NL8602307A - Recombinant dna molekuul; werkwijze voor het bereiden van humane endotheliale plasminogeen activator remmer (pai) of een mutant daarvan; farmaceutisch preparaat; getransformeerde gastheercellen. - Google Patents

Description

it * VO 8388

Titel: Recombinant DNA molekuul; werkwijze voor het bereiden van humane endotheliale plasminogeen activator remmer (PAD of een mutant daarvan; farmaceutisch preparaat; getransformeerde gastheer-5 cellen.

De uitvinding heeft betrekking op een recombinant DNA molekuul voor gebruik in het kloneren en/of tot expressie brengen van een DNA sequentie in gastheercellen. Ook heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor 10 het bereiden van humane endotheliale plasminogeen activator remmer of een mutant daarvan, alsmede op een farmaceutisch preparaat met invloed op de bloedstolling of de fibrinolyse, omvattende humane endotheliale plasminogeen activator remmer of een mutant daarvan, en op getransformeerde 15 gastheercellen.

Plasminogeen activatoren (PA's) zijn serine proteasen die een belangrijke rol spelen bij de vasculaire fibrinolyse en ook betrokken zijn bij een aantal andere fysiologische processen, zoals ovulatie, cel migratie, 20 epitheel differentiatie en activatie van ^'latent' colla-genase. Regulatie van de expressie van PA's is daarom van essentieel belang voor een normale lichaamsfunktie.

Ket enzym dat primair verantwoordelijk wordt geacht voor het lyseren van fibrine-stolsels is piasmine.

25 Piasmine komt onder normale fysiologische omstandigheden niet in het bloed voor maar ontstaat uit het proenzym plasminogeen bij activatie door plasminogeen activatoren, zoals weefsel-type plasminogeen activator (t-PA) en urokinase (u-PA). Een potentiële plasminogeen activator bron 30 is het vaatwand-endotheel. Daarnaast komen in andere celtypen, en ook in het bloed plasminogeen activatoren voor.

In het algemeen worden proteolytische systemen 8602307 & -2- 4 * gereguleerd door protease remmers. Zo ook het fibrinoly-tische systeem. Fibrinolyse remmers kunnen grofweg in twee categorieën worden ingedeeld. Remmers, zoals alpha-2-antiplasmine en alpha-2-macroglobuline, die 5 voornamelijk op plasmine-niveau werkzaam zijn en in plasma worden aangetroffen en plasminogeen activator remmers die met name in weefsels of geïsoleerde celcultures zijn aangetoond (Levin en Loskutoff, 1979; Christensen et al., 1982; Holmberg et al., 1978; Emeis et al., 1983; Loskutoff 10 et al., 1983; Crutchley et al., 1981). De struktuur en funktie van de eerstgenoemde categorie remmers is in detail beschreven. Dit is minder het geval met plasminogeen activator remmers. Goed gedocumenteerd zijn de waarnemingen, dat fibroblasten en vasculaire endotheel-15 cellen remmers van u-PA produceren (Levin en Loskutoff, 1979; Loskutoff et al., 1983; Crutchley et al., 1981;

Dosne et al., 1978; Loskutoff en Edgington, 1981; Baker et al., 1980). De fysiologische betekenis van deze remmers is evenwel niet duidelijk. Recent is vastgesteld,

20 dat gekweekte endotheelcellen ook remmers van t-PA

produceren (Emeis et al., 1983; Van Mourik et al, 1984;

Levin, 1983). Een aantal waarnemingen doet nu vermoeden, dat deze vasculaire endotheelcel remmers een belangrijke rol spelen bij de regulatie van de fibrinolyse. Bij 25 patiënten met een verhoogde tromboseneiging is namelijk aangetoond, dat in enkele gevallen deze aandoening samenhangt met een verhoogde concentratie van een circulerende remmer (Chmielewska et al., 1983; Nilsson en Tengborn, 1984). Deze t-PA remmer (PAI) vertoont qua 30 moleculair gewicht (ca.50000 daltons) en stabiliteit onder denaturerende omstandigheden overeenkomsten met de vasculaire t-PA remmer (PAI) (Van Mourik et al., 1984; Levin, 1983; Nilsson en Tengborn, 1984; Wiman et al., 1984). Tevens is gebleken dat PAI het karakter 35 draagt van een acuut-fase eiwit (Kruithof et al., 1985; Juhan-Vague et al., 1985) en versneld kan worden aange- 8602307 % i £ -3- maakt of uitgescheiden door endotheelcellen in diverse klinische situaties (ontstekingen, leveraandoeningen, chirurgische ingrepen). Mogelijk leidt deze respons tot een extra bescherming tegen locale of systemische 5 ontsporing van proteolytische systemen. Gezien de biologische eigenschappen van PAI is deze protease remmer van mogelijk therapeutisch belang. Niet alleen in die klinische situaties waarbij de hemostatische balans is verstoord (bijv. diffuse intravasale stolling, aange-10 boren stollingsafwijkingen zoals hemofilie, trobocytopenie) en door toediening van PAI als antifibrinolyticum kan worden genormaliseerd, maar ook bij tromboembolische aandoeningen, waarbij het toedienen van t-PA is geïndiceerd.

Binnen de medische wereld bestaat sinds een aantal 15 jaren grote belangstelling voor t-PA als antitrombolyticum.

Deze interesse is gebaseerd op de waarneming, dat t-PA specifiek de afbraak van fibrinestolsels katalyseert en niet zoals streptokinase of u-PA de afbraak van circulerend fibrinogeen. Toediening van deze laatste 20 twee proteasen leidt daarom niet zelden tot bloedingscom-plicaties. Deze complicaties worden in mindere mate gezien bij een therapie met t-PA. De ervaring heeft echter geleerd, dat om een effectieve recirculatie te bewerkstelligen, hoge t-PA doses nodig zijn (Van 25 de Werf et al., 1984). Enerzijds wordt dit toegeschreven aan de snelle klaring van t-PA via de lever, anderzijds wordt complexvorming met PAI en derhalve inactivatie van t-PA verantwoordelijk gesteld voor de snelle 'turnover' van het toegediende t-PA. De klonering van genetisch 30 materiaal dat kodeert voor de humane endotheliale piasmi-nogeen activator remmer (PAI) en de expressie van biologisch aktieve PAI in weefselkweek cellen, zoals in deze beschrijving nader zal worden beschreven, opent de weg naar konstruktie van moleculaire varianten van 35 PAI die wel binden aan t-PA maar t-PA niet inaktiveren.

Dergelijke moleculaire varianten kunnen mogelijk bij 8602307 9 * % η · -4- een trombolytische therapie gelijktijdig met t-PA worden toegediend en kunnen fungeren als een competitieve component voor het in plasma circulerende PAI (natuurlijk PAI). Dergelijke preparaten van competitieve PAI bieden 5 ook potentiële toepassingsmogelijkheden bij patiënten met tromboembolische aandoeningen, waarbij wordt waargenomen dat een verhoogde (endogene) PAI spiegel verantwoordelijk is voor de trombose neiging (Chmielewska et al., 1983; Nilsson en Tengborn, 1984; Kruithof et al., 10 1985; Juhan-Vague et al., 1985).

De uitvinders zijn er nu in geslaagd, om de humane endotheliale plasminogeen activator remmer (PAI) te kloneren en tot expressie te brengen.

De uitvinding wordt in de eerste plaats belichaamd 15 in een recombinant DNA molekuul voor gebruik in het kloneren en/of tot expressie brengen van een DNA sequentie in gastheercellen, welk recombinant DNA molekuul naast een vectorgedeelte een DNA sequentie omvat die kodeert voor humane endotheliale plasminogeen activator 20 remmer of een mutant daarvan.

Verder wordt de uitvinding belichaamd in een werkwijze voor het bereiden van humane endotheliale plasminogeen activator remmer of een mutant daarvan, waarbij op een op zichzelf bekende wijze gastheercellen 25 worden gekweekt, die onder toepassing van een dergelijk recombinant DNA molekuu] zijn getransformeerd, en de door de gastheercellen geproduceerde humane endotheliale plasminogeen activator remmer of mutant daarvan wordt gewonnen.

30 Ook wordt de uitvinding belichaamd in een farmaceu tisch preparaat met invloed op de bloedstolling of de fibrinolyse, omvattende humane endotheliale plasminogeen activator remmer of een mutant daarvan, verkregen onder toepassing van een dergelijke werkwijze, alsmede 35 in gastheercellen, die als gevolg van transformatie met behulp van een recombinant DNA molekuul als bovenstaand 8602307 % « $ -5- gedefiniëerd in staat zijn om humane endotheliale plasminogeen activator remmer of een mutant daarvan te produceren.

Met de woorden 'een mutant daarvan' worden zowel 5 natuurlijk voorkomende mutanten, zoals allele vormen, als ook kunstmatige mutanten bedoeld, in het bijzonder mutanten waarvan de eigenschappen gelijk aan of zelfs beter dan die van de gekloneerde humane endotheliale plasminogeen activator remmer zijn, en mutanten welke 10 wel met t-PA complexeren, maar de biologische werking van t-PA niet verhinderen en/of de klaring van t-PA in de lever vertragen.

In het geval dat de woorden 'een mutant daarvan' betrekking hebben op de DNA sequentie voor PAI, wordt 15 naast de bovenstaand vermelde betekenissen ook gedoeld op afwijkende DNA sequenties, die echter als gevolg van de 'degeneratie' van de genetische code toch voor dezelfde aminozuurvolgorde koderen.

Met de term 'gastheercellen' wordt hier gedoeld 20 op levende organismen, zoals bacteriën, gisten en schimmels, alsmede op dierlijke of humane celcultures.

Aan de deskundige zal duidelijk zijn dat het vectorgedeelte van de recombinant DNA molekulen volgens de uitvinding geselekteerd moet worden op basis van 25 de soort gastheercellen waarin men het PAI of mutant daarvan wil kloneren en/of tot expressie brengen. Voor transformatie van bacteriën, gisten, schimmels en dierlijke of humane cellijnen geschikte vectoren, meestal plasmiden, zijn aan de deskundige op zichzelf bekend. De term 30 'transformatie' wordt hier in ruime zin gebruikt, zodat behalve transformatie in eigenlijke zin ook transductie '' (of transfectie) wordt omvat.

Onderstaand zal in detail worden aangegeven, hoe de humane endotheliale plasminogeen activator remmer 35 gekloneerd en tot expressie gebracht is.

Uitgaande van humaan endotheliaal polyA RNA

8602307 -6- y werd in vitro dubbelstrengs copie DNA (cDNA) gemaakt, dat met behulp van Sepharose CL-4B chromatografie op grootte werd gescheiden. cDNA met een lengte groter dan ca. 600 baseparen (bp) werd middels 'G-C tailing' 5 geinsereerd in de expressie-vector pUC9.

Transformatie van Escherichia coli DH1 resulteerde in een 'expressie bank' van ca. 60000 kolonies, waarvan ca. 90% recombinant DNA plasmiden dragen met een humane endotheliale cDNA insertie met een lengte van tenminste 10 600 bp. De kolonies werden geanalyseerd op de aanwezigheid van humane endotheliale plasminogeen activator remmer (PAI) achtige polypeptiden. Hiertoe werd een screening toegepast, waarbij gebruik werd gemaakt van een heteroloog antiserum, t.w. konijne anti-runder PAI IgG, waarvan 15 bekend is dat dit antiserum immuuncomplexen vormt met de humane endotheliale PAI. Als tweede antistof, die op zijn beurt bindt aan het konijne anti-runder PAI IgG, werd schape anti-konijn IgG gebruikt dat radioactief gemerkt was met 125χ. Na autoradiografie werden in 20 duplo drie positieve kolonies gevonden, waarvan een positieve kolonie geanalyseerd werd met behulp van restrictie-enzym analyse op agarose’gels en met behulp van DNA sequentie bepalingstechnieken. Geconcludeerd werd, dat de humane cDNA insertie met een lengte van 25 ca. 2150 bp een gedeelte van de genetische informatie van het amino-terminale gedeelte van PAI mist. Een tweede screening van de 'kolonie bank' met een synthetisch oligonucleotide (24-meer), waarvan de nucleotide-volgorde complementair is met een van de DNA strengen van de 30 PAI cDNA insertie (2150 bp) resulteerde in een aantal kolonies, die recombinant DNA plasmiden bleken te bevatten met een cDNA insertie van ca. 2350 bp. De genetische informatie, gelegen op de cDNA insertie met een lengte van ca. 2350 bp, kodeert voor biologisch aktieve PAI, 35 hetgeen gekonstateerd kon worden na in vivo synthese in weefselkweek cellen, getransfecteerd met een plasmide DNA, die PAI cDNA draagt met een lengte van ca. 2350 baseparen. De voorspelde aminozuur volgorde, afgeleid 8602307 -7- uit de bepaalde volledige basevolgorde van het coderende gedeelte van het 2350 bp fragment, toonde aan, dat er een significante homologie bestaat tussen PAI en andere plasma protease remmers, zoals antithrombine 5 III, alpha-2-antiplasmine en alpha-l-antitrypsine. Een Escherichia coli K12 DH1 (pSV2/PAI2350 ex) stam, welke het in het experimentele deel beschreven plasmide pSV2/PAI2350 ex bevat, is op 10 september 1986 bij het Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) te Baarn, Nederland, gedepo-10 neerd onder nummer CBS 366.86.

Screening van de humane endotheel cel expressie 'bank1 op aanwezigheid van antigene determinanten, gerelateerd aan PAI:

Een humane endotheliale cDNA 'bank' werd geconstru-15 eerd, waarbij de stam Escherichia coli DH1 als gastheer werd gebruikt en het plasmide püC9 als vector (Viera en Messing, 1982). Dit plasmide draagt de promotor van het lactose operon van E.coli en een kort amino-termi-naal gedeelte van het eerste gen van het lactose operon, 20 t.w. beta-galactosidase, en derhalve translatie initiatie elementen. Fusie van cDNA, in de korrekte oriëntatie en het korrekte translatie leesframe van beta-galactosidase, leidt tot de synthese van fusie-eiwitten. Het gegeven, dat PAI in humane vasculaire endotheelcellen 25 wordt gesynthetiseerd en dat er derhalve in deze cellen specifieke PAI mRNA synthese zal geschieden, rechtvaardigt de veronderstelling, dat tijdens cDNA synthese met totaal humaan endotheliaal polyA RNA eveneens PAI cDNA gevormd zal worden. De cDNA bank, gekonstrueerd zoals 30 aangegeven in Materialen en Methoden, bestaat uit ca.

60000 kolonies, die in principe allen verschillende recombinant DNA plasmiden dragen. Ca. 90% van de kolonies bevatten recombinant DNA plasmiden, terwijl ca. 10% van de kolonies uitsluitend de vector pUC9 bevatten.

35 De genoemde kolonie-bank is voorhanden op 13 nitrocellulose filters (diameter 13 cm), waarop de kolonies gelijkmatig zijn verspreid. De kolonies op de duplo filters werden gelyseerd en de eiwitten gefixeerd op de filters, zoals beschreven (Verweij et al., 1985). Met behulp van een heteroloog 8602307 9 -8- \ antiserum, t.w. konijne anti-runder PAI IgG en vervolgens met een anti-antistof (met radioactief gemerkte schaap anti-konijne IgG) werd een screening op de aanwezigheid van potentiële PAI antigene determinanten uitgevoerd.

5 Na autoradiografie werden drie kolonies gevonden, die op beide duplicaat filters radioactief waren, hetgeen indicatief is voor de aanwezigheid van PAI antigene determinanten in de betreffende kolonies. Deze kolonies werden gezuiverd ('rein gestreken') en de screening 10 werd herhaald. Nu bleek een 'clone' in de bovengenoemde detectiemethode een sterk signaal te geven na autoradiografie, terwijl de andere twee clones een zwakker signaal gaven. De clone die het sterke signaal gaf, werd gekozen voor verdere analyse. Hieruit werd een recombinant 15 DNA plasmide geïsoleerd, dat in het vervolg pPAI2150 genoemd zal worden.

Restrictie-enzymen DNA sequentie analyse van PPAI2150 DNA;

Het tentatief pPAI2150 genoemde plasmide werd 20 geïsoleerd volgens een standaard methode (Maniatis et al, 1982). Digestie van dit plasmide DNA met of HindlII of BamHI of met beide enzymen en de analyse van de digestiepatronen op een 0.8% agarose gel na electroforese toonde aan, dat zowel na digestie met 25 HindlII als na digestie met BamHI een enkel fragment met een lengte van ca. 4800 bp wordt gevormd, terwijl na digestie met beide restrictie-enzymen twee fragmenten worden gegenereerd met een lengtevan resp. ca. 2675 bp en ca. 2150 bp. Het fragment met een lengte van 30 ca. 2675 bp kan toegeschreven worden aan de vector pUC9, terwijl het fragment met een lengte van ca. 2150 bp potentieel codeert voor PAI antigene determinant(en).

Met het oogmerk een gedeelte van de basevolgorde van het geinsereerde cDNA fragment te bepalen, werd 35 het HindiII-BamHI fragment van pPAI2150, dat mogelijk PAI cDNA bevat geïsoleerd en vervolgens geinsereerd .. ' '-JWÏi 8602307 -9- in de dubbelstrengs replicatie-vorm van de E.coli bacte-riofaag Ml3mp8 en daarna werd de enkelstrengs DNA vorm van de recombinant DNA bacteriofaag geisoleerd (Sanger et al., 1977). Met behulp van de zgn. dideoxy chain-ter-5 mination procedure werd met de universele sequentie-primer (New England Biolabs, Beverly, Mass.) de basevolgorde van een segment van het 2150 bp HindlII-BamHI fragment bepaald. Dit segment bevat het 51 terminale gedeelte van de insertie, hetgeen geconcludeerd kan worden uit 10 de bekende positie van de unieke HindlII, PstI en BamHI sites op de vector pUC9.

De basevolgorde is weergegeven in Fig. 1. Hieruit kunnen de volgende conclusies worden getrokken. Twee van de drie mogelijke translatie leesframes bevatten 15 meerdere stopcodons en kunnen derhalve niet in aanmerking komen als potentieel leesframe van PAI. Het resterende translatie leesframe bevat naar beide richtingen geen stopcodons. Echter, op grond van deze waarnemingen kan nog niet gekonkludeerd worden of het 5'terminale 20 gedeelte van het cDNA een ATG codon bevat, dat fungeert als translatie initiatie-codon. Op twee wijzen werd vervolgens getracht om een indicatie te verkrijgen over de vraag of de cDNA insertie van ca. 2150 bp de volledige genetische informatie bevat voor PAI. Enerzijds 25 werd een 'Northern blotting'experiment gedaan, waarbij totaal endotheliaal polyA RNA werd gescheiden op grootte middels electroforese en dan gehybridiseerd met radioactief gemerkt 2150 bp cDNA fragment, teneinde de lengte van PAI mRNA te bepalen, anderzijds werd een·synthetisch 30 oligonucleotide bereid, waarmee bepaald kan worden of de kolonie-bank 'clones' bevat met inserties langer dan 2150 bp.

Northern blotting van humaan endotheliaal polyA

RNA: 35 Totaal RNA en totaal polyA RNA werd geisoleerd uit humane endotheel cellen en na denaturatie in formamide-formaldehyde 8602307 -10-

V

» op grootte gescheiden met behulp van electroforese op een formaldehyde-agarose gel. Na blotting van gefracti-oneerd RNA op een nitrocellulose membraan filter werd gehybridiseerd met het HindlII-BamHI PAI215Q cDNA fragment, 5 dat na radioactieve merking met 32p d.m.v. 'nick translatie' werd gedenatureerd door koken (Maniatis et al., 1982).

Als lengte markers werd ribosomaal RNA gebruikt (28 en 18 S) en tevens werd totaal endotheliaal RNA na electroforese gehybridiseerd met radioactief gemerkt 10 cDNA dat codeert voor weefsel-type plasminogeen activator (t-PA). Deze radioactieve t-PA 'probe' hybridiseert met t-PA mRNA, dat een lengte heeft van ca. 2540 nucleo-tiden (Pennica et al., 1983). De resultaten tonen, dat de radioactief gemerkte PAI2150 cDNA probe hybridiseert 15 met een humaan endotheliaal mRNA met een lengte van ca. 2300 nucleotiden. Deze waarnemingen geven aan, dat de genetische informatie die potentieel codeert voor PAI en gelegen is op het plasmide pPAI2150 waarschijnlijk een (relatief kort) segment mist aan de 5' zijde 20 van het volledige PAI cDNA. Derhalve werd verwacht, dat de betreffende clone genetische informatie mist, die potentieel codeert voor een aantal amino-terminale aminozuren van PAI. Op grond van deze gevolgtrekking werd een synthetisch oligonucleotide gemaakt, met 25 een lengte van 24 nucleotiden, die complementair is met nucleotiden 5 t/m 28 van de volgorde afgebeeld in fig. 1. De rationale is dit oligonucleotide met T4-polynucleotide kinase en gamma-gelabeld 32p atp aan de 5' zijde radioactief te merken en deze 'probe' 3Q vervolgens te gebruiken om de humane endotheliale cDNA expressie-bank nogmaals te screenen op zoek naar andere · potentieel PAI cDNA bevattende clones, die mogelijk meer 5' gelegen genetische informatie dragen, maar niet noodzakelijkerwijs 'tot expressie komen'. Dergelijke 35 clones zullen in deze opzet PAI cDNA bevatten, dat hetzij niet dezelfde oriëntatie heeft als het amino-ter- 8602307 4 d -11- minale segment van beta-galactosidase op de vector pUC9, hetzij niet hetzelfde translatie leesframe.

Screening van de humane endotheliale cDNA 'bank1 met een synthetisch oligonucleotide (24-meer); 5 Op grond van de bepaalde basevolgorde (ca. 250 bp) van het 5' terminale gedeelte van de cDNA insertie van het pPAI2150 plasmide (zie fig.1) is met behulp van een DNA synthesizer type 381A (Applied Biosystems,

Poster City, Cal.) een 24-meer bereid, die complementair 10 is met nucleotiden 5 t/m 28.De volgorde van de oligonucleotide is de volgende: 5' GCACCAGCCGTGT CAG C T G G T C CA 3'. Screening van de humane endo-theelcel bank met radioactief gemerkte 24-meer resulteerde in 20 'clones', die op duplo filters na autoradiografie 15 positief waren. Verdere identificatie van deze 20 clones, die recombinant DNA plasmiden bevatten, geschiedde met behulp van standaard technieken, zoals beschreven (Maniatis et al., 1982). De lengte van de cDNA inserties kan wederom bepaald worden na digestie met zowel HindlII 20 als BamHI, daar, 2oals eerder uiteengezet, ook voor deze recombinant DNA plasmiden bleek te gelden, dat de cDNA inserties geen restrictie-sites dragen voor de restrictie-enzymen HindlII en BamHI. Karakteristiek voor recombinant DNA plasmiden, die nucleotide-homologie 25 hebben met het plasmide pPAI2150, is de aanwezigheid van een PvuII fragment met een lengte van ca, 550 bpi De PvuII restrictie-site, welke aan de 5' zijde van de cDNA inserties is gesitueerd, valt samen met de complementaire sequentie van het synthetische oligonucle-30 otide (24-meer), t.w. 5'CAGCTG3'. Na digestie van de potentiële 20 pPAI DNA preparaten met het PvuII, gevolgd door Southern blotting van gedenatureerd DNA op nitrocellulose membraan filters, werd gehybridiseerd met radioactief gemerkt HindlII-BamHI fragment van pPAI2150 DNA, 35 waarvan de lengte ca. 2150 bp bedraagt. Essentieel is de waarneming, dat alle 20 gedigereerde DNA preparaten 8602307 -12- een PvuII restrictie-fragment met een lengte van ca.

550 bp bevatten, dat hybridiseert met de genoemde probe.

Op grond van deze resultaten kunnen de 20 plasmiden eveneens aangemerkt worden als potentiële pPAI plasmiden.

5

De pPAI plasmiden, die op basis van digestie met zowel HindlII als BamHI, een cDNA insertie van ca. 2350 bp dragen werden gekozen voor verdere studie. Dergelijke pPAI2350 DNA preparaten kunnen de volledige 10 genetische informatie bevatten voor humaan PAI.

In vitro synthese van polypeptiden, gecodeerd door PAI cDNA;

Een recombinant DNA plasmide, genoemd pSP65/PAI2350, werd geconstrueerd zoals beschreven in de sectie Materials len en Methoden. In vitro transcriptie met de lineaire vorm van dit plasmide (pSP65/PAI2350 DNA gedigereerd met HindlII) werd uitgevoerd met het zgn. SP6 RNA polymerase, dat specifiek de transcriptie initieert op de SP6 promotor, gelegen aan de 5' zijde van de 2350 bp 20 HindlII-BamHI PAI cDNA insertie op pSP65/PAI2350 DNA.

Op deze wijze werden zgn. 'run-off' transcripten gegenereerd met een lengte van ca. 2350 nucleotiden. Het resulterende RNA werd als matrijs gebruikt voor in vitro eiwitsynthese met behulp van een reticulocyten 25 lysaat. Na in vitro eiwitsynthese werden de gevormde polypeptiden electroforetisch van elkaar gescheiden m.b.v. SDS-polyacrylamide gelen. Wanneer de novo polypeptiden werden gemerkt met radioactiviteit tijdens de synthese (met 35S gemerkt methionine) blijkt, dat de 30 meest dominante 'band' gevormd wordt door een polypeptide met een 'apparent' molecuul gewicht van ca. 43000 daltons. De novo polypeptiden met een kleiner molekuul gewicht kunnen het gevolg zijn van zgn. interne translatie initiaties, gebruikmakend van interne AUG codons in 35 PAI mRNA. Wanneer er geen RNA wordt toegevoegd aan het eiwitsynthetiserend systeem, wordt er geen polypeptide geproduceerd met een ('apparent') molekuul gewicht 8602307 -13- ft van ca. 43000 daltons. Dit experiment toont aan, dat de insertie van ca. 2350 baseparen geen nonsense codons bevat en derhalve kan coderen voor een eiwit van de verwachte grootte. Het is aangetoond, dat de runder 5 PAI een glyco-proteïne is (Van Mourik et al., 1984).

Het verschil in 'apparent* molekuul gewicht tussen het in vitro gesynthetiseerde produkt (43000 daltons) en de humane endotheliale PAI (52000 daltons; Sprengers et al., 1984) kan toegeschreven worden aan koolhydraat-ketens 10 op het PAI polypeptide.

In vivo synthese van biologisch actief PAI, gecodeerd door PAI cDNA:

Een recombinant DNA plasmide werd geconstrueerd middels een procedure, zoals aangegeven in de sectie 15 Materialen en Methoden. Essentiële elementen, welke op dit plasmide aanwezig zijn, kunnen als volgt worden samengevatï de oorsprong van replicatie,en het beta-lac-tamase gen van het B.coli plasmide pBR322, de 'vroege' promotor, polyadenylerings signaal, 1 splice' signaal 20 van het eukaryotische virus SV40, alsmede het gedeelte van de volledige PAI2350 cDNA insertie van het plasmide pPAI2350 gelegen tussen de EcoRI restrictieplaats 52 en de BglII restrictieplaats 1477. Restrictie-enzym analyse van het resulterende plasmide, in het vervolg 25 genoemd pSV2/PAI2350 ex, toonde aan, dat het PAI2350 cDNA fragment in de correcte oriëntatie ten opzichte van de vroege promotor van SV40 is geinsereerd. De vroege promotor van SV40 dient in dit construct als transcriptie promotor voor de genetische informatie, 30 die potentieel codeert voor PAI.

Transfectie van Mouse Ltk-cellen met een gezuiverd pSV2/PAI2350 ex DNA preparaat, gevolgd door een periode van vijf dagen ten behoeve van zgn. 'transient' expressie van de genen gelegen op het plasmide (Lopata et al., 35 1984) resulteert in geconditioneerd medium, dat getest kan worden op gesynthetiseerde en gesecreteerde polypep-tiden.

8602307 τ -14-

Het geconditioneerde medium werd daartoe geanalyseerd met behulp van de 'reverse fibrin autoradiography' (RFA) techniek, zoals beschreven (Loskutoff et al., 1983; zie tevens Materialen en Methoden). Uit de resultaten 5 (niet getoond) kunnen een aantal conclusies worden getrokken. Het PAI2350 cDNA gedeelte van het plasmide pSV2/PAl2350 ex draagt de genetische informatie voor PAI, hetgeen blijkt uit een specifieke zone in de 'overlay' die resistent is tegen lysis van fibrine, veroorzaakt 10 door piasmine (gegenereerd uit plasminogeen door plasmino-geen activator). Deze aktiviteit komt niet tot uitdrukking wanneer RFA wordt uitgevoerd met geconditioneerd medium van weefselkweek cellen, getransfecteerd met een controle plasmide eveneens gebaseerd op pSV2.

15 Een andere conclusie, die uit dit experiment kan worden getrokken betreft de grootte van het produkt dat door pSV2/PAI2350 ex DNA wordt gecodeerd. Vergelijking met een standaard (een partieel gezuiverd PAI preparaat uit geconditioneerd medium van humane vasculaire endotheel 20 cellen) toont aan, dat met dit SDS-polyacrylamide gelelec-troforese systeem een produkt wordt gedetecteerd met een identiek ('apparent') molecuul gewicht. Op grond van deze waarneming kan de conclusie worden getrokken, dat 'natief' PAI uit geconditioneerd medium van humane 25 endotheel cellen dezelfde eigenschappen heeft als het recombinant DNA produkt, gecodeerd door PAI cDNA, geconstrueerd en geïsoleerd zoals aangegeven in de vorige paragrafen. Het ('apparent') molecuul gewicht van de humane endotheliale plasminogeen activator remmer (PAI) 30 is ca 52000 daltons (Sprengers et al., 1984), hetgeen overeenkomt met het ('apparent') molecuul gewicht van de runder endotheliale remmer (PAI) (Van Mourik et al., 1984).

8602307 -15- üit deze resultaten wordt de conclusie getrokken, dat het beschreven cDNA fragment PAI2350 de genetische informatie bevat, die codeert voor biologisch actief PAI.

Basevolgorde van PAI cDNA en de voorspelde aminozuur-5 volgorde van PAI

Zowel met behulp van de chemische degradatiemethode (Maxam en Gilbert, 1977) als met behulp van de dideoxy--methode (Sanger et al., 1977) werd de nucleotide-volgorde van beide DNA strengen van PAI cDNA bepaald. De resultaten 10 zijn weergegeven in Pig. 2. Uit de bepaalde basevolgorde van PAI cDNA kan de aminozuur volgorde van het PAI eiwit worden voorspeld. Een vergelijking van de aminozuur volgorde van PAI met andere eiwitten toonde aan, dat er extensieve homologie bestaat tussen PAI en andere 15 plasma protease remmers, te weten antithrombine III, alpha-2-antiplasmine en alpha-l-antitrypsine. De constatering, dat de humane plasma protease remmers antithrombine III,alpha-2-antiplasmine, alpha-l-antitrypsine en ovalbu-mine overeenkomsten vertonen in aminozuur volgorde 20 werd eerder vermeld (Lijnen et al., 1982).

Materialen en methoden DNA analyse

Het isoleren van plasmide DNA, de analyse van DNA gedigereerd met restrictie-enzymen m.b.v. agarose-25 en polyacrylamide gelelectroforese, 'Southern' en 'Northern' blotting, het merken van DNA met radioactiviteit, hetzij door 'nick translation' hetzij met T4 polynucleotide kinase en de techniek van kolonie-hybridisatie werden gedaan, zoals beschreven (Maniatis et al., 1982). Het 30 bepalen· van de volgorde van de basen in het DNA (DNA sequencen) werd zowel uitgevoerd met de dideoxy methode (Sanger et al., 1977) als met de chemische degradatie methode (Maxam en Gilbert, 1977).

Weefselkweek cultures; 35 Endotheel cellen werden geïsoleerd uit venen 8602307 -16- van humane navelstrengen, zoals beschreven door Jaffe et al. (1973) met enkele modificaties, zoals aangegeven door Willems et al. (1982). Cellen, die gebruikt werden voor RNA isolatie hadden drie of vier passages ondergaan 5 en bereikten confluentie voordat zij werden geoogst.

Het oogsten van de cellen werd uitgevoerd met behulp van trypsinizatie en vervolgens gewassen met 10 mM natrium fosfaat (pH 7.4), 0.14 M NaCl en daarna ingevroren in vloeibare stikstof.

10 De isolatie en karakterisering van humaan endothe- liaal polyA RNA:

De procedure voor de isolatie van humaan endothe-liaal polyA RNA en de analyse t.a.v. de intactheid van dergelijke preparaten werd gedaan, zoals eerder 15 beschreven (Verweij et al., 1985).

De zuivering van de runder endotheel plasminogeen activator remmer:

Runder PAI werd tot homogeniteit gezuiverd uit serum-vrij geconditioneerd medium van gekweekte runder 20 aorta endotheel cellen, zoals tevoren beschreven (Van Mourik et al., 1984). Dit gezuiverde preparaat werd gebruikt om konijnen te immuniseren en de immunoglobuline G (IgG) fractie werd vervolgens gezuiverd door ammonium--sulfaat precipitaties en DEAE-Sephadex chromatografie.

25 Het heterologe anti-runder PAI IgG preparaat is in staat om specifieke immuun-complexen te vormen met humaan endotheliaal PAI (Van Mourik, ongepubl. waarneming). Deze eigenschap van dit antiserum maakt het mogelijk, de aanwezigheid van humaan endotheliaal PAI vast te 30 stellen.

Copie·ΡΝΑ (cDNA) synthese en de transformatie van Escherichia coli DH1:

De cDNA synthese, waarbij totaal humaan endotheliaal polyA RNA als substraat werd gebruikt, werd uitgevoerd 35 volgens de procedure beschreven door Gubler en Hoffman (1983). Het verkregen cDNA werd op grootte gescheiden 8 6 0 2 3 0 7, -17- met behulp van Sepharose CL-4B chromatografie, waarna cDNA met een lengte groter dan ca. 600 baseparen (bp) met het enzym terminal transferase aan de beide 3' uiteinden werd verlengd met C-residuen. Dit zgn. 'getailde' 5 cDNA preparaat werd 'geannealed' met een tweevoudige molaire overmaat vector, t.w. een G-getaild pUC9 DNA (Viera en Messing, 1982). Transformatie van stam Escherichia coli DH1 (recA) met de op bovenstaande wijze verkregen recombinant DNA preparaten werd uitgevoerd volgens 10 het protocol beschreven door Hanahan (1983).

Het testen op expressie van PAI-achtige produkten in Escherichia coli DH1 kolonies:

De gebruikte methode was analoog aan de procedure, die eerder werd beschreven (Verweij et al-, 1985). Daaraan 15 moet worden toegevoegd, dat zowel het konijne anti-runder PAI IgG als de 'anti-antistoffen' (d.i. met 125χ radioactief gemerkte anti-konijne IgG, afkomstig uit een daartoe geïmmuniseerd schaap) werden gepreincubeerd gedurende 2 uren bij 4°C met een gekookt lysaat van E.coli DH1 20 bacteriën. Ten behoeve van de detectie van PAI antigene determinanten, die potentieel aanwezig kunnen zijn in de gelyseerde kolonies aanwezig op de nitrocellulose filters (Verweij et al., 1985) werd een 1 op 1000 verdunning gebruikt van het konijne anti-runder PAI IgG preparaat 25 en daarna in een tweede incubatie werden ca. 2xl07 tellen per minuut aan radioactieve schaap anti-konijne IgG gebruikt. Na wassen van de filters (Verweij et al., 1985) werd autoradiografie uitgevoerd, teneinde 'positieve' kolonies te identificeren op duplo-fliters.

30 In vitro synthese van PAIt

Uit een analyse met restrictie-enzymen van PAI cDNA, geinsereerd in de vector pUC9, bleek dat dit cDNA geen restrictie-sites bevat voor o.m. de restrictie-enzymen HindlII en BamHI. Echter de vector bevat unieke HindlII 35 en BamHI sites aan weerszijden van de PAI cDNA insertie. Derhalve kunnen intacte PAI cDNA inserties verkregen 8602307 ► -18- worden na digestie van recombinant DNA plasmiden met zowel HindiII als BamHI. Het verkregen en in navolgende paragrafen beschreven plasmide pPAI2350 bevat aan de 5' zijde een unieke BamHI site en aan de 3' zijde van 5PAI cDNA een unieke HindlII site. Dit BamHI-HindlII fragment met een lengte van ca. 2350 bp werd geinsereerd in het plasmide pSP65, dat tevoren gedigereerd was met eveneens BamHI en HindlII. Het aldus verkregen recombinant DNA plasmide pSP65/PAl2350 bevat een zgn.

10 SP6 promotor direct gelegen voor het geinsereerde PAI cDNA. Deze SP6 promotor fungeert als specifiek startpunt voor RNA synthese in vitro, gekatalyseerd door een RNA polymerase preparaat, gecodeerd door de Salmonella typhimurium bacteriofaag SP6 (Melton et al., 1984).

15 Digestie van pSP65/PAI2350 DNA met HindlII resulteert in lineair DNA, dat als substraat kan dienen voor zgn. 'run-off' transcriptie met behulp van het enzym SP6 RNA polymerase en o.m. de vier ribonucleotide trifosfaten (ATP, GTP, CTP en UTP). De reacties werden uitgevoerd, 20 zoals voorgeschreven door de fabrikant van het SP6 RNA polymerase preparaat (New England Nuclear, Dreieich, W.Duitsland). Ca. 0.1 /u/g PAI mRNA, gemaakt in vitro, zoals hierboven beschreven, diende als matrijs voor in vitro eiwitsynthese met behulp van een zgn. reticulo-25 cyten lysaat, zoals beschreven door de fabrikant (Promega--Biotec, Wisconsin).

De novo polypeptiden, radioactief gemerkt met 35S-methionine, werden geanalyseerd m.b.v. SDS-polyacryla-mide gelelectroforese (Laemmli, 1970).

30 In vivo synthese van PAI;

Als vector voor transfectie van Mouse Ltk-cellen werd pSV2tPA gebruikt (Mulligan en Berg, 1981; Van Zonneveld et al, 1985; zie fig. 3). Dit plasmide bevat de oorsprong van replicatie en het beta-lactamase gen 35 van het plasmide pBR322 en daarenboven de zgn. vroege promotor, een polyadenylerings signaal en een 'splice site' van het eukaryotische virus SV40. In deze vector 8602307 -19- tussen in de unieke HindlII en BglII sites het volledig coderende t-PA cDNA geinsereerd. Het t-PA cDNA segment van het plasmide pSV2tPA werd vervangen door het PAI cDNA fragment met een lengte van ca. 2350 bp. Hiertoe 5 werd het plasmide pSV2tPA gedigereerd met het enzym HindlII en vervolgens geincubeerd met het enzym DNA polymerase 'large fragment' (New England Biolabs, Beverly, Mass.) en o.m.de vier desoxyribonucleotide trifosfaten (dATP, dGTP, dCTP, TTP), teneinde de zgn. 'sticky' 10 of 'cohesive' uiteinden op te vullen ('blunt' maken) (Maniatis et al., 1982). Daarna werd het preparaat gedigereerd met BglII. Het plasmide pPAI2350 werd gedigereerd met het enzym EcoRI en vervolgens, na opvullen van de sticky uiteinden als beschreven, werd ook dit 15 preparaat gedigereerd met BglII. Vervolgens werd door ligering met het enzym T4 DNA ligase het PAI cDNA fragment (1425 bp) in de vector pSV2 geinsereerd (Maniatis et al., 1982). De oriëntatie van het PAI cDNA ten opzichte van de vroege promotor van SV40 kon worden bepaald 20 na digestie van de recombinant DNA piasmiden met restrictie-enzymen en electroforese op agarose gels.

Transfectie van Mouse Ltk-cellen met pSV2/PAI2350 ex DNA werd uitgevoerd zoals beschreven (Lopata et al., 1984). Vijf dagen na transfectie werd het geconditio-25 neerde medium getest op de aanwezigheid van PAI activiteit.

Bepaling van PAI activiteit:

De biologische activiteit (remming PA activiteit) van in vivo gesynthetiseerde PAI werd bepaald met de zgn. omgekeerde fibrine autografische methode ('reverse 30 fibrin autography* of kortweg RFA)(Loskutoff et al., 1983). Hiertoe werden monsters geelectroforeerd in SDS-polyacrylamide gelen en vervolgens werden de gelen gewassen in een oplossing, die 2.5% Triton-X-100 bevat (Loskutoff et al., 1983). Dergelijke gelen verkregen 35 dan een 'overlay' van vaste fibrine, gevormd door de toevoeging van trombine aan een mengsel van fibrinogeen, agarose en plasminogeen. De aanwezigheid van geringe 8602307 -20- hoeveelheden plasminogeen activator veroorzaakt de vorming van piasmine in de gehele 'overlay'. De eventuele aanwezigheid van PAI verzorgt ter plaatse een zone, die resistent is ten aanzien van lysis van fibrine 5 door piasmine omdat plasminogeen activator een inactief complex vormt met PAI en er aldus geen piasmine gegenereerd kan worden.

In de tekening toont fig. 1 de nucleotide volgorde van de 'boven'streng (richting 51 naar 3') van het 10 PAI2150 cDNA fragment.

Het omlijnde gedeelte is complementair aan de synthetische 24-meer, die gebruikt werd om de 'kolonie bank' te screenen op het voorkomen van recombinant DNA plasmiden, die PAI cDNA bevatten. Fig. 2 toont 15 de volledige basevolgorde van het coderende gedeelte van PAI2350 cDNA. De voorspelde aminozuurvolgorde is weergegeven in de één-letter code. x is het symbool voor methionine (met); + is het symbool voor een stopcodon (in dit geval TGA); de pijlen geven achtereenvolgens 20 aan: het translatie initiatie startcodon (ATG 127-129), de voorgestelde plaats waar het 'rijpe' PAI eiwit begint (Val) en het stopcodon (TGA 1333-1335). Fig.3 toont het plasmide pSV2t-PA, dat gebruikt is voor de constructie van het in deze aanvrage beschreven plasmide pSV2/PAI2350 25 ex. Het plasmide pSV2t-PA bestaat uit 6333 baseparen.

Het 'zwarte' gedeelte representeert segmenten van het eukaryotisch virus Simian Virus 40 (SV40) en beslaat totaal 1350 baseparen. De 'dunne' lijn is afkomstig van het Escherichia coli plasmide pBR322, bevat het 30 ampicilline-resistentie gen en de oorsprong van replicatie en beslaat 2883 baseparen. Het gearceerde segment is afkomstig van een recombinant DNA plasmide, een afgeleide van pBR322 die het volledige cDNA bevat coderend voor weefsel-type plasminogeen activator (t-PA). Het t-PA 35 segment in pSV2t-PA, gelegen tussen de restrictie sites HindlII en BglII (gearceerd) beslaat 2100 baseparen.

8602307 5 -21-

Na digestie van het plasmide pSV2t-PA met Hindlli en BglII en zuivering van het fragment met een lengte van 4233 baseparen, kan het EcoRI-BglII fragment dat PAI cDNA bevat worden geinsereerd. Hierbij ontstaat 5 het plasmide pSV2/PAI2350 ex.

Referenties

Levin en Loskutoff, Thromb.Res. 15 (1979) 869-878.

Christensen et al., Thromb.Haemostasis 48 (1982) 24-26.

Holmberg et al., Biochim.Biophys. Acta 544 (1978) 128-137.

10 Emeis et al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 110 (1983) 392-398.

Loskutoff et al., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 80 (1983) 2956-2960.

Crutchley et al., Ann.N.Y. Acad.Sci. U.S.A. 370 (1981) 15 609-616.

Dosne et al., Thromb.Res.12 (1978) 377-387.

Loskutoff en Edgington, J. Biol.Chem. 256 (1981) 4142-4145.

Baker et al., Cell 21 (1980) 37-45.

Van Mourik et al., J. Biol.Chem. 259 (1984) 14914-14921.

20 Levin, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 80 (1983) 8804-8808.

Chmielewska et al·., Thromb.Res.33 (1983) 427-436.

Nilsson en Tengborn, Haemostasis 14 (1984) 24 (abstract).

Kruithof et al., In: Progress in Fibrinolysis (Davidson, J.F.,Donati, M.B. en Coccheri, S.eds.). Vol. VII, Churchill 25 Livingstone, Londen, pp. 130-132 (1985).

Juhan-Vague et al., In: Progress in Fibrinolysis (Davidson, J.F., Donati, M.B. en Coccheri, S.eds.). Vol. Vil,

Churchill Livingstone, Londen, pp. 146-149 (1985).

Wiman et al., J. Biol.Chem. 259 (1984) 3644-3647.

30 Van de Werf et al., New Engl.J.Med.310 (1984) 609-613.

Maniatis et al., Molecular Cloning Laboratory Manual,

Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1982).

Sanger et al., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 74 (1977) 5463-5467.

35 Maxam en Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.Ü.S.A. 74 (1977) 560-564.

Jaffe et al., J. Clin.Invest.52 (1973) 2745-2756.

8602307 b -22-

Will ems et al./ Exp.Cell. Res.139 (1982) 191-197.

Verweij et al., Nucleic Acids Res.13 (1985) 4699-4717.

Van Mourik et al./ J. Biol.Chem. 259 (1984) 14914-14921. Gubler en Hoffman/ Gene 25(1983) 263-269.

5 Viera en Mesing/ Gene 19(1982) 259-268.

Hanahanf J. Molec.Biol.166 (1983) 557-580.

Melton et al., Nucleic Acids Res.12 (1984) 7035-7056. Laemmli, Nature 227 (1970) 680-685.

Mulligan en Berg, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 78 (1981), 10 2072-2076.

Van Zonneveld et al, Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1985, aangeboden ter publikatie).

Lopata et al., Nucleic Acids Res.12 (1984) 5707-5717. Loskutoff et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 80 (1983) 15 2956-2960.

Pennica et al., Nature 301 (1983) 214-221.

Sprengers et al., Biochim Biophys.Acta 801 (1984) 163-170. Lijnen et al., Thromb.Haemostasis 48 (1982) 311-314.

8602307

Claims (5)

1. Recombinant DNA molekuul voor gebruik in het kloneren en/of tot expressie brengen van een DNA sequentie in gastheercellen, welk recombinant DNA molekuul naast een vectorgedeelte een DNA sequentie omvat die 5 codeert voor humane endotheliale plasminogeen activator remmer of een mutant daarvan.

2. Recombinant DNA molekuul volgens conclusie 1, omvattende de DNA sequentie weergegeven in fig. 2, of een mutant daarvan.

3. Werkwijze voor het bereiden van humane endotheliale plasminogeen activator remmer of een mutant daarvan, waarbij op een op zichzelf bekende wijze gastheercellen worden gekweekt, die onder toepassing van een recombinant DNA molekuul zoals gedefinieerd in conclusie 1 of 2 15 zijn getransformeerd en de door de gastheercellen geproduceerde humane endotheliale plasminogeen activator remmer of mutant daarvan wordt gewonnen.

4. Farmaceutisch preparaat met invloed op de bloed-stolling of de fibrinolyse, omvattende humane endotheliale 20 plasminogeen activator remmer of een mutant daarvan, verkregen onder toepassing van de werkwijze volgens conclusie 3.

5. Gastheercellen die als gevolg van transformatie met behulp van een recombinant DNA molekuul zoals gedefi- 25 nieerd in conclusie 1 of 2 in staat zijn om humane endotheliale plasminogeen activator remmer of een mutant daarvan te produceren. 8602307