件下に維持すること；（ｅ）その固相 と液相を分離すること；及び（０その結合試・薬と結合（複合体形成）したイン ヒビターの存在を測定すること、のステップが含まれている。
その結合試薬と複合体を作るインしビターの存在は、用いられる検定法のタイプ に依存するいくつかの方法で、直接的に、又は間接／競争的（後述）に測定する 。
直接法の１つの好ましい態様において、その測定は、（ｉ）上記ステップ（ｅ） の後に得られる固相と、固体サポート上で結合した試料のインヒビターに結合す る、インヒビターと複合体を作る第２の結合試薬の水溶液とを混合する；（ｉｉ ）その第２の結合試薬がインヒビターと結合（複合体形成）するのに十分な時間 （典型的には約２〜４時間）、生物学的検定条件に、その第２の固液混合物を維 持する；（ｉｉ）その第２の固−液相混合物を固相と液相に分離する；そして（ ｉｖ）そのインヒビターに結合した第２の結合試薬の量を測定し、それにより、 インヒ・ビターの量を決定する、これらのステップからなる。
そのインヒビターと結合又は複合体形成する第２の結合試薬の量は、典型的には 、先に述べた、指示手段で測定する。その指示手段は、第２の結合試薬に結合さ せることができるので、第２の結合試薬及びその指示手段は１つの分子である。
その第２の結合試薬と、指示手段は、単独分子である方がより好ましい。
このように、その指示手段が、第２の結合試薬に結合している場合は、第１の結 合試薬と複合体を形成するインヒビターの存在を測定する上記の方法は、（ｉ） 上述のステップ（ｅ）の後に得られる固相と、結合して、そのインヒビターに結 合した第２の結合試薬の量を測定する手段を提供する指示手段を含む、そのイン ジケーターと結合（複合体形成）する第２の結合試薬の水溶液を混ぜ、第２の固 ・液相混合物を作る；（ｉｉ）その混合物を、第２の結合試薬がそのインヒビタ ーと結合（複合体形成）するのに十分な予め決められた時間、生物学的検定条件 下に維持する；　（ｔｉｉ）その固・液相混合物を、固相と液相に分離する；そ して（ｉｖ　）インヒビターに結合した第２の結合試薬の量を測定する、これら のステップを用いて行う。
その指示手段は、特に好ましい態様においては、単独分子である。そのような状 態では、結合（複合体形成）したインヒビターは、（ｉ）上述のステップ（ｅ） の後で得られた固相と、そのインヒビターと結合（複合体形成）する第２の結合 試薬の溶液を混合する；（ｉｉ）そのようにしてできた混合物を、その第２の結 合試薬がインヒビターと結合（複合体形成）するのに十分な、予め決められた時 間生物学的検定条件に維持する；　（ｉ）その第２の固・液混合物を、固相と液 相に分離する；（ｉｖ）単独の分子のインジケータ標識手段（後に議論する）を 混合し、第３の固・液相混合物を作る；　（Ｖ）その第２の結合試薬とインジケ ータ標識手段が結合するのに十分な予め決められた時間（典型的には約２〜４時 間）、その第３の固・液相混合物を、生物学的検定条件に維持する：（ｖｉ＞第 ３の固・液相混合物を、面相と液相に分離する；そして（ｖｉ　）その第２の結 合試薬に結合した単独分子のインジケータ標識手段の量を測定する、これらのス テップにより測定する、これらのステップにより測定する。
上述の態様の詳細は、以後に述べるが、そこでは、第１結合試薬はｔ−ＰＡ又は ｕ−ＰＡ、第２結合試薬はウサギ抗インヒビター抗体及び単独分子インジケータ 手段はヤギの抗つサギＩｇＧ抗体を用いた。
また、他の方法では、第１の結合試薬と反応又は複合体形成したインヒビター量 は、第２の結合試薬を使用せず測定することができる。前述の、ステップ（ｅ） の固相及び液相の分離後、未結合の放射性標識したタンパク質を、その混合物か ら除去し、結合した、放射性標識インヒビターを、固体サポート上に残した。そ れから、その結合した放射性標識したインヒビターの存在及びその量を、ガンマ 線計数器をつかって測定した。放射性元素の代りに、検定試料中の成分と反応す る、フルオレセイン、イソシアネートのような、インジケーター標識手段として の反応性螢光分子を用いても、同様の結果が得られた。
好ましい第１及び第２結合試薬には、ｋＩＩＩｌ型及びウロキナーゼ型プラスミ ノーゲン活性化因子又は、先に述べた本発明のレセプターがある。もし第１の結 合試薬として、組織型又はウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を用いた ならば、第２結合試薬は、そのレセプターである。別に、もし、第１結合試薬に レセプターを使ったならば、第２結合試薬は、上記プラスミノーゲン活性化因子 の１つを用いる。このように、第１結合試薬が（ａｌ　ｔ　−ＰＡ及びｕ−ＰＡ からなる群から選ばれたブーラスミノーゲン活性化因子又は−）そのインヒビタ ーに結合する本発明のレセプターであり、そして、第２結合試薬は（ａｌ　ｔ　 −Ｐ　Ａ及びｕ−ＰＡからなる群から選ばれたプラスミノーゲン活性化因子又は （ｂ１本発明のレセプター、である、しかし、第１及び第２結合試薬は異なる。
このように、第２結合試薬は、第１結合試薬で用いなかった（５１）及び伽）の 一方と言うことができる。
インヒビターに結合する本来の、又は、実質的に本来のものと同じ、本発明の抗 体レセプターを第２結合試薬とする場合は、単独分子インジケーター標識手段を 用いるのが好ましい、そのように、単独分子インジケータ標識手段としては、放 射性同位元素、酵素又は螢光色素のような、結合指示グループを有する、ヤギ抗 ウサギＩｇＧ又は、タンパク質Ａのような抗体であることが好ましい。
本発明の別の面では、競争検定法が用いられる。ここでは、実質的に純粋な組換 え、タンパク質性分子（後述）を固定化した固体マトリックスを含む固体サポー トが提供される。天然の（本来の）、内皮細胞型ＦＡＩの検定のための液体試料 の部分標本を、Ｉｌｌ、その固体サポートの一部をなす、マトリックスに固定さ れた組換えインヒビター及び（２）検定するインヒビターに両方に結合する、予 め決められた量の結合試薬と混合する。そのような結合試薬の例としては、先に 述べたレセプター分子及びｔ−ＰＡ及びＵ−ＰＡがある。そのようにしてできた 混合物を、その結合試薬が、試料中に存在するインヒビターと結合し、複合体を 作るのに十分な、予め決めた時間、生物学的検定条件下に維持する。
それから、その混合物を、先に述べた固体サポートと混合し、固・液相混合物を 作る。その固・液相混合物を、その試料のインヒビター分子に結合しなかった、 混合物の全ての結合試薬が、固体サポートの組換えインヒビター分子に結合する のに十分な、予め決められた時間生物学的検定条件に維持する。
さらに、その固液相を、デカンチーシラン及び洗浄により分離する。液相及びそ の内容物を回収し、５ＤＳ−ＰＡＧＥ又はリバース・フィブリン・オートグラフ ィーにより検定し、ベーターＰＡＩの存在を直接測定する。さらに、試料中のヒ トの内皮ＰＡＩの存在（量）を、ｍ換えヒト内皮ＦＡＩと複合体形成した結合試 薬量を検定し、既知標準試料におけるものと、定性的、望ましくは定量的にその 差異を比較することにより測定する間接的測定を行うことが望ましい。
固相に結合する結合試薬量の測定は、第二の結合試薬が、先に使用したものと異 なる分子を用いること以外、以前に議論した一般的方法を用いて行った。このよ うに、第１の結合試薬が、１−ＰＡ又はｕ−ＰＡであるなら、第２の結合試薬は 、一般に、適当なタンパク質に対して生じた標識結合した抗体である。また第１ の結合試薬がレセプターである場合は、一般に、第１の結合試薬は、ウサギの抗 ベータＦＡＩ抗体が第１の結合試薬であるときのヤギの抗ウサギ抗体のような、 第１結合試薬レセプター分子が生じたものと異なる、宿主動物中で生じた標識結 合抗体である。標識したタンパク質Ａも、この間接競争検定法に有用である。標 識化したレセプター分子も、第１結合試薬として用いることができ、これにより 、第２結合試薬を使う必要がなくなることに注目すべきである。
特に、先に述べた固相検定法は好ましい、しかし、液相（均一）検定法も考慮し ていることを理解してはし１１．このようなシステムも、当分野ではよく知られ ており、詳しく述べることはしない。
しかし、簡単に言うと、液体システムでは、検定法の第１結合試薬として、レセ プター、ｕ−ＰＡ又はｔ−ＰＡを利用することもできる。一般的に、そのような システムの指示手段は、形成した複合体において、その基質に抗体が結合し、こ のことがその結合酵素の活性を阻害し、それにより、抗体が結合する複合体成分 の存在を指示するという、信号酵素に結合した抗体である。そのような検定法の ための典型的標識手段は、米国特許第３．８１７．８３７号、第３．９９６．３ ４５号に示されている。ｔ−ＰＡのようなプラスミノーゲン活性化因子も、ｔ− ＰＡ／ヒト・ベーターＰＡＩ複合体の形成により示される活性をもつ酵素に結合 したとき、標識化第１結合試薬として用いることもできる。このように、そのよ うな標識システムには、米国特許第３ａ、　８７５．０１１号に述べられている 酵素ハプテンシステムに類似のいくつかの方法がある。
さらに本発明は、試料中のベータ移動、ヒトプラスミノーゲン活性化因子インヒ ビターの存在及び量を検出するための、キットの形をした、診断システムを考え ている。そのキットは、（１）活性成分として、乾燥形、溶液形又は分散形で、 効果的量の、本発明の生化学的試薬システム、及び（２）ｔ−ＰＡ又はｕ−ＰＡ を含む少なくとも１つのパッケージを含む。
また、その診断システムは、マイクロタイター・ストリップ又は多くのウェルが あるマイクロプレートの固体マトリックスを含む。存在するｔ−ＰＡ又はウロキ ナーゼは、その固体マトリックスに結合している方が望ましい。
その診断システム及び、先に述べた方法において適切な固体マトリックスには、 ファルコン・マイクロテスト■フレキシブルアッセイプレート（ＣＡ州、オック スナード（Ｏｘｎａｒｄ）　、ファルコンプラスチック社）という名で市販され ている９６穴マイクロプレート及び、イムロン■及びＩＩ　（ＶＡ州、アレキサ ンドリア・ダイナチク社）という名で市販されているマイクロタイター・ストリ ップなどがある。マイクロタイター・ストリップ又はプレートは、透明なプラス チラグ、できれば、ポリ塩化ビニル又は、ポリスチレンでできていることが望ま しい。診断システム及びこの方法で用いる、別の固体マトリックスには、ＩＬ州 、北シカゴ・アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ　１ｌｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ）社製の、直径約１ミクロン〜約５ミリメートルのポリスチレンビーズ、使 いやすい大きさのポリスチレンチューブ、棒又は、へら、及びポリスチレン粒子 の大きさが約１ミクロンで、遠心により、ララックスと分離できる、ポリスチレ ンラテックスなどがある。
固体マトリックスも、ニューシャーシー州、ビス力タウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗ ａｙ）のファルマシア・ファイン・ケミカル社製の、セファデックスＧ−２５、 −５０、−１００、−２００及びこれに類するもののような、網状テキストラン 、及びファルマシア・ファイン・ケミカル社製の、セファロース６Ｂ、ＣＬ６Ｂ 、４Ｂ。
ＣＬ４Ｂ及びこれに類するもののような、アガロース及び網状アガロースなどが 含まれる。
アガロース及びセファロース・マトリックスは、一般的に、臭化シアンを用いた 結合で活性化される。それから、その活性化したマトリックスを、１モル濃度の グリシンで洗い、その活性化マトリックスを乾かさずに、本発明の生化学的試薬 システム、１−ＦＡ又はｕ−ＰＡを結合する。マトリックスに結合した試薬シス テム、ｔ−ＰＡ又はｕ−ＰＡを洗い、使用する準備が整う。これら固体マトリッ クスの使用に対する細かいことは、セクション■、Ａ２に示した。
さらに、この診断システムは、検定結果を比較するための標準物質及び、乾燥形 又は液状の種々のバッファを含む。
先に述べた指示手段は、本発明の生化学的試薬システム中のレセプターと共に供 給されるのが好ましく、レセプターに結合しているものは、その中に、またより 好ましくは、単独分子指示手段を用いた場合は、別々に、包装されることになる 。過酸化水素及びジアミノベンジジンなどの付加的試薬も、ＨＲＰなとの指示グ ループが用いられるときは、そのシステム中に組込まれる。それらの物質は、多 くの指示手段と同様に、市販されており、容易に入手でき、この診断システムと 共に供給されなくともよい。さらに、過酸化水素のような、いくつかの試薬は、 保存するうちに分解が起こり、いくつかの放射性元素と同様に寿命が短かく、使 用者が直接入手する方が望ましい。
以後議論されているい（つかの研究からのデータは、プラスミノーゲン活性化因 子インヒビター及び本発明の生化学的試薬診断システムが、ヒト血清中のプラス ミノーゲン活性化因子に結合した、プラスミノーゲン活性化因子インヒビターを 検出及び定量する能力を検定して得られた。
本発明の診断システムは、内皮細胞形ＦＡＩがプラスチック製マイクロタイター ウェル上に固定した、ｔ−ＰＡ又はｕ−ＰＡに結合する能力に基づいている。洗 浄後、その結合の程度は、はじめに、インヒビターに対するウサギの抗血清と混 合し、その複合体を維持（インキユベート）シ、さらに、Ｉ冨％ｌ−ヤギ抗ウサ ギＩｇＧと混合し、複合体を形成させる。
本発明の診断システム及び検定方法を用いて、ｔ−ＰＡ及びそのインヒビターと の反応は、迅速で（１時間以内に７８パ一セント以上結合）、時間及び濃度依存 で、広いインヒビター濃度に渡り〔ミリリットル当り１−１００ナノグラム（ｎ ｇ／５Ｊ））感度をもつことがわかった。外部から与えたｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡ は、インヒビターに対する固定化ｔ−ＰＡの結合能を、ｔ−ＰＡ。
１２ｎｇ／ｍｊ及びｕ−ＰＡ、６ｎｇ／ｍＡの場合、５０パーセント減少させる よう競争することが分った。
以後議論される結果は、本発明の生化学試薬システム及び診断システムを用いた 態様を示すもので、本発明の制限を意図するものではないことを理解しなければ ならない。
ヒトの内皮細胞型ＰＡＩ又は、そのＦＡＩを含む融合ポリペプ子をコードする、 生物学的に純粋なりＮＡ分子も、本発明の一面をなしている。そのＤＮＡ分子は 、約１１４０〜約３０００ヌクレオチド又はヌクレオチド塩基対を含み、そして 、基本的に、左から右に、５′末端から３′末端への方向で、図２２の式で示さ れるヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列を 含んでいる。もちろん、本発明のヌクレオチド配列の読み枠は、ヒトの内皮細胞 型ＰＡＩ又は、内皮細胞型ＰＡＩを含む融合ポリペプチドのものと一致していな ければならない。
このように読み枠はシフトしてはならず、図２２で示した部位１３のヌクレオチ ド残基がトリプレットコドンの第１ヌクレオチドとなるものと一致していなけれ ばならない。
適当なりＮＡ分子は、ヌクレオチド部位１３から約１１５３までの記述された配 列に対応するヌクレオチド配列を含む、その他の適当なりＮＡ分子は、ヌクレオ チド部位１からヌクレオチド部位約１１５３、ヌクレオチド部位１から約１９６ ０、及び、図２２に示したヌクレオチド部位１から、約２９９５までの全配列に 対応するＤＮＡ配列を含む。
本発明のヌクレオチド配列は、基本的に、先に述べた配列の１つを含んでいる。
このように、本発明のヌクレオチド配列は、ヒトの内皮ＰＡＩをコードするヌク レオチド配列の基本的及び新しい特性に影響する付加的配列は除外する。
本発明のヌクレオチド配列は、その配列の５′末端側に機能的に結合した１つ以 上の転写プロモーター配列を含みうる。そのＤＮＡの翻訳及びタンパク質の発現 が望まれる場合は、そのＤＮＡには、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）及び翻訳終止コ ドン（ＴＡＡ又はＴＡＧ又はＴＧＡ）が、それぞれ、その配列の５′末端及び３ ′末端にプロモーター配列と、５′末端との間に翻訳開始コドンが位置するよう な形で機能的に結合して含まれることもある。
その他の分子の全部又はその１部をコードするＤＮＡ配列がそのＤＮＡ中に含ま れ、その結果翻訳（発現）されたタンパク質性分子が、発現した、ヒト内皮ＦＡ Ｉに融合（ペプチド結合で結合）した他の分子の全部又は一部のアミノ酸残基配 列を含む融合ポリペプチドであることもある。典型的融合ポリペプチドには、ヒ トの内皮細胞ＰＡＩのアミノ末端に融合したベータ・ガラクトシダーゼ分子の一 部を含む、後に議論されるタンパク質性分子がある。
その分子は、ベータ・ガラクトシダーゼ領域と、ＰＡＩ配列の間に、ペプチド結 合で融合したＦＡＩリーダーペプチドの４個のアミノ酸残基をも含む。
上述の全てのヌクレオチド配列は、複製のみが望ましい場合、列挙したＤＮＡ分 子が複製可能なだけの長さで存在しうる。複製及び翻訳（タンパク質性分子の発 現）が望まれるなら、それらのヌクレオチド配列は、そのＤＮＡ分子が複製可能 なだけの長さをもち、そして、発現した、ヒト内皮細胞ＦＡＩのアミノ酸配列を 含むタンパク質性分子は、ここで述べる、天然のウシ及びヒトの内皮ＰＡＩと免 疫学的な交差反応を起こす、好ましくは、その発現したタンパク質性分子も、ｔ −ＰＡに結合し、そして、ここで議論されているように、リバース・フィブリン ・オートグラフィーにおいて、少なくともｔ−ＰＡへの阻害を示す、さらに好ま しくは、その発現した分子は、リバース・フィブリン・オートグラフィー検定法 において、ｕ−ＰＡ活性に結合し、これを阻害する。
本発明のヌクレオチド配列は、図２２に示した配列に対応するヌクレオチド配列 を含むので、保存的ヌクレオチド置換同様、保存的コドン置換も、ここでその語 句を定義しているとおり、考慮している。
図２２に示すように、本発明のヌクレオチド配列は一本鎖である。しかし、ある ＤＮＡ配列は、水素結合により、そのヌクレオチド配列と相補的な第２のＤＮＡ 分子と、第１のＤＮＡ配列と逆平行に結合していることが望ましい、そこで、さ らに本発明のＤＮＡは、二本鎖で、しかも、相補的配列とともに、図２２に示し た配列の全て、又は列挙した傾城に対応する、先に述べたＤＮＡ配列を含んでい る。
複製／発現媒体、例えば大腸菌、Ｓ、セレヴイシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） のような単細胞生物又はそれに類するもの、又は、ＣＯ８細胞のような哺乳動物 細胞、における上述の望ましいＤＮＡヌクレオチド配列の増殖及び発現のための 、非染色体ベクターも考えている。そのベクターは、複製／発現媒体と両立し、 その中に、そのベクターが、そのＤＮＡ配列を増殖できる形で複製されるＤＮＡ 分子を含むレプリコンを含んでいる。
加えて、その非染色体ベクターは、転写及び翻訳に使用される配列要素も含んで いる。最後に、転写プロモーターがすでに記述したように、その５′末端に機能 的に結合していることもある。
その転写プロモーターは、そのベクター由来のものでも、外来のものでもよい、 ここで用いている、ｊａｃＺプ“ロモーター・オペレータのようなベクター由来 の転写プロモーターが好ましい。
また翻訳ターミネータ−も、図２２の式で示されているヌクレオチド配列に、タ ーミネータ−配列を含んでいるように、いくつかの例でそのＤＮＡ分子の３′末 端に機能的に結合している。
先に述べた、図２２のＤＮＡ分子は、複製／発現媒体において翻訳を開始する、 その配列の５′末端に隣接する開始コドン（ＡＴＧ）を欠いている。そのような コドンは、先に述べたように、読み枠を同じくして、定義されたＤＮＡ分子に連 結していることもあるし、また、ここで例示しているように、そのベクターヌク レオチド配列の一部でもありうる。
ヒトの内皮ＰＡＩは、分泌されるタンパク質であり、それゆえ、天然に発現され るように、細胞質膜を通してタンパク質を移動するのを助け、そして、翻訳後切 り捨てられる、いわゆるポリペプチド・リーダー又はシグナル配列を含む、ヒト の内皮ＰＡＩのコード化ポリペプチド・リーダー配列の一部のみが、先に定義さ れたＤＮＡ分子配列中に含まれる。ここで示される典型的Ｄ　Ｎ　Ａ分子は、細 胞周辺校と比べ、大腸菌のような複製／発現媒体の細胞質内で発現される。大腸 菌の細胞質内での発現は、それら複製／発現媒体にとって通常のことである。
先に議論した、転写プロモーター、翻訳開始及び翻訳終止コドン及び、用いられ る場合には、ポリペプチドリーダー配列をコードする配列は、通常、本発明のＤ ＮＡ分子に比較されるように、非染色体ベクターの一部となる。タンパク質性分 子の発現に用いるために、通常そのベクターは、よ（知られているように、その ＤＮＡ配列の５′端に隣接し、開始コドンの上流に、リポゾーム結合部位（シャ イン・ダルガルノ配列）をも含んでいる。ここで典型的に用いられている１ａｃ Ｚプロモーターのようなベクタープロモーターは、リボゾーム結合部位を含んで いる。
このように、複製及び一般的ベクター機能に必要なこれらヌクレオチドとは別に 、そのベクターのヌクレオチド配列は、読み枠をともにして、５′末端から３′ 末端へと、転写プロモーターの５′端に隣接して、機能的に結合したりボゾーム 結合部位、翻訳開始コドンの５′端に機能的に結合した転写プロモーター、（ａ ｌ真核性生物での発現のためのリーダー配列、又は、（ｂｌ望ましいヒト内皮Ｆ ＡＩとの融合ポリペプチドとして発現される他の分子の一部の配列、又は、本発 明のＤＮＡ分子、の５′端に機能的に結合した翻訳開始コドン、（ａ）又は（ロ ）が存在する場合には、本発明のＤＮＡの５′端に機能的に結合した、（ａ）又 は（ハ）の配列、及び本発明のＤＮＡ配列を含んでいる。その５′端に隣接して 結合をもつ本発明のＤＮＡ配列は、その３′端に隣接して、翻訳終止コドンを結 合している。図２２に試しに示しであるものから明らかなように、望ましい事象 である転写そして、または、翻訳を、付加的配列が妨害、または、ヒト、又はウ シの内皮ＰＡＩに対する、発現したタンパク質分子の免疫学的同一性を妨害しな いかぎり、付加的配列が、終止コドンの３′端に機能的に結合して存在すること も可能である。いかなる付加的ヌクレオチドも、発現したタンパク質性分子によ り示されるプラスミノーゲン活性化因子に対する生物学的活性を妨害しないこと が望ましい。
そのベクターの全てのＤＮＡ配列は、そのＤＮＡを複製するのに用いる複製／発 現媒体と両立し、より望ましくは、本発明のＤＮＡ分子によりコードされる、産 物を発現することと両立しなければならないことを理解されなければな・らない 。本発明のベクターは、本発明のＤＮＡ分子を少なくとも複製（増殖）できる。
さらにそのベクターは、ＤＮＡ分子を複製できるだけではなく、ここで定義した ように、ヒトの内皮ＰＡＩと免疫学的に同じ、組換えタンパク質性分子へ、その ＤＮＡの遺伝情報を、発現もしくは翻訳できることが望ましい。
本発明の非染色体ベクターを、宿主複製／発現媒体としての大腸菌における複製 及び翻訳（発現）に有用なこれらのベクターに制限する必要はない。ＤＮＡ配列 を実質的に複製（増殖）のに用いられるどのベクターも、例えば、噴孔動物又は 真核細胞において、そのＤＮＡの複製に用いることができる。
そのような広い範囲のベクターは、適切な宿主複製媒体と同様に市販されている 。プラスミド及びバクテリオファージの両方の代表的ベクター及び宿主は、ＭＤ 州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ クションで入手でき、１９８５年、第１６＆ｉｍの“細菌、ファージ及びｒＤＮ Ａベクターのカタログにリストされている。加えて、ＩＮ州、インジアナポリス （Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌ　ｉｓ）のペーりンガー・マンハイム・バイオケミカル 社、ＭＤ州ゲデルスブルグ（Ｇａｅｔｈｅｒｓｂｒｇ）のベセスダ・リサーチ・ ラボラトリ−社、及びＭＡ州ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）のニューイングランド ・バイオラボ社から入手できるように、プラスミド、コスミド及びクローニング ベクターもリストされている。
本発明のもう１つの面に、ヒトの内皮細胞型プラスミノーゲン活性化因子インヒ ビターは免疫学的に同一な、実質的に純粋な、組換えタンパク質性分子がある。
すなわちその組換え分子により生じた抗体は、本来のヒトの内皮細胞型プラスミ ノーゲン活性化因子インヒビターと免疫反応を起こす。すでに述べたように、そ の組換え分子は、検定において有用な、交差反応抗体の分泌を誘導するのに有用 な、本来の分子のアミノ酸残基配列をもつことのみが必要である。そのように、 この分子は、すでに述べてきたように、適当な翻訳開始及び好ましくは終止コド ンを有するベクターを含む、複製／発現媒体から翻訳されうる。先に述べた免疫 学的同一性は、ウサギ中での抗体の誘導と、それにつづく、セクションＩ［［Ａ ３で後に述べられるウシ内皮ＦＡＩに対する操作により示すことができる。
実質的に純粋な組換えタンパク質性分子も、ヒトの内皮細胞型ＰＡＩの生物学的 活性を、全部ではないにしろ、いくらか所有していることが望ましい。そのよう な分子は、本発明のこの面でのもう１つの態様を構成している。
このように、ここでは、実質的に純粋な、組換えヒト内皮細胞型ＦＡＩも考えら れている。その組換え分子は、ここで述べられてきているように、リバース・フ ィブリン・オートグラフィーにより測定され、ヒトのｔ−ＰＡに結合し、その活 性を阻害することが分った。またその分子は、ｕ−ＰＡにも結合し、その活性を 阻害することが望ましい。
その組換え分子は、プロテアーゼ・ネキシン及びヒトの胎盤ＦＡＩとは免疫学的 に異なる。分子間の免疫学的差異は、いくつかの方法で、抗原的又は、免疫原的 観点から検定される。しかし、もっとも簡単には、三つの分子の免疫学的差異は 、その組換え分子に結合するポリクローナル抗体を用いた特異的結合研究で示さ れる。これらの抗体は、実質的に、プロテアーゼ・ネキシン又は、ヒトの胎盤Ｆ ＡＩとの特異的結合を持たない。その組換えヒト内皮細胞型ＦＡＩは、ウシのＦ ＡＩに対して生じたポリクローナル抗体が、その組換え及び天然のＦＡＩと免疫 学的に特異的反応を起こすという事実から証明されるように、ウシの内皮細胞型 ＦＡＩ及び天然のヒト内皮細胞型ＦＡＩと関連しており、同様のものである。
加えて、天然のヒト内皮ＦＡＩに対して生ずるポリクローナル抗体又は他のレセ プターは、ウシ及びその発現された組換えＦＡＩ分子と免疫反応を起こす。同様 に、その組換え分子に対して生じたポリクローナル抗体又は他のレセプターは、 天然のウシ及びヒト内皮細胞型ＦＡＩ分子に特異的に、免疫学的結合を起こす。
このように、発現された、組換えヒト内皮細胞型ＦＡＩは、天然のウシ及びヒト 内皮ＦＡＩ分子と免疫学的な交差反応を示す。
実質的に純粋な組換えヒト内皮細胞型ＦＡＩは、実質的に、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分 析と、コマージ・ブリリアント・ブルー染色によって確認されるような無縁のタ ンパク質やポリペプチドを含まない。例えば、その望ましい純度は、アフィニテ ィー・カラム又は吸着体として、ウシ内皮ＦＡＩに固定化したポリクローナル抗 体を含む他の吸着体を用い、一般的な溶出及びタンパク質精製手段を使うことに より達成される。
特別な態様において、その組換えヒト内皮細胞型Ｐ／ｌは、ここで述べている典 型的融合ポリペプチドのような、ポリペプチド結合グリコジル基を実質的に含ま ない。そのような分子は典型的には、大腸菌のような、真核性複製／発現媒体を 用いて発現される。
組換えヒト内皮細胞型ＦＡＩは、ポリペプチド結合グリコジル基も含むことがあ る。そのグリコジル化分子は、一般に、よく知られているように、例えば、ＳＶ ４０誘導ベクター又は他のベクターを用い、哺乳類のチャイニーズ・ハムスター ・卵巣（ＣＨＯ）又はＣＯ８細胞のような真核性細胞から発現される。
ＣＨＯ細胞及びＳＶ４０誘導ベクター又は、Ｓ、セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ）のようなイースト複製／発現媒体及びｐＴＤＴ１由来のベクターのよう な適当なベクターのような真核性複製／発現媒体及び適当なベクターも、その発 現組換え分子が、その培養培地中に分泌される場合は、特に有用である。リーダ ー又はシグナルペプチド配列をコードする核酸配列は、培養培地への組換え分子 の発現に対し用いる。
先に議論したように、その細胞外及び培養培地へＦＡＩを分泌させるために、他 の遺伝的信号をその構築物中に含ませることもある。これは、その精製操作を改 善する。原核性及び真核性システムにおいて、そのタンパク質のアミノ末端の“ リーダーペプチド”は、分泌の信号として働く。このリーダーペプチドは、宿主 の細胞性プロテアーゼにより切断され、成熟タンパク質を作る。
リーダー配列を含むそのようなタンパク質を作るために、“融合”ポリペプチド が、発現及び分泌されるべきＰＡＩのコード領域の５′端に、読み枠を同じとし て、既知の分泌タンパク質のリーダーペプチドのヌクレオチドコード領域を連結 するやり方で構築される。その切断信号は、リーダーペプチド上に存在し、その 切断依存プロテアーゼは、宿主中にあるので、正常な分泌が起こる。
この融合タンパク質戦略は、イースト及びＣＨＯ細胞でうまく行なわれている。
例えば、フィルホ（Ｐｉｌｈｏ）等は（１９８６年、バイオテクノロジー（［１ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、４巻、３１１頁）は、プロテアーゼ切断信号を含 む、イーストのアルファ因子由来のリーダーペプチドを、真核性タンパク質マウ スアルファーアミラーゼに融合したイーストでの発現のための構築物が、アルフ ァ因子プロモーターから始まり、そして培地中に成熟タンパク質として分泌され たことを報告した。他の、アルファー因子遺伝子プロモーターを用いた同様の構 築物がイースト中で、外来タンパク質を発現したことが報告されている（ビター （Ｂｉｔｔｅｒ）等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オフ ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　、ＵＳＡｓ　８ １巻、５５３０頁（１９８４年）、ブレーク（［１ｒａｋｅ）等、プロシーディ ング・イン・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　、ＵＳＡ、　８１巻、４６４２頁（１９８４年）　；及 びサイン（Ｓｉｎｇｈ）等、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、１２巻、８９２７頁（１９８４年））。
哺乳類細胞発現システムにおいて、ヘルプス・シンプレックス・パイラス・グリ コプロティンＤ由来のリーダーペプチドを、ＨＴＬＶＩ［Ｉ由来の外被グリコプ ロティンの一部に融合した。融合ポリペプチドをＣＨＯ細胞中で分泌した（ラス キー（Ｌａ５ｌｅｙ）等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３３巻、２０９頁 （１９８０年））。
生産量を高める方法として、トランスフェクトしたプラスミドのコピー数を、細 胞当り高く維持することが報告されている。このことは、発現プラスミドに、ジ ハイドロフォレート・リダクターゼ（竺）のような選択マーカーを含め、そして 、増殖のために、高いレベルの独を必要とする培地の存在下、並を欠損したトラ ンスフオームした細胞を培養することにより成し遂げられた（シモンセン（Ｓｉ ｍｏｎｓｅｎ）等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オフ・ サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、）　、ＵＳＡ、８０巻、２４９５頁（１９８３年））。同様に、ＳＶ４ ０の複製オリジンをもつ、ｐＫＳＶ−１０のような５ｖ４０を基本とするベクタ ーを、ＣＯ８細胞中、高いコピー数で維持することができた。これは、ＣＯ５細 胞が、宿主細胞の細胞質中に、自発的に複製するよう、発現ベクターのＳＶ４０ オリジンを選択的に刺激する、不完全なＳＶ４０ウイルス遺伝子を含むからであ る（グルズ７７　（Ｇｌｕｚｍａｎ）、セル（Ｃｅｌ＋）、２３巻、１７５頁（ １９８１年））。
加えて、すでに述べたように、組換えタンパク質は、いくつかの形で発現される 。１つの態様においては、そのアミノ酸配列が図２２に示した、アミノ酸残基部 位、約１　（ＤＮＡヌクレオチド番号１３〜１５）から、アミノ酸残基３７９（ ＤＮＡヌクレオチド番号１１５４〜１１５７）まで、に示されるものであるタン パク質として発現される。そのように発現し、実質的に、ポリペプチド結合グリ コジル基を含まない場合、その組換えタンパク質は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によ る測定により、約４０．０００ダルドＩ〔４０キロダルトン（ｋｄａ）　］の見 かけの相対的分子量（し１「）；ζ示した。別の態様においては、ＦＡＩは、５ ＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、約１８０　ｋｄａのＭｒをもち、図２２において、 アミノ酸残基部位−４（ヌクレオチド部位１−３）で示される式のアミノ末端ア ミノ酸残基に、ペプチド結合を通して機能的に結合したベータ・ガラクトシダー ゼ分子の一部を含む、融合ポリペプチドの一部として発現した。これらの典型的 分子は双方とも、それらが、後に議論され、また図２１に示したように、リバー ス・フィブリン・オートグラフィーにおいて、ｕ−ＰＡに結合でき、その活性を 阻害するという意味で、ヒトの内皮細胞型プラスミノーゲン活性化因子インヒビ ターと同じ生物学的活性を示した。また、その組換えタンパク質は、すでに述べ たようにアミノ末端リーダーポリペプチド配列を伴って発現することもできる。
先の議論から明らかなように、固体サポートの一部として、固体マトリックスに 固定したとき、固相競争検定システムにおいて、実質的に純粋な、組換えヒト内 皮細胞型ＦＡＩは有用である。またその組換えＦＡＩは、他の検定システムにお けるレセプター分子として使用する抗体を生じさせるのに用いる免疫原として有 用でもある。後者の使用は、生物学的活性を必要としない、実質的に純粋な組換 え、タンパク質性分子の使用と同様である。
そのようにして用いる場合、及び検定法において、固体サポートの一部として固 体マトリックスに固定して用いる場合は特に、そのタンパク質又は、融合ポリペ プチドが、組換え技術により調製したタンパク質性物質をしばしば汚染している ことが知られているような細菌の糖脂質（ＬＰＳ）、又は、他の細胞生産物を実 質的に含まないということは、あまり重要なことではない。しかし、ＬＰＳを実 質的に含まないことが望まれる、その物質をか′原として用いるような場合は、 実質的に、細菌性ＬＰＳや、他の細菌細胞破壊物を含まない、ＦＡＩを調製する のに、既知の方法を用いることができる。例えば、イセクツ（ｌ５ｓｅｋｕｔｚ ）　（１９８３年）ジャーナル・オフ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ、　Ｉｍ ｍｕｎｏｌ。
Ｍｅｔｈｏｄｓ、）　６１巻、２７１〜２８１頁及びソファ　−（５ａｆｅｒ＞ 、バイオ／チク−ノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣ−ＮＯＬＯＧＹ）　、１９８４年１ ２月、１０３５−１０３８頁及びその中の引用文献を参照せよ。複製／発現媒体 は、既知の適当なベクターとともに、発現媒体として、先に議論されている、イ ーストＳ、セレビシアエ（Ｃｅｒｅｖ　ｉｓ　１ａｅ）又は、哺乳類細胞を用い ることにより調整することができる。
■、結　果 Ａ、ウシ内皮細胞（ＢＡＥ）インヒビターの精製ＢＡＥのＣＭ（後のセクション Ｉ［ＩＡｌ及び２及び次に掲げる報告の中で述べられているように）は、繊維素 溶解インヒビターと同様（ロスクトフ（Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ）等、プロシーディ ング・イン・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、）　、ＬＩＳＡ、　８０巻、２９５６頁（１９８３年））、組織型（ｔ −ＰＡ）及びウロキナーゼ型（ｕ−ＰＡ）プラスミノーゲン活性化因子の両方を 含んでいることが以前に示された（レビン（Ｌｅｖｉｎ）等、ジャーナル・オフ ・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ。
Ｂｉｏｌ、）、９４巻、６３１頁（１９８２年））。コイカナバリンＡ−セファ ロースでのアフィニティー・クロマトグラフィーによる、このＣＭの分画で、ｕ −ＰＡとｔ−ＰＡが互いに分離されることが明らかになり（ロスクトフ（Ｌｏｓ ｋｕｔｏｆｆ）等、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、６２巻、６２頁（１９８３年）） 、そして、この方法も、そのインヒビターの精製に有効であろうことを指差した 。
ＣＭＩ！Ｊットルを、コンカナバリンＡ−セファロースカラムにかけ、そのカラ ムを、後のセクション■で述べるように処理し六−ピーク画分を集め、５ＤＳ− ＰＡＧＥで分画し、コマージ・ブリリアント・ブルーにより染色を行ってタンパ ク質を分析し、また、リバース・フィブリン・オートグラフィーにより、繊維素 溶解活性化因子及びそのインヒビターの分析を行った。図１に示されているよう に、カラムにかけたタンパク質の８５％以上は、スッポヌケ液から回収された（ プールり。この両分は、アルブミン及びｕ−ＰＡの両方を含んでいたが、インヒ ビターは含んでいなかった。いくらかのインヒビターは、回収ｔ−ＰＡ活性の大 部分を含む両分である。プール■に検出されたが（ロスクトス（Ｌｏｇｋｕｔｕ ｆｆ）等、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）　６２巻、６２頁（１９８３年））、溶解耐 性ゾーンの相対的大きさによる判定だと、全インヒビターの２０パーセント以下 しか示さなかった（エリクソン（Ｅｒ　１ｃｋｓｏｎ）等、アナリティカル・バ イオケミストリー（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１３７巻、４５４頁（１９８ ４年））。検出可能なインヒビター活性の大部分は、全タンパク質のわずか５′ ％を含むフラクションである（図２の挿入図で示したように）コンカナバリンＡ １プール■画分に回収された。それは、主要な染色されたタンパク質の１つと、 共に移動しているようである。
また、コンカナバリンＡプール■を、チューブゲルにより５ＯＳ−ＰＡＧＥで分 析し、その結果を図２に示した。電気泳動後、そのゲルをスライスし、そのスラ イスは　ＩＪＳ■−フィブリンのＵ−ＰＡ仲介の溶解を阻害する能力をテストす るため抽出を行った。
再度、そのゲルの単一領域にインヒビター活性が見い出され、それは、図２の挿 入図に示した溶解耐性のものと区別できない相対移動度（すなわち、Ｒ，＝０． ６）で移動した。このゲルのこの領域には、他のタンパク質がほとんど検出され ず、このことは、その精製がそのゲルからのインヒビターの抽出により完全であ るこ２を示している。
最も高いインヒビター活性をもつ抽出物（図２、スライス４９〜５２）を集め、 ７，５〜２０パーセント勾配ゲルで再び分析し、その結果を図３に示した。その ゲルをコマージ・ブリリアント・ブルー（図３、レーン１）又は、過ヨウ素酸・ シッフ試薬（図３、レーン２）で染色したとき、単一のタンパク質が検出され、 それは、リバース・フィブリン・オートグラフィーで明らかにされたインヒビタ ーと同じ移動度を示した（図３、レーン３）。出発ＣＭ及び種々の採集プール中 に存在するインヒビターの量を、精製インヒビターに対して作った抗血清を作っ て、ローレル（Ｌａｎｒｅｌ　ｌ）のロケット技術により測定した（スカンジナ ビアン・ジャーナル・オフ・クリニカル・ラボラトリ−・インベスチゲーシ３？ 　７　（Ｓｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｌａｂ−Ｉｎｖｅｓｔ、）　２９巻、 ２１頁（１９７７年））。
このようなスクリーニングは、ＣＭがミリリットル当り、０．６マイクログラム のインヒビターを含み、６００マイクログラムのインヒビターをカラムにかけ、 そして、最終的なゲル抽出物から９０マイクログラム回収したことを示した（図 ２、図３）。このように、この精製手順は、出発抗原の約１５パーセントの回収 率を得ることができる。精製インヒビターは、Ｍｒ標準物質を直接比較した、還 元及び非還元条件下で、約５０．０００±２．５００ダルトンの見かけ上の相対 分子量（Ｍｒ）をもっていた。
Ｂ、精製インヒビターの予備的特性化 ＰＡは、単一のアルギニソーバリン結合の解裂により、単鎖プラスミノーゲンを ２本鎖のプラスミンに転換する（スマリア（Ｓｕｍｍａｒ　ｉａ）等、ジャーナ ル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　２ ４２巻、４２７９頁（１９６７年））。
このプロセスは、還元剤の存在下、５ＤＳ−ＰＡＧＥでモニターできる（ム７　 ＝　（Ｍｕｓｓｏｎｉ）等、スロンボ・リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂ。
Ｒｅｓ、）３４巻、２４１頁（１９８４年）：スマリア（Ｓｕｍｍａｒ　ｉａ） 等、ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、　）　２４２巻、４２７９頁（１９６７年）：ダノ（Ｄａｎｏ）等、 バイオケム・バイオフィズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉａ＋、Ｂｉｏｐｌｙｓ、　Ａ ｃｔａ）５６６巻、１３８頁（１９７９年））。そのインヒビターが抗・活性化 因子であるかどうかを決めるため、この切断を阻害するその能力を検定し、その 結果を図４に示した。精製したインヒビターは、ｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡ両方の、 １１３１−プラスミノ−ケンを、特徴的な重鎮及び軽鎖へ切断する能力を阻害し 、及びそれは、投与量依存の結果を示した。ｔ−ＰＡの阻害は、図５で示した５ ＤＳ−ＰＡＧＥ後でもなお明らかな酵素−インヒビター複合体の形成と関連して いる。
集密的ＢＡＥから採集したＣＮ中に検出されるように、（ロスクトス（Ｌｏｓｋ ｕｔｏｆｆ）等、プリシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オフ・サ イエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、ＵＳＡ、８０巻、２ ９５６頁（１９８３年））、精製分子のインヒビター活性は、３７℃、６０分間 、ＰＨ２，７のインキュベーションでも、又ＳＤＳにさらしても破壊しなかった （図６）。逆に、精製したプロテアーゼ・ネキシンのインヒビター活性は、これ らの処理で破壊した。これらのタンパク質のインヒビター活性は、５％２−メル カプトエタノールの存在下、３７℃、３０分間のインキュベーションでは影響を 受けなかった。
’Ｃ，Ｌ　（３，４，５−１〕ロイシン存在下で培養したＢＡＥからのインヒビ ターの精製 血漿及び血清は双方とも、ＩｍＭ！素溶解のインヒビターを−１，−いる（ロス クトフ（Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ）、ジャーナル・オプ・セル・フィジオロジー（Ｊ 、　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）　９６巻、３６１頁（１９７８年）；ムレル ッ（Ｍｕｌｌｅｒｔｚ）　、プログレス・イン・ケミカル・フィブリツリシス及 びトロンポリシス　（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｃｈｅａ＋１ｃａｌＦｉｌｒｉ ｎｏｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ）、ダビッドソン（［１ａ ｖｉｄｓｏｎ）等線、３巻、２１３−２３７頁、シーベン・プレス・ニューヨー ク（１９７８年）；コレン（Ｃｏｆｆｅｎ）　、Ｉ−ｔ＋ンボ・ヘモスタス（Ｔ ｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、）４３巻、７７頁（１９８０年））。培養 した内皮細胞は、これら血清タンパク質をインターナライズ又は結合し、ひきつ づき、それらを、血清を含まない媒体に、ＣＭｍ製時に、逆放出する（シーへン （Ｃｏｈｅｎ）　、ジャーナル・オフ・クリニカル・インベスチゲーション（Ｊ 、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、）　５２巻、２７９３頁、（１９７３年）；バ スタン（Ｐａ５ｔａｎ）等、セル（Ｃｅｌｌ）　、１２巻、６０９頁（１９７７ 年）；ローリッヒ（Ｒｏｈｒｉｃｈ）等、ジャーナル゛・オプ・セル・フィジオ ロジ−（Ｊ。
Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、１０９巻、１頁（１９８１年）：７クフアーソ ン（Ｍｃ　Ｐｈｅｒｓｏｎ）等、ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミスト リー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｎ、）２５６巻、１１３３０頁＜１９８１年） 。
インヒビターが実際にＢＡＥにより合成されるのか、単に、混入している血清イ ンヒビターなのかを決定するため、非ｍＲｃＭから、そのインヒビターを精製す るために開発されたのと同様の手順を用い、Ｌ　（３，４，５−’Ｈ〕ロイシン 存在下で培養した細胞のＣＭからインヒビターを精製した。低及び高塩存在下コ ンカナバリンＡ−セファロース・カラムをアルファ・メチル・マンノシドで溶出 すると、２つの放射性標識されたピークが回収された。
そのインヒビターを含むピーク■画分を集め、それを、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析 し、その結果を図７に示した。インヒビター活・ｄ及び大部分の放射活性は同じ 画分から回収された。ピーク・インヒビター画分（図７の画分５２．５３）を集 め、透析し、ひきつづく、アルカリＰＡＧＥにかけても（図８）、これら２つの 活性は、同じ移動度を示した。総合すると、これらのデータは、インヒビターが 、その細胞の生合成産物であり、混入した血清タンパク質でないことを示してい る。
上記の結果を確かめ、クローン化したＢＡＥによるインヒビター合成量を定量す るため、免疫沈澱スクリーニングを行った。その結果を以下の図９及び表１に示 す。
表！ ＢＡＥによるインヒビターの合成 ａ、　種々の画分及び免疫沈殿中の総ＴＣＡ沈殿放射活性は、この分野でよく知 られている標準的方法により、測定した。各データは各ステップにおける出発物 質中（ＣＭ）のｃｐｓに対するパーセント（カンフで示されている）に標準化し ている。
ｂ、　各々の場合において、後のセフシラン■で述べるように、およそ、１．５ Ｘ１０’個の細胞を、Ｌ　（３，４，５−”）Ｉ）ロイシンを用い（２０Ｃｉ／ ｓｊ）　、２４時間で標識化した。血清を含まないＣＭ（１５■ｊりを集め、示 されているように、分画した。
このような、免疫学的スクリーニングにおいて、クローン化したＢＡＥから集め た放射性標識したＣＭを、精製したインヒビターに対する抗体と混合してインキ ュベート（生物学的検定条件に維持）した、結合物質を、抗体タンパク質入−セ ファロースビーズから抽出し、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、そしてオートラジオ グラフィーで分析した（図９）、およそ、ｓｏ、ｏｏｏダルトンの計値をもつ、 単一の放射能標識されたポリペプチドが明らかにされ、そして、リバース・フィ ブリン・オートグラフィーで分析してみると、それは、インヒビター活性を有し ていた。このタンパク質は、前免疫血清で調製したタンパク質Ａ−セファロース ビーズには吸着しない、これら免疫沈殿スクリーニングで分析した種々のＣＭか ら回収された全放射能活性、及び精製の各ステップでの放射能標識されたタンパ ク質回収物（図７−８９表夏）は、そのインヒビターが合成され、２４時間に細 胞により分泌された全タンパク質の２．５〜１２パーセントであることを示した （表■）。
Ｄ、　インヒビターの機能検定法の開発と評価（インヒビター結合検定法）ポリ 塩化ビニル（Ｐ　Ｖ　Ｃ）プラスチックウェルを、種々の濃度のｔ−ＰＡと、４ ℃で一晩コートし、ポリ塩化ビニルマトリックスにｔ−ＰＡを固定し、図１０で 示したように本発明の検定法のための至適ｔ−ＰＡ濃度を測定した。そのウェル を洗浄し、ＢＳＡでブロックして、非特異的タンパク質結合部位を除き、そして 、３種類の濃度の精製インヒビター（２０，５０及び１１００ｎ／ｓＪ）と、３ ７℃で２時間、維持（インキュベート）し、複合体を形成させた。洗浄後、その ように形成した複合体を、ウサギ抗−インヒビターレセプター（１００分の１希 釈）を加えてこれとインキュベートし、ついで、ｌｌ５Ｉ−ヤギ抗ウサギＩｇＧ 　（１，５Ｘ１０’ｃｐｍ／ウェル）を加えることにより、その結合量を定量し た。ｐｖｃウェルをコートするのに用いたｔ−ＰＡ濃度が、０、１から１．０マ イクログラム／ｍｌと増加するにつれ、すべての三つの濃度において、結合イン ヒビターの検出量は増加した（図１０）、ｔ−ＰＡコシー濃度を、ｌマイクログ ラム７’ｓ１以上に増加することは、結合インヒビターの検出量の増加にはつな がらなかった。従って、今後行うスクリーニングには、ｔ−ＰＡを固定するＰｖ Ｃウェルのコーティングに、１マイクログラム／−２のｔ−ＰＡ濃度を採用する 。
インヒビターと、固定化したｔ−ＰＡとの相互作用の速度論をインヒビター含有 溶液の至適維持（インジケ−ター・ン）時間を決めるため測定した。精製したイ ンヒビター（１００ｎｇ／ａ＋ｆ　）を、種々の時間、ｔ−ＰＡ又はＢＳＡコー トしたウェル中、３７℃でインキュベートした。その後、結合インヒビターを、 ウサギ抗インヒビターレセプター（１：　１００）とひきつづく、１２５１−ヤ ギ抗ウサギＩｇＧ　（１，５Ｘ　１０’　ｃｐｍ　／ウェル）により定量化した 。インヒビターと固定化ｔ−ＰＡとの反応は、３０分以内に７５パーセント以上 起こるという速い反応であった（図１１）。
このＩＩ間内に、インヒビターは、コントロールの、ＢＳＡでコートしたウェル に結合しなかった。便宜上、以後のスクリーニングには、インヒビター含有溶液 のインキュベーション時間は１時間を採用した。
ポリクローナルレセプターの維持（インキュベーション）時間及び、指示手段結 合時間も同様に至適化した。ｔ−ＰＡ又は、ＢＳＡでコートしたウェルを、イン ヒビター（５０ｎｇ／ｍｉ’）と３７℃で１時間インキュベートし、さらに、種 々の時間、ウサギの抗インヒビターレセプターとインキュベートした。結合した レセプターを、インジケータ（１２ｓＩ−ヤギ抗ウサギＩｇＧ　）と２時間イン キュベーションすることにより検出した。その検定において、レセプター及びイ ンジケーター共、その各々の抗原と、１．５〜２時間後、８０パ一セント以上の 結合を生じるという速い会合を示した（図１２）。従って、以後のスクリーニン グには、レセプター及びインジケーターに対するインキュベーション時間として ２時間を採用した。
インヒビターの検出に関する、ウサギ抗インヒビターレセプターの希釈の影響を 測定し、検定感度を至適化した。ｔ−ＰＡコシーしたウェルを、種々の濃度のイ ンヒビター（１−１００ｎｇ／ｍｊり種々に希釈した（１：５０〜１：５００） ウサギ抗インヒビターレセプターとインキュベートし、結合した抗体を　１２８ ３−ヤギ抗ウサギＩｇＧ　（１，５Ｘ１０’　ｃｐａ＋　／　ｍｌ）で検出した 。インヒビターの至適検出は、その抗血清の１：５０〜１ニア５希釈のときであ った。（図１３）。以後のスクリーニングには、１ニア５希釈の抗血清を採用す る。１１８■−ヤギ抗ウサギＩｇＧの濃度変化（２，５×１０４〜３ｘ１０ＳＣ ｐＩＩＩ／ウエル）の効果も、コノ検定法ノ感度を至適化するため、スクリーニ ングした。インヒビターの至適検出は、１１５１−ヤギ抗ウサギＩｇＧ　２．５ 〜５Ｘ１０’　ｃｐｔｔｒ　／つ、ＪＬ／のときであった（図１４）。
本検定法で検出されるように、精製したインヒビターの典型的標準投与一応答白 線を、図１５に示した。この検出は、ｌｎｇ／ｓｊ！の感度があり、１０から１ ００ｎｇ／ｍ１のインヒビターに対し、線型な応答を示し、２５０ｎｇ／ｍ１以 上のインヒビター濃度で飽和する。ウシの大動脈内皮細胞ならし培地を用いた投 与一応答も図１５に示した。標準白線とこの曲線との比較は、このＣＭ試料は、 約１００ｎｇ／ｍ１の機能的活性をもつインヒビターを含んでいることを示して いる。便宜上、未知試料中のインヒビター濃度を計算する目的で、両対数プロッ トをした（図１６）。このようなプロットでは直線となることがわかる。
Ｅ、　インヒビター結合検定法と、リバース・フィブリン・オートグラフィーと の比較本発明の機能検定法（インヒビター結合検定法）の感度を、ＰＡインヒビ ターの検定及び定量に一般的に使われる別法である、リバース・フィブリン・オ ートグラフィーの感度と比較した。種々の濃度（０，５ｎｇ〜Ｌｏｎｇ／レーン ）のインヒビターを、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、リバース・フィブリン・オー トグラフィーで分析した。その結果を図１７に示す。この技術においては、洗浄 したポリアクリルアミドゲルをフィブリン、プラスミノーゲン及びＰＡを含む、 インジケータゲル上に置く。
インヒビターが相当するゲルに存在する領域以外では、プラスミンが徐々に形成 し、ゲルの全般的溶解が起こる。リバース・フィブリン・オートグラフィーの感 度は２，５ｎｇ／レーン（図１？）であり、０．１ｍｊ２を各レーンにかけるの で、その感度は、２５ｎｇ／−２であるので、インヒビター結合検定法よりも２ ５倍も感度が低い。
Ｆ、　インヒビター結合検定法の応用 本発明のインヒビター結合検定法を、精製酵素と、インヒビターの相互作用の研 究に用いた。三つの精製ＰＡ　（ｔ−ＰＡ、　ｕ　−ＰＡ及びストレプトキナー ゼ）を、精製インヒビター（５０ｎｇ／−１）と３７℃１時間インキュベートし 、そのインヒビターがひきつづき、ｔ−ＰＡに結合する能力を有するかどうか、 インヒビター結合検定法で定量した。外から加えたｔ−ＦＡ及びｕ−ＰＡは、イ ンヒビターへの結合に関し、固定化ｔ−ＰＡと競争することが分り、図１８に示 したようにｔ−ＰＡ１２ｎｇ／ｍｌ又はＵ−ＰＡ６ｎｇ／ｍ１の場合に得られる 結合の５０％減少をもたらした。
ストレプトキナーゼも、ＤＦＰ−不活性化ｔ−ＰＡ（データ示さず）も、固定化 ｔ−ＰＡに対するインヒビターの結合に影響を与えなかった。
本発明のインヒビター結合検定法は、ヒトの血漿及び血清中のインヒビターを検 出するのにも用いた。血漿及び血清を１６名の健康な提供者からの血液から調製 し、各試料中のインヒビター活性を、インヒビター結合検定法で測定した。正常 なヒト血漿は、図１９に示したように、低く、又は、検出不能なレベルのインヒ ビターしか含んでいない。一方、これら提供者からの血清は、図１９に示したと おり、高いレベルのインヒビター活性を含んでいた。
最後に、この検定法を、正常な提供者及び、ヘモスタチックシステムに異常をも つ提供者由来の血漿中のインヒビターレベルを測定及び比較するのに用いた。結 果を下の表Ｈに示した。
表　■ 正常人及び患者血漿中のインヒビターの検出正常血漿　１　：　５　１５００　 Ｎ、Ｄ、１１：１０　７００　Ｎ、口。
患者血漿　１：５　４７００　２５ １：１０　２３００　２５ ″Ｎ、　Ｄ、”インジケータ検出されず（２ｎｇ／１１以下）これらの試料は、 Ｂ、ワイマン（ＬａＩａｎ）博士に提供していただいた。このスクリーニングに より、正常人の血漿中には、インヒビターは検出されず、一方、患者血漿中のそ れは、およそ、２５ｎｇ／ｃａｌであったことが分かる。この同じ患者は、ワイ マン（Ｍｉａ＋ａｎ）の（トロンボシス・リサーチ（Ｔｈｒｏａｂｏｓｉｓ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ）３１巻、４２７頁（１９８３年））異なる検定法で研究すると 、さらに高いインヒビター値を有することが示された。
Ｇ、　胎盤中の内皮細胞型ベーターＰＡＩ活性の同定ヒトの胎盤粗抽出物２０マ イクロリツトルを、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（レムリ（Ｌａｅｍａ＋１ｉ）　（１９ ７０年）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　（Ｏンドン）、２２７巻、６８０〜６ ８５頁）及びリバース・フィブリン・オートグラフィー（ＲＦＡ）（エリクソン （Ｅｒｊｃｋｓｏｎ）等、（１９８４年）、アナリティカル、バイオケミストリ ー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１３７巻、４５４−４６３頁）で、ＦＡＩ 活性を分析してみると、約５０〜５５ｋｄａの計値を有する２つのインヒビター ゾーンが明らかになった。免疫沈殿による研究は、その２つのインヒビターゾー ンは、胎盤型ＰＡＩ［アステット（Ａｓｔｅｄｔ）等、（１９８５年）トロンボ ・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）、５３巻、１２２ −１２５頁）及び内皮細胞型ＦＡＩ［Ｏスクトフ（Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ）等、等 、（１９８３年）プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オフ・サ イエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ）　Ｕ　Ｓ　Ａ　８０ 巻、２９５６−２９６０頁；エメイス（１，ｗｅｉｓ）等（１９８３年）、バイ オケム、バイオフィズ・レス・コム（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｐｈｙｓ。
Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ）　１１０巻、３９２−３９８頁；ソーセン（Ｔｈｏｒｓ ｅｎ）等（１９８４年）、バイオヒム・パイオフィス・アクタ（Ｂ　１ｏｃｈ　 １Ｉｌｌ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）、８０２巻、１１１〜１１８頁；バンモリク（Ｖａ ｎ　Ｍｏｕｒｉｋ）等、（１９８４年）、ジャーナル・オフ・バイオロジカ）Ｌ ｔ−ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　）　２５９巻、１４９１４ −１４９２１頁）の両方の存在から生ずることを示した。放射性免疫検定法を用 いた定量化では〔シュリーフ（Ｓｃｈｌｅｅｆ　）等（１９８５年）、ジャーナ ル・オフ・ラボラトリー−クリニカル・メディシン（Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ 、　Ｍｅｄ、）　１０６巻、４０８−４１５頁）、その抽出物が、内皮（ベータ ）ＦＡＩをミリリットル当り２７０ナノグラム含むことを示した。
胎盤組織は、抽出前にしくごく洗浄しているので、このベータＦＡＩは、胎盤中 に含まれる細胞により合成されたものであり、血清混入物ではないと考えてよい であろう。それゆえ、胎盤を、ベータＰＡＩのｃＤＮＡ単離源として採用した。
Ｈｏ　ヒト・ベータＰ　Ａ　Ｉ　ｃＤＮＡの単離ヒトの胎盤ｍＲＮＡから調製し たｃＤＮＡ挿入物を含むλｇｊ＋＋発現ライブラリーからの、およそ７Ｘ１０’ 個の組換えファージを、ＣＡ州、う・ジョラ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）　、う・ジョ ラ・キャンサー・リサーチ−７、ンデーシ：ｙ　ン（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ　Ｃａｎ ｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、キャンサーーリサーチ“ センター（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　０Ｃｅｎｔｅｒ）のジョセ・ミラ ン（Ｊｏｓｅ　Ｍｉｌｌａｎ）博士から入手した。その発現ライブラリーは、ミ ラノ（ＭｉｌＩａｎ）　（１９８６年）、ジャーナル・オフ・バイオクジカフ１ ／−ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、）、　２６１巻、３１１ ２−３１１５頁に公開されており、ここで参考文献として掲げているが、そこに は％ｌＸ１０’個の独立した組換えファージが含まれている。
そのファージ感染した大腸菌由来の細胞質抽出物を、ベータＰＡｌ又は、λｇｔ 、ベクターによりコードされているベータ・ガラクトシダーゼ分子の一部にその アミノ末端を介して、融合したＰ／ｌを含む融合ポリペプチドを発現する、クロ ーン化ｃＤＮＡを含む、それらファージを同定するため、免疫学的にスクリーニ ングした。
３４個の陽性ファージが得られ、そのうちの半分は、第２スクリーニングを通じ て、陽性を維持した。３個の陽性クローンを任意に選択し、そのプラークを精製 し、そのファージＤＮＡを精製した。
λ８．２、λ、及びλ１．．と命名した３個のクローン由来のファージＤＮＡを 、ＥｃｏＲＩで消化し、そのｃＤＮＡ挿入物の長さは、各々１．９．３．０及び １．９キロ塩基対（ｋｂ）であった。λ、由来の、ＥｃｏＲＩ　３．　Ｏｋｂ　 ｃＤＮＡ挿入物を、ｐＢＲ３２２ｍ導プラスミドベクターｐＧＥＭ−３にサブク ローンし、ポリバー（Ｂｏｌ　１ｖａｒ）等（（１９７７年）、ジーン（Ｇｅｎ ｅ）　、２巻、９５−１１３）により報告されている、単細胞複製／発現媒体と して、大腸菌ＭＣ１０６１を用いて、組換えプラスミドρＰＡＩ３を作った。サ ブクローンしたｃＤＮＡ挿入物を［１ｃｏＲＩで消化し、アガロースゲルを用い て、精製した。そのｃＤＮＡｈｌｉ入物をニック・トランスレーションし、高張 条件下、λ１．。
及びλ１，２にハイブリダイズすることが示され、このことは、３個のクローン 中のＤＮＡ挿入物が互いに関連していることを明らかにした。
３系統の証拠が、その三種の単離クローンがヒト内皮細胞型（ベータ移動）ＦＡ Ｉである又は、これを含むタンパク質性分子をコードするという結論を支持して いる。
（ｉ）　高頻度溶層性株（Ｙ１０８９：ＡＴＣＣ３７１９６）にλ１．２を感染 させることにより調製した大腸菌の溶層性株の誘導により、精製したＢＡＥベー ターＰＡＩに対して生じた抗血清から、アフィニティー精製したＩｇＧにより確 認された、約１８０．０００ダルトンの見かけ上の相対分子量（Ｍｒ＝　１８０ 　ｋｄａ　）を有する、組換え融合ポリペプチドの発現が起った（図２０、レー ンＢ）。
λｇｊ＋＋で溶原化した、もしくは、そのｃＤＮＡ挿入物を含まない大腸菌は、 そのような免疫反応性のタンパク質は生産しなかった（図２０、レーンＣ）。
（ｉｉ　）　組換え融合ポリペプチド上での、ＢＡＥベータＰＡＩに対する抗血 清のアフィニティー精製は、ウェスタンプロットにおいて、精製ＢＡＥベータＰ ＡＩを確認する抗体を生じたので、その１８０　ｋｄａの組換え融合ポリペプチ ド及びＢＡＥベータＰＡＩは、抗原エピトープを共有している（図２０、レーン Ｄ）。
（ｉｉ　）　Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　ＥついてＲＦＡによる大腸菌の分析は そのｌ、　９　ｋｄａ挿入物を含む、λ３．．溶原体溶層ＡＩ活性を発現するが 、λｇｔ＋＋溶原体は発現しない（図２１、レーンＢ）。
驚くべきことに、それぞれＭｒｓ　１８０　ｋｄａ及び４Ｑｋｄａの、２つの組 換えタンパク質性ＰＡＩがλ９．．抽出物の中に存在した。
これらのＦＡＩの関係を研究するため、溶層体由来のタンパク質を、５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥで分画し、再度、ウェスタンプロットで分析したが、今回は、オートラジ オダラムを、より長い露光の後に現像した（図２１、レーンＥ、Ｆ）。２個のポ リペプチドが検出され、これらは、インヒビター活性と同じ移動度をもつ（レー ンＢ、Ｅと比較せよ）。λ、−２溶原体溶層り作られる最大のベータＦＡＩ抗原 は、およそ１８０　ｋｄａのＭｒ位置に検出されたが、計４０ｋｄａの位置にも 少量の抗原が検出された（図２１、レーンＥ）。
２つのＦＡＩは免疫学的及び生物学的性質を共有しているので、小さい方は、ベ ータ・ガラクトシダーゼ−ＰＡＩ融合ポリペプチドのタンパク質分解プロセッシ ングにより、大きい方のものから誘導されたものであろう。放出された４Ｑｋｄ ａのタンパク質の特異的活性は、それが、もはや、融合ポリペプチド断片により 立体障害をうけていないため、より大きい融合タンパク質のものより高い値を示 した。しかし、おそらく立体障害により、特異的活性が低くても、１８０ｋｄａ の融合ポリペプチドは、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター活性を示し、 そして、ＢＡＥ−ＦＡＩとの免疫学的関連（同じ）性を示した。ｔ−ＰＡに結合 し、これを阻害するという、観察された生物学的活性は、その複製／発現媒体が 原核性細胞であり、そして、そのタンパク質性分子が哺乳類由来のものであるこ とから、驚くべきことである。加えて、その本来の分子はグリコジル化され、一 方、発現した融合ポリペプチド及び小さい４Ｑｋｄａタンパク質は、実質的にグ リコジル化を含まない。従って、その発現したタンパク質性分子が、本来の分子 とは異なる折りたたみ方であることが予想され、そして、グー９コシル化を含ま ず、一方では、本来の分子はグリコジル化されているにもかかわらず、その発現 したタンパク質性分子は、本来の、哺乳類タンパク質と同じ生物学的活性を示し た。
宿主大腸菌ＭＣ１０６１株中に含まれる組換えプラスミドｐＰＡＩｓは、メリー ランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ）　、ｏ−ｔクビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）のアメリ カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に登録した。それは、１ ９８６年８月１９日に受理され、ＡＴＣＣ号と命名された。
本登録は、登録期間が、その保管場所における保管に対する最新の要請から５年 間に対する保管期日から３０年間か、又は、その出願が満了する、米国特許の有 効期限のいずれか長い方であるという、ブタペスト協約に準じて行なわれる。そ の組換えプラスミド含有細胞が、その保管所で死滅したならば、再び補給される 。
■　ヒト・ベータＦＡＩをコードするＤＮＡ配列と、タンパク質配列決定。
クローンλ３の３．　Ｏｋｂ　−ｃＤＮＡ挿入物の両方の鎖のＤＮＡ配列は、ゾ ール（Ｄａｔｅ）等の方法（（１９８５年）、プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）、 １３巻、３１〜４０）により、構築されたプリージョンサブクローンの配列決定 を行うことにより確かなものにした。図２２に推論されるアミノ酸配列とともに 、そのＤＮＡ配列を示した。未翻訳領域・開始コドン及び全んどのシグナルペプ チドは、その分子の５′端から欠除しているので、これは全長のＤＮＡではない 。
アミノ末端又は成熟タンパク質をコードするコドンを同定するために、誘導した アミノ酸残基配列を、我々の研究室で、他の手段で単離した、部分的に配列決定 したヒト内皮ＦＡＩ及びウシベータＦＡＩと並べてみた。成熟ヒト内皮細胞型Ｆ ＡＩのアミノ末端残基は、バリン（Ｖａｌ、　Ｖ）であることが分った。その整 列化に基づき、図２２で１番に割当てたバリンは、ヒト内皮（ベータ）ＰＡＩの アミノ末端残基である。
２つの始めに得られたクローンは、−４番のアミノ酸残基部位のコドンが異なっ ていた。そのコドンのうちの１つは、セリン（Ｓｅｔ、　Ｓ）残基をコードしく λ、）、一方、もう１つは（λ３．．）は、グルタミン酸残基（Ｇｌｕ、　Ｅ） をコードしていた。グルタミン酸がその部位の正しい残基であることがわかり、 図２２にはそう示しておいた。
天然のヒト・ベーターＰＡＩは分泌され、それゆえ、シグナルペプチドを含むよ うである（プロベル（Ｂｌｏｂｅｌ）等、（１９７５年）ジャーナル・オフ・セ ル・バイオロジー（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）６７巻、８５２−８６２頁） 。通常、シグナルペプチダーゼは、グリシン・アラニン及びセリンのような小さ な中性側鎖残基のカルボキシル側を切断する（ウォン・ヘイン（Ｗｏｎ　Ｈｅ１ ｊｎｅ）　（１９８４年）ジャーナル・オフ・モレキユラー・バイオロジー（Ｊ ８Ｍｏ１．Ｒｉａｌ、）１７３巻、２４３−２５１頁）。したがって、１番のバ リンのアミノ末端側のアラニン（Ａｌａ）は、シグナルペプチドの末端残基であ ろう。
図２２に示した読み枠は、多数の終止コドンをもたない唯一のものであり、そし て、３８３残基とそれにつづ＜ＴＧＡ終止コドンをコードしている。−１番のア ラニンと、１番のバリンの間での切断による、推定シグナルペプチドの除去は、 ３７９残基長で、４２７７０ダルトンの炭水化物を含まない分子量をもつ成熟ベ ータ・ＦＡＩを生ずる。この計算は、そのａ＋ＲＮＡの、イン・ビトロ（ｉｎ　 ｖｉｔｒｏ）での翻訳により測定したＢＡＥベータＰＡＩの非グリコジル化型の 分子量とよく一致する（ソーディ（Ｓａｗｄｅｙ）等、（１９８６年）、トロン ボ・リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、）　４１巻、１５１−１６０頁）。
ヒトのベータ・ＦＡＩはグリコジル化されており（パン・モウリク（Ｖａｎ　Ｍ ｏｕｒｉｋ）等、（１９８４年）ジャーナル・オフ・バイオロジカ）Ｌｔ−ケミ ストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、）、２５９巻、１４９１４〜１４９２１ 頁）、図２２のアミノ酸残基配列は、部位２０９−２１１．２６５−２６７、及 び３２９−３３１に、正規のａｓｎ−Ｘ−ｓｅｒ　／　ｔｈｒ配列を満たす、３ 個の推定されるグリコジル　化部位を含む（マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）　 （１９７４年）バイオケミカル・ソサイアティー・シンポジウム（Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、　Ｓａｃ、　Ｓｙｍｐ、）　４０巻、１７〜２６頁）。
３、０　ｋｂ　ｃＤＮＡの３′側の非翻訳領域は、ポ！Ｊ　（Ａ）領域を除いて 、１７８８塩基対である。共通のポリアゾニレ−ジョン配列ＡＡＴＡＡＡは、ポ り（Ａ）結合部位の上流１６塩基のところにみられ、このことは、この配列が一 般的に、ポリアゾニレ−ジョン部位の上流１５〜２５塩基のところに存在すると いう従来の報告と一致している（ブラウトフット（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ）、（１ ９７６年）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　（ｏンドン）２６３巻、２１１− ２１４頁）。
１、９　ｋｂのｃＤＮＡ挿入物をもつ２つのクローンを部分的に配列決定した結 果、これらは同一のものであるようだ。またこれらのクローンは、それらが、短 縮化され、そして多くの３′側非翻訳領域を欠いている（すなわち、ヌクレオチ ド１９６０番から３′側を欠いている）こと以外、３．０　ｋｂ　ｃＤＮＡと同 じである。プローブとして、３．０　ｋｂ　ｃＤＮＡを用い、ヒトのフィブロザ ルコーマ細胞系列ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣＣＣＬ　１２１）由来の全ＲＮＡのノ ーイン・プロット分析は、３．０及び２．２　ｋｂ長の２つの異なる転写物の存 在を示した（図２３）。この観察は、１．９　ｋｂ　ｃＤＮＡが、より短かいＲ ＮＡ転写物からコピーされたものであることを示している。ｍＲＮＡの３′端の 同じ大きさの異種性が他のシステムでも観測されている。これは、別のスプライ シング事象、多くのポリアゾニレ−ジョンシグナルの使用又は１つ以上の遺伝子 の発現に起因しているのかもしれない〔クラブトリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ）等（ １９８２年）セル（Ｃｅｌｌ）　、３１巻、１５９−１６６、キング（Ｋｉｎｇ ）等（１９８３年）セル（Ｃｅｌｌ）　、３２巻、７０７−７１２頁；上フック （Ｈｉｃｋｏｋ）等、（１９８６年）プロシーディング・イン・ナショナル・ア カデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、）、ＵＳＡ、８３巻、５９４−５９８頁）。この場合のメカニズムは明 らかになっていない。
このｃＤＮＡ配列中にみられる唯一のポリアゾニレ−ジョン・コンセンサス・シ グナル（ＡＡＴＡＡＡ）が、３．０　ｋｂ　ｃＤＮＡの３′端に存在するが（図 ２２）、同様であるが若干修正している配列（ＡＡＴＡＡＴ）がヌクレオチド部 位１９９ｇ−２００３に存在する。この配列が、ポ！Ｊ　（Ａ）付加のシグナル として用いられているなら、より短かい転写物の存在を説明することができる。
他のシステムにおいて、ポリアゾニレ−ジョンは、ＡＡＴＡＡＡ配列の不在下で も起こることが知られている（オークボ（０ｈｋｕｂｏ）等、（１９８３年）、 プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ。
８０巻、２１９６−２２００頁）。
ファースト・プロティン・分析ホモロジープログラム（リップマン（Ｌｉｐａａ ｎ）等（１９８５年）サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ）、２２７巻、１４３５−１ ４４１頁）を用いた、誘導したアミノ酸配列と、他のタンパク質との比較で、ベ ータ・ＦＡＩは、アンチトロンビンＩＩＩ　（ＡＴｎＩ）、アルファ、−アンチ トリプシン（アルファ、ＡＴ）、アルファ、−アンチキモトリプシン及びオバル ブミンと２５〜３０％のホモロジーをもっており、したがって、セリン・プロテ アーゼ・インヒビター・スーパーファミリーのタンパク質　・（セルピン）の− 員である。セルピンは、５００万年以上前の分子から分岐してきたもので（カレ ル（Ｃａｒｒｅｌｌ）等（１９８５年）、トレンズ・イン・バイオケミカル・サ イエンス（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｓｃｉ、）　ｌ　Ｑ巻、２０〜２４頁）、現在では、身体の主要なタンパク質分 解カスケードをコントロールする多くのグループの関連タンパク質を示している （たとえば、凝析、補体、繊維素溶解及び炎症カスケード）。
セルピンの阻害的特異性は、反応中心における単一アミノ酸、いわゆるＰ、残基 により、基本的に限定されているようだ（カレル（Ｃａｒｒｅｌｌ）等、（１９ ８５年）、トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンス（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、Ｓｃｉ、）　、１０巻、２０〜２４頁）。
一般に、このアミノ酸残基は、目標プロテアーゼの既知の特異性を反映している 。セルピンの反応中心は、カルボキシ末端近くに存在し、それが、その分子の他 の部分から突き出ているため（カレル（（：ａｒｒｅｌｌ）等、（１９８５年） 、トレンズ・イン・バイオケミカＪＬ／−サイエンス（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、Ｓｃｉ、）　１０巻、２０〜２４頁）、プロテアーゼに対する理想的基 質又は１餌”を提供している。
プロテアーゼ阻害は、インヒビターと酵素の１＝１の複合体形成に関連している 。そのベータＦＡＩ、アルファ、ＡＴ及びＡＴ■の反応中心のアミノ酸残基配列 を、１文字アミノ酸残基命名法を用い、図２４に並列して示した。
この整列化において、部位３４６のＲ（ａｒｇ）残基がＰＡＩのＰ１残基である 。プラスミノーゲン活性化因子は、単一のａｒｇ−ｖａｌ結合の切断により、プ ラスミノーゲンをプラスミンに転換する（コレン（Ｃｏｌｌｅｎ）　（１９８０ 年）トロンボ、ヘマトスタシス（ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍａｔｏｓｔａｓ　ｉｓ） 、４３巻、７７〜８９頁）。従って、この整列化は、既知の、ＰＡのａｒｇ特異 性との一致を示している。Ｐ　＋ｙ残基がグルタミン酸（Ｅ）であるという知見 も、このグルタミン酸がセルピン中の“蝶番”の役割をはたし、今日まで配列決 定されてきている全てのセルピンにおいて保存されていることから、この整列化 を支持するものである（カレル（Ｃａｒｒｅｌ）等（１９８５年）トレンズ・イ ン・バイオケミカル・サイエンス（Ｔｒｅｎｄｓ　ＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉ）　ｌ 　Ｑ巻、２０〜２４頁）。
ヒトのベータＦＡＩは、異常にも酸化剤に対し、感受性があり、低濃度のクロラ ミ７Ｔの存在下で、迅速にその活性を失う。誘導されたタンパク質配列中にシス ティンがないことから（図２２）、及び酸化的に不活性化したベータＦＡＩが、 メチオニン・スルホキシド・ペプチド・リダクターゼによる処理で回復すること から、その活性の消失は重要なメチオニンの酸化を反映しているようだ。
ベータＦＡＩの反応中心のメチオニン（すなわち、部位３４７、Ｐ、部位）は、 アルファ＋ＡＴも、酸化に対し、感受性があり、その消失がＰ１メチオニンの酸 化に関連していることから（カレル、（Ｃａｒｒｅｌ）等、（１９８５年）トレ ンズ・イン・バイオケミカル・サイエンス　（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ５ｃｉ）、１０巻、２０−２４頁）、その候補者であろう。両方の場合において 、生じたメチオニンスルホキシドは、かさ高い残基であり、その基質プロテアー ゼのポケットに容易に納まらないであろう。
その活性化部位の酸化により、選択的にアルファ、ＡＴを失活させる能力は、こ のシステムの重要で独特な制御の特徴である。
炎症箇所で、活性化した好中球は、酸素フリーラジカルの分泌により、インヒビ ターを中和することができる（カレル（Ｃａｒｒｅｌｌ）等、（１９８５年）、 トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンス）、１０巻、２０〜２４頁）。こ の付加的レベルの制御は、基本的組織の破壊が、通常好中球エラスターゼ存在下 を阻害するインヒビターの存在下でさえ、発生する手段を提供している。増加す るＦＡ活性は組織破壊、組織改造及び新しい器官の形成と相関がある（レヴ二一 として、ダノ（口ａｎｏ）等、（１９８５年）アドバーンス・キャンサー・リサ ーチ（Ａｄｖ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）　４４巻、１３９−２６６頁）。こ れら組織中に存在するベータＦＡＩを酸化的に失活させる能力も、ＰＡを、それ らインヒビターの存在下で機能させる、これらシステムの重要な制御の特徴であ る。従って、酸化剤の局所的発生は、アルファ＋ＡＴ及びベータＰＡＩの双方を 失活させ、そして、そのプロセスにおいて、エラスターゼ、プラスミン及びコラ ゲナーゼを含むタンパク質分解酵素のカスケードを解放する（モスカテリ（Ｍｏ ｓｃａｔｅｌｌｉ）等（１９８０年）、“プロテアーゼ及び腫瘍侵入“Ｐ、スト ル！Ｊ　（Ｓｔｒｕｌｉ）編（シーベン・プレス・ニューヨーク）１４３〜１５ ２頁）。
■　材料と方法 Ａ、　検定法関係 １、プラスミノーゲン活性化因子 組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）を、リケン（Ｒｉｊｋｅｎ）等 （ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅａｐ、）　、２５６巻、７０３５頁（１９８１年））により報告されている、 ヒトのメラノーマ細胞調整培地から単離した。簡単にいうと、ヒトのメラノーマ 細胞を、６パーセントのＣＯ３を補った３囲気中、３７℃で、プラスチック製培 養フラスコ（ファルコンオクスナード（Ｏｘｎａｒｄ）　、ＣＡ州）中で集密化 単層に生育させる。生育培地は、炭酸水素ナトリウム（培地１リットル当り、７ ．５パーセント溶液１６ｊ２）及び、Ｌ・グルタミン（培地１リットル当り、２ ００ｍＭ溶液１０ｍｊ２）及び熱不活性化新生ウシ血清（最終濃度、１０パーセ ント）を補った修正型、イーグル基本培地１００ｍＡを含んでいる。その細胞を 仔ウシ血清を含まない培地で洗い、２５Ｉ１１１の血清を含まない培地中でイン キュベートした。生じたならし培地（ＣＭ）で収穫及び置換を３日間連続してく り返し、７０００ｘｇ、３０分間の遠心を行ない、使用するまで一２０℃に保存 した。指示した時には、アプロチニン（カルバイオケムーベーリング、ラジョラ （ＬＡ、　Ｊｏｌｌａ）ＣＡ州）を、血清含有及び血清を含まない培地に加えた （最終濃度、２０Ｋｉｌｌ／ｍＪり。
市販されているウロキナーゼ（ＮＹ州、レンセリア（Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ）ス ターリン−ランスロップ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ−１１ｉｎｔｈｒｏｐ）、５Ｘ１０ ’ＣＴＡユニツトのウィンキナーゼ）を、ホルムバーブ（Ｈｏｌｍｂｅｒｇ）等 （バイオヒム・バイオロジー・アクタ（Ｂｉｏｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔ ａ）。
４４５巻、２１５頁（１９７６年））により報告されているように、アフィニテ ィー・クロマトグラフィーでさらに精製した。
２、プラスミノーゲン活性化因子インヒビターインヒビターの精製に用いた、ウ シ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＳ）を、ボイス（Ｂｏｏｙｓｅ）等（トロンボ、ダイ アセス、ヘモ（Ｔｈｒｏｍｂ。
Ｄｉａｔｈｅｓ、Ｈａｅｍｏｒｒｈ、）　３４巻、８２５頁、（１９７５年）） の方法により、ウシの大動脈から単離しくその教えを参考文献に掲げた）、レビ ン（Ｌｅｖｉｎ）等（トロンボ、リサーチ（Ｔｈｒｏｓ＋ｂ、　Ｒｅｓ、）、１ ５巻、８６９頁（１９７９年））により報告されているように、１０％のウシ胎 児血清（ＣＡ州、サンタナ（Ｓａｎｔａ　Ａｎａ）、アービン、サイエンティフ ィック社（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、））を補った修正イーグル培 地１５ｍｊｉ！を入れた、１５０ｃＩＩＩフラスコ（ＣＡ州、オクスナード（Ｏ ｘｎａｒｄ）　、ファルコンプラスチック社）で培養した。スクリーニングのた めの細胞を、１：５の比率で、１６〜２２回通過させ、そして一般に、以下に述 べられているように、ならし培地（ＣＭ）Ｉｍ製前に少なくとも１週間集密化さ せた。
いくつかの代謝ｌＩ識ススクリーニング、クローン化したＢＡＥを用いた、これ らのクローンは、最初の細胞調製から生育した単一細胞に由来する。簡単に言う と、新しく単離した細胞を、６０閣培養皿に植えつけ、−晩付着させる。その細 胞を、予め温めた培地で洗い、トリプシンでその培養皿から解放しくＮＹ州、ロ ングアイランド（Ｌｏｎｇ　ｌ５ｌａｎｄ）、ギブコ）、ピペットで穏やかに分 散させ、そして、生育培地中、ミリリットル当り約２０個の細胞にまで希釈する 。その希釈細胞４〜５個の部分標本（各５０マイクロリツトル）を、クーパー皿 の蓋の逆さにした無菌的な下側に置き（ＣＡ州、オクスナード（Ｏｘｎａｒｄ） 　、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）製）、室温で６０分間インキュベートして付着 させた。各細胞液滴の位置をペンで印をつけた後、その蓋を６．７＋ｉｊ２の生 育培地中の集密化ＢＡＥを含むクーパー皿の底にかぶせた。その集密化ＢＡＥを 、この培地中で２４時間維持し、成長因子を作らせた（ガドセク（Ｇａｊｄｎｓ ｅｋ）等ジャーナル・オフ・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、） 　８５巻、４６７頁（１９８０年））。その印をした領域を顕微鏡で観察し、単 一細胞を含むこれらの領域で細胞の生育を、何日間か連続してモニターした。こ れらのクローンが数千個の細胞に増殖したとき、その細胞を、トリプシンの存在 下、リング・クローニングで取り出し、１００マイクロリツトルの生育培地を入 れた０、５ｃｍマイクロプレートのウェルに分配（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ） 　）　、集密化するまで増殖させた。空の蓋も、この方法のコントロールとして 、ＢＡＥを含むクーパー皿の底にかｊｐせておいた。これらの蓋は、インキュベ ーション時間を通して、細胞はみられず、このことは、底の細胞が離れ、蓋の方 に再び付着することはないことを示している。この操作で作ったクローンは、因 子関連抗原に対し陽性で、このことは、それらが内皮細胞からなることを示して いる（ジャフ（Ｊａｆｆｅ）等、ジャーナル・オフ・クリニカル・インベスチゲ ーション（Ｊ、Ｃｈｉｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、）５２巻、２７５７頁（１９７３年） 。
それからその集密化単層を、１５ｍ１のＰＢＳで２度洗い、つづいて、１５＋ｎ Ａ’の血清を含まない培地とインキュベートした。
２４時間後、生じたＣＭを集め、４００ｘｇ、５分間の遠心を行ない、アジ化ナ トリウム及びトウィーン８０（ＭＯ州、セントルイス（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ）シ グマ（Ｓｉｇｍａ）社製）を各々、０．０２パーセント及び０．０１パーセント の濃度になるよう加えた後、使用するまで、−３０℃で保存した。ＣＭ約１リッ トルを、予め、０．０２パーセントのアジ化ナトリウム及び０．０１パーセント のトウィーン８０（ポリオキシエチレン（８０）ソルビタン・モノオレート〕を 含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で平衡化しておいた、１０ｍ１のコニカナバリ ンＡ−セファロース（ＭＯ州、セントルイス、シダ？−ケミカル（Ｓｉｇｍａ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社製）カラムに、４℃で１０ｍ１／ｈの流速で通した。
素抜は物質を採集した後、そのカラムを、少なくともカラム容積の１０倍のＩＭ ＮａｌＪｌ、０．０１バーセントドウイーン８０及び０．０２パーセントのアジ 化ナトリウムを含むＰＢＳ（ｐＨ７，４）で洗浄し、非特異的に吸着しているタ ンパク質を除いた。そのカラムを、およそ同体積の、ＮａＣ１を含まない同バッ ファで洗い、その後２ステップで溶出を行った。まず、０．５Ｍアルファメチル −Ｄ−マンノシド（ＭＯ州、セントルイス、シグマケミカル社ＩＰＩ′″０．０ ２パーセントアジ化ナトリウム及び０．０１バーセントドウイーン８０を含む０ ．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，２）を、２．５ｔａ１／　ｈの流速で、タ ンパク質を溶出した。２度目は、カラムを、ＩＭＮａＣｊ？を含まない同バッフ ァで溶出した。
精製の第２ステツプは、分取５ＤＳ−ＰＡＧＥである。インヒビターを含む両分 （スラブゲル電気泳動及びリバース・フィブリン・オートグラフィーで同定した もの）を集め、そしてその部分標本（２２５マイクロリットル）を、チューブゲ ルの５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。マーカー色素がゲルの底に到達したとき、その ゲルを凍結し、１閣厚にスライスした。２枚のスライスを合わせ、０．０１パー セントのトウィーンを含むＰＢ３２ａｊ！で、４℃、２４時間の抽出を行った。
その後、各抽出物について、＋′Ｉ−フィブリン・プレート・検定法（以下に述 べる）により、インヒビター活性をテストした。インヒビター活性のピークを含 む両分を集め、使用するまで、−７０℃で保存した。
また、インヒビターは、Ｌ　［３，４，５−’Ｈ）ロイシンの存在下で培養した 細胞から採集したＣＭからも精製した。この場合その培養物を、１５ｍ１のロイ シンを含まないＭＥＭ　（ＮＹ州、ロングアイランド・ギブコ（ＧＩＢＣＯ）） で２度洗浄し、その後、Ｌ［３，４，５−３８〕ロイシン（ＭＡ州・ボストン・ 二ニー・イングランド・ニュークリア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａ ｒ）、１５８ｃｉ／ｍｍｏｊり、２０マイクロｃｉ　／ｍｌを含む、ロイシン・ フリーＭＥＭ１５ｓｉの存在下でインキュベートした。２４時間後、その培地を 上述のごとく採集し、非ａ［ｆｋｃ　Ｍ　５５　ｍｌｌと合わせ、２１ｍＡ’の コンカナバリンＡ−セファロースカラム（０，６Ｘ　３．５ａ１）に４ｍ１／ｈ の流速で流した。カラムを洗浄し、１ｆｆ１１／ｈの流速で溶出した。再び、イ ンヒビター含有画分を集め、そして、分取用チューブゲル電気泳動にかけた。生 成したインヒビター含有ゲル抽出物を、使用するまで一７０℃で保存した。
以後詳しく述べるように、精製インヒビターに対するポリクローナルレセプター をウサギ中で作る。プロティンＡ−セファロースＣＬ−４８（ＮＪ州、ビス力タ ウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）　、ファルマシア・ファイン・ケミカルス社製 ）を、０．０２パーセントのアジ化ナトリウム、０．０５パーセントのトウィー ン２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕及び０．１パ ーセントのウシ血清アルブミン、を含むＰＢＳで再水和し、１０倍過剰のこのバ ッファで３回洗浄した。この抗血清のＩｇＧ画分を、製造業者の説明書に従がい 、抗インヒビター試薬又は、免疫前血清４０マイクロリットル当り、およそ８０ マイクログラムのプロティンＡ−セファロースの割合で洗浄したビーズに結合し た。そのＩｇＧ　：ｌ−トしたビーズを、（３，４，５−’Ｈ）０イシン（Ｄ存 在下で培養したクローン化ＢＡＥから採集したＣＭ１＋＋＋ｊｉ！に加えた。
その試料を、室温で１時間インキュベートし、そのビーズを、遠心で洗った後（ ＩＩｌｌｌのＰＢＳ−）ウィーンバッファで３回）、０゜０２５バーセン）ＳＤ Ｓ、２０パーセントグリセリン、０．０２５パーセントブロモフエノール・ブル ー及び２．５パーセント（Ｖ／Ｖ）２−メルカプトエタノールを含む、０．２５ 　Ｍ　）リス−塩酸（ｐＨ。
６．８）を用い、３７℃、１時間で抽出した。生じた上清を、スラブゲルの５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥ又は液体シンチレーション計数で分析した。
それから、スラブゲル（１５Ｘ１　ｏｘｏ、ｔ　５ａａ）又は、チューブゲル（ ＩＱＸｏ、５ｃｍ）での５ＤＳ−ＰＡＧＥを、ここで参考文献として掲げている レムリ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ）　（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、（ロンドン）、 ２２７巻、６８０頁（１９７０年））の方法に従って行った。スラブキング・ゲ ルは、４パーセントのポリアクリルアミドゲルからなり、そして、分離ゲルは、 ９パーセントのポリアクリルアミドゲルからある（両ゲルとも３％の架橋を有す る）。
分離ゲルにおいて７．５〜２０パーセントのポリアクリルアミドの勾配からなる スラブゲルも調製した。電気泳動後、そのゲルを固定し、１パーセントのコマー ジ・ブリリアント・ブルー（ＣＡ州、リッチモンドバイオラド社）を含む５０％ トリクロロ酢酸、又は、ギンスバーグ（Ｇｉｎｓｂｕｒｇ）等（メソッド・イン ・ヘマトロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｆｌａｅＩＩｌａｔｏｌｏｇｙ）　、 バーカー（Ｈａｒｋｅｒ）等線、８巻、１５８〜１７６頁、チャーチヒル・リビ ングストン、　ＣｈｕｒｃｈｈｉｌｌＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ）、ニューヨーク （１９８３年））の方法に従い、過ヨウ素酸・シッフ試薬で染色した。
精製インヒビターの見かけ上の分子量を測定するために用いた分子量標準物質に は、ホスホリラーゼＢ　（９２，５００）、ヒトのプラスミノーゲン（９０，０ ００）、トランスフェリン（７７、０００）、ウシ血清アルブミン（６６、２０ ０）、ヒト血清アルブミン（６６、０００）、オバルブミン（４３，５００）、 カルボニツタ・アンバイトラーゼ（３１，０００）、ソイビーン・トリプシン・ インヒビター（２１，５００）、リゾチーム（１４，４００）及びヒトのフィブ リノーゲンの６６、０００．５２．３００及び４６．５００サブユニツトが含ま れる。
放射性標識したタンパク質の位置を決めるため、染色したスラブゲルを、ボンナ ー（Ｂｏｎｎｅｒ）等（ヨーロピアン・ジャーナル・オフ・バイオケミストリー （Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、４６巻、８３頁（１９７４年））によ り報告されているように、オートラジオグラフィーのため乾燥し、処理した。チ ューブゲル中の放射性標識したタンパク質の位置は、そのゲルを１　ｍｍ片にス ライスし、上述のように、そのゲルスライスをバッファで抽出し、そして、各フ ラクション中の放射活性を測定した。
アルカリ（ＳＤＳなし）連続ＰＡＧＥは、ゲル及びランニングバッファとして０ ．３７　Ｍ　）リス・グリシン（ｐＨ９，５）を用い、バーテン（Ｈｊｅｒｔｅ ｎ）等（アナリティカル・バイオケミストリ（Ａｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、１１巻、２１９頁（１９６５年））の方法に従って行っ た。チューブゲルは、２．５パーセントの架橋を含む、１０パーセントポリアク リルアミドである。試料を４０パーセントスクロースにし、ゲルに乗せ、最初は 、２．５ｍＡ／ｃｊ、　０．５時間、ついで、５ｍＡ／ｃａｒで１〜１．５時間 の電気泳動を行った。
アイソエレクトリック・フォーカシング・ゲルは、オファーレル（Ｑ　Ｉｐａｒ ｒｅｌｌ）　（ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｒｉ ａｌ、　Ｃｈｅｌｌ、）　、２５０巻、４００７頁（１９７５年）の方法に従が い、ガラスチューブ（２，５ｍｒｎ　）中に作った。形成したｐｔ＋勾配は、そ のゲルをｌ　＋ｎｍスライスに切断して測定した。各２個のスライスを合わせ、 ９．２ｍＪの水へ、４℃、１８時間で抽出し、各抽出物のＰＨ及び放射活性を測 定した。また、平行ゲルからのスライスを、０．２１１＋１のＰＢＳ／）ウィー ンで抽出し、インヒビター活性及び放射活性を検定した。ポリアクリルアミドゲ ル中のインヒビター活性は、そのゲル抽出物の、　１！Ｓ■−フィブリンのｕ− ＰＡ仲介の溶解を阻止する能力を直接測定するか（ロスクトフ（Ｌｏｓｋｕｔｏ ｆｆ）等のフィブリン−プレート法、プロシーディング・イン・ナショナル・ア カデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、５ｃｉ）、ＵＳＡ１７４巻３９０３頁（１９７７年）） 、又は、エリクソン（Ｅｒ　１ｃｋｓｏｎ）等（アナリティカル・バイオケミス トリー（Ａｎａ　１．　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、）、１３７巻、４５４頁（１９８４ 年））による、リバース・フィブリン・オートグラフィーにより、その位置決め を行った。後者の技術において、そのインジケータフィルムにおける白色の溶解 耐性ゾーンは、そのスラブゲル中にインヒビターが存在することによる。
変性条件Ｔでの、そのインヒビターの安定性を測定するため、精製分子（２０マ イクログラム／ｌ１１）を、ヒトの血清アルブミン、２５マイクログラム／　ｍ ｌを含む、０．０２Ｍのグリシン（ｐＨ２，７）中、３７℃、１時間インキュベ ートした。その試料を、３培容の同バッファ（ｐＨ＆１）を加えて中和し、ひき つづき、同バッファで種々に希釈したものを、　１２５■−フィブリン・プレー ト・検定法により、残存する活性をテストした。またインヒビター（２０マイク ログラム７ｍ１ｌ）を０．０２５パーセントＳＤＳ及びアルブミン（２５マイク ログラム／ｍｊりを含むＰＢＳ中、３７℃、１時間インキュベートした。そのＳ ＤＳを、０．１８パーセントのトリトンＸ−１００［ポリオキシエチレン（９） オクチル・フェニル・エーテル〕を含む同バッファ、３倍容を加えることにより 中和し、残存するインヒビター活性を測定した。グリシン及びＳＤＳの代りにＰ ＢＳで処理した試料を、これらスクリーニングのためのコントロールとして用い た。精製プロテアーゼ、ネキシン（１６０マイクログラム／１ｍｌりのインヒビ ター活性に関する、酸グリシン及びＳＤＳの効果を同方法で測定した。
３、　ポリクローナル・レセプターの形成そのインヒビターに対する血清を、１ １１１１の食塩水に溶かし、ｌｌ１１１の、７０インド完全アジユバン）（ＩＬ 州、ネイパービル（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ）、マイルス　ラボラトリーズ（Ｍｉ ｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でエマルジョン化した精製インヒビター２ ０マイクログラムを、ニューシーラントウサギに皮下注射することにより作った 。食塩水０．５＋＋＋Ｊ！に溶解し、同量の不完全フロイント・アジュバント（ ＩＬ、ネイバービル、マイルス・ラボラトリーズ）でエマルジョン化したｌＯマ イクログラムの精製インヒビターを用いたニしく注射を２週間後に行った。その インヒビターに対するポリクローナルレセプターを含む血清を第３及び第４免疫 化の１０日後に採集した。
４、ｔ−ＰＡに対するインヒビターの結合検定法リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中 の精製ｔ−ＰＡ（５０マイクロリツトル／ウエル、１マイクログラム／ｌ１１） を、Ｕ底マイクロプレート（ＣＡ州、オクスナード（Ｏｘｎａｒｄ）　、ファル コン、ＰｖＣ，プラスチック、ファルコン３９１１、マイクロテスト■）中、４ ℃で一晩インキコベートした。この、そして、全てのこれに続くステップで、そ のプレートを、５ＰＲＩＡバツフア（０，１バーセン）ＢＳＡ、０．０５パーセ ントＮａＮ５及び０．０５バーセントドウイーン２０を補ったＰＢＳ）で洗浄し た。そのプラスチック上の残存する部位を“ブロック”するため、ウェル中、３ パーセントＢＳＡ（２００マイクロリツトル／ウエル）を、３７℃、１時間イン キュベートした。試験試料及び、精製インヒビターの標準白線を希釈バッファを 用いて作り（３パーセントＢＳＡ、５ｄＥＤＴＡ、０．１バーセントドウイーン ８０及び０．０２パーセン）　ＮａＮ５）、５０マイクロリツトル／ウエルで３ ７℃、１時間インキュベートした。結合したインヒビターを、ウサギの抗インヒ ビターレセプター（希釈バッファでの１＝７５希釈、５０マイクロリツトル／ウ エル）と、３７℃、２時間インキュベートすることにより、検出した。その後、 結合抗体−インヒビター−ｔ−ＰＡ複合体を、１２Ｓ■標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ 　（５ｘｌＯ’ｃｐｍ　／ウェル、ＰＡ州、コクランビル（Ｃｏｃｋｒａｎｖｉ ｌｌｅ）カッペル・ラボラトリーズ（ＣａｐｐｅｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｓ）と 、３７℃、２時間インキュベートすることにより定量化した。そのウェルを個々 に切り、そして、各ウェル中の放射活性を、ガンマ計数器で測定した（Ｗ！州、 ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、ゼネラル−ｘレフトリック（Ｇｅｎｅ ｒａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）、ＣＴ　（８０−８００）ＣＴ／Ｔ）。
５、雑 プラスミノーゲンを、デユーシュ（０ｅｕｔｓｃｈ）等（サイエンス（５ＣＩＥ ＮＣＥ）、１７０巻、１０９５頁（１９７０年））の方法に従がい、リジン−セ ファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、古いヒトの血漿 から精製した。タンパク質は、ウシ血清アルブミンを標準物質とした、ブラッド フォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の方法（アナリティカル、バイオケミストリー（ ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ、＞　１２巻、２４８頁（１９７６年））により測定し た。
ＰＡ活性は、ロストコツ（Ｌｏｓｔｋｏｆｆ）等の方法（プロシーディング・イ ン・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、　７４巻、３９０３頁（１９７７ 年））に従がい、＋２５１−フィブリンをコートした多穴組織培養皿で検定した 。タンパク質は、固体ラクトパーオキシダーゼ／グルコースオキシダーゼ試薬（ ＣＡ州、リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）　、バイオ・ラドラボラトリーズ（ Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））と、キャリヤーを含まないＮａ ”Ｊ　（Ｉ　Ｌ州、アーリントン・バイア　（ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉＡｒｌ ｌｎ、アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　）を用いるか、又は、その標識間隔 をわずか５分間とし、温度を４℃に修正した、フレーカ−（Ｐｒａｋｅｒ）等（ バイオケム・バイオフィズ・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏ　ｃｈｅｍ 、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、）８０巻、８４９頁（１９７８年 ））のヨード・ジエン操作により、′２Ｓ１による酵素的標皿を行った。最終産 物の典型的比活性は、タンパク質マイクログラム当り、１〜４　Ｘ　１０　’　 ｃｐｍであった。ウシフィブリノーゲン（ＣＡ州、う・ジョグ（Ｌａ　Ｊｏｌｌ ａ）　、カルバイオケムーベーリング（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ ）　、フラクション■）を、モセソン（Ｍｏ５ｅｓｓｏｎ）　（バイオヒム・バ イオフィズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉａ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）　５７巻、２０４頁（１９６２年））により示され た方法により精製し、プラスミノーゲンを除いた。プロテアーゼ・ネキシンは、 スコツト（５ｃｏｔｔ）等（ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー （Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ＣｈｅＩｌｌ、）２５８巻、１０４３９頁（１９８３ 年））の方法により精製し、また、ＫＳ州、ローレンｘ　（Ｌａｗｒｅｎｃｅ） 　、カンサス大学のＪ、ベーカ−（Ｂａｋｅｒ）博士より提供していただいた。
１２ｓｌ−プラスミノーゲン切断検定法は、ロスクトフ（Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ） 等（ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー（、Ｌ　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｍ、）　２５６巻、４１４２頁（１９８１年））及び、ムソニ（Ｍｕｓｓｏ ｎ　ｉ）等（トロンボ、リサーチ（Ｔｈｒｏａ＋ｂ。
Ｒｅｓ、）　、３４巻、２４１頁（１９８４年））の方法により行った。
Ｂ、　ベータ・ＦＡＩ関係 １、試　薬 制限酵素、アルカリホスファターゼ、Ｔ’４ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡポリ メラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ■のクレノーフラグメント及びＴ４ＤＮＡポリメ ラーゼは、ベーりンガー・マンハイＡ　にｍｂＨから購入した。フル７７　”Ｐ ｄＧＴＰ　（３０００ｃｉ／ｇｎｍｏｊ！　）及び３’５ｄＡＴＰ−アルファ・ Ｓ　（６００ｃｉ／ｍ　ｔａｏｌ　；　１ｃｉ＝　３７ＧＢｑ＞は、アマ−ジャ ム（Ａｍｅｒｓｈａｓ＋）から購入した。ヒトのアルファ・トロンビンはＪ、７ ｚン）ン（Ｆｅｎｔｏｎ）　（Ｎ　Ｙ州、ニューヨーク、アルバニー（Ａｌｂａ ｎｙ）　）氏から提供していただき、フィブリノーゲンは、ＣＡ州、う・ジョグ （Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）　、カルバイオケムーベーリング（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ −Ｂｅｈｒｉｎｇ）から購入した。精製ヒト・ウロキナーゼ［ｗ、Ｈ，０，ウロ キナーゼ・スタンダード（プレパレーショ７６６〜４６）〕は、ナショナルイン スチチュート・フォー・バイオロジカル・スタンダード・アンド・コントロール （ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｔ ａｎｄａｒｄ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏ＋　）　（英国、ロンドン、ハンプステッ ド（１ａｎｐｓｔｅａｄ）、ホリヒル（Ｈｏ１ｌｙｈｉｌｌ））から入手した。
ヒト・プラスミノーゲンは、デユーシュ（Ｄｅｕｔｓｈ）等（＜１９７０年）、 サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１７０巻、１０９５〜１０９６頁）の操作法に 従がい、入手及び精製した。ＢＡＥベーターＰＡＩの精製及びそれに対する抗体 の生成は、パン・モリク（Ｖａｎ　Ｍｏｕｒｉｋ）等（（１９８４年）、ジャー ナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）　 ２５９巻、１４９１４〜１４９２１頁）の方法により行った。胎盤ＰＡＩの抗血 清は、ＮＹ州、ニューヨーク、ロックフェラー大学のジェームス・ワン（Ｊａｍ ｅｓ　Ｎｕｎ）博士からいただいた。ファージλｇｔｔ＋は、ＡＴＣＣから、Δ ＴＣＣ３７１９４！：して入手した。
２、粗胎盤抽出物の調製及び分析 凍結したヒトの胎盤（３，５ｇ）をＰＢＳで洗浄し、４℃で、０．５％トリトン Ｘ−１００［ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル〕を含むＰＢ Ｓ１５＋ａｊ２で抽出した。その組織を、ダウンス・ホモジナイザーでホモジナ イズし、細胞破壊物を、１０．０００ｘ　ｇ、　１０分間の遠心でとり除いた。
その抽出物について、リバース・フィブリン・オートグラフィー〔エリクソン［ Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ）等、（１９８４年）、アナリティカル、バイオケミスト１ｌ −（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１３７巻、４５４〜 ４６３頁〕により、そのインヒビター活性を検定した。ヒト胎盤型ＦＡＩ及びウ シ・ベータＦＡＩに対する単一特異性抗血清を、プロティンＡ−セファロースに 結合し〔スウェーデン、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、ファルマシア（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ）３　、先に報告されているように用い〔ヴアン・モウリク（Ｖａｎ 　Ｍｏｕｒｉｋ）等、（１９８４年）、ジャー１　ナル・オフ・バイオロジカＪ し・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）２５９巻、１４９１４〜１ ４９２１頁、ソーディー　（Ｓａｗｄｅｙ）等、（１９８６年）、トロンボ・リ サーチ（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、）　、４１巻、１５１〜１６０頁〕、抽出物 中に存在するＦＡＩを免疫沈殿化させた。。
３、　λｇｔ＋＋　ｃＤＮＡライブラリーの免疫学的スクリーニング、未熟（３ ４週間）ヒト胎盤から誘導し、ｌＸｌ０’個の独立した組換えファージを含む、 ヒトλｇｊ＋＋　ｃＤＮＡライブラリーを〔ミラン（Ｍｉｌｌａｎ）、（１９８ ６年）、ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｒｉａｌ、 　［”ｈｅｍ、）　、２６１巻、３１１２〜３１１５頁〕を、抗体プローブとし て、精製したＢＡＥベータＰＡｌに対する抗体〔ヴアン・モウリク（Ｖａｎ　Ｍ ｏｕｒｉｋ）等、（１９８４年）、ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミス トリー（Ｊ。
Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｗ、）　２５９巻、１４９１４〜１４９２１頁〕のアフィニ ティー精製したＩｇＧフラクション〔クアトレヵサス（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ ）、（１９６９年）、バイオケム・バイオフィズ・リサーチ・コミュニケーショ ン（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、）　３５巻、 ５３１〜５３７頁〕を用い、ベータＦＡＩに対して、免疫学的なスクリーニング を行った〔ヤング（Ｙｏｕｎｇ）等、（１９８３年）、プロシーディング・イン ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイパンｘ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、　８０巻、１１９４〜１１９８頁；ヤング（Ｙｏｕ ｎｇ）等、（１９８３年）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２２巻、７７８ 〜７８２頁；バイン（Ｎｕｙｎｈ）等、（１９８４年）、”ＤＮＡクローニング 技術”実際的アプローチ、Ｄ、グロバー（Ｇｌｏｖｅｒ）　＃１４１（オックス フォード、ＩＲＬプレス）〕。
抗体の結合を視覚化するため、′２５■標識したプロティンＡ〔５５ミリキエー リー／ミリグラム（ｍｃｉ　／■）〕を用いた。オートラジオグラフィーは、そ のフィルターで、−８０ｔにおいて増悪スクリーンを用いて、コダックＸＡＲ５ フィルムを感光させることにより行った。
４、大腸菌分解物のウェスタン・プロット分析ラムダｇｊ＋　＋及び組換え溶層 体の誘導、及び、惑染大騙菌の粗抽出物の調製を先に報告されているように行っ た〔バイン（ｌｕｙｎｈ）等、（１９８４年）、“ＤＮＡクローニング技術”実 際的アプローチ、Ｄ、グロバー（Ｇｌｏｖｅｒ）　ｍ、（オフクスフォード、Ｉ ＲＬブレス）〕０発現したＰＡＥのウェスタン・プロット分析のために、粗抽出 物５０マイクロリツトル（μｌ）を、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分画した〔リムリ　（ Ｌａｅｍｍｌｉ）　（１９７０年）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、（ロンドン ）２２７巻、６８０〜６８５頁〕、そのタンパク質を、電気泳動的にニトロセル ロース紙に移行させ、べ−りＰＡＩアフィニティーカラム（上述）又は、単離し た実質的に純粋な融合ポリペプチドで精製した抗血清の免疫グロブリン画分を用 い、先に報告されているように〔ラムレ（Ｌａｍｍｌｅ）等、（１９８６年）、 トロンボ・リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、）　、４１　Ｓ。
７４７〜７５９頁；ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）等（１９８４年）、ジーン・ アナリティカル・チク−’−７り（Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ＋Ｔｅｃｈ＋）　１巻、 ３〜８頁〕、免疫プロンティングを行った。
単離した、実質的に純粋な融合ポリペプチドでの抗血清のアフィニティー精製の ため、誘導した大腸菌分解物の粗抽出物９００μ／（バイン（Ｈｕｙｎｈ）等、 （１９８４年）、“ＤＮＡクローニング技術１実際的アプローチ、Ｄ、グローバ ー（Ｇｌｏｖｅｒ）繻（オックスフォード、ｒＲＬプレス））を、５ＤＳ−ＰＡ ＧＥで分画し、ニトロセルロース紙に移行させた。Ｍｒ１５０〜２００キロダル ドア　（ｋｄａ　）のタンパク質物質を含むストリップを、ニトロセルロースシ ートから切り出し、抗血清のアフィニティー精製に用いた。
ニトロセルロースフィルターストリップのブロッキング、ＩＨＩ的抗体の結合、 及び洗浄は、抗体プローブを用いた、λｇＬ＋　ｔライブラリーのスクリーニン グで述べたように行った〔バイン（Ｈｕｙｎｈ）等（１９８４年）、′″ＤＮＡ ＤＮＡクローニング技術的アプローチ、Ｄ、グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）　ｌｌ ａ　（オックスフォード、ＩＲＬブレス）〕、結合した抗体を溶出させるため、 そのフィルターストリップを、０．０２％ウシ胎児血清を含む０．１　Ｍグリシ ン−ＨＣ＆パンファー（ｐ）１２．５）　、２００μｌと、３分間、２回インキ ユベートシた。溶出してきた物質を、０．５　Ｍ　）リス−塩酸（ｐＨ８，０） １４０μｉを加えて、中和し、１晩、透析し、そして、ウェスタン・プロンティ ング分析での一次抗体として用いた。
５、核酸法 （ａｌＰＡＩ遺伝子のクローニング及び配列決定プレート・ライセード法により 調製し、ＣｓＣ１平衡遠心により精製したファージ粒子を、ファージＤＮＡ’の 精製に用いた〔、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、（１９８２年）、′モレ キュラー・り０−ニング、ラボラトリ−マニュアル、ＮＹ州、コールド・スプリ ング・ハーバ−・コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−〕、プラスミ ドＤＮＡを、バーンポイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）等（（１９７９年）、ヌクレイ ンク・アシフズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、）　、７巻、 １５１３〜１５２２頁）の方法、及び、つづく、２回の連続したエチジウムブロ マイド／ＣｓＣ１平衡遠心により単離した。酵素反応は、業者により示されてい る条件を用いて行った。全ＲＮＡは、培養したＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣＣＣ Ｌ　１２１）から、バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）等１１９７９年）、バイオケミス トリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、１８巻、５１４３〜５１４９頁）の方 法に従がい調製し、ホルムアルデヒドの存在下でのアガロースゲル電気泳動によ り分画し〔フェラス（Ｆｅｌ　Ｉｏｕｓ）等、（１９８２年）、プロシーディン グ・イン・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　、ＵＳＡ、７９巻、３０８２〜３０８６頁〕、そ して、ノーイン・プロット分析にかけた（、）−７ス（Ｔｈｏｍａｓ）　（１９ ８０年）、プロシーディング・イン・ナシヨナル・アカデミ−・オプ・サイエン ス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ）　、ＵＳＡ％　７７３％、 、５２０１〜５２０５頁）。
λｇＬ＋＋・クローンからのＤＮＡを、ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼで消化し 、切断したｃＤＮＡ挿入物を、バクテリオ・ファージＭ１３クローニングベクタ ー５ｐ９（メリック（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、（１９８２年）、ジーン（Ｇｅｎｅ） 　、１９Ｓ、　２６９〜２７６頁〕又は、プラスミドベクターｐＧＥＭ−３（Ｗ 　Ｉ州、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、プロメガ・バイオチク（Ｐｒｏ＊ｅｇａ 　Ｂｉｏｔｅｃｈ））にサブクローンした０両方向性をもつ、ｃＤＮＡ挿入物を 含むＭ１３クローンを単離し、ゾール（Ｄａｌｅ）等（（１９８５年）、プラス ミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）、１３巻、３１〜４０頁）の−末鎖Ｍ１３法を用いて、 両値のプリージョン・ライブラリーを作った。配列決定の前に、Ｍ１３テンプレ ートの大きさを、０．７％アガロースゲル電気泳動で測定し、選択したテンプレ ートを、グイデオキシ・チェーン・ターミネーション法〔サンガー（Ｓａｎｇｅ ｒ）等、（１９７７年）、プロシーディング・イン・ナシヨナル・アカデミ−・ オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、　７４巻、５４６３〜５４８７頁〕で配列決定した。
両方のＤＮＡ鎖を配列決定し、各鎖の８０％以上が、２回以上の配列決定を行な われた。
ＤＮＡ配列データの処理は、スティデン（Ｓｔａｄｅｎ）　（スティデン（Ｓｔ ａｄｅｎ）、（１９８２年）、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅ ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　、１０巻、４７３１〜４７５１頁〕を用いて行 った。ホモロジーサーチは、パーソン・ファースト・プロテインホモロジー・プ ログラム〔リフブマン（Ｌｉｐｓａｎ）等、（１９８５年）、サイエンス（Ｓｃ ｉｅｎｃｅ）、２２７巻、１４３５〜１４４１頁〕を用いて行った。
山）　真核生物での発現 （ｉ）　哺乳類細胞での組換えＤＮＡの発現による、ＰＡＩの産生 哺乳類のチャイニスハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞でＦＡＩ遺伝子を発現できる 組換えＤＮＡベクターを、本分野でよ（知られており、マニアチス（Ｍａｎｉａ ｔｉｓ）等（モレキュラー・クローニング；ラボラトリーマニエアル、コールド スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２年））により詳細に述べられて いる方法を用いて構築した。
ラムダ３クローンＤＮＡ又はプラスミドｐＰＡ１ｓ　ＤＮＡを、制限エンドヌク レアーゼＥｃｏＲＩによる制限エンドヌクレアーゼ消化にかけ、ついで、生じた ３キロ塩基対断片を、サイス分別により精製した。その３ｋｂの制限エンドヌク レアーゼ消化ＤＮＡの３′粘着末端を、ＤＮＡポリメラーゼ■のクレノーフラグ メントを用いて充填した０次の配列ＧＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＣを有する 合成オリゴヌクレオチド断片を、カルザース（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）等（ジャー ナル・オフ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー（Ｊ、Ａ−、Ｃｈｅｗ、Ｓ ｏｃ、）１　０　３　巻、　３１８５頁　（１９８１年）　）　及びゲイト（Ｇ ａｉｔ）等（コールド・スプリング・ハーバ−・シンポジウム・オフ・クオンテ ィタティブ・バイオロジー（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、 　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏ＋、）４７巻、３９３頁（１９８３））の方法に従って 作り、Ｔ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼを用い、充填した３ｋｂ断片に、連結し た。生じた、３ｋｂ断片と合成オリゴヌクレオチドを含む連結断片をさらに、Ｒ ａｍ旧制限エンドヌクレアーゼ消化にかけた。
シミアン・ビールス（ＳＶ４０）を基本にした発現ベクターｐに５Ｖ−１０（Ｎ Ｊ州、ビス力タウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｉｙ）、ファルマシア　ファイン　 ケミカルス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を、Ｂｇｌ ＩＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。上述のＢａｍ旧で消化してできた、Ｆ ＡＩコード配列を含む断片を、ＢｇｌＩＩで消化したベクターと合わせ、Ｔ４Ｄ ＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐＳＶ−ＦＡＩと命名した環状組換え発現プラス ミドを形成させた。
発現プラスミドｐＳＶ−ＦＡＩは、本来の大腸菌アンピシリン耐性遺伝子を含ん でいる。ｐＳＶ−ＦＡＩでトランスフオームしたとき、大腸菌ＲＲＩＯＩ（ＭＤ 州、ゲイサースバーグ（Ｇａ　ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、ベセスダ・リサーチ・ ラボラトリ−（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ）を、そのプラスミドを含む細菌を、アンピシリン耐性に基づいて選択できる 。プラスミドを含む細菌をクローン化し、つづいて、そのクローンを、その発現 ベクターに正しい方向でＦＡＩコード遺伝子が挿入しているものを選択した。
方向性に対するスクリーニングは、挿入した遺伝子と、発現ベクターの両方にあ るＰｓｔ　Ｅ制限エンドヌクレアーゼ部位の位置を考慮して行った。ｐＳＶ−Ｐ ＡＩのＰｓｔ　Ｉによる消化で、図２２に示されているように、左から右に読ん で、ＳＶ４０転写プロモーターの３′側に、ＦＡＩ含有挿入物があるときは、約 ３．９．３．１゜３．０及び０．５　ｋｂの断片が生じ、また、その挿入物が反 対方向に入っているときは、約３．９．３．５，２．６及び０．５ｋｂの断片が 生じる。
従って、適正な方向性をもつＰＳＶ−ＰＡＩ構築物の同定には、Ｐｓｔ　１制限 エンドヌクレアーゼ消化後に生ずる断片のサイズ分析を必要とし、そして、その 断片が約３．９，３．１，３．０及び０．５　ｋｂであるものの選択を要する。
適当な、先に述べた方向での挿入物を含む構築物を、発現に使用するため選択し 、以後、ｐｓＶ−ＦＡＩと呼ぶ。
上で得られた、ＦＡＩをコードする遺伝子を含むｐＳＶ−ＦＡＩプラスミドを、 このプラスミドを含む大腸菌を培養することにより増やした。このプラスミドの ＤＮＡを、大腸菌培養物から、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等（モレキュラ ー・クローニング：ラボラトリ−マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ− ・ラボラトリ−（１９８２年））のアルカリ分解法により単離した。
ＰＡＩの発現は、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）等（ピロロジー（Ｖｉｒｏｌ、）５ ２巻、４５６頁（１９７３年））のリン酸カルシウムによるトランスフェクショ ン法を用いた、哺乳類細胞系列、ＣＨＯへのｐＳＶ−ＰＡＩの導入により行った 。培養物中の全てのＣＨＯ細胞へのｐＳＶ−ＦＡ　Ｉの導入における最高の効率 を保証するため、トランスフェクションを、サウザーン（５ｏｕｔｈｅｒｎ）等 によって報告されているように、第２のプラスミド、ｐＳＶ　２　Ｎ　Ｅ　Ｏ（ ＡＴＣＣ雰３７１４９　）　及び細胞毒薬剤Ｇ４１８（ＮＹ州、グランド・アイ ランド（ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ）　％ギブシーラボラトリーズ（ＧＩＢＣＯＬ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の存在下で行った。（ジャーナル・オフ・モレキュラ ー・アンド・アプライド・ジェネティクス（Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅ ｎｅｔ、）　１巻３２７頁（１９８２年））。Ｇ４１８に対して、耐性な、これ らＣＨＯ細胞を培養し、そして、これらは、その中に、プラスミドｐｓＶ２ＮＥ Ｏ及びｐＳＶ−ＰＡＩ　（７）両方を獲得しており、ＣＨＯ／　ｐＳＶ−ＰＡＩ 細胞と命名した。ｐＳＶ−ＦＡＩ発現ベクターの遺伝子的構築学により、ＦＡＩ は、生成したＣ　ＨＯ／　ｐＳＶ−ＰＡＩで発現され、これら細胞の細胞質中に 検出され、それから精製する。
発現したＦＡＩは先に述べたリバース・フィブリン・オートグラフィー（ＲＦＡ ）検定法により簡便に検定される。最後に、ＣＨＯ／　ｐＳＶ−ＰＡＩ細胞を培 養し、ひきつづいて、レリム化ａｅｍａ＋１ｉ）により報告されたように（ネイ チャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、２２７巻、６８０頁（１９７０年））、５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥ試料バッファ中で分解した。その細胞タンパク質を含む溶液を、１５．０ ００ｒｐｎ＋　、　１０分間遠心し、そして、その上清を収穫した。生じた上清 物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ＲＦＡにより、生物学的 に活性なＦＡＩを分析した。
−（ｉｉ　）　イーストにおける、組換えＤＮＡ発現によるＰＡＩの産生 きる。組換えベクターは、セクションｌｌｌＢ５　（ｂ）（ｉ）で述べた操作を 用いた次の方法で構築した。多くのステップは、イースト・コンパチブルな発現 ベクターへのＰＡＩ遺伝子の挿入と、イースト細胞の取り扱いに適応するのに必 要なもの以外は、先に述べたものと同様である。
λ、クローン又はｐＰＡＩｓ由来の３ｋｂ断片の単離及びその３′粘着末端の充 填の後、配列； ＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣ を有する、同様に調製した合成オリゴヌクレオチドを、その生じた断片に、連結 した。そのイースト発現ベクター、ｐＴＤＴｌ（ＡＴＣＣ＃３１２５５）、及び オリゴヌクレオチドを連結した断片を、両方とも、Ｃ１ａ　Ｉ制限エンドヌクレ アーゼで消化し、合せて、それらを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し、ｐＹ−ＦＡ Ｉと命名した環状組換え発現プラスミドを作った。そのように調製したプラスミ ドで大腸菌をトランスフオームした後、アンピシリン耐性プラスミドを含む細菌 を、ｐＹ−ＦＡＩに存在するアンピシリン耐性遺伝子に基づいて選択した。
プラスミド含存細菌をクローン化し、そして、基本的に、先に述べた方法に従が い、挿入したＦＡＩ遺伝子の適正な方向性に対し、スクリーニングを行った。
ｐＹ−ＦＡＩにおいて、図２２で示されているように左から右に読んで、ｐＴＤ Ｔ　１のＴＲＰＩイーストプロモーターの３′側に、ＦＡＩ含有挿入物があると き、Ｂａ５ａｌ制限エンドヌクレアーゼ消化により、約７．４及び３．３ｋｂの 断片を生じた。先に述べた適正な方向での挿入物を含む構築物を、さらに、発現 への使用により選択し、以後、ｐＹ−ＦＡＩと呼ぶ、イーストにおけるＦＡＩの 発現は、先に述べたように増殖し、精製したｐＹ−ＦＡＩプラスミドＤＮＡを用 い、Ｓ、セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｓ　ＨＹ　３株（Ａ　Ｔ　Ｃ Ｃ＃４４７７１）をトランスフオームすることにより行った。ハイネン（Ｈｉｎ ｎｅｎ）等（プロシーデインダス・イン・ナシ１ナル・アカデミ−・オフ・サイ エンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ）ＵＳＡ、　７５巻、１ ９２９頁（１９７８年））のスフェロプラスト操作法によるトランスフォーメー シッン後、５ＨＹＵ３細胞を、アミノ酸を含まない、０．６７パーセントのイー スト・ナイトロジェン・ベース（Ｍｌ州、デトロイト（ｎｅｔｒｏｉｔ）、ディ フコ・ラボラドリース（ＤＩＦＣＯＬａｂ。
ｒａｏｒｉｅｓ）、２パーセント・グルコース及びアデニン・ロイシン及びウラ シルを各、ミリリンドル当り５０マイクログラムを含む栄養選択培地中で、ミャ ジマ（Ｍｉｙａｊｉｍａ）等（モレキュラー・セル−の遺伝子的構築学により、 生成したｐｙ−ｐａｉでトランスフオームした５ＨＹ３細胞、以後、ＳＨＹ　３ 　／ｐＹ　−ＰＡＩ細胞と呼ぶ、でＰＡｌを発現し、そして七のＰＡＩは、これ ら細胞の細胞質中で検出され、そこから精製した。
発現したＦＡＩは、先に述べた、ＰＦＡ検定法により簡便に検出できる。最後に 、５ＨＹ３／ｐＹ−ＰＡＩ紺胞を、６００ナノメーターでの光学密度（００６０ ０）が１になるまで、対数増殖させ、それからそのイースト細胞を水で洗浄し、 ３倍容の、５０ａ＋Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７，０）　、１ａＭエチレンジアミ ン四酢酸（εＤＴＡ）、５−Ｍ２−メルカプトエタノール、０．５ａＭフェニル メチルスルホニルフルオライド及びロイペプチン及びペプスタチンを各々、ミリ リアトル当り１マイクログラムを含む溶液に懸濁した。その後、イースト細胞を ガラスピーズとともに手で振ることにより破壊し、ソーパル５Ｓ３４０−ターを 用い、１２０００ｒｐｍ、３０分間の遠心をした。遠心からの上清を、二倍濃縮 したイースト細胞タンパク質を含む、先に述べた５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファ で１：ｌに希釈した。この溶液を遠心し、先に述べたように５ＤＳ−ＰＡＣ，Ｅ 後、ＲＦＡで分析した。
先に述べた各説明において、生じた発現ＦＡＩは、全アミノ酸残基配列を含み、 さらに、配列 Ｍａｔ−Ｇｌｎ−Ｐｂｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−５ｅｔ−Ａｌａを、成熟Ｐ ＡＩの７ミノ末端に含んでいる。
前記のものは、本発明を説明するもので、これを制限を意図するものではない、 多くの変化や修正が本発明の真の意図及び範囲を逸脱することなしに行うことが 可能である。
ｆｌＧ、　１ 販尤度　２８０　ｎｍ ＦＩＧ、２ 万ズ出［１２５１３ｃｐｍｘｌＯ°３ ＦＩＧ、　３ ≦プラスミン（コントｌ］Ｌ／しとの組ヌ１ぷヒ）Ｃ％）ＦＩＧ、５ 放出ＣρＭ（りＤキグトご°コント蒔どの相又Ｕ宅）（％）ｒ’Ｈ１，ｒ：ｐｍ ｘ　１０”’Ｊｐｌ　（捧−）［’Ｈ３，ｃｐｍ　Ｘ　ＩＤ’７ｍｌ　（−一） 放出［＋２５１１　（ｐｍｘ　ＩＱ−’　（’ＦＩＧ、　９ 結合敷材活性（％） 結合数訂后栓（％） 紹合放打活性（％） 苺舌合　力文　１寸ン古性（ｙ−） 結合族１７ｒ活妊　（％） 紹８放Ｍ后性（％） オ角失イン乙乙゛ター（ｎｇＪｍｌ） ＦＩＧ、　１６ ＦＩＧ、１７ ０．５　１　２．５　５　１０ インヒじ゛ター（ｎｇｌａｎｅ） 末古”合ｃｐｍ、コント自−ルＥの相Ｘ寸を口２）ｋ漿　血清 ＦＩＧ、　１９ ＾　ＢＣＤＥＦ ＦＩＧ、　２０ ＢＣＤＥＦ ＦＩＧ、　２１ ＝菖＞　ψくく 国際調査報告 １□＋ａｅｅｉ□ｍ、　、、Ｔ、、、ｑ、、、０．ｎ七Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　 Ｔｏ　Ｆｏｒｍ　ＰＣτ／Ｚ５Ａ／２１０．　ｐａｒｔ　ＶＬＡｔｔａｃｈｍｅ ｎｔ：　Ｔｏ　Ｆｏｒｍ　ＰＣＴ／ＸＳ〜−１０，Ｐａｒｔ　ＶＩ。
Ｔｅ１ｅｐｈｏｎｅ　Ａｐｐｒｏｖａｌ＝Ｒｅａｓｏｎｓ　ｆｏｒ　ｈｏｌｄｉ ｎｇ　１ａｃｋ　ｏｆ　ｕｎｉセｙ　ｏｆ　１ｎｖｅｎｔｉｏｎ：

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．約１１４０から約３０００ヌクレオチドを含み、かつ、図２２の式でヌクレ オチド部位１３番から約１１５３番までに示される配列に対応する、左から右へ 、５′端から３′端方向で示され、ヒトの内皮プラスミノーゲン活性化因子イン ヒビターを読み枠を同じくして、コードするヌクレオチド配列を基本的に含むヌ クレオチド配列を含む、生物学的に純粋なＤＮＡ分子。 ２．図２２でヌクレオチド部位１番から約１９６０番の配列に対応するヌクレオ チド配列を基本的に含むヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のＤＮＡ分子。 ３．図２２でヌクレオチド部位１番から約１１５３番の配列に対応するヌクレオ チド配列を基本的に含むヌクレオチド配列を含む請求項１記載ＤＮＡ分子。 ４．図２２に示されている配列に対応するヌクレオチド配列を基本的に含むヌク レオチド配列を含む請求項１記載のＤＮＡ分子。 ５．上記分子が一本鎖である請求項１記載のＤＮＡ分子。 ６．第１のＤＮＡ分子に相補的で、その向きが逆平行であるヌクレオチド配列を 有する第２のＤＮＡ分子と、水素結合で結合した、請求項１記載のＤＮＡ分子。 ７．複製／発現媒体中、その媒体とコンパチブルなレプリコンを含み、そして、 その中に、請求項１のＤＮＡ分子を含むＤＮＡをクローニングするための、上記 ＤＮＡ分子を増殖することができる非染色体ベクター。 ８．上記含有ＤＮＡ分子の５′端に機能的に結合し、上記ＤＮＡ分子により、コ ードされる産物を発現するのに、上記複製／発現媒体と矛盾しない転写プロモー ターを含む請求項７記載のベクタ９．前記含有ＤＮＡ分子の各々５′末端及び３ ′末端に、機能的に結合し、そのＤＮＡ分子によりコードされるタンパク質産物 を発現するために、上記複製／発現媒体と矛盾しない翻訳開始コドン及び翻訳終 止コドンを含む、請求項８記載のベクター。 １０．上記複製／発現媒体が単細胞生物である、請求項７記載のベクター。 １１．プロテアーゼ・ネキシン及び胎盤プラスミノーゲン活性化因子とは免疫学 的に異なる、ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡの両活性を阻害する、実質的に純粋な組換え 、ヒト内皮プラスミノーゲン活性化因子インヒビター。 １２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、約１００キロダルトンの、見かけの相対 分子量を示す、融合ポリペプチドである、請求項１１記載の実質的に純粋な純粋 プラスミノーゲン活性化因子インヒビター。 １３．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、約４０キロダルトンの、見かけの相対分 子量を示す、請求項１１記載の、実質的に純粋なプラスミノーゲン活性化因子イ ンヒビター。 １４．以下の工程： （ａ）プロテアーゼ．ネキシン及び胎盤プラスミノーゲン活性化因子と免疫学的 に異なる、ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡの両方の活性を阻害する、実質的純粋な組換え ヒト内皮プラスミノーゲン活性化因子を固定化した固体マトリックスを含む、固 相サポートを準備し、（ｂ）検定すべき液体試料の部分標本と、上記固体サポー トの上記組換えインヒビター及び、検定すべきインヒビターの両方に結合する、 予め決められた量の結合試薬と混合し、（ｃ）上記混合物を、その結合試薬が、 試料中に存在するインヒビターに結合するのに十分な時間、生物学的検定条件に 維持し、（ｄ）上記の維持混合物を、上記固体サポートと混合し、固液相混合物 を作り、 （ｅ）上記固・法相混合物を、試料のインヒビターに結合しなかった混合物の結 合試薬が、固体サポートの組換えインヒビターに結合するのに十分な、予め決め られた時間、生物学的検定条件に維持し、 （ｆ）固相及び液相を分離し、 （ｇ）固体サポートに結合した組換えインヒビターに結合した結合試薬の量を測 定する、 を含む、検定試料中の内皮プラスミノーゲン活性化因子インヒビターの存在を検 出する、固相検定法。 １５．上記結合試薬が抗体である、請求項１４記載の方法。
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