JPH03162671A - 蛋白分解酵素阻害剤の新規な検出方法 - Google Patents

蛋白分解酵素阻害剤の新規な検出方法

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JPH03162671A
JPH03162671A JP22088990A JP22088990A JPH03162671A JP H03162671 A JPH03162671 A JP H03162671A JP 22088990 A JP22088990 A JP 22088990A JP 22088990 A JP22088990 A JP 22088990A JP H03162671 A JPH03162671 A JP H03162671A
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JP
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inhibitor
antibody
target
target enzymes
trypsin
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JP22088990A
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Nobuya Kitaguchi
暢哉 北口
Yasuyuki Takahashi
保之 高橋
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Asahi Chemical Industry Co Ltd
Original Assignee
Asahi Chemical Industry Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、蛋白分解酵素阻害剤の検出及び定量方法に関
するものである。更に詳しくは、蛋白分解酵素阻害剤に
対する抗体と、該阻害剤に親和性を有する酵素とを用い
た、該阻害剤の検出方法に関するものである。
〔従来の技術〕
一般に蛋白質又はペプチド等目的とする抗原(以下目的
抗原と略す)を、その目的抗原に対する抗体を用いて検
出する方法としては、固相酵素免疫測定法(Enzym
e Linked Immuno SorbentAs
say,以下、固相ELISAと略す)、及び放射性同
位元素標識免疫測定法(Radio ImmunoAs
say、以下、RIA法と略す)が挙げられる。
RIA法は放射性同位元素を扱う点での制限が多い。一
方固相ELI SA法は、放射線同位元素を使わない点
、一度に多数の検体が処理できる点ですぐれており広く
用いられているが、固相ELISA法に用いるELI 
SA用マイクロプレートの各ウェルへの蛋白の吸着量に
は限界があり、多量の夾雑蛋白中にある微量の目的抗原
を検出する際には問題となる。プレート材質や表面処理
等EL I SAプレート自体に工夫がなされているが
必ずしも満足な結果を与えるとはいえない。そこで夾雑
蛋白が多い時は、現在では、二抗体サンドイッチ固相E
LISA法(以下、単に“二抗体サンドイッチ法”と略
す。)が主に採用されている。
この二抗体サンドイッチ法とは、目的抗原中の異なる抗
原決定基を認識する2種類の抗体が得られるとき、一方
の抗体(以下、一次抗体”という。)をプレート上に吸
着させ、そのプレートに検体を添加して該検体中の多量
の夾雑蛋白の中から、目的抗原のみを選択的にプレート
上に(より正確にはプレートに吸着された一次抗体上に
)固定し、次いでもう一方の抗体(以下、“二次抗体”
という。)を反応させ、プレート上に結合した二次抗体
の量を測定〔二次抗体を蛍光ラベル化したり、二次抗体
にパーオキシダーゼなどの酵素標識化を行ったり、二次
抗体とのみ反応する第三の抗体(以下、“三次抗体”と
いう。)を用いたりする〕することにより、目的抗原の
量を測定する方法である。〔具体的には、例えば、ヒト
胎盤性アルカリフォスファターゼを測定する方法(特開
昭64−15659号参照)〕 しかし、二抗体サンドイッチ法は、サンドイッチするの
に十分離れた2つの抗原決定基を認識する抗体が必要で
あるが、二抗体サンドイッチ法に適した抗体(多くの場
合モノクローナル抗体)を得ることは一般に容易ではな
く、特に目的抗原と同種の蛋白、ペプチド等が、抗体を
得る免疫動物(ウサギ、マウス、ラット、ロバ、ウシ、
ウマ、モルモット等)にも存在し、かつ検体中の目的抗
原のアミノ酸配列と、免疫動物のそれとが類似している
場合、即ち両者の相同性が高い場合には、二抗体サンド
イッチ法に適した2種の抗体を得ることは困難である。
更に、目的抗原がより大きな蛋白の一部である場合には
、そのより大きな蛋白のペプチド鎖又は糖鎖により目的
抗原の抗原決定基がかくされてしまい、抗体との反応性
が“むきだしの”目的抗原に比べ弱くなり、検出感度が
おちてしまうことがある。
二抗体サンドイッチ法の一方の抗体のかわりに、被験物
質に親和性のあるものを用いる方法も報告されている。
EL I SA法ではないが、特開昭53−13042
4号には、ヒト等の血清中に存在する、ある抗原に対す
るそのヒト等の抗体を検出するために、固相に該抗原を
固定しておき、それに検体であるヒト血清等を反応させ
て該抗原に対する抗体を結合させ、次いで、ヒト等の免
疫グロブリンに対する標識抗体を反応させる方法が記載
されている。
更に、米国特許第4, 757. 134号明細書にお
いてはつぎのことか開示されている。即ち、免疫グロブ
リンA(IgA)を定量するにあたって、グループBス
トレプトコッカスから単離したIgA結合蛋白質をEL
 I SAプレートに吸着固定し、次いでIgAを含む
検体を反応、結合させ、更にIgA1プロテアーゼを作
用させることによりプレートに結合した(正しくはIg
A結合蛋白に結合した)IgAをFabとFcに分解し
(Fc部分がIgA結合蛋白と結合しているので切れた
Fabは洗浄時に除去される)、次いで、免疫グロブリ
ンのL鎖(I gAのFabと反応)に対する標識抗体
を反応させ、その結合した標識抗体量即ち少量残存する
未分解のIgA量と、上述操作中I gAlプロテアー
ゼを作用させる工程を行わない以外は上述の場合と同様
の操作を行って結合した標識抗体量、即ち多量に残存す
る未分解のIgA量との差から、検体中のIgA量を測
定する方法が開示されている。
また、−ELISAプレートに抗L鎖抗体を吸着固定し
、次いで基質としてのIgAを結合させ(IgAのFa
b部分が結合している)、これに検体中の被験物質であ
るIgAプロテアーゼを作用させ、そQ後標識抗Fc抗
体を反応させることにより、検体中のIgAプロテアー
ゼ活性が高ければ、発色が弱<(IgAがFcとFab
に分解され、標識抗体と反応するFc部分が除去されて
しまう)、低ければ発色が強いという方法で、検体中の
IgAプロテアーゼ活性を測定する例も報告されている
[Jesper Reinholdt, Mogens
 Kilian, J.I mmunological
 Methods, 6 3 3 6 − 6 3 7
 6(1 9 8 3)参照〕。
更に、ELI SA法ではないが、リガンド・レセプタ
ー反応を物質の検出に利用する例が他にも報告されてい
る(特開昭5 5−3 7 9 4 9号、同54−1
04391号等)。
以上、従来知られている技術の大半は、蛋白分解酵素以
外の広義の受容体とリガンドの検出方法であり、蛋白分
解酵素とその阻害剤の組み合わせを用いた、蛋白分解酵
素阻害剤の検出方法や定量方法については、従来技術に
何らの例もみない。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明の目的とするところは、検体中に微量含まれる蛋
白分解酵素阻害剤の高感度検出法を提供することにある
〔課題を解決するための手段〕
本発明者らは、上述の目的を達成すべく鋭意研究を重ね
た結果、検出しようとする蛋白分解酵素阻害剤に対し親
和性を有する酵素と、該阻害剤に対する抗体を組み合わ
せたサンドイッチ固相ELISA法を完成し、これを用
いれば検体中の微量の蛋白分解酵素阻害剤を高感度で検
出できることを見出し、本発明に至ったものである。
即ち本発明は、蛋白分解酵素阻害剤を検出する際に、(
イ)固相担体に結合した、蛋白分解酵素阻害剤に対し親
和性を有する蛋白分解酵素又はその誘導体と、該蛋白分
解酵素阻害剤に対する抗体、又は(口)固相担体に結合
した、蛋白分解酵素阻害剤に対する抗体と、該蛋白分解
酵素阻害剤に対し親和性を有する蛋白分解酵素又はその
誘導体、の(イ)又は(口)の組合せを用いて固相酵素
免疫測定法を実施することを特徴とする、該阻害剤の検
出方法である。即ち、具体的に述べると、次の2つの組
み合わせのいずれかとなる。1つは、96穴マイクロウ
ェルプレート等の固相に検出しようとする蛋白分解酵素
阻害剤に対し親和性を有する蛋白分解酵素又はその誘導
体(以下、該阻害剤の標的酵素類と呼ぶ)を固定し、該
阻害剤を含む検体をこの固相上の標的酵素類と接触させ
該阻害剤をこの酵素類に結合させ、次に、標的酵素類と
結合した該阻害剤を認識できる抗体を反応させる。この
抗体は、パーオキシダーゼのような酵素、ケイ光物質、
放射性同位元素等で標識しておくか、又は該阻害剤に対
する抗体を認識できる標識抗体(先述した二抗体サンド
イッチ法の三次抗体に相当する)と反応させ、必要なら
ば適当な基質を用いて発色させ、該阻害剤を検出あるい
は定量する方法である。今一つは、同じくプレート等の
固相に、該阻害剤に対する抗体(標的酵素類と結合した
状態の該阻害剤とも反応する抗体)を固定し、それに検
体中の蛋白分解酵素阻害剤を結合させ、ついで標識した
該阻害剤の標的酵素類を結合させるか又は、非標識の標
的酵素類を反応させ更に該標的酵素類に対する標識抗体
を反応させるかして該阻害剤を検出あるいは定量する方
法である。
本発明における“標的酵素類”とは、検出しようとする
蛋白分解酵素阻害剤に対し親和性を有する蛋白分解酵素
又はその誘導体を意味する。また“その誘導体”とは、
該酵素の阻害剤に対する親和性を残したまま加水分解活
性などを消失させた誘導体をいう。
以下に本発明について詳述する。
本発明において、検出しようとする蛋白分解酵素阻害剤
としては、標的酵素類と結合した状態でも抗原決定基が
かくされずに、抗該阻害剤抗体と反応できるものであれ
ばいずれの蛋白分解酵素阻害剤でもよい。例えば、クニ
ッッ型塩基性トリプシンインヒビター族に属するものや
、カザール型インヒビタ一族に属するもの等比較的大き
い蛋白性の蛋白分解酵素阻害剤が検出しやすいが、IO
アミノ酸程度の比較的小さな阻害剤も対象となりつる。
具体的に例示すると、血液中のαl−アンチトリプシン
(αl−プロテイナーゼインヒビター)、インターα一
トリプシンインヒビター、アンチトロンビン■、プラス
ミンインヒビター、αl−アンチキモトリプシン、膵臓
トリプシンインヒビター(クニッツ型)、膵臓分泌性ト
リプシンインヒビター、オボムコイド、エグリン01大
豆中のトリプシンインヒビター トリプスタチン、ヒル
ジン、初乳インヒビター、ヘビ毒インヒビター等のセリ
ンプロテアーゼ阻害剤、カルパスタチン等のチオールプ
口テアーゼ阻害剤、これら以外に、他にメタルプロテア
ーゼ阻害剤や酸性プロテアーゼ阻害剤等が挙げられる。
またセリンプロテアーゼ阻害剤の中でも、最近注目され
ているものの一つにアルツハイマー型老人性痴呆症(以
下、ADと略す)患者の脳に沈着する老人斑アミロイド
蛋白前駆体蛋白(以下、APPと略す)のうちAPP7
51,APP770中の蛋白分解酵素阻害領域(以下、
APPIと略す)がある [例えば、Ponte  e
t al., Nature331, 525−527
(1988); Tanzi et al.,Natu
re331, 528−530(1988);K it
aguchi et al. , Nature331
, 530−532(1988);伊東・北口、日本臨
床46巻、第7号72−78(1988)等).APP
770のmRNA量はAD患者脳で対照脳の約2倍、A
PP751のmRNA量は約1.3〜1.4倍に増加し
ていることが判ってきており[Tanaka et a
l.,  Biochem.Biophys  Res
  Commun.157, 472−479(198
8);J ohnson et al., Exper
imental  Neurologyl02,264
−268(1988)等〕、脳脊髄液中あるいは血液中
のAPP Iを検出あるいは定量することは、アルツハ
イマー型老人性痴呆症の診断に有効であると考えられる
APPIのうち、N末端側の約50アミノ酸は既知のク
ニッツ型塩基性トリプシンインヒビターと相同性が高く
、ヒト、ラット、マウス間でほとんど同じなので、この
部分に対する抗体はできにくい。APPIのうちC末端
側は、動物種差がかなりあるので抗体ができ易い。従っ
て、APPIのN末端側は蛋白分解酵素と結合して阻害
活性を示す部分であり、抗原決定基としてより適してい
るC末端側は蛋白分解酵素結合部分の立体的に正反対に
位置し、本発明の方法による検出がきわめて適している
以上述べたことは、他のクニッツ型塩基性トリプシンイ
ンヒビターでもあてはまる。クニッツ型塩基性トリプシ
ンインヒビターの活性中心付近は、50数個のアミノ酸
が3つのS−S結合や他の水素結合等によりきわめて堅
固な立体構造をとり、標的酵素によっても分解されない
。即ち、この活性中心付近の50数個以外の部分が存在
する場合、標的酵素によりその“活性中心付近以外の部
分”の一部又は全部が消化され、この活性中心付近の5
0数個を含む断片が残ることもある。この場合でも、該
阻害剤に対する抗体として適当なものを用いれば該阻害
剤の検出が可能である。更に、こういった“活性中心付
近以外の部分”の消化により、抗原決定基が“むきだし
”になり、より高感度に検出される場合もある。例えば
、先述したAPP7 5 1,APP7 7 0中のA
PPIの検出の際には、用いる抗体によってはこのよう
な現象が起こりうる。
このような被験阻害剤の部分消化により抗原決定基を露
出させる方法として、(イ)固相に固定した標的酵素に
よるもの、(ロ)該阻害剤を固相に固定した抗被験阻害
剤抗体に結合させた複合体に標的酵素を作用させる方法
、があるが、この他にも、検体を前処理することによっ
ても可能である。即ち、被験阻害剤を含む検体を、固相
担体に固定化した酵素(この場合の酵素は必ずしも被験
阻害剤の標的酵素である必要はなく、糖鎖分解酵素など
を用いることも可能である。)で部分消化し、抗原決定
基を露出後、必要なら適当な溶離液で固定化酵素と阻害
剤を分離し、得られた部分消化阻害剤を本発明の検出方
法、さらには一抗体通常ELISA,又は二抗体サンド
イッチELISAに供して、該阻害剤を検出する方法が
可能である。固定化酵素の例としては、アガロースやポ
リアクリルアミドビーズに結合したトリプシンやキモト
リプシン、ヘパリナーゼ、コンドロイチナーゼ等が挙げ
られる。被験阻害剤がこれらの固定化酵素に結合してし
まう場合は、一般にpH2前後の酸性バッファーを溶離
液として用いると被験阻害剤の部分消化物を回収できる
。この部分消化物を中和、濃縮して、ELISAに供す
る。
本発明で用いる固相担体としては、ポリスチレンやポリ
カーボネー゛ト等でできたELI SA用96穴プレー
トが好ましいが、その他48穴や24穴等のプレートや
、ポリマーやアガロース等でできたビーズ、ガラス壁、
プラスチックチューブ等も用いることができる。
本発明において使用される被験物質である蛋白分解酵素
阻害剤に対し親和性を有する蛋白分解酵素又はその誘導
体としては、被験物質である蛋白分解酵素阻害剤によっ
て阻害される蛋白分解酵素ならよい。一般に蛋白分解酵
素とその阻害剤の結合力は強く、Ki(阻害平衡定数)
でいえば10−7から10−”Mのようにきわめて親和
性の強いものが多い。このKi値は、一般の抗原と抗体
の合力に匹敵するか、又はそれ以上のものである。本発
明で用いる蛋白分解酵素としては、例えば、セリンプロ
テアーゼ阻害剤が被験物質である場合は、トリプシン、
プラスミン、カリクレイン、キモトリプシン、膵臓エラ
スターゼ、白血球(顆粒球、好中球)エラスターゼ、ト
ロンビン、ファクターXa、ファクターXIa,ファク
ターXIIa、チマーゼ、トリプターゼ等が挙げられる
。ただし、蛋白分解酵素阻害剤といっても、阻害スペク
トルは各々の阻害剤によって大きく異なるので、その阻
害剤に対する親和性の高い酵素を選ぶことが必要である
。例えばセリンプロテアーゼ阻害剤の場合、αl−プロ
テイナーゼインヒビターに対しては白血球エラスターゼ
、アンチトロンビン■に対してはトロンビンやファクタ
ーXa,インターα一トリプシンインヒビターに対して
はトリプシン、αl−アンチキモトリプシンに対しては
キモトリプシン、エラスターゼ等、APPIに対しては
、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン、カリクレ
イン、白血球エラスターゼ等、膵臓クニッッ型トリプシ
ンインヒビターに対してはトリプシン,キモトリプシン
,ファクターXIa等が適している。
これらの蛋白分解酵素をそのまま用いてもよいし、阻害
剤に対する親和性を残して、加水分解活性を消失させて
用いてもよい。阻害剤に対する親和性を残して、蛋白分
解酵素の加水分解活性を消失させた蛋白分解酵素の例と
しては、セリンプロテアーゼの活性中心のセリンを脱水
したアンヒドロ体(アンヒドロトリプシン、アンヒ.ド
ロキモトリプシン等)、トシルフェニルアラニルクロロ
メチルケトン(T P C K)で処理したキモトリプ
シン、そしてトシルリシルクロロメチルケトン(TLC
K)で処理したキモトリプシン等を例示できる。トリプ
シン、キモトリプシンに対し親和性を有する阻害剤の大
半は、アンヒドロトリプシン、アンヒドロキモトリプシ
ンにも親和性がある。オボムコイドは、TPCK又はT
LCK処理したキモトリプシンとも結合する。こういっ
た加水分解活性を消失又は著減させた蛋白分解酵素を本
発明に用いると、被験阻害剤は消化されず、該酵素との
結合部位以外の抗原決定基の大半を利用して抗体と反応
させることができる。
本発明で用いる抗体としては、抗血清、精製したポリク
ローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用する
ことができるが、蛋白分解酵素と結合した状態の阻害剤
と反応できる抗体であることが必要である。
又、必ずしも未変性の(nativeな)蛋白分解酵素
阻害剤を抗原として免疫した抗体である必然性はなく、
該阻害剤の断片や、その部分ペプチド更には該阻害剤又
はその一部をドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、トラ
イトンX−100、NP−40等の界面活性剤や、β−
メルカプトエタノール(β−ME) 、ジチオスレイト
ール(DTTつ等の還元剤で変性させた後、必要に応じ
て透析、アセトン沈澱等の脱変性剤処理を行って、又は
行わずに得られた変性抗原を免疫して取得される抗血清
、モノクローナル抗体等をも用いることができる。変性
抗原を用いた場合、未変性抗原を用いるよりも高感度に
被験物質を検出することが可能な場合がある。ただしこ
の場合は、後述するようにELI SAプレート等の固
相に蛋白分解酵素等の標的酵素類を固定し、それに被験
阻害剤を結合させた後、SDSやβ−MEによる変性を
行うことが好ましい。
本発明において、被験阻害剤の標的酵素類又は被験阻害
剤に対する抗体の標識方法については、通常用いられて
いる標識方法が採用される。即ち、FITCなどの蛍光
物質、ホースラディシュパーオキシダーゼやアルカリフ
ォスファターゼ、βガラクトシダーゼ等の酵素、ビオチ
ン、放射性同位元素等を適当なスペーサーを介し又は介
さないで、標的酵素や抗阻害剤抗体に結合させる。パー
オキシダーゼやアルカリンフォスファターゼ、β−ガラ
クトシダーゼを結合したときは、適当な蛍光または発色
基質により検出する。ビオチンを結合させたときは、パ
ーオキシダーゼやアルカリンフォスファターゼ等又はそ
の他の標識を行ったアビジン又はストレプトアビジンを
ビオチンに結合させて検出する。あるいは、標的酵素や
抗阻害剤抗体のうち固相に結合していない方に対する抗
体を用いて検出することも可能である。
本発明において、被験阻害剤の標的酵素類又は抗被験阻
害剤抗体を固相担体に固定する方法としては、単純な物
理的吸着固定でもよいが、適当な固定剤を用いてもよい
。物理的な吸着固定の際、通常はpH9又はpH7程度
の溶液中で4°C一晩か37°C1時間程度の固定操作
を行うか、標的酵素類を固定する際には、被験阻害剤へ
の親和性が失活してしまわないpHで固定を行う必要が
ある。
例えば、トリプシン、キモトリプシンの場合は、pH2
程度の弱酸性又はpH9〜IO程度の弱アルカリ性が望
ましい。
物理的吸着固定では、担体への固定量が十分でない場合
がある。担体への固定量を増加させるためには、適当な
固定剤を用いることが好ましい。
特に、標的酵素類を同相に固定する際には固定剤を用い
ることが好ましい。固定剤の例としては、グルタルアル
デヒド、ブタン−1.  4−ジアール、ペンタン−1
.  5−ジアール、ヘキサン−1.  6ジアール、
パラホルムアルデヒド等が用いられるが、溶解度、入手
のしやすさ、固定効率などの点でグルタルアルデヒドが
使いやすい。固定時のグルタルアルデヒド等固定剤の濃
度は、標的酵素又は抗被験阻害剤抗体の、被験阻害剤に
対する親和性が失活してしまう濃度より低く、かつ不十
分な固定量しかできない濃度より高ければよい。
般には、水又はリン酸緩衝液(P B S)等の適当な
バッファ一中に、0.1〜5%(W/V)の濃度のグル
タルアルデヒドを希釈した液が用いられる。固定量と失
活の点から0.3〜2%程度の濃度がより好ましい。固
定操作は室温でl5〜60分くらい静置又はプレートミ
キサー等で振とラすることによって行われる。4℃一晩
の固定等も可能である。
被験阻害剤の標的酵素類、又は抗被験阻害剤抗体の固相
への固定量は、物理的吸着固定を行う際は、通常二抗体
サンドイッチ法で採用される量でよい。固定剤を用いる
際は、あまり多量の標的酵素類又は抗体を、マイクロプ
レート等の固相に固定しようとすると、標的酵素類同志
、又は抗体同志の結合が多くなってしまい、固相に保持
できる被験阻害剤の量をかえって減じてしまうことがあ
る。そのため各標的酵素類や抗体の最適固定量を事前に
求めておくことが好ましい。例えばトリプシンを通常の
EL I SAプレートに固定する場合は、各ウエル当
たり0.  5%グルタルアルデヒド含有10mM}リ
ス塩酸緩衝溶液(pH7.6)iooμlに、精製トリ
プシンを1〜500μg溶解した液を入れて、室温下3
0〜60分固定する。固定量が多すぎるとバックグラウ
ンドが高くなり、かつ被験阻害剤の保持量も減る傾向が
あり、固定量が少ないとバックグラウンドは低くなるが
、被験阻害剤の保持量も減ってしまうので、トリプシン
量は、上記条件ではlO〜60μg/ウエルのトリプシ
ン溶液を固定することが好ましい。ここに述べるトリプ
シン量は、固定時の仕込みトリプシン量である。
この固相に固定化した、被験阻害剤の標的酵素類、また
は抗被験阻害剤抗体と、被験阻害剤を含有する検体との
反応は、37℃で0.3〜3時間、または、室温で0.
  5〜5時間、または、4℃で8〜24時間等の条件
で行なわれる。その中でも、37℃1〜2時間または4
℃一晩放置などの条件が、感度および操作性の点で好ま
しい。
本発明において、固相に固定した標的酵素類(又は、抗
被験阻害剤抗体)と被験阻害剤の複合体を、そのまま次
の反応に供してもよいし、再度固定剤を用いてこの複合
体をより強固なものにしてもよい。特に、標的酵素類を
固相に固定しておき、先述した変性抗原に対する抗体を
反応させる場合では、標的酵素類と被験阻害剤との複合
体を、SDSやβ−ME等の変性剤で処理した方がより
高感度で被験阻害剤を検出することができることがあり
、この際は、該複合体をクルクルアルデヒド等の固定剤
でより強固に結合させたほうが、よりよい結果が得られ
るので、この“再固定操作”を行うことが好ましい。再
固定操作の条件は、先述した固相への固定操作に準じて
行う。例えば、0.2〜1%程度のグルタルアルデヒド
の水又はPBS溶液中で、室温下15〜60分静置又は
振とうして行う。
先述したように、被験阻害剤と標的酵素類の複合体に、
変性した被験阻害剤(又はその一部)に対する抗体や、
被験阻害剤の一部のアミノ酸配列を基に合成したペプチ
ドに対する抗体を反応させるときは、該複合体を変性さ
せた方がよい場合があるが、このときの変性条件につい
て述べる。変性剤としては、SDS,NP−40,  
トライトン等の界面活性剤、あるいはβ一ME,DTT
,還元型グルタチオン等の還元剤あるいはグアニジン,
尿素等の水素結合変性剤等を用いることができる。
界面活性剤としてSDSを用いる場合、その濃度は0.
05〜5%、より好ましくは0.1〜3%であるが、検
出感度に対するSDS濃度の影響はこの範囲ではあまり
大きくない。また、還元剤としてβMEを用いるときの
濃度は、0.5〜10%、より好ましくはl〜5%であ
る。その他6〜8M程度のグアニジン塩酸や、5〜8M
程度の尿素も用いられる。変性条件は、室温下1〜24
時間、70℃では0.5〜4時間、80℃では15〜1
20分程度でよい。室温以上の温度で変性させる場合と
してELISAプレートを使用する際は、フタ又はシー
ルをしてウェル中の液が蒸発しないような配慮力く必要
である。
本発明において、上述のように変性させた、または変性
させないままの、固相に固定した標的酵素類(又は、抗
被験阻害剤抗体)と被験阻害剤の複合体を、適当な適当
なブロッキング剤でブロックして、非特異的反応を防止
することが望ましい。
ブロッキング剤としては、燐酸バッファ−等適当なバッ
ファーに溶解させた1〜10%程度のアルブミン(一般
にはウシ血清アルブミンーBSA−)0.1〜2%程度
のゼラチン、1〜15%程度のスキムミルク、或はこれ
らを組み合わせたもの、例えば2%BSAと0.1%ゼ
ラチンの混合物等が非特異反応抑制率の点で好ましい。
ブロッキングの反応時間は、37°Cで0.5〜6時間
、または、室温で1−12時間、または、4℃で8〜2
4時間等の条件で行なわれる。
本発明において、標的酵素類と被験阻害剤とを反応させ
たあとに、該標的酵素類の加水分解活性が、後の操作に
悪影響を与える場合がある。このような場合には、メシ
ル酸ガベキセート,メシル酸カモスタット,メシル酸ナ
ファモスタット,PMS F,アブロチニン,ペプスク
チン,ロイペプチン等、標的酵素類の阻害剤であり被験
阻害剤の検出に支障のないものを、標的酵素類一被験阻
害剤反応のあとに添加することも可能である。この際、
後で添加する阻害剤の標的酵素類に対する親和性が、被
験阻害剤より強く、かつ再固定操作を行っていないとき
は、被験阻害剤と後で添加した阻害剤がおきかわってし
まうことがあるので、後で添加する阻害剤は、被験阻害
剤とおきかわらないものを選ぶことが必要である。後で
添加する阻害剤の濃度は、各阻害剤と標的酵素類の組合
わせによるが、トリプシンを用い、メシル酸ナファモス
タットで阻害する場合は、10−’M以上の濃度があれ
ばよい。
本発明において、固相に固定した標的酵素類(又は、抗
被験阻害剤抗体)と被験阻害剤の複合体に、抗被験阻害
剤抗体(または、標的酵素類)を反応させるときの条件
としては、抗体(または標的酵素類)の濃度は非特異反
応が出ない程度で感度が高い条件を別途あらかじめ決め
ておき、反応時間としては、37℃で0.3〜3時間、
または室温で0.5〜6時間、または4℃で8〜24時
間等の条件が採用される。抗被験阻害剤抗体を反応させ
るときは、感度の点で、37℃で1〜2時間、または、
4℃で一晩放置の条件がよく、使う抗体によっては、4
°C一晩放置がきわめて高感度の結果を与える事がある
固相に固定された、(A)標的酵素類一被験阻害剤一抗
被験阻害剤抗体の複合体、または(B)抗被験阻害剤抗
体一被験阻害剤一標的酵素類の複合体を検出,定量する
方法としては、(A)の場合には、抗被験阻害剤抗体を
パーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリン
フォスファターゼ等の酵素や、ビオチン、!25I等の
放射性同位元素等で直接標識しても良いし、抗被験阻害
剤抗体を得た動物の免疫グロブリンに対する抗体であっ
て上記の標識がなされたものを、抗被験阻害剤抗体に反
応させても良い。酵素で標識する場合の基質として0−
フェニレンジアミン等の発色剤や、4−メチルウンベリ
フエニルや7−アミノクマリン等が結合した蛍光基質を
用いることができる。高感度という点では、蛍光基質を
用いることが好ましい。蛍光基質を用いる場合の酵素の
種類としでは、測定時のバックグラウンドが低いという
点でβ−ガラクトシダーゼが好ましい。ビオチンで標識
する場合の基質としては、酵素や放射性同位元素で標識
されたアビジンやストレプトアビジン等を通常用いる。
一方(B)の場合には、抗標的酵素類抗体を標的酵素類
と反応させ、(A)と同様にして検出,定量する。
本発明においては、(イ)固相に被験阻害剤の標的酵素
類を固定し、被験阻害剤と結合後、抗被験阻害剤抗体を
反応させる方法と、(ロ)固相に抗被験阻害剤抗体を固
定し、被験阻害剤と結合後、標的酵素類を反応させる方
法、の2通りの方法があるが、標的酵素類、として加水
分解活性を失活させない酵素を用いる場合は、抗体を分
解してしまいにくく、かつ検体中の被験阻害剤中の抗原
決定基を“むき出し”にしやすい(イ)の方法が好まし
い。
本発明の操作において、固相への標的酵素類又は抗被験
阻害剤抗体の固定、被検体と固相との反応、固相上で複
合体を形成した被験阻害剤に対する抗体等の反応、発色
や蛍光などの検出操作、以上の各工程間に、十分な洗浄
が必要である。洗浄液としてはPBSやトリス緩衝液等
、またはそれらにTween − 2 0 ,  }ラ
イトンx−iooなどの界面活性剤を添加したものが用
いられる。
本発明の検出方法を、蛋白分解酵素阻害剤の種々の異常
に関係する疾病の診断に用いる際の検体としては、血液
、脳脊髄液、唾液等の体液の他、組織の一部を生検等で
取り出しその抽出物等を用いることができる。これらの
検体は、そのまま本発明の方法に供することもできるし
、濃縮又は適当なバッファーで希釈して供してもよい。
必要に応じて脱脂、脱塩などの操作や、遠心、濾過など
の操作、さらには適当な酵素を用いた部分消化などの操
作、さらには透析や限外濾過などの前処理を行うことも
できる。夾雑蛋白の種類、量によっては、ゲル濾過やイ
オン交換クロマトグラフィ等で予備的に分画したり、ブ
ルーセファロースカラム等を用いた脱アルブミン処理が
有効なこともある。
本発明の方法を用いて種々の疾患を診断する場合は、検
体として髄液、血漿、血清、尿、唾液等が用いられるが
、アルツハイマー型老人性痴呆症等の中枢神経系の疾患
を診断する際においては、脳脊髄液を検体として用いる
ことが有用な場合が多い。
以下余白 〔実施例〕 以下、実施例及び比較例により本発明を詳述する。しか
し、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではな
い。
尚、実施例及び比較例中の実験書として記載されている
文献は下記の成書を示す。マニアティスら著、モレキュ
ラー・クローニング・ア・ラボラトリーeマニュアル、
コールド●スプリング●ハーバー・ラボラトリー出版、
1982年[T. M−aniatis et al.
,Molecular Cloning A Labo
ratoryManual, Cold Spring
 Harbor Laboratory (1982)
1実施例及び比較例に記載の略称乃至略号で、本文中に
は説明のないものは以下の通りのものである。
PBS (−):ダルベツコの燐酸緩衝塩類后液(Ca
”,Mg2+ 不含) EL I SA用96穴プレート(ダイナテック社)の
各ウエルに、20mMトリス緩衝液(pH8.0)(以
下トリス液)にブタ膵臓トリプシン(シグマ社)を2m
g/ml ,lmg/ml ,0.5mg/ml ,0
.2 5mg/ml ,0.1 2 5mg/ml ,
 0. 0 6 2 5mg/ml , Omg/ml
となるよ9溶かした溶液を各々50μlずっ入れた。
ついで1%グルタルアルデヒド水溶液(和光純薬製20
%グルタルアルデヒド水溶液を水で希釈)を各ウエルに
50μlずっ添加し、マイクロプレートミキサーで十分
に撹拌しながら室温下45分間放置した。
その後PBS(−)溶液(ニッスイ社製の粉末を、添付
のプロトコール通り処理して作製)で各ウエルを3回洗
浄し、ヒト正常血清(カッペル社)をトリス液で500
倍に希釈したものを一部のウェルに添加し、これをトリ
ス液でプレート上で倍々希釈した。このプレートを37
℃のインキュベーターに1時間静置した。そののち、P
BS(−)で3回洗浄後、0.5%グルタルアルデヒド
水溶液を各ウエルに100μlずっ添加し、室温下で4
5分間振とうした。次いで、PBS(−)で3回洗浄の
のち、2%ウシ血清アルブミン(以下BSAと略す)(
シグマ社)、及び0.1%のゼラチン(ウシ皮フ、シグ
マ社)、5X10−6Mのメシル酸ナファモスタット(
鳥居薬品、フサンR)を含むPBS(−)液で37℃1
時間ブロッキングを行った。0.05%T ween 
− 2 0を含むPBS(=)で4回洗浄ののち、l%
BSA/PBS (−)液に、ウサギ抗ヒト・インター
α一トリプシンインヒビター抗血清(デンマーク、DA
KOPATTS社)を4000倍に希釈したものを各ウ
ェル100μIずつ添加し、室温下1時間振とうし−た
。0.05%Tween−20入りPBS(−)で4回
洗浄後ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識、ヤギ
抗ウサギ免疫グロブリンG(γ+L)抗血清(ICN社
)を1%BSA/PBS (−)液で1000倍に希釈
した液を各ウエル100μlずつ添加し、室温下1時間
振とうした。0.05%T ween − 20入りP
BS(−)で6回洗浄後、0−フェニレンジアミン(シ
グマ社)30mgを20mlのクエン酸バッファ一(ク
エン酸” IH2 0,5.11g, Na2Hpo4
12H20,18.41gを水にとかしILにしたもの
)(pH5.0)に溶かし35%過酸化水素水を67μ
1添加した液を各ウエルに100μlずつ加え5分間発
色させた。そののち4.5N硫酸を各ウェルに100μ
lずつ添加し発色をとめ、プレートリーダー(バイオラ
ッドマイクロプレートリーダーModel 3550)
で490nmの吸光度を測定した。バックグラウンドを
差し引いた値の結果を表lに示す。
実施例2  APPIの検出(未′゛ 処理)アルツハ
イマー型老人性痴呆症脳アミロイド前駆体蛋白中の蛋白
分解酵素阻害剤部分APPIのうち約70アミノ酸を含
むポリペプチドsPIの検出系を構築した。sPIは本
発明者らによる欧州特許出願88113283.1号(
公開番号0304013号)の実施例(とくに実施例7
)に記載の方法で得た。sPIのアミノ酸配列を第1図
に示す。
トリプシン仕込量は25μg/ウエルにし、検体として
はヒト血清のかわりにsPIのトリス液溶液を用い、さ
らに抗体として、抗インターα−トリプシンインヒビタ
ー抗体のかわりに、特開平2−138995 (特願昭
63−290626)の実施例9で得たモノクローナル
抗体ADJ−5−3−7 (このモノクローナル抗体の
産生株は、微生物工業技術研究所にFERM  P−1
0388号の寄託番号で寄託されている。この抗体は、
来変性のsPIを感度よく検出できる。)を用い、抗ウ
サギ免疫グロブリンG抗体のかわりにホースラディッシ
ュパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンG
抗体を用いた以外は、実施例1と同様にして、反応を行
った。バックグラウンドを差し引いたA490値はsP
I50ng/ウエルで0.600,sPI25ng/プ
レートで0. 373であった。
実施例3 APPIの検出 (変性処理) l)免疫抗原の作成 βガラクトシダーゼ・APPI融合タンパクの大腸菌に
よる発現 〔工程l〕 融合タンパク発現プラスミドの構築大腸菌
βガラクトシダーゼ(β−g at)のN末端にAPP
 Iを結合した融合タンパク(ZPI)を発現しつるプ
ラスミドを構築した。具体的には、発現用ベクターpE
Xl (ベーリンガー・マンハイム山之内社)を制限酵
素BamHI及びPstlで切断し、直鎖状ベクターD
NA断片を得た。一方欧州特許出願88113283.
1号(公開番号0304013号)の実施例4に記載の
プラスミドpPItrp75−1をBamHI及びPs
tIで切断し、アガロースゲル電気泳動後0.3kbの
断片を、フナコシ社製ジーン・クリーン・キットを用い
て単離した。得られた2つの断片をT4DNAリガーゼ
を用いて連結せしめた。該反応物を、マニアティスらの
実験書に記載されている方法に従って調製した大腸菌P
OP2136株(ベーリンガー・マンハイム山之内社)
コンビテントセルに加え、形質転換せしめた。アンピシ
リン耐性形質転換コロニー6個を選び、各プラスミドを
抽出し、BamHI及びPstで切断し解析したところ
すべて目的とするプラスミドを有していた。得られたプ
ラスミドをpEX−ZPIと命名した。本プラスミドは
、ラムダ・ファージ由来のPRプロモーターの制御によ
り、βガラクトシダーゼ・APP Iの融合タンパクを
発現しつる。
〔工程2〕 融合タンパクの生産 工程lで得たプラスミドpEX−ZPIを保持する大腸
菌POP2 1 3 6/pEX−ZPIを、50μg
/m1のアンピシリン含有L培地で、30℃一晩培養せ
しめた。本培養液1mlを、50μg/mlアンピシリ
ン含有L培地50mlに添加し、30℃にて3時間培養
した後、42℃の恒温培養槽に移し、さらに3時間培養
した。42℃において、ラムダ・ファージPRプロモー
ターのリプレッサーは不活化され、PRプロモーターが
作動することによって、目的とする融合タンパクが生産
される。
該培養液を遠心分離し菌体を集め、菌体の一部を、レム
リーの方法[Laemmli. U. K. , Na
ture.227.680−685(  1970))
に従って、SDS・サンプルバッファ一中で煮沸後、1
0%ポリアクリルアミドゲルを用いてSDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルをクマ
シー染色した結果、分子量約12万ダルトンの目的とす
る融合タンパクが存在することが確認された。以下この
βガラクトシダーゼ・APPI融合タンパクをZPIと
略す。
〔工程3)  ZPIの可溶化 工程2で得た培養菌体の一部を、尿素を終濃度OM,2
M,4M,6M,8Mをそれぞれ含む20mMトリス塩
酸(pH8.0)に懸濁し、オークケ・ンニケータ−(
大岳製作所)を用いて菌体を超音波破壊し、遠心分離に
より不溶物を集めた。
得られた不溶物を工程2と同様に処理して、SDS−P
AGEにより解析した。クマシー染色の結果、目的物Z
PIのバンドは、尿素OM,2Mおよび4M含有バッフ
ァーで抽出した不溶画分では検出されたが、尿素6Mお
よび8M含有バッファ−抽出後の不溶画分では認められ
なかった。
以上の結果から、目的融合タンパクは産生後大腸菌体内
で不溶物としてタンパク封入体( inc Ius i
onbody)を形成し、この不溶物は6M以上の尿素
で可溶化されることが判明した。
〔工程4]  ZPIの部分精製 工程2と同様にして、大腸菌POP2136/pEX−
ZPIを培養し、200mlの培養液から菌体を回収し
た。該培養菌体を、40mlの4M尿素を含む20mM
}リス塩酸(pH8.0)バッファーに懸濁し、菌体を
超音波破壊した。菌体破壊物を遠心分離(10,000
xg,10分間)し、沈澱物を回収した。次いでこの沈
澱物を20mlの8Mトリス塩酸(pH8.0)バッフ
ァーに再懸濁し、超音波処理により沈澱を分散せしめた
。遠心分離 (10,000Xg,10分間)後上清を
回収した。以上の操作により、4M尿素で可溶な大腸菌
タンパク、および8M尿素に不溶な大腸菌タンパクが除
去され、ZPIの部分精製液が得られた。この部分精製
液の一部をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
で解析したところ、全タンパクのうち50%以上が目的
融合タンパクZPIであった。
〔王程5〕 プロテアーゼ・インヒビター領域の挟坦 工程4で得たZPI部分精製液20m lを、20mM
トリス塩酸(pH8.0)2Lに対して2回透析し、尿
素を除去せしめると同時にタンパクの立体構造を回復せ
しめた。
得られた透析液を37℃にて保温した後、TPCK処理
済みトリプシン固定化アガロースビーズ(シグマ社)1
00単位を加え、37℃で1時間振とラすることにより
、ZPI中のβガラクトシダーゼ領域を切断すると同時
にプロテアーゼ・インヒビター領域を吸着させた。かか
る懸濁液を、5゛ プライム→3゜ プライム社のセレ
クトSR空力ラムに充填し、アガロースビーズを回収し
た。
アガロースビーズとバッファーとの分離は、l000r
pm 1分間の遠心操作により行った。(以下の記述中
のアガロースビーズの回収も同様にして行なった。)回
収したビーズを、0.3M  NaC1、10mM  
CaClt、10mM  HCI (pH2)から或る
溶出液6mlで溶出した。溶出は計3回行い、各溶出液
を5N  NaOHを用いて中和した後、トリプシン阻
害活性を測定した。
各溶出液に含まれるトリプシン・インヒビター活性濃度
は、溶出分画の順に、BPTIに換算して16.4μg
/ml , 1.5 t.t g/ml , 0.27
μg/mlであった。これらの溶出分画をZtPIとす
る。
〔工程6〕 プロテアーゼ・インヒビターの解工程5で
得た溶出液に、あらかじめ−20℃に冷却したアセトン
を4倍容量加え、−20℃にて1時間冷却した。冷却遠
心分離( 10,000x g, 15分間)し、沈澱
を回収した。得られた沈澱をlmlの20mM}リス塩
酸(pH7.5)に再溶解し、工程5と同様にしてトリ
プシン阻害活性濃度を測定した。その結果、62μg相
当のトリプシン・インヒビターが含まれていることが判
明した。
得られたインヒビター溶液の一部を、SDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法により解析したところ、分子
量約6キロダルトンのメジャーなタンパクが検出された
2)抗血清の作戒 上記l)で得られたZPI30Qμgを、前述したレム
リーの方法によるSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で用いるサンプルバッファ一(2%SDS.5%β
−MEを含む、ただし色素は加えなかった)中で、10
0℃5分間処理したのち、80%のアセトン水溶液で沈
澱させ脱SDS処理を行い、その沈澱をPBS(−)に
懸濁し、これとフロイント完全アジュバント(FCA)
とをよく混合してウサギに皮下注射した。31日後にF
CAのかわりにフロイント不完全アジュバントを用いた
以外は同じ処理(免疫)を行った。さた。さらに16日
後、ZtPIを用いて同じ処理(免疫)を行った。さら
に15日後sPI150μg(正しくはsPIより数ア
ミノ酸大きいAPPI)を同じ処理をして免疫した。こ
のウサギから5cc採血し、抗血清を得た。以後この抗
血清を抗変性ZtPI抗血清と呼ぶ。
この抗体は未変性sPIよりも、SDS−β一MEで変
性させたsPIをより強く認識した。また尿中トリプシ
ンインヒビター(日本ケミカルリサーチ社)とは全く反
応しなかった。
3)変性APPIの検出 被験化合物としてs P I 、夾雑蛋白のモデルとし
てBSAを100μg/ウェル使用した。実施例1と同
様の方法でトリプシン25μg/ウェルをEL I S
Aプレートに固定し、BSAをつねに100μg/ウェ
ルを含むようにして、sPIをsong/ウェルから倍
々希釈して検体とした。
検体の入ったプレートを37°C1時間処理し、PBS
(−)で3回洗浄後、0.5%グルタルアルデヒドで4
5分間室温で再固定操作を行った。このプレートを以下
の変性液で変性処理した。
(A)0.15%SDSS l%β−ME  12.5
mM}リス緩衝液(pH6.8) (B)2%SDS、5%β一ME62.5mM}リス緩
衝液(pH6.8) 変性条件は、(A)の変性液で80°CO.5時間、あ
るいは2時間、あるいは(B)の変性液で80’C0.
5時間のいずれかであった。加熱処理は80℃に加熱し
たインキュベーター(空気浴)中に、プレートシールで
フタをしたプレートを静置することによって行った。こ
の処理ののち、PBS(−)で5回洗浄後、実施例lと
同じブロッキング,洗浄操作を行い、次いで500倍に
希釈した抗変性ZtPI抗血清を室温、1時間反応させ
、後の操作は実施例lと同様に行って発色させた。
バックグラウンドを差し引いた吸光度(Alio)の結
果を表2に示す。
比較例1 通常のEL I SA法によるAPPI検出
未変性BSAを含むpH9.6の1.1 MNaHCO
./NazcOsバッファ一中、EL I SAプレー
ト上で実施例3記載の(B)液で100’C5分間処理
して変性させたsPIを50ng/ウエルから倍々希釈
し、4℃一晩放置した。BSAは各ウェル100μgと
なるようにした。このプレートを0.05%Tween
20人りPBS(−)で4回洗浄後、1%BSA/PB
S (−)で室温2時間ブロッキングし、ブロッキング
後の洗浄操作以降は実施例2と同様に行った。表3に示
したように、バックグラウンドを差し引いた後の吸光度
(A...)は、実施例2に比べ、発色度はきわめて低
く、かつ抗原sPIに対する抗原量依存性も悪かった。
但し、この抗変性ZtPI抗血清は、上述の方法でBS
A非存在下においては変性sPIを0.4ng/ウェル
程度まで抗原量依存的に極めて強く認識した。
実施例4  APPIの検出( 固定操作なし)トリプ
シンとsPIの反応後のグルタルアルデヒドによる再固
定操作を行わない以外は、実施例3と同様に反応を行っ
た(ただし変性液は(A)液のみを使用)。バックグラ
ウンドを差し引いた後の吸光度(A.。。)の結果を表
4に示す。
実施例5 キモトリプシンの使用 トリプシンのかわりにウシ膵臓キモトリプシン(シグマ
社)を用い、変性条件を(A)液70℃1時間とした以
外は、実施例3と同様に反応を行った。結果は、トリプ
シンを用いた場合とほとんど同じであった。
実施例6 アンヒドロトリプシンの使用キモトリプシン
のかわりに、アンヒドロトリプシン(アンヒドロトリプ
シンアガロース用の未固定アンヒドロトリプシンを宝酒
造株式会社より入手)を用いた以外は、実施例5と同様
に反応を行った。結果はトリプシンを用いた場合とほと
んど同じであった。
実施例7  APP中のAPPIの検出検体として、欧
州特許出願88113283. 1号(公開番号030
4013号)の実施例5に記載の方法で得られた分泌型
APP (sAPP)を用いた。
分泌型APPとして、プラスミドp S VMT667
をCOS−1細胞にトランスフエクトして培養上清中に
分泌されたものをsAPP667、プラスミドpSVM
T592から得られたものをsAPP592とする。前
者はAPP770のうち、C末端103個のアミノ酸が
欠失したものである。
これに対し後者は、APPI部分を含まない695アミ
ノ酸からなるA P P 6 9 5 [Kang e
t al,,Nature 325, 733−736
 (1987)参照〕中のC末端103個のアミノ酸が
欠失したものである。sAPP667、sAPP592
を各々含む培養上清、及び未処理COS−1細胞の培養
上清をセントリコン10(アミコン社)で濃縮した。実
施例3と同様の方法でトリプシン固定プレートを調製し
、検体として上述の濃縮培養上清を9.6μg蛋白/ウ
エルとなるようにプレーティングし、順次倍々希釈を行
った。このプレートを37℃、1時間処理し、それ以降
は実施例3記載の方法で処理(但し、変性は(A)液、
80°C、0.5時間)を行い、sAPPを部分消化し
てその中に含まれるAPPIの検出を行った。バックグ
ラウンドを差し引いていない吸光度(A4g。)の結果
を表5に示す。
本方法によって、sAPP667中のAPPIが明確に
検出できた。COS−1細胞自身がAPP751,AP
P770を産生しており、表5中のsAPP592の発
色は、COS−1細胞自身がもともと分泌するAPP由
来のものであり、COS−1細胞のみの発色と同じレベ
ルであった。
標的酵素としてトリプシンの代わりにアンヒドロトリプ
シン(実施例6参照)を用いた以外は、実施例7と同様
の反応を行った。
結果は、実施例7と同様にsAPP667中のAPPI
を明確に検出できたが、全体の発色度が実施例7の1/
8からl/16となった。実施例7及び実施例8.のポ
ジティブコントロールとして反応させたsPIの発色度
はほぼ同程度であったので、実施例7と実施例8の差は
、抗原決定基の露出度の差由来と考えられる。
表 1 表 2 表 3 表 4 表 5 実施例9 蛍光法を用いたsAPP中のAPP 1被験
化合物としてsPI、夾雑蛋白のモデルとしてBSAを
100μg/ウエル使用した。実験例lと同様の方法で
トリプシン25μg/ウェルをEL I SAプレート
に固定し、BSAをつねに100μg/ウェルを含むよ
うにして、sPIを1.40ng/ウェルから0.2n
g刻みでOng/ウエルまでのサンプルを調整し検体と
した。検体の入ったプレートを37°C1時間処理し、
PBS(一)で3回洗浄後、0.5%グルタルアルデヒ
ドで45分間室温で再固定操作を行った。このプレート
を100μlの0.l5%SDS,1%β−ME62.
5mMhリス緩衝液(pH6.8)中で80°Cで0.
5時間変性させた。こののち、PBS(−)で5回洗浄
後、実施例lと同じブロッキング,洗浄操作を行い、次
いでl%BSA/PBS (−)で1000倍に希釈し
た抗変性ZtPI抗血清を400で一晩反応させた。こ
れを0.5%TWeen20入りPBS(−)で4回洗
浄後、β−ガラクトシダーゼ標識したヤギ抗ウサギIg
G (ZYMED社)をl%BSA/PBS (−)/
1mM  MgSO4液で1000倍に希釈し各ウエル
100μlずつ添加し、37°CI時間反応させた。0
.05%Tween−20入りPBS(−)で6回洗浄
後、4一メチルウンベリフェリルガラクトシド(シグマ
社)を0.3mMふくむP B S (−) / 1 
mMMgsO4を各ウエル100μl加え1時間反応さ
せた後、バンデックス社製FCA蛍光プレートリーダー
を用い励起波長360nmで450nmの蛍光を測定し
た。測定結果を表6に示す。
表 6 実施例1 0 蛍光法を用いたAPP770の 泉垂崖立塗坦 l)抗原及び評価用タンパクの作成 〔工程1〕 APP770からのAPPI部 の切り出しAPP中に
存在するプロテアーゼインヒビター領域(以下APPI
と略す)に加えて、N末端側及びC末端側にAPP77
0由来のアミノ酸を含むペプチド部分を発現させるため
にAPP?70をコードするDNAを、合戊オリゴヌク
レオチドを用いたいわゆる部位特異的変異法で切り縮め
た。
この反応にはMutanG(宝酒造)システムを用い、
反応は附属されるプロトコールを一部改変して3′側及
び5′側の欠失反応を同時に行った。
欧州特許出願番号88113283.1号(公開番号0
30413号)記載の方法で得たヒト老人斑アミロイド
前駆体遺伝子cDNAを含むプラスミドpGBP2 (
ATCC−6 7 5 0 2)を制限酵素BamH 
 消化後アガロースゲル電気泳動で分画し、APP1部
分を含む、1.6KbのDNA断片を回収した。この断
片をBamHI切断後バクテリアアルカリフォスファタ
ーゼ(BAP)処理したベクターTv1B(宝酒造)に
接続し、目的の方向に組み込まれたクローンTvBB 
1を得た(第2図参照)。5゜末端側、及び3′末端側
の欠失のため、第3図に示す2本のオリゴヌクレオチド
D5,D3をアプライドバイオシステムズDNA合成機
380Aにて合成し、反応に使用した。D5による欠失
反応が起こると、BamHI切断後、ヒト組織型プラス
ミノーゲンアクチベータ−(以下tPAと略す)のシグ
ナル配列中に存在するBglII部位と接続した時、t
PAシグナルの後に先述の欧州特許出願番号88113
283. 1号(公開番号030413号)に記載され
たエクソンH(Lemaireら、Nucle−ic 
 AcidsR e s e a r c h  17
  517−522 1989によればエクソン6)由
来の6アミノ酸に続きエクソンI(エクソン7)以下に
コードされたペプチドがつながる構造を持つ。(第4図
参照)さらにD3による欠失が起こると、エクソンJ(
エクソン8以下ヒトAPP遺伝子のエクソンは数字で表
記する)に記した部分に続きエクソン9由来のC末端側
アミノ酸とそれに続く停止コドンとBamHI部位が導
入される。すなわちD3を用いた反応は欠失反応と同時
に2塩基の置換を行うものである(第3図、第4図参照
)。まず1本鎖TvBBIDNA0.5μgに、キット
に付属するmp 1 8DNAを0.2μg加え、lO
μlの 20mM  TrisHC l  (pH8.
 0) 、1 0 mM  Mg C l 2、50m
M  NaC1,1mM  ジチオスレイトール(DT
T)中で100℃ 3分、65°C  10分、37°
C  10分インキユベートして、アニルさせた。この
アニールされたDNA4.5μlにリン酸化したD3,
D5をそれぞれ16ng加え、65°CI5分、37°
C15分インキユペートしてアニールさせた。ここに3
0μlの50mMTris−HCI (pH8.0) 
、6 0mMNH.OCOCH=5mM  MgCL 
、5mMDTTS lmMNAD及び60ユニットのE
.coliリガーゼ、■ユニットのT4ポリメラーゼを
加えて、25℃で2時間反応させた。この反応物を大腸
菌BMH71一18株にトランスフェクトし、1時間培
養後ファージ粒子を含む培養液を大腸菌MV1184株
にトランスフエクトし、プラークを形成させた(使用し
た大腸菌及びバッファ一、酵素は全て宝酒造)。このプ
ラークに対して32Pで標識したD5とD3を用いてス
クリーニングした。D5,  D3ともにポジティブな
シグナルを与えるプラーク4つを同定し、M13シーク
エンスキット(宝酒造)を用いて欠失部位の塩基配列を
決定した。D3の欠失の確認時には、キットに付属のユ
ニバーサルプライマーを、D5の欠失の確認時には、カ
スタムメイドのプライマー(5゜ACTTTGGGAC
ATGGCGCTGCCACA  3’ )を用いた。
目的の欠失が起こっているクローンを、TvIJと命名
した。
〔工程2〕 泌シグナルを持つ動物ベクターへの組み込み上記の欧州
特許出願番号88113283.1号(公開番号030
413号)に記載のtPAを発現するプラスミドベクタ
ーpSVMTtPAを制限酵素BglI[で完全消化後
、BamHIで部分消化し、得られる約3.8Kbの断
片を、TvIJのプラスミドをBamHIで消化して得
られる約300bpの断片と連結し、目的の方向に組み
込まれたクローンを選択した。これによりtPAのシグ
ナル配列に続<APPのエクソン7、8を主に含む部分
をSV40及びマウスノタロチオネインプロモーターに
て発現させるベクターpIJを得た(第5図参照)。
〔工程3〕 異体の作成とベクターへの組み込み pIJをBamHI消化後、切り出される断片をmpl
8(宝酒造)に組み込み、目的の方向に組み込まれたク
ローンmpIJを得た(第5図)。
〔工程4〕 置換体プラスミドの合成 mplJの一本鎖DNAを常法に従って調製した。一方
、オリゴヌクレオチドデリーターDJ2(5’  TA
GAGGATCCTAGGCGCTGCCACA  3
゜)及びミューテータ−DOG 1(5’  AGAG
GTTCCTGGGCAGCCTTGAGTAAACT
TTG  3゜)を合成し、以下に示すプロトコールに
従ってデリーターDJ2を用いて、エクソン8より下滝
の部分(第4図塩基番号295から369まで)の除去
、及びミューテーターDOG1を用いてエクソン8領域
内に内在する〇一結合型糖鎖付加部位と考えられる部分
の改変を行った。まずDJ2またはDOG lを3 2
 pmo l e,合成オリゴヌクレオチド(5′GT
TTTCCCAGTCACGA  3’ )10pmo
 1を、アデノシン3リン酸の存在下にT4DNAキナ
ーゼ(宝酒造)を用いてリン酸化後、先に調製した一本
鎖DNA0.6μgと混合し、95℃ 5分インキュベ
ート後、室温に放置した後、デオキシリボヌクレオチド
(アデニン、グアニン、シトシン、チミジン)3リン酸
及びアデノシン3リン酸存在下にDNAポリメラーゼK
lenowフラグメント、T.DNAリガーゼを作用さ
せ二本鎖DNAを合成させた後、大腸菌JMl05(宝
酒造)を形質転換させ、プラークを形成させた。これを
Maniatisの実験書に従い、32p−γATPを
用いて、放射標識したDJ2又はDOG1をプローブと
して、目的の変異を持つプラークを選定した。これらの
プラークから一本鎖DNAを回収し、M13シークエン
スキット(宝酒造)を用いて塩基配列を決定した。DJ
2を用いたものでは、第4図の塩基番号第295番目の
Aから第369番目のCまでが除去されたもの、即ち2
94番目以後に370番目以後のTAG停止コドンがつ
ながったものが得られた。DOG1を用いたものでは、
316番目のAがGに、319番目のAがGに変わり、
それに伴って、コードされていた2つのThrがAla
に変換されたものが得られた。
これらのクローンをそれぞれmpDJL及びmpDOG
Lと命名した。mpDJL及びmpDOGLの二本鎖D
NAをBamHIで切断して得られる断片を、BamH
I切断後BAP処理をしたpIJに挿入し目的の方向に
組み込まれたクローンを選択した(第5図参照)。更に
確認のために同じプローブを用いてこれをManiat
iSの実験書に従いサザン解析を行って、目的の変異を
各々のクローンが持っていることを確認した。こうして
得られた発現ベクターをpSVMT−DJL及びpSV
MT−DOGLと命名した。pSVMT=DJLは、p
IJと比較してエクソン8以下を欠失させた部分のみを
発現する。一方pSVMT−DOGLは、エクソン8内
に内在する〇一結合型糖鎖付加部位と考えられる2つの
Thr残基がAla残基に変換されたタンパクを発現す
る。
〔工程5〕 動物細胞での発現と精製 工程4で得られたpSVMT−DJL,pSVMT−D
OGL及びpIJ各々20μgを、各1×106個のC
OS−1細胞に対し、シヨ糖含有PBS(272mMシ
ヨ糖、7mMリン酸ナトリウム( p H7. 4) 
 1 mMM g C I 2 )中で導入した。導入
は、バイオラッド社のジーンパルサーWを用い、電圧4
00V,キャパシタ−3μF,1.0〜1.3m秒で、
30秒の間隔をおいて2回電気パルスを与えることによ
り行った。導入後一の細胞を、10%ウシ胎児血清(以
下、FCSと略す)を含むダルベツコの変法最小基本培
地中で37℃、5%CO2の条件下で24時間培養後、
ダルベツコのリン酸緩衝塩類溶液(Ca2+、Mg2+
不合)(以下PBS(一)と略す)で洗浄し、FCSを
除いた後、FCSを含まない培地に交換し、以後48時
間毎に培地を交換し、計3回培養上清を回収した。更に
導入を各プラスミドに対してlO回行い、各プラスミド
当たり計300mlの培養上清を得た。なお、p IJ
,pSVMT−DJL及びpSVMT−DOGLによっ
て発現されたタンパクを以下、各々fJ,DJL,及び
DO  GLと略す。各培養上清に対してアセトンを終
濃度40%となるように加え、−20℃にてl時間放置
後、5000rpm,−10℃で20分間遠心分離し、
上清を回収した。さらに回収上清に対し、終濃度80%
となるようにアセトンを加え、−20℃にて1時間放置
後遠心分離し、沈査を回収した。得られた沈査を6ml
の20mMトリス塩酸(pH8.0)に溶かし、500
0rpm、4°CにてlO分間遠心分離し、上清を回収
した。次いでこの上清6mlに対し、トリプシンアガロ
ース(アガロースビーズに固定されたトリプシン)(シ
グマ社)50単位を加え、37℃で10分間 振とうし
、試料を吸着させた。懸かる懸濁液を、5プライム→3
プライム社のセレクトSカラムWに充填し、アガロース
ビーズを回収した。以降、アガロースビーズの分離は、
1000rpm,1分間の遠心操作により行った。回収
したビーズを0.3MNaC L I OmMCaC 
12から成る洗浄液6mlで洗浄した後、0.3MNa
Cl、10mMCaC L 、1 0mMHC 1  
(pH2)から成る溶出液3mlで溶出した。溶出は計
3回行い、各溶出液をlMトリス塩酸(pH8.0)を
用いて中和した。得られた溶出液計9mlに対し、アセ
トンを終濃度80%となるように加え、−20°Cにて
1時間した後、5000rpm、−10°Cで20分間
遠心分離し、沈査を回収し、得られた沈査を約200μ
1の20mMトリス塩酸(pH8.0)に溶かした。
〔工程6〕 IJ,DJL及びDOGLの解析 工程5で得られたIJXDJL及びDOGLの一部を1
7.5%SDS−PAGEで電気泳動後、Coomas
 s i e染色を行い、回収された各タンパクの純度
検定及び分子量の確認を行った。得られたIJ,DJL
及びDOGLは大きさが各々〜17Kd,〜7Kd及び
〜7Kdのほぼ均一なバンドであった。このことは、A
PPのエクソン8上に推定された〇一結合型糖鎖付加部
位を持つIJ上には、実際に糖鎖が存在し、そのみかけ
の分子量が約10Kdであること、また、DJL及びD
OGLに於いては、それぞれエクソン8領域の欠失及び
〇一結合型糖鎖付加部位の変異によってペプチド部分の
みが発現していることが、強く示唆された。さらに各タ
ンパク上の糖鎖の有無についてZachariusらの
方法に従ってPAS (Periodic  acid
−  Shiff)染色を行った(Zacharius
ら、Anal.Biochem.30  148−15
2  1969)。その結果、IJのみがPAS染色陽
性であったことから、IJには糖鎖が存在するが、DJ
L及びDOGLには糖鎖が存在しないことが明らかにな
った。即ち、それぞれ設計通りのタンパクを精製、回収
していることが明らかになった。
〔工程7〕 APP667,648及び592の精製欧州特許公開番
号0304013号実施例5工程2記載の分泌型APP
を以下に示す方法により精製した(第1図−2にその模
式図を示す)。
欧州特許公開番号0304013号実施例5工程2記載
のプラスミドpSVMT667、648及び592をC
OS細胞に導入した。方法は上記の本発明実施例l工程
5に記載の方法に従った。
各プラスミド導入COS細胞の培養上清に対し終濃度2
mMになるよう(p−アミジノフエニル)メタンスルホ
ニルフルオリド塩酸塩(和光純薬工業株式会社)を添加
し、Centriprep#30W(アミコン社)を用
いて濃縮を行いさらに同装置中で2 0mMT r i
 s−塩酸(pH8.0)にバッファ一交換を行った。
次に、DEAE−Sepharose (ファルマシア
社)カラムを用い、上記試料をアプライし、20mMT
ris−塩酸(pH8.0) 、NaC1勾配0−1M
の条件?カラムクロマトグラフィーを行った。
クロマトグラフィーの各画分について、APPに対する
抗体を用いて固相ELISAを行い、APP溶出位置を
同定した。抗体としては、APP592及びAPP64
8については、大腸菌で発現させたA P P +9−
7− ( Z K X)に対して作成したウサギ抗AP
P,。−3■。抗血清、APP667については、特開
平2−138995の実施例9て得たモノクローナル抗
体ADJ5−3−7(微工研FERM  P−1038
8号)を用いた。ZKXは、工程lに記載のpGBP2
のうちAPP770の一部をコードしているKpnI−
Xho■断片をリンカーを用いて、実施例3に記載した
ベクターpEXlに挿入L,ZPIと同様の方法で大腸
菌中に発現させ,精製したAPP770中のN末端から
19アミノ酸から379アミノ酸よりなるポリペプチド
とβ−ガラクトシダーセとの融合蛋白である。
コノ固相ELISAi:より、各APPは、0.30.
4MNaCIで溶出されたことがわかった。
EL ISA陽性画分をセントリコン#30W(アミコ
ン社)を用いて濃縮し、さらに同装置中で50mMリン
酸ナトリウム(pH7.2)にバッファ一交換した。次
に、ヘパリンカラムを用いたアフィニティークロマトグ
ラフィーを行った。DEAE−Sepharose(フ
ァルマシア社)カラムによる部分精製画分をヘパリン−
SPWカラム(東ソー株式会社)にアプライし、NaC
1勾配0−2Mの条件でクロマトグラフィーを行った。
クロマトグラフィーの各画分について同様にウサギ抗A
PP19−379抗血清又はADJ5−3−7を用いた
固相ELISAを行い、APP溶出位置を同定した。各
APPは1.0−1.2MNaClで溶出した。ELI
SA陽性画分をセントリコン#30W(アミコン社)を
用いて濃縮後、20mMTris−塩酸(pH8.0)
にバッファ−交換した。これらを7.5%SDS−PA
GEにかけ、Coomassie染色を行い、純度及び
分子量の確認を行った。p S VMT667,648
及び592を導入したCOS細胞培養上清から、上記操
作を行うことにより得られた各タンパクは、いずれもS
DS−PAGE上でややブロードな単一バンドであり、
見かけの分子量はそれぞれl05.5Kd,100. 
5K d及び94.5Kdと決定された。以下pSVM
T667、648及び592をCOS細胞に導入した培
養上清から精製されるAPPをそれぞれAPP667、
648及び592と略す。
〔工程8〕 モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作成(i)マ
ウスの感作 ハイブリドーマ作成のための抗原は、以下のようにして
調製した。本実施例 工程5で得たIJをPBS(−)
に溶かし、LaemmliのSDS−PAGEサンプル
バッフy−(Laemmli  U.  K. Na 
t u r e  227  680−685(197
0))中で100°C、3分間煮沸後、4倍容のアセト
ンを加え、−20℃で1時間冷却を行い、9000回転
20分間の遠心操作を行った。過剰量のSDSを除去し
、沈査よりSDS変性IJを回収し、これをハイブリド
ーマ作成のための抗原として用いた。免疫は50μgの
SDS変性IJを500μlのPBS(−)に溶かした
ものをそれぞれ3匹の6週齢のBalb/c雌マウスの
腹腔にフロイントの完全アジュバントと共に注射し、以
後2週間の間隔でフロイントの不完全アジュバントと共
に合計4回の免疫を行った。免疫の過程で抗原に対する
血清の抗体価の上昇を単クローン抗体実験マニュアル(
講談社サイエンティフィク 富山朔二著)に従って、固
相ELISA法により確認した。
(i i)細胞融合 単クローン抗体実験マニュアル(講談社サイエンティフ
ィク 富山朔二著)に従って細胞融合を行った。血清の
抗体価の最も高かったマウスに、200μlのPBS(
−)に溶かした50μgのSDS変性IJを尾静脈より
注射し、その3日後に、牌細胞を無菌的に取り出し、ス
テンレスメッシュで単細胞にほぐし、牌細胞の1/5量
の87ザグアニン耐性骨髄腫細胞株P3X63−Ag8
−6 5 3細胞・(株式会社 免疫生物研究所より入
手)と、MediaIW培地(株式会社 免疫生物研究
所)を混合し、遠沈後、細胞のペレットに50%PEG
1500(ベーリンガー社製)を加え、融合操作を行っ
た。その後、融合細胞を遠心して上清を吸引除去した後
、30%FCS入りHAT培地(上述 単クローン抗体
実験マニュアル参照)を加え、96穴マイクロプレート
1l枚にまいた。融合後、約2週間で600ウエルから
コロニーが生育し、これらの培養上清についてSDS変
性IJをスクリーニング用抗原とした固相EL I S
Aを行い、SDS変性IJと強く反応するクローンを得
、限界希釈法によるクローニングを3回繰り返した。3
回のクローニングにより安定した抗体産生を示す1クロ
ーンを7E11と命名し、これを平成2年7月27日付
けで微生物工業技術研究所に寄託した。(FERM  
P−11633号) 〔工程9〕 モノクローナル抗体7E11の特徴ブ (i)免疫グロブリンのクラス及びサブクラスモノクロ
ーナル抗体7E11の免疫グロブリンのクラス及びサブ
クラスをアイソタイピングキット(アマーシャム社)を
使用して決定した。その結果IgGl,L鎖はκと決定
された。
(i i)特異性 7E11の特異性を以下に示す試験により決定した。本
実施例工程5で作成したIJ.DOGL,及びDJLを
用いた通常の固相ELI SAを行った。その判定結果
を表7に示す。
表7 7E11との反応性 この結果から本発明による7E11抗体はAPP遺伝子
エクソン8領域対応タンパクを特異的に認識しているこ
とが示唆された。7E11について更に次の試験を行い
、その抗原特異性を明らかにした。試験には、工程7で
得られた分泌型各種APP(APP667、APP 6
 4 8、APP592)を用い、非変性条件下及びS
DS一変性処理を行い、通常の固相ELI SA法を用
いて判定を行った。一次抗体を2μg/m1の7E11
IgGの濃度で加え、二次抗体はβ−ガラクトシダーゼ
標識ヒツジF (ab’ ) 2抗マウスIg(アマー
シャム社)を用い、基質は4−メチルウンベリフェリル
β一D−ガラクトピラノシドを用い、蛍光リーダーFC
A (PANDEX社)を用いて蛍光強度を測定した。
その結果を表8,9に示す。
表8 7E11の抗原特異性(1) 表9 7E1 ■の抗原特異性(2) 本発明による7E11抗体はAPP667を強く認識し
たが、APP648及びAPP592は全く認識しなか
った。このことからも、7E11抗体がAPP遺伝子エ
クソン8領域対応タンパクに特異的であり、非変性及び
SDS変性対応タンパクを共に認識することがわかった
〔工程10F 7E11を用いたトリプシンEL I SA実施例1と
同様の方法でトリプシン20μg/ウェルをEL I 
SAプレートに固定し、BSAをつねに100μg/ウ
ェルを含むようにして、APP667を25ng/ウェ
ルから倍々希釈して4℃1夜吸着を行った。この後PB
S(−)で5回洗浄ののち、2%ウシ血清アルブミン(
以下BSA)(シグマ社)、及び0.1%のゼラチン(
ウシ皮フ、シグマ社)、5X10−’Mのメシル酸ナフ
ァモスタット(鳥居薬品、フサンR)を含むPBS(−
)液で4°08時間ブロッキングを行った。0.05%
Tween−20を含むPBS(−)で4回洗浄ののち
、5XIO−6Mのメシル酸ナファモスタットを含む1
%BSA/PBS (−)液に、2ug/mlの7E1
1  IgGを加え、これを各ウェルlOOμlずつ添
加し、4℃一晩反応させた。
この後0.05%Tween−20入りPBS(−)で
4回洗浄後、β−ガラクトシダーゼ標識したヒツジFa
b’ フラグメント(アマシャム社)を、5 X 1 
0.−6Mのメシル酸ナファモスタットを含むl%BS
A/PBS (−)/1mMMgSO4液でiooo倍
に希釈し各ウエル100μlずっ添加し、37℃l時間
反応させた。0.05%Tween−20入りPBS(
−)で6回洗浄後、4−メチルウンベリフェリルガラク
トシド(シグマ社)を0.3mM含むPBS (−)/
1mMMgSO.を各ウェル100μl加え1時間反応
させたの値バンデックス社製FCA蛍光プレートリーダ
ーを用い励起波長360nmで450nmの蛍光を測定
した。
結果を表1 0に示す。
表10 実施例1l 脳脊髄液中のAPPTの検出(1)下記の
44歳から64歳のアルツハイマー型造人性痴呆症及び
その他の疾病の患者から採取し六脳脊髄液(C S F
)中のAPPI量を検出、定1した。
l)アルツハイマー病患者群(AD群):No.2. 
 3,  4.  1 12)対象群: No.5.10(小脳変性症),No.8(パーキソン
病),No.9(脳血管性痴呆症),No17.18(
脊髄小脳変性症、非痴呆)用いた抗体及び検出方法は実
施例3の3)と暉様で、変性操作は(A)液、80°C
,0.5時間で行った。検体のCSF 1 0 0μ1
程度からトリ冫液で倍々希釈し、最終的に得られたA 
4 g。の値と希釈率を図示し、50μICSFのとき
のA 4 s oの値をそのグラフから読み取った。バ
ックグラCンドを差し引いた後の吸光度(A4,。)の
結果を表11に示す。AD群は対象群に比べ、t一検定
で95%以上有意に高い値を示した。
実施例l2 脳脊髄液中のAPPIの検出(2)購入し
たばかりの抗ウサギ免疫グロブリン抗体を用い、発色時
間をやや長くした以外は、実施例1lと同様にして、下
記の52歳から64歳のアルツハイマー病及びその他の
疾病の患者から採取したCSF中のAPPIを検出した
l)アルツハイマー病患者群(AD群):No.l2,
16 2)対象群: No.21(脳梗塞),No.8(頚椎症)バックグラ
ウンドを差し引いた後のA。。の結果を表12に示す。
表 l ■ 表 l 2 比較例2 免疫開始前に採取したウサギの血清を用いた
脳脊髄液中のAPPIの検出 抗変性ZtPI抗血清の代わりに、免疫開始前に採取し
た同じウサギの血清を用いた以外は、実施例11と同様
の反応を行った。結果は、CSF及びポジティブコント
ロールとしてのsPIいずれもバックグラウンド(無抗
原)と同じ程度の発色しか認められなかった。
実施例l3 脳脊髄液中のAPPIの定量(3)アルツ
ハイマー型老人性痴呆症群(AD)12例、脳血管性痴
呆症群(MID)6例及びその他の疾病の患者群(no
n−D)9例から採取した脳脊髄液(C S F)中の
APPI量を検出、定量した。
用いた抗体及び検出方法は実施例3の3)と同様で、変
性操作は(A)液、80℃、0.5時間で行った。 A
PP667を標準物質として検量線を作成し、検体のC
SFを100μ1175μ1150μlの各水準(いず
れも100μlとなるようにトリス液を加えた)でのA
PPI量を求め、IL当りのAPPI濃度を計算して、
各水準の平均値をその検体のAPPI濃度とした。 各
患者のCSF中のAPPI濃度を表13に示す。
t一検定でAD群は、MID群に比べ99.6%以上有
意に高い値を示し、non−D群に比べても98%以上
有意に高い値を示した。
表13 CSF中のAPPI濃度(nM) 〔発明の効果の概要〕 本発明によれば、蛋白分解酵素阻害剤の高感度の検出が
可能である。特に多量の猥雑蛋白中の微量の蛋白分解酵
素阻害剤を検出する際、蛋白分解酵素阻害剤の抗原決定
基が“隠れてしまっている場合、及び2、抗体サンドイ
ッチELI SAを行うのに適当な抗体が得られない場
合に特に有用である。
【図面の簡単な説明】
第1図−1は、アルツハイマー型老人性痴呆症脳アミロ
イド前駆体蛋白APP695, APP751,A P
 P 770の模式図、及びA P P 770中の蛋
白分解酵素阻害剤部分APPI付近の約60から約90
アミノ酸を含むポリペプチドs P−I、IJ,DoG
L,DJLのアミノ酸配列の概略図を示す。 斜線部はプロテアーゼインヒビター活性を有する56ア
ミノ酸からなる領域、点々部分はAPP770に固有の
19アミノ酸からなる領域、黒く塗りつぶした部分(B
AP)は脳に沈着する老人斑アミロイド部分を示す。 
図中CHOは糖鎖を示し、Xは糖鎖がないことを示す。  図中の数字はAPP770のN末端から数えたアミノ
酸残基番号を示す。第1図−2は分泌型APP (AP
P667A P P648, A P P592)の構
造を示す模式図。 図中の数字は各APPのN末端から数えたアミノ酸残基
番号を示す。 第2図は、アミロイド前駆体蛋白をコードするプラスミ
ドpGBP2からMu t a nTMGをもちいて5
゛側、3′側を欠失させてTvlJを得るまでを示した
ものである。 第3図は、tvBBlの1本鎖DNAが、合成したオリ
ゴヌクレオチドD5およびD3とハイブリダイズした様
子を示したものである。DNA配列の上に推定されるア
ミノ酸配列を示し、下に制限酵素切断点を示す。また欠
失を確認するための塩基配列決定に使用したしたプライ
マーの位置も示す。 第4図は、pIJ,pSVMT−DJL及びpSVMT
−DOGLが持つ、tPAのシグナル配列に続<APP
IをコードするDNA配列と、それから推定されるアミ
ノ酸配列である。tPAとAPPI部分をつないだ制限
酵素部位を示す。 第5図は、tvIJからpIJを作成後APPI部分に
変異を導入し、もとのベクターに戻してpSVMT−D
OGL及びpSVMT−DJLを作成するまでを示した
ものである。 特 許 出 願 人 旭化戒工業株式会社 T 目

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. (イ)固相担体に結合した、蛋白分解酵素阻害剤に対し
    親和性を有する蛋白分解酵素又はその誘導体と、該蛋白
    分解酵素阻害剤に対する抗体、又は、(ロ)固相担体に
    結合した、蛋白分解酵素阻害剤に対する抗体と、該蛋白
    分解酵素阻害剤に対し親和性を有する蛋白分解酵素又は
    その誘導体、の(イ)又は(ロ)の組合せを用いて固相
    酵素免疫測定法を実施することを特徴とする蛋白分解酵
    素阻害剤の検出方法。
JP22088990A 1989-08-22 1990-08-22 蛋白分解酵素阻害剤の新規な検出方法 Pending JPH03162671A (ja)

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JP1-214118 1989-08-22
JP21411889 1989-08-22

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JP22088990A Pending JPH03162671A (ja) 1989-08-22 1990-08-22 蛋白分解酵素阻害剤の新規な検出方法

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014517295A (ja) * 2011-05-26 2014-07-17 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド アルファ1−アンチトリプシン活性の測定のための固相結合エラスターゼ結合アッセイ

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2014517295A (ja) * 2011-05-26 2014-07-17 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド アルファ1−アンチトリプシン活性の測定のための固相結合エラスターゼ結合アッセイ

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