JPH07253429A - アルツハイマー病の診断検査方法 - Google Patents
アルツハイマー病の診断検査方法Info
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- JPH07253429A JPH07253429A JP6276715A JP27671594A JPH07253429A JP H07253429 A JPH07253429 A JP H07253429A JP 6276715 A JP6276715 A JP 6276715A JP 27671594 A JP27671594 A JP 27671594A JP H07253429 A JPH07253429 A JP H07253429A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- G01N2800/28—Neurological disorders
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 イムノアツセイを利用したアルツハイマー病
の診断検査方法の提供。 【構成】 アルツハイマー病に罹患している可能性のあ
る患者からの生物学的試料に存在するｐ３３の量を非罹
患者からの対照試料中のｐ３３の量と比較測定すること
によって、ヒト患者におけるアルツハイマー病を診断す
る。
の診断検査方法の提供。 【構成】 アルツハイマー病に罹患している可能性のあ
る患者からの生物学的試料に存在するｐ３３の量を非罹
患者からの対照試料中のｐ３３の量と比較測定すること
によって、ヒト患者におけるアルツハイマー病を診断す
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はアルツハイマー病の診断
に関わる。
に関わる。
【０００２】
【従来の技術】アルツハイマー病（ＡＤ）は一般に４５
才あるいはそれ以上の人々によく現れる認識機能の破壊
的な障害である。この疾病による犠牲者数にも拘らず、
病気の本質の理解は未だ不十分である。ＡＤにおける痴
呆症の度合はＡＤ患者の大脳皮質に見出される老人班
（ＳＰ）の数に関連づけられて来た (Roth et al., Nat
ure 209:109, 1966)。
才あるいはそれ以上の人々によく現れる認識機能の破壊
的な障害である。この疾病による犠牲者数にも拘らず、
病気の本質の理解は未だ不十分である。ＡＤにおける痴
呆症の度合はＡＤ患者の大脳皮質に見出される老人班
（ＳＰ）の数に関連づけられて来た (Roth et al., Nat
ure 209:109, 1966)。
【０００３】組織学的には、老人班（ＳＰ）は退化性神
経突起及び活性の星状膠細胞に囲まれ (Wisniewski and
Terry, Progress in Neruropathology 2:23, 1973) 、
また生化学的には、老人班はβアミロイドと呼ばれる小
分子の不溶性繊維状タンパク質を含んでいる (Glenner
and Wong, Biochem. Biophys, Res. Commun. 120:885-8
90) 。正常胎児組織 (Kang et al., Nature 325:733-73
6, 1987)及びＡＤ患者の脳組織 (Zain et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 85:929-933, 1988) からのβアミ
ロイドの遺伝子の分子クローニングによって、この物質
は、より高分子の前駆体タンパク質であるアミロイド前
駆体タンパク質（ＡＰＰ）から誘導されることが判明し
ている。老人班に加えて、アルツハイマー病は、神経単
位の核周部及び遠位樹状突起に多数の神経繊維濃縮体が
存在し、又、海馬の錘体細胞に顆粒胞崩壊があるのが特
徴である。
経突起及び活性の星状膠細胞に囲まれ (Wisniewski and
Terry, Progress in Neruropathology 2:23, 1973) 、
また生化学的には、老人班はβアミロイドと呼ばれる小
分子の不溶性繊維状タンパク質を含んでいる (Glenner
and Wong, Biochem. Biophys, Res. Commun. 120:885-8
90) 。正常胎児組織 (Kang et al., Nature 325:733-73
6, 1987)及びＡＤ患者の脳組織 (Zain et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 85:929-933, 1988) からのβアミ
ロイドの遺伝子の分子クローニングによって、この物質
は、より高分子の前駆体タンパク質であるアミロイド前
駆体タンパク質（ＡＰＰ）から誘導されることが判明し
ている。老人班に加えて、アルツハイマー病は、神経単
位の核周部及び遠位樹状突起に多数の神経繊維濃縮体が
存在し、又、海馬の錘体細胞に顆粒胞崩壊があるのが特
徴である。
【０００４】ＡＤの原因は不明であり、ＡＤの治療法も
存在しない。更に、発症前或いは発症している患者にお
けるＡＤの診断検査法も皆無である。ＡＤの診断に用い
られている現行の方法には、死後患者から採取された脳
脊髄液（ＣＳＦ）或いは脳組織の分析が含まれる。
存在しない。更に、発症前或いは発症している患者にお
けるＡＤの診断検査法も皆無である。ＡＤの診断に用い
られている現行の方法には、死後患者から採取された脳
脊髄液（ＣＳＦ）或いは脳組織の分析が含まれる。
【０００５】アネキシン類（或いはリポコルチン類）
は、カルシウムに依存して陰荷電リン脂質に結合する一
群のタンパク質である。これらの物質は高等或いは下等
の真核生物の種々の細胞型に見出だされる。アネキシン
系のカルシウム結合タンパク質は、可溶性タンパク質及
び膜性タンパク質両方の特徴を示す。１３種の既知のア
ネキシン系メンバーの一次配列は、大部分、４種の高度
に保存された繰返し配列から成っている。このタンパク
質の大きさとは対照的に、アネキシンのＮ末端の長さと
配列は大いに異なっている (Crompton et al., Cell 5
5:1-3, 1988; Barton et al., Eur. J. Biochedm. 198:
749-760, 1991) 。
は、カルシウムに依存して陰荷電リン脂質に結合する一
群のタンパク質である。これらの物質は高等或いは下等
の真核生物の種々の細胞型に見出だされる。アネキシン
系のカルシウム結合タンパク質は、可溶性タンパク質及
び膜性タンパク質両方の特徴を示す。１３種の既知のア
ネキシン系メンバーの一次配列は、大部分、４種の高度
に保存された繰返し配列から成っている。このタンパク
質の大きさとは対照的に、アネキシンのＮ末端の長さと
配列は大いに異なっている (Crompton et al., Cell 5
5:1-3, 1988; Barton et al., Eur. J. Biochedm. 198:
749-760, 1991) 。
【０００６】アネキシンの生体内での役割は知られてい
ない。提唱されている機能の１つは、膜相互の融合とエ
キソサイトーシスへの関与である (Creutz, Science 25
8:924-931, 1992)。さらに、アネキシンの役割として、
細胞骨格タンパク質 (Mangeat, Biol. Cell. 64:261-28
1)との相互作用、抗凝固活性 (Tait et al., Biochemis
try 27:6268-6276) 、炎症制御におけるホスホリパーゼ
Ａ2 の阻害 (Davidson, et al., J. Biol. Chem. 265:5
602-5609, 1990) 、及びアネキシンＶとＶＩＩによるリ
ン脂質二重膜におけるカルシウム選択性イオンチャネル
の形成への関与が提唱されている (Pollard et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2974-2978, 1988; Rojas
et al., J. Biol. Chem. 265:21207-21215, 1990; Kar
shikov et al., Eur. Biophys. J. 20:337-344, 1992)
。アネキシン系列のメンバーのあるものは、生長に依
存して発現され (Schlaepfer and Haigler, J. Cell. B
iol.111:229-238, 1990) 、生体内における細胞のキナ
ーゼに対する標的である [Moss et al., Novel Calcium
Binding Proteins (Claus W. Heizmann, Ed.) Springe
r, Berlin, 1991; Erikson and Eriskon, Cell 21:829:
836, 1980]。
ない。提唱されている機能の１つは、膜相互の融合とエ
キソサイトーシスへの関与である (Creutz, Science 25
8:924-931, 1992)。さらに、アネキシンの役割として、
細胞骨格タンパク質 (Mangeat, Biol. Cell. 64:261-28
1)との相互作用、抗凝固活性 (Tait et al., Biochemis
try 27:6268-6276) 、炎症制御におけるホスホリパーゼ
Ａ2 の阻害 (Davidson, et al., J. Biol. Chem. 265:5
602-5609, 1990) 、及びアネキシンＶとＶＩＩによるリ
ン脂質二重膜におけるカルシウム選択性イオンチャネル
の形成への関与が提唱されている (Pollard et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2974-2978, 1988; Rojas
et al., J. Biol. Chem. 265:21207-21215, 1990; Kar
shikov et al., Eur. Biophys. J. 20:337-344, 1992)
。アネキシン系列のメンバーのあるものは、生長に依
存して発現され (Schlaepfer and Haigler, J. Cell. B
iol.111:229-238, 1990) 、生体内における細胞のキナ
ーゼに対する標的である [Moss et al., Novel Calcium
Binding Proteins (Claus W. Heizmann, Ed.) Springe
r, Berlin, 1991; Erikson and Eriskon, Cell 21:829:
836, 1980]。
【０００７】
【発明の開示】我々は、３３ｋＤの一種のタンパク質
（ｐ３３）が、正常対照と比べてアルツハイマー患者の
ＣＳＦ及び脳のホモジェネートに特に豊富であることを
示した。従って、この３３ｋＤタンパク質の検出と定量
はアルツハイマー病の診断に有用である。
（ｐ３３）が、正常対照と比べてアルツハイマー患者の
ＣＳＦ及び脳のホモジェネートに特に豊富であることを
示した。従って、この３３ｋＤタンパク質の検出と定量
はアルツハイマー病の診断に有用である。
【０００８】それ故、第一の局面で、本発明はヒト患者
のアルツハイマー病の診断方法を提供する。この方法で
は、患者由来の生物学的試料中に存在するｐ３３の量
を、発症していないヒトからの同じタイプ（例、腰椎
性、或いは脳室性のＣＳＦ、脳ホモジェネート、又は皮
質の薄片）の対照試料に存在するｐ３３の量と比較決定
する。患者からの試料中のｐ３３の相対的レベルが、対
照試料中のレベルより５０％、更に望ましいのは１５０
％、最も望ましいのは３００％と高い場合、アルツハイ
マー病の診断を示唆する。
のアルツハイマー病の診断方法を提供する。この方法で
は、患者由来の生物学的試料中に存在するｐ３３の量
を、発症していないヒトからの同じタイプ（例、腰椎
性、或いは脳室性のＣＳＦ、脳ホモジェネート、又は皮
質の薄片）の対照試料に存在するｐ３３の量と比較決定
する。患者からの試料中のｐ３３の相対的レベルが、対
照試料中のレベルより５０％、更に望ましいのは１５０
％、最も望ましいのは３００％と高い場合、アルツハイ
マー病の診断を示唆する。
【０００９】ｐ３３レベルの測定は、ｐ３３と抗体間の
結合の検出を可能にするイムノアッセイを用いて達成さ
れる。結合量は、ｐ３３に結合する抗体、或いはｐ３３
に結合する抗体を認識する抗体に付けた酵素的、発色力
学的、放射活性、或いは発光性標識の解析によって決定
することが出来る。使用可能のイムノアッセイには、こ
れに限定されないが、エリザ（ＥＬＩＳＡ）、阻害エリ
ザ、ウエスタンブロット、免疫沈降、スロット或いはド
ットブロットアッセイ、免疫染色、ラジオイムノアッセ
イ（ＲＩＡ）、フルオレッセイン或いはローダミンの様
な蛍光基質の抗体複合体又は抗原複合体を用いる蛍光イ
ムノアッセイ、オクタロニー二重拡散分析、及びアビジ
ン−ビオチン或いはストレプトアビジン−ビオチン検出
系を用いるイムノアッセイが含まれる。
結合の検出を可能にするイムノアッセイを用いて達成さ
れる。結合量は、ｐ３３に結合する抗体、或いはｐ３３
に結合する抗体を認識する抗体に付けた酵素的、発色力
学的、放射活性、或いは発光性標識の解析によって決定
することが出来る。使用可能のイムノアッセイには、こ
れに限定されないが、エリザ（ＥＬＩＳＡ）、阻害エリ
ザ、ウエスタンブロット、免疫沈降、スロット或いはド
ットブロットアッセイ、免疫染色、ラジオイムノアッセ
イ（ＲＩＡ）、フルオレッセイン或いはローダミンの様
な蛍光基質の抗体複合体又は抗原複合体を用いる蛍光イ
ムノアッセイ、オクタロニー二重拡散分析、及びアビジ
ン−ビオチン或いはストレプトアビジン−ビオチン検出
系を用いるイムノアッセイが含まれる。
【００１０】これらの方法は、アルツハイマー病診断の
目的に対し、患者から得られた腰椎性ＣＳＦ、脳室性Ｃ
ＦＳ、脳組織ホモジェネート、或いは脳薄切片を含む、
これに限定されないが、生物学的試料に存在するｐ３３
の検出を可能にする。腰椎性ＣＦＳの分析は、生きてい
る患者から得られた試料を用いて施行可能であるので特
に有用である。これまでは、生きている患者でＡＤを検
出する診断法はなかった。
目的に対し、患者から得られた腰椎性ＣＳＦ、脳室性Ｃ
ＦＳ、脳組織ホモジェネート、或いは脳薄切片を含む、
これに限定されないが、生物学的試料に存在するｐ３３
の検出を可能にする。腰椎性ＣＦＳの分析は、生きてい
る患者から得られた試料を用いて施行可能であるので特
に有用である。これまでは、生きている患者でＡＤを検
出する診断法はなかった。
【００１１】本発明の方法に有用な抗体には、ｐ３３と
の結合に実質的に特異的な抗体、アネキシンＶ、或いは
ＡＰＰのＣ２断片が含まれ、特に、抗体４４３１或いは
ＴＣ２が、本発明の方法及び標品に用いられてよい。本
発明の抗体のあるものは、ｐ３３以外のタンパク質も認
識する可能性のあることは理解されよう。この様な抗体
の場合、タンパク質の大きさ及び分子量の区別を可能に
する様なイムノアッセイが最も有用である。
の結合に実質的に特異的な抗体、アネキシンＶ、或いは
ＡＰＰのＣ２断片が含まれ、特に、抗体４４３１或いは
ＴＣ２が、本発明の方法及び標品に用いられてよい。本
発明の抗体のあるものは、ｐ３３以外のタンパク質も認
識する可能性のあることは理解されよう。この様な抗体
の場合、タンパク質の大きさ及び分子量の区別を可能に
する様なイムノアッセイが最も有用である。
【００１２】本発明には、又、実質的に精製されたｐ３
３の標品とその断片、及び実質的に純粋なＣ２ペプチド
（ＡＰＰのアミノ酸６４４番から６７６番迄）が含まれ
る。これらのタンパク質（ｐ３３とその断片、及びＣ２
ペプチド）には多くの有用性がある。例えば、それら
は、ＡＤに対して有用な治療薬である化合物のスクリー
ニング法に使用出来る。更に、これらの物質は、本発明
の診断法及び診断キットにおける対照標準物質として用
いることが出来る。
３の標品とその断片、及び実質的に純粋なＣ２ペプチド
（ＡＰＰのアミノ酸６４４番から６７６番迄）が含まれ
る。これらのタンパク質（ｐ３３とその断片、及びＣ２
ペプチド）には多くの有用性がある。例えば、それら
は、ＡＤに対して有用な治療薬である化合物のスクリー
ニング法に使用出来る。更に、これらの物質は、本発明
の診断法及び診断キットにおける対照標準物質として用
いることが出来る。
【００１３】第二の局面では、本発明はｐ３３を特異的
に認識する抗体の生成法を提供する。この方法は、実質
的に純粋なｐ３３、アネキシンＶ、またはその抗原性の
ある断片、或いはＡＰＰのＣ２断片（もし必要ならば、
担体に結合したもの）で哺乳動物を免疫することを含
む。次いで、多クローン性抗血清が被免疫動物から分
離、精製され得る。又は、被免疫動物から抗体生産器官
を採取して、当該器官から調製された細胞ホモジェネー
トを培養癌細胞に融合することが出来る。ｐ３３に特異
的な単クローン抗体を生成するハイブリッド細胞を選別
することが出来る。
に認識する抗体の生成法を提供する。この方法は、実質
的に純粋なｐ３３、アネキシンＶ、またはその抗原性の
ある断片、或いはＡＰＰのＣ２断片（もし必要ならば、
担体に結合したもの）で哺乳動物を免疫することを含
む。次いで、多クローン性抗血清が被免疫動物から分
離、精製され得る。又は、被免疫動物から抗体生産器官
を採取して、当該器官から調製された細胞ホモジェネー
トを培養癌細胞に融合することが出来る。ｐ３３に特異
的な単クローン抗体を生成するハイブリッド細胞を選別
することが出来る。
【００１４】本発明の第三の局面は、患者からの生物学
的試料中のｐ３３検出によるアルツハイマー病のインビ
トロの診断キットを提供することである。ｐ３３検出キ
ットは、（１）ｐ３３に結合可能な一次抗体、及び
（２）シグナル発生標識に結合した二次抗体、この二次
抗体はｐ３３に結合可能であるが、一次単クローン性抗
体の結合サイトとは異なった（即ち、間隔を置いた）サ
イトに結合出来るもの、を含む。この様な抗体は、この
当業界に周知の方法によって調製することが出来る。こ
のキットは、二抗体サンドイッチイムノアッセイ、例え
ば、二抗体サンドイッチエリザ（ＥＬＩＳＡ）の施行に
最適である。
的試料中のｐ３３検出によるアルツハイマー病のインビ
トロの診断キットを提供することである。ｐ３３検出キ
ットは、（１）ｐ３３に結合可能な一次抗体、及び
（２）シグナル発生標識に結合した二次抗体、この二次
抗体はｐ３３に結合可能であるが、一次単クローン性抗
体の結合サイトとは異なった（即ち、間隔を置いた）サ
イトに結合出来るもの、を含む。この様な抗体は、この
当業界に周知の方法によって調製することが出来る。こ
のキットは、二抗体サンドイッチイムノアッセイ、例え
ば、二抗体サンドイッチエリザ（ＥＬＩＳＡ）の施行に
最適である。
【００１５】ｐ３３の検出に有用な他のキットで、本発
明の一部となるものは、（１）ｐ３３に結合能のある一
次抗体、及び（２）シグナル発生標識に結合した二次抗
体で、当該抗体が前記一次抗体に結合することが出来る
もの、が含まれる。前記のアッセイキットのいずれにお
いても、二次抗体に結合したシグナル発生標識には、こ
れに限定されるわけではないが、酵素（例えば、セイヨ
ウワサビのペルオキシダーゼ、或いはアルカリホスファ
ターゼ）が含まれる。好適には、酵素とその基質の両方
がキットに提供される。コーティングされていない担体
も又キットに含まれ、その上に、一次抗体（前記の１番
目のキットにおいて）、或いは検査されるべき試料（前
記の２番目のキットにおいて）が使用者によって固定さ
れ得る。キットには、又、精製タンパク質、例えば、標
準として用いられるｐ３３も含まれることがある。
明の一部となるものは、（１）ｐ３３に結合能のある一
次抗体、及び（２）シグナル発生標識に結合した二次抗
体で、当該抗体が前記一次抗体に結合することが出来る
もの、が含まれる。前記のアッセイキットのいずれにお
いても、二次抗体に結合したシグナル発生標識には、こ
れに限定されるわけではないが、酵素（例えば、セイヨ
ウワサビのペルオキシダーゼ、或いはアルカリホスファ
ターゼ）が含まれる。好適には、酵素とその基質の両方
がキットに提供される。コーティングされていない担体
も又キットに含まれ、その上に、一次抗体（前記の１番
目のキットにおいて）、或いは検査されるべき試料（前
記の２番目のキットにおいて）が使用者によって固定さ
れ得る。キットには、又、精製タンパク質、例えば、標
準として用いられるｐ３３も含まれることがある。
【００１６】本発明の第四の局面は、患者に、最も好適
には脳組織内におけるｐ３３レベルを減少する化合物を
導入することによって脳組織におけるｐ３３レベルを低
下させる法を特徴とする。この方法を用いて同定された
この様な化合物は、アルツハイマー病を発症する前の、
或いは発症している患者の治療に用いることが出来る。
には脳組織内におけるｐ３３レベルを減少する化合物を
導入することによって脳組織におけるｐ３３レベルを低
下させる法を特徴とする。この方法を用いて同定された
この様な化合物は、アルツハイマー病を発症する前の、
或いは発症している患者の治療に用いることが出来る。
【００１７】本発明の第五の局面は、候補化合物のｐ３
３レベル減少能力を測定する方法を特徴とする。この方
法においては、ｐ３３を発現する細胞をある化合物と接
触させ、細胞のｐ３３レベルを測定する。このｐ３３レ
ベルの測定には、前記のイムノアッセイのいずれを用い
てもよい。当該細胞は、Ａ４−Ｃでトランスフェクトさ
れたＰＣ１２、或いは、代わりに、患者の皮膚生検から
採取した繊維芽細胞、或いはｐ３３を発現するいかなる
他の細胞型でもよい。
３レベル減少能力を測定する方法を特徴とする。この方
法においては、ｐ３３を発現する細胞をある化合物と接
触させ、細胞のｐ３３レベルを測定する。このｐ３３レ
ベルの測定には、前記のイムノアッセイのいずれを用い
てもよい。当該細胞は、Ａ４−Ｃでトランスフェクトさ
れたＰＣ１２、或いは、代わりに、患者の皮膚生検から
採取した繊維芽細胞、或いはｐ３３を発現するいかなる
他の細胞型でもよい。
【００１８】本発明は、候補化合物のｐ３３レベル減少
能力を測定するもう１つの方法を特色とする。この方法
において、候補化合物はｐ３３を発現する哺乳動物に投
与される。この哺乳動物はＡ４−Ｃ形質転換遺伝子を発
現するマウスであり得る(Sandhu et al., Journal of B
iological Chemistry 266:21331, 1991)。ｐ３３のレベ
ルは、前記のイムノアッセイ法を用い、マウスからの組
織試料、例えば、脳のホモジェネート、或いは脳皮質の
薄片の分析により決定することが出来る。
能力を測定するもう１つの方法を特色とする。この方法
において、候補化合物はｐ３３を発現する哺乳動物に投
与される。この哺乳動物はＡ４−Ｃ形質転換遺伝子を発
現するマウスであり得る(Sandhu et al., Journal of B
iological Chemistry 266:21331, 1991)。ｐ３３のレベ
ルは、前記のイムノアッセイ法を用い、マウスからの組
織試料、例えば、脳のホモジェネート、或いは脳皮質の
薄片の分析により決定することが出来る。
【００１９】ここに用いられている様に、“実質的に純
粋”という術語は、ある化合物、例えば、タンパク質或
いはポリペプチド、例えば、ｐ３３タンパク質或いはそ
の断片、或いはＡＰＰのＣ２ペプチドが、天然ではそれ
に付随している諸成分から分離されていることを表現す
るものである。一般的に、試料中の全物質の少なくとも
１０％、さらに好適には少なくとも２０％、さらに好適
には少なくとも５０％、さらに好適には少なくとも６０
％、さらに好適には少なくとも７５％、さらに好適には
少なくとも９０％、及び最も好適には少なくとも９９％
が（容量、湿重量或いは乾重量、或いはモルパーセント
或いはモル分率上）初期の化合物である場合に、ある化
合物は実質的に純粋である。純度は、何らかの適切な方
法、例えば、ポリペプチドの場合は、カラムクロマトグ
ラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、或いはＨ
ＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）分析によって
測定することが出来る。ある化合物も又、例えば、ある
タンパク質は、それが天然では付随している成分を本質
的に含まない場合、或いは、自然の状態ではそれに付随
している天然の汚染物質から分離されている場合、本質
的に純粋にされている。
粋”という術語は、ある化合物、例えば、タンパク質或
いはポリペプチド、例えば、ｐ３３タンパク質或いはそ
の断片、或いはＡＰＰのＣ２ペプチドが、天然ではそれ
に付随している諸成分から分離されていることを表現す
るものである。一般的に、試料中の全物質の少なくとも
１０％、さらに好適には少なくとも２０％、さらに好適
には少なくとも５０％、さらに好適には少なくとも６０
％、さらに好適には少なくとも７５％、さらに好適には
少なくとも９０％、及び最も好適には少なくとも９９％
が（容量、湿重量或いは乾重量、或いはモルパーセント
或いはモル分率上）初期の化合物である場合に、ある化
合物は実質的に純粋である。純度は、何らかの適切な方
法、例えば、ポリペプチドの場合は、カラムクロマトグ
ラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、或いはＨ
ＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）分析によって
測定することが出来る。ある化合物も又、例えば、ある
タンパク質は、それが天然では付随している成分を本質
的に含まない場合、或いは、自然の状態ではそれに付随
している天然の汚染物質から分離されている場合、本質
的に純粋にされている。
【００２０】本発明の抗体に関して、“特異的に結合”
という術語は、抗体と抗原の相互作用を指すものである
（例えば、ＴＣ２、或いは４４３１のｐ３３、アネキシ
ンＶ、又はＡＰＰのＣ２断片との相互作用）。ある抗体
がある抗原に対して、最大でも１０-7モル／リットル、
或いは、好適には１０-8モル／リットルの親和常数（Ｋ
ｄ）を持つ場合、その抗体は当該抗原に特異的に結合す
る（代わりに、“接触する”或いは“結合する”と呼ば
れる）能力があると言われる。これに反して、ある抗体
が、ある抗原に対し、少なくとも１０-2モル／リット
ル、或いはそれ以上のＫｄ値を持つ場合、その抗体は当
該抗原に結合する能力がないと言われる。ここで定義さ
れる抗体は、単クローン性、或いは多クローン性であり
得る。
という術語は、抗体と抗原の相互作用を指すものである
（例えば、ＴＣ２、或いは４４３１のｐ３３、アネキシ
ンＶ、又はＡＰＰのＣ２断片との相互作用）。ある抗体
がある抗原に対して、最大でも１０-7モル／リットル、
或いは、好適には１０-8モル／リットルの親和常数（Ｋ
ｄ）を持つ場合、その抗体は当該抗原に特異的に結合す
る（代わりに、“接触する”或いは“結合する”と呼ば
れる）能力があると言われる。これに反して、ある抗体
が、ある抗原に対し、少なくとも１０-2モル／リット
ル、或いはそれ以上のＫｄ値を持つ場合、その抗体は当
該抗原に結合する能力がないと言われる。ここで定義さ
れる抗体は、単クローン性、或いは多クローン性であり
得る。
【００２１】本発明の有利な特色は、当該発明が、症候
を呈する、或いは症候を呈しない患者におけるＡＤに対
する診断検査法を提供することにある。本発明の診断検
査法から最も便宜を受けると思われる患者は、人格の変
化、言葉の見出しに伴う困難、記憶喪失、特に最近の記
憶の喪失、物体の置忘れ、人名忘却、及び言語流暢性の
進行的喪失の様なアルツハイマー病の初期症候を呈する
患者である。この診断法は、病状の進行抑制、及び、恐
らくは、罹患者に対する治療薬の投与を可能にする。更
に、本診断法は、医者がＡＤと類似の症候で特徴づけら
れる他の疾病とを区別することが出来るようにする。腰
椎性ＣＳＦの分析は、生きている患者に対する適切な診
断法で危険度の低いアッセイである。ＣＳＦは、外来患
者の基準で採取可能であり、結果は凡そ数時間、或いは
数日間内に得ることが出来る。さらに、本発明は、ＡＤ
の死後診断に対する容易で信頼性のある方法を提供す
る。
を呈する、或いは症候を呈しない患者におけるＡＤに対
する診断検査法を提供することにある。本発明の診断検
査法から最も便宜を受けると思われる患者は、人格の変
化、言葉の見出しに伴う困難、記憶喪失、特に最近の記
憶の喪失、物体の置忘れ、人名忘却、及び言語流暢性の
進行的喪失の様なアルツハイマー病の初期症候を呈する
患者である。この診断法は、病状の進行抑制、及び、恐
らくは、罹患者に対する治療薬の投与を可能にする。更
に、本診断法は、医者がＡＤと類似の症候で特徴づけら
れる他の疾病とを区別することが出来るようにする。腰
椎性ＣＳＦの分析は、生きている患者に対する適切な診
断法で危険度の低いアッセイである。ＣＳＦは、外来患
者の基準で採取可能であり、結果は凡そ数時間、或いは
数日間内に得ることが出来る。さらに、本発明は、ＡＤ
の死後診断に対する容易で信頼性のある方法を提供す
る。
【００２２】本発明の他の特色と有利な点は、特許請求
の範囲、以下の詳細な記載、図面、から明らかになるで
あろう。
の範囲、以下の詳細な記載、図面、から明らかになるで
あろう。
【００２３】
Ｉ．ｐ３３の特性決定 ＳＶ４０プロモータの支配下にＡ４−Ｃ断片（ＡＰＰの
Ｃ末端の１００残基、図１参照）を過剰発現しているＰ
Ｃ１２細胞が構成された。Ａ４−Ｃ断片は、この断片に
よって惹起される神経毒性が細胞培養系において観察さ
れたので、ＡＤへの関与が以前に示唆されていた (Yank
er et al., Science 245:417, 1989) 。これらの細胞系
を用い、我々は、Ａ４−Ｃの発現の結果、新規の３３ｋ
Ｄタンパク質が生成されることを見出して、ｐ３３と命
名した。このタンパク質は、特異的にＡＤ患者に過剰発
現される（下記参照）。
Ｃ末端の１００残基、図１参照）を過剰発現しているＰ
Ｃ１２細胞が構成された。Ａ４−Ｃ断片は、この断片に
よって惹起される神経毒性が細胞培養系において観察さ
れたので、ＡＤへの関与が以前に示唆されていた (Yank
er et al., Science 245:417, 1989) 。これらの細胞系
を用い、我々は、Ａ４−Ｃの発現の結果、新規の３３ｋ
Ｄタンパク質が生成されることを見出して、ｐ３３と命
名した。このタンパク質は、特異的にＡＤ患者に過剰発
現される（下記参照）。
【００２４】Ｆ１００、及びＧ１００と命名された、２
つの独立したＧ−４１８耐性クローンの細胞系が分離さ
れた。これらの細胞系は、ＡＰＰのアミロイド領域を認
識する抗体（抗体Ａ２８及びＡ１７、図１参照）によっ
て、標準対照のＰ１２細胞と比較してより強い免疫染色
性を示した（細胞は、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中
に、４％のスクロース、０．２５％のグルタールアルデ
ヒドを含む４％のパラホルムアルデヒドで固定され、Ｐ
ＢＳで２回、１分間洗浄された。固定された細胞は、Ｐ
ＢＳ中、０．２５％のトリトンＸ−１００で５分間、膜
透過処理された。２０％の正常ヤギ血清で１５分間ブロ
ックした後、細胞を、ＰＢＳ中、２％の正常ヤギ血清に
存在する一次抗体と、４℃で一晩インキュベートした。
セイヨウワサビのペルオキシダーゼを結合した二次抗体
が用いられ、ＤＡＢが色素源として使用された）。
つの独立したＧ−４１８耐性クローンの細胞系が分離さ
れた。これらの細胞系は、ＡＰＰのアミロイド領域を認
識する抗体（抗体Ａ２８及びＡ１７、図１参照）によっ
て、標準対照のＰ１２細胞と比較してより強い免疫染色
性を示した（細胞は、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中
に、４％のスクロース、０．２５％のグルタールアルデ
ヒドを含む４％のパラホルムアルデヒドで固定され、Ｐ
ＢＳで２回、１分間洗浄された。固定された細胞は、Ｐ
ＢＳ中、０．２５％のトリトンＸ−１００で５分間、膜
透過処理された。２０％の正常ヤギ血清で１５分間ブロ
ックした後、細胞を、ＰＢＳ中、２％の正常ヤギ血清に
存在する一次抗体と、４℃で一晩インキュベートした。
セイヨウワサビのペルオキシダーゼを結合した二次抗体
が用いられ、ＤＡＢが色素源として使用された）。
【００２５】Ａ４−Ｃ断片は、ニューロン細胞に毒性で
あることが報告されている (Yankeret al., Science 24
5:417, 1989; Kozlowski et al., Journal of Neurosci
ence 12:1679, 1992)。そこで、神経成長因子（ＮＧ
Ｆ）の存在下、及び非存在下で培養されたＰＣ１２細胞
におけるＡ４−Ｃ発現の影響が検討された（図２参
照）。Ａ４−ＣでトランスフェクトされたＰＣ１２細胞
は、標準対照細胞よりも大きく、凝集する傾向があった
（図２、パネルＡとＢを比較）。標準対照細胞は、ＮＧ
Ｆの存在下に培養された場合、予期された様に、分化し
て神経軸索を伸長することが観察された（図２、パネル
Ｄ参照）。これに対し、Ａ４−Ｃでトランスフェクトさ
れた細胞の大部分は、ＮＧＦに応答せず、着実に生長を
継続した（図２、パネルＢ参照）。ＮＧＦ処理、及び未
処理の、Ａ４−Ｃでトランスフェクトされた細胞間で、
細胞数の明らかな差異は認められなかった（図２、パネ
ルＡとＢを比較）。従って、我々の観察は、ＰＣ１２細
胞においてＡ４−Ｃの発現はＮＧＦ誘導によるニューロ
ン分化を阻止することを示唆した。
あることが報告されている (Yankeret al., Science 24
5:417, 1989; Kozlowski et al., Journal of Neurosci
ence 12:1679, 1992)。そこで、神経成長因子（ＮＧ
Ｆ）の存在下、及び非存在下で培養されたＰＣ１２細胞
におけるＡ４−Ｃ発現の影響が検討された（図２参
照）。Ａ４−ＣでトランスフェクトされたＰＣ１２細胞
は、標準対照細胞よりも大きく、凝集する傾向があった
（図２、パネルＡとＢを比較）。標準対照細胞は、ＮＧ
Ｆの存在下に培養された場合、予期された様に、分化し
て神経軸索を伸長することが観察された（図２、パネル
Ｄ参照）。これに対し、Ａ４−Ｃでトランスフェクトさ
れた細胞の大部分は、ＮＧＦに応答せず、着実に生長を
継続した（図２、パネルＢ参照）。ＮＧＦ処理、及び未
処理の、Ａ４−Ｃでトランスフェクトされた細胞間で、
細胞数の明らかな差異は認められなかった（図２、パネ
ルＡとＢを比較）。従って、我々の観察は、ＰＣ１２細
胞においてＡ４−Ｃの発現はＮＧＦ誘導によるニューロ
ン分化を阻止することを示唆した。
【００２６】ＰＣ１２細胞におけるＡ４−Ｃ発現の特徴
をさらに検討するために、Ｆ１００及びＧ１００細胞
系、並びに標準対照であるＰＣ１２細胞から調製された
溶解液のウエスタンブロット解析が遂行された。Ａ４−
Ｃによってコードされるタンパク質の推定分子量は１６
ｋＤである。従って、ある抗アミロイド抗体 (Boehring
er Mannheim)がＡ４−ＣでトランスフェクトされたＰＣ
１２細胞の溶解液に存在する１つの１６ｋＤタンパク質
を認識したが、対照の細胞溶解液では認識しなかったこ
とは驚くに当たらない（図３、パネルＡ参照）。反対
に、ＡＰＰのＣ２領域を含む合成ペプチド（図１、アミ
ノ酸６４４番から６７６番、下記の例Ｉ参照）に対して
生成されたＴＣ２抗体は、Ａ４−Ｃ細胞溶解液中の３３
ｋＤタンパク質を認識するが、対照の細胞溶解液では認
識しなかった（図３、パネルＢ参照）。更に、Ａ４−Ｃ
は、Ａ４−Ｃに対する遺伝子を導入されたマウスからの
脳のホモジェネート中の３３ｋＤタンパク質を認識した
が、対照のホモジェネートでは認識しなかった（図４参
照）。ＴＣ２抗体が親和性利用で精製され、抗体がＣ２
ペプチドで予め吸着されると、３３ｋＤタンパク質の染
色は減少するので（図４参照）、Ａ４−Ｃ遺伝子でトラ
ンスフェクトされた細胞由来の溶解液、及びＡ４−Ｃ遺
伝子を導入されたマウス由来の脳のホモジェネートに存
在する３３ｋＤタンパク質の染色はＣ２に特異的であっ
た。抗アミロイド抗体を用いて、臭化シアンで切断した
３３ｋＤタンパク質のウエスタン解析を行ったところ、
３３ｋＤタンパク質は、Ｃ２抗原決定基以外のアミロイ
ド領域を含むことが判明した（図５参照、臭化シアンに
よる切断は、次の様にして行われた。電気泳動後、３３
ｋＤバンドはゲルから切出され、ゲル切片は凍結乾燥さ
れた。乾燥したゲルを、７０％（ｖ／ｖ）ギ酸中でＣＮ
Ｂｒと３７℃で１６時間、タンパク質／ＣＮＢｒの分子
比、１：２０−１００でインキュベートした。反応後、
ゲルを再び凍結乾燥して０．１ＭのＮＨ2 ＨＣＯ3 と５
時間、３７℃でインキュベートした。凍結乾燥後、乾燥
ゲルをラムリ (Laemmli)の試料緩衝液とインキュベート
してウエスタンブロット解析にかけた）。
をさらに検討するために、Ｆ１００及びＧ１００細胞
系、並びに標準対照であるＰＣ１２細胞から調製された
溶解液のウエスタンブロット解析が遂行された。Ａ４−
Ｃによってコードされるタンパク質の推定分子量は１６
ｋＤである。従って、ある抗アミロイド抗体 (Boehring
er Mannheim)がＡ４−ＣでトランスフェクトされたＰＣ
１２細胞の溶解液に存在する１つの１６ｋＤタンパク質
を認識したが、対照の細胞溶解液では認識しなかったこ
とは驚くに当たらない（図３、パネルＡ参照）。反対
に、ＡＰＰのＣ２領域を含む合成ペプチド（図１、アミ
ノ酸６４４番から６７６番、下記の例Ｉ参照）に対して
生成されたＴＣ２抗体は、Ａ４−Ｃ細胞溶解液中の３３
ｋＤタンパク質を認識するが、対照の細胞溶解液では認
識しなかった（図３、パネルＢ参照）。更に、Ａ４−Ｃ
は、Ａ４−Ｃに対する遺伝子を導入されたマウスからの
脳のホモジェネート中の３３ｋＤタンパク質を認識した
が、対照のホモジェネートでは認識しなかった（図４参
照）。ＴＣ２抗体が親和性利用で精製され、抗体がＣ２
ペプチドで予め吸着されると、３３ｋＤタンパク質の染
色は減少するので（図４参照）、Ａ４−Ｃ遺伝子でトラ
ンスフェクトされた細胞由来の溶解液、及びＡ４−Ｃ遺
伝子を導入されたマウス由来の脳のホモジェネートに存
在する３３ｋＤタンパク質の染色はＣ２に特異的であっ
た。抗アミロイド抗体を用いて、臭化シアンで切断した
３３ｋＤタンパク質のウエスタン解析を行ったところ、
３３ｋＤタンパク質は、Ｃ２抗原決定基以外のアミロイ
ド領域を含むことが判明した（図５参照、臭化シアンに
よる切断は、次の様にして行われた。電気泳動後、３３
ｋＤバンドはゲルから切出され、ゲル切片は凍結乾燥さ
れた。乾燥したゲルを、７０％（ｖ／ｖ）ギ酸中でＣＮ
Ｂｒと３７℃で１６時間、タンパク質／ＣＮＢｒの分子
比、１：２０−１００でインキュベートした。反応後、
ゲルを再び凍結乾燥して０．１ＭのＮＨ2 ＨＣＯ3 と５
時間、３７℃でインキュベートした。凍結乾燥後、乾燥
ゲルをラムリ (Laemmli)の試料緩衝液とインキュベート
してウエスタンブロット解析にかけた）。
【００２７】ＴＣ２が、Ａ４−Ｃに対して、推定１６ｋ
Ｄサイズのタンパク質よりも、３３ｋＤのタンパク質を
認識したという観察は、（１）ＴＣ２は、Ａ４−Ｃの凝
集体を検出している可能性がある、（２）Ａ４−Ｃは、
翻訳後に修飾された、或いは、（３）ＴＣ２は、元来
は、Ａ４−Ｃに関連しないある種の３３ｋＤのタンパク
質と交差反応をする、ことを示唆している。
Ｄサイズのタンパク質よりも、３３ｋＤのタンパク質を
認識したという観察は、（１）ＴＣ２は、Ａ４−Ｃの凝
集体を検出している可能性がある、（２）Ａ４−Ｃは、
翻訳後に修飾された、或いは、（３）ＴＣ２は、元来
は、Ａ４−Ｃに関連しないある種の３３ｋＤのタンパク
質と交差反応をする、ことを示唆している。
【００２８】１６ｋＤのＡ４−Ｃタンパク質が異常に凝
集して３３ｋＤタンパク質を形成するか否かを決定する
ために、ギ酸及び尿素を用いて推定凝集体を解離した。
３３ｋＤタンパク質を９０％ギ酸中で、２４時間、室温
でインキュベートした。ギ酸処理後、試料を凍結乾燥し
てＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した。３３ｋＤタンパク
質の泳動性に変化はなかった。同様に、３３ｋＤタンパ
ク質の８Ｍ尿素による前処理とタンパク質の６Ｍ尿素存
在下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによっても、結果として３３ｋ
Ｄタンパク質の泳動度に変化は起こらなかった。Ａ４−
Ｃが翻訳後に修飾されるか否かを決定することを目的と
した実験は、当該物質がグリコシル化も（図６参照、Ｄ
ＩＧグリカン検出キットはBoehringer Mannheim から購
入され、検出は、製造元の指針によって行われた）、ま
た、ユビキチン化もされていないことを明らかにした。
集して３３ｋＤタンパク質を形成するか否かを決定する
ために、ギ酸及び尿素を用いて推定凝集体を解離した。
３３ｋＤタンパク質を９０％ギ酸中で、２４時間、室温
でインキュベートした。ギ酸処理後、試料を凍結乾燥し
てＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した。３３ｋＤタンパク
質の泳動性に変化はなかった。同様に、３３ｋＤタンパ
ク質の８Ｍ尿素による前処理とタンパク質の６Ｍ尿素存
在下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによっても、結果として３３ｋ
Ｄタンパク質の泳動度に変化は起こらなかった。Ａ４−
Ｃが翻訳後に修飾されるか否かを決定することを目的と
した実験は、当該物質がグリコシル化も（図６参照、Ｄ
ＩＧグリカン検出キットはBoehringer Mannheim から購
入され、検出は、製造元の指針によって行われた）、ま
た、ユビキチン化もされていないことを明らかにした。
【００２９】ＩＩ．３３ｋＤタンパク質はアネキシンＶ
を含有する ３３ｋＤタンパク質の特徴決定は、さらに、タンパク質
の精製、及びペプチド配列解析によって達成された。３
３ｋＤタンパク質は、Ａ４−Ｃでトランスフェクトされ
たＰＣ１２（ＰＣ１２細胞は American Type Culture C
ollection, Rockville, Maryland, ATCC# CRL 1721から
入手可能である）細胞の溶解液から、一連の標準クロマ
トグラフィー法を用いて精製された。略述すると、Ａ４
−ＣでトランスフェクトされたＰＣ１２細胞の溶解液か
ら得た上清をＱセファロースカラム［３ｍｌ、５０ｍＭ
トリス（Ｔｒｉｓ）（ｐＨ７．４）］に適用した。Ｑセ
ファロースカラムに結合したタンパク質を２００ｍＭの
ＮａＣｌで溶出し、試料中のＮａＣｌ濃度を１．５Ｍに
引き上げてから、フェニル−セファロースカラム［３ｍ
ｌ、５０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）（ｐＨ７．４）中で
１．５ＭのＮａＣｌで平衡化されたもの］に適用した。
結合したタンパク質は、フェニル−セフェロースカラム
から、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）中に溶出され、
５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）に対して透析して、モノ
Ｑ（Ｍｏｎｏ−Ｑ）カラムにかけ、そこからタンパク質
は、１２５−２５０ｍＭのＮａＣｌの直線密度勾配によ
り、０．７５ｍｌ／分の流速で２０分間にわたって溶出
された。図７は、精製過程にそって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって分画された試料のクマシー染色とウエスタンブ
ロット解析（ＴＣ２抗体）を示す。
を含有する ３３ｋＤタンパク質の特徴決定は、さらに、タンパク質
の精製、及びペプチド配列解析によって達成された。３
３ｋＤタンパク質は、Ａ４−Ｃでトランスフェクトされ
たＰＣ１２（ＰＣ１２細胞は American Type Culture C
ollection, Rockville, Maryland, ATCC# CRL 1721から
入手可能である）細胞の溶解液から、一連の標準クロマ
トグラフィー法を用いて精製された。略述すると、Ａ４
−ＣでトランスフェクトされたＰＣ１２細胞の溶解液か
ら得た上清をＱセファロースカラム［３ｍｌ、５０ｍＭ
トリス（Ｔｒｉｓ）（ｐＨ７．４）］に適用した。Ｑセ
ファロースカラムに結合したタンパク質を２００ｍＭの
ＮａＣｌで溶出し、試料中のＮａＣｌ濃度を１．５Ｍに
引き上げてから、フェニル−セファロースカラム［３ｍ
ｌ、５０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）（ｐＨ７．４）中で
１．５ＭのＮａＣｌで平衡化されたもの］に適用した。
結合したタンパク質は、フェニル−セフェロースカラム
から、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）中に溶出され、
５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）に対して透析して、モノ
Ｑ（Ｍｏｎｏ−Ｑ）カラムにかけ、そこからタンパク質
は、１２５−２５０ｍＭのＮａＣｌの直線密度勾配によ
り、０．７５ｍｌ／分の流速で２０分間にわたって溶出
された。図７は、精製過程にそって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって分画された試料のクマシー染色とウエスタンブ
ロット解析（ＴＣ２抗体）を示す。
【００３０】３３ｋＤタンパク質のＮ末端配列の分析に
より、これがＡ４−Ｃトランス遺伝子によりコードさ
れ、内在性のＡＰＰに対応しないことが明らかとなっ
た。図８：３３ｋＤタンパク質を含むモノＱ画分をプー
ルして１０％のLaemmli のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離
して、ＰＶＤＦ膜 (Millipore 、或いはBio-Rad)上に電
気泳動により転移した。クマシーブリリアントブルーで
染色した後、ブロットされたタンパク質の自動エドマン
分解をアプライド・バイオシステムズのモデル４７０Ａ
型シークエンサーで行った［ＰＴＨ（フェニルチオヒダ
ントイン）アミノ酸の割当ては逆相ＨＰＬＣによって行
った］。この分析により、３３ｋＤのタンパク質が、多
数の異なったペプチドを含むこともまた明らかとなっ
た。そこで、３３ｋＤのタンパク質の追加成分を同定す
るために、配列の分析がさらに行われた（図９参照）。
精製した３３ｋＤのタンパク質をリシルエンドペプチダ
ーゼで消化した後、ペプチドを逆相ＨＰＬＣで分離し、
これらペプチドのうち４つは、上記の如く、常法により
配列が決定された。これらペプチドの配列は、完全にア
ネキシンＶの内部配列に一致した（図９参照、５７−６
８、８５−９５、１０７−１２０、及び２５９−２８
４）。３３ｋＤのタンパク質にアネキシンＶが存在する
ことに対する追加の支持は、アネキシンＶに対して生成
された抗体（ここでは、“４４３１”と呼ばれる）が、
ウエスタンブロット分析において、３３ｋＤのタンパク
質を認識するという観察によって提供された（図１０参
照）。さらに、ウエスタンブロット分析は、ＡＰＰのＣ
２断片に対して生成されたＴ２抗体が精製されたアネキ
シンＶを認識することを明らかにした（図１０参照）。
より、これがＡ４−Ｃトランス遺伝子によりコードさ
れ、内在性のＡＰＰに対応しないことが明らかとなっ
た。図８：３３ｋＤタンパク質を含むモノＱ画分をプー
ルして１０％のLaemmli のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離
して、ＰＶＤＦ膜 (Millipore 、或いはBio-Rad)上に電
気泳動により転移した。クマシーブリリアントブルーで
染色した後、ブロットされたタンパク質の自動エドマン
分解をアプライド・バイオシステムズのモデル４７０Ａ
型シークエンサーで行った［ＰＴＨ（フェニルチオヒダ
ントイン）アミノ酸の割当ては逆相ＨＰＬＣによって行
った］。この分析により、３３ｋＤのタンパク質が、多
数の異なったペプチドを含むこともまた明らかとなっ
た。そこで、３３ｋＤのタンパク質の追加成分を同定す
るために、配列の分析がさらに行われた（図９参照）。
精製した３３ｋＤのタンパク質をリシルエンドペプチダ
ーゼで消化した後、ペプチドを逆相ＨＰＬＣで分離し、
これらペプチドのうち４つは、上記の如く、常法により
配列が決定された。これらペプチドの配列は、完全にア
ネキシンＶの内部配列に一致した（図９参照、５７−６
８、８５−９５、１０７−１２０、及び２５９−２８
４）。３３ｋＤのタンパク質にアネキシンＶが存在する
ことに対する追加の支持は、アネキシンＶに対して生成
された抗体（ここでは、“４４３１”と呼ばれる）が、
ウエスタンブロット分析において、３３ｋＤのタンパク
質を認識するという観察によって提供された（図１０参
照）。さらに、ウエスタンブロット分析は、ＡＰＰのＣ
２断片に対して生成されたＴ２抗体が精製されたアネキ
シンＶを認識することを明らかにした（図１０参照）。
【００３１】３３ｋＤのタンパク質の検出が、Ａ４−Ｃ
の発現に依存しているという観察は、Ａ４−Ｃがアルツ
ハイマー病の特徴である老人班に関連しているＡＰＰの
断片であるという事実と相俟って、３３ｋＤのタンパク
質の検出がＡＤの診断に有用である可能性を示唆してい
る。そこで、我々は、以下に詳述する様に、３３ｋＤの
タンパク質を認識する抗体を用いての３３ｋＤタンパク
質検出の有用性を検討した。
の発現に依存しているという観察は、Ａ４−Ｃがアルツ
ハイマー病の特徴である老人班に関連しているＡＰＰの
断片であるという事実と相俟って、３３ｋＤのタンパク
質の検出がＡＤの診断に有用である可能性を示唆してい
る。そこで、我々は、以下に詳述する様に、３３ｋＤの
タンパク質を認識する抗体を用いての３３ｋＤタンパク
質検出の有用性を検討した。
【００３２】ＩＩＩ．アルツハイマー病の検出のための
抗体 Ａ．有用な抗原 ３３ｋＤのタンパク質を認識する抗体の生成に有用な抗
原には、３３ｋＤタンパク質、ＡＰＰのＣ２断片（アミ
ノ酸６４４番〜６７６番）、天然に存在するアネキシン
Ｖ或いはその断片、組替えアネキシン或いはその断片、
合成アネキシン或いはその断片またはその同族体、及び
ＡＰＰの組換え或いは合成のＣ２断片、が含まれる。そ
の上、タンパク質或いはペプチド抗原は、それらの起
源、長さ、天然に存在するアネキシンＶ或いはＡＰＰの
Ｃ２断片との正確な相同性に拘らず、結果として特異的
に３３ｋＤタンパク質に結合する抗体の生成に至るもの
は、本発明の方法に有用な可能性がある。ラットのアネ
キシンＶの結晶構造が決定され(Concha et al., Scienc
e 261:1321, 1993) 、従って、抗原として有用なアネキ
シンＶペプチドの選択を容易にしている。前記の有用な
抗原は、多クローン性或いは単クローン性抗体の生成に
用いることが可能である。例えば、ＡＰＰのＣ２断片
は、ＡＤの診断用の抗体を生成する抗原として用いられ
ることが、下記の例Ｉに述べられている。
抗体 Ａ．有用な抗原 ３３ｋＤのタンパク質を認識する抗体の生成に有用な抗
原には、３３ｋＤタンパク質、ＡＰＰのＣ２断片（アミ
ノ酸６４４番〜６７６番）、天然に存在するアネキシン
Ｖ或いはその断片、組替えアネキシン或いはその断片、
合成アネキシン或いはその断片またはその同族体、及び
ＡＰＰの組換え或いは合成のＣ２断片、が含まれる。そ
の上、タンパク質或いはペプチド抗原は、それらの起
源、長さ、天然に存在するアネキシンＶ或いはＡＰＰの
Ｃ２断片との正確な相同性に拘らず、結果として特異的
に３３ｋＤタンパク質に結合する抗体の生成に至るもの
は、本発明の方法に有用な可能性がある。ラットのアネ
キシンＶの結晶構造が決定され(Concha et al., Scienc
e 261:1321, 1993) 、従って、抗原として有用なアネキ
シンＶペプチドの選択を容易にしている。前記の有用な
抗原は、多クローン性或いは単クローン性抗体の生成に
用いることが可能である。例えば、ＡＰＰのＣ２断片
は、ＡＤの診断用の抗体を生成する抗原として用いられ
ることが、下記の例Ｉに述べられている。
【００３３】アネキシンＶ、及びＡＰＰの EMBL/GeneBa
nk寄託番号は、夫々、J03899とY00264である。これらの
アミノ酸配列が入手可能なため、分子生物学の通常の技
法を用いて追加の抗原性ペプチドの製法となっている。
nk寄託番号は、夫々、J03899とY00264である。これらの
アミノ酸配列が入手可能なため、分子生物学の通常の技
法を用いて追加の抗原性ペプチドの製法となっている。
【００３４】Ｂ．抗体生成の方法 単クローン性抗体 本発明のハイブリッド細胞系は、当業者には一般に周知
の種々の方法によって生成することが可能である (Harl
ow et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold S
pring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
New York)。一般に、この方法は、適当な哺乳動物（マ
ウスの様な）を関心のある抗体で免疫し、その動物の脾
臓から分離した抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合
し、その結果得られたハイブリッド細胞をクローニング
し、問題の抗原を結合する所期の単クローン性抗体を産
生する細胞を選別することを含む。
の種々の方法によって生成することが可能である (Harl
ow et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold S
pring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
New York)。一般に、この方法は、適当な哺乳動物（マ
ウスの様な）を関心のある抗体で免疫し、その動物の脾
臓から分離した抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合
し、その結果得られたハイブリッド細胞をクローニング
し、問題の抗原を結合する所期の単クローン性抗体を産
生する細胞を選別することを含む。
【００３５】免疫処置は、通常、精製された抗原を用い
て行われる。免疫処置に使用される通常の哺乳動物は、
マウス、特にＣＤ−１系マウスであるが、他の動物や他
系のマウスを使用してもよい。免疫処置は、夫々、適当
量の精製抗原（即ち、約１ｍｇから約５０ｍｇ）を含む
注射液を３回から６回、腹腔内、静脈内、及び／または
皮下に、約１乃至６週間の間隔で、通常は、リンパ球の
生成を促進するアジュバント、例えば、完全、或いは不
完全のフロイントのアジュバントと共に投与する様な当
業界に周知の様式で遂行される。
て行われる。免疫処置に使用される通常の哺乳動物は、
マウス、特にＣＤ−１系マウスであるが、他の動物や他
系のマウスを使用してもよい。免疫処置は、夫々、適当
量の精製抗原（即ち、約１ｍｇから約５０ｍｇ）を含む
注射液を３回から６回、腹腔内、静脈内、及び／または
皮下に、約１乃至６週間の間隔で、通常は、リンパ球の
生成を促進するアジュバント、例えば、完全、或いは不
完全のフロイントのアジュバントと共に投与する様な当
業界に周知の様式で遂行される。
【００３６】免疫された動物の脾臓に存在する抗体産生
細胞は、最後の［“追加免疫”(booster) ］免疫処置か
ら２乃至６日後に採取され、適当な系のミエローマ細胞
に融合される。ミエローマ細胞系、及びそれから誘導さ
れた細胞系が、適当な融合相手細胞として知られてい
る。同種間のハイブリッドは異種間のハイブリッドより
も生存能力が高いので、ミエローマ細胞系は、一般に被
免疫哺乳動物と同じ動物種から誘導される。
細胞は、最後の［“追加免疫”(booster) ］免疫処置か
ら２乃至６日後に採取され、適当な系のミエローマ細胞
に融合される。ミエローマ細胞系、及びそれから誘導さ
れた細胞系が、適当な融合相手細胞として知られてい
る。同種間のハイブリッドは異種間のハイブリッドより
も生存能力が高いので、ミエローマ細胞系は、一般に被
免疫哺乳動物と同じ動物種から誘導される。
【００３７】酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、或いは、酵素
チミジンキナーゼ（ＴＫ）を欠損し、ヒポキサンチン、
アミノプテリン及びチミジンを含む選択培地（ＨＡＴ培
地）では生存しないミエローマ細胞を使用することが出
来る。ＨＡＴ培地では生存せず、いかなるイムノグロブ
リン、或いはその部分を分泌しないミエローマ細胞及び
それから生成された細胞系、例えば、ＸＳ６３細胞系も
また使用することが出来る（ＸＳ６３細胞は、American
Type Culture Collection, Rockville, Maryland, ATC
C# TIB17から入手可能である）。種々の融合プロモー
タ、例えば、センダイウイルス或いは他のパラミクソウ
イルス、希望すれば紫外線（ＵＶ）処理した不活性型と
して、カルシウムイオン、イソレシチンの様な界面活性
脂質、或いはポリエチレングリコール（“ＰＥＧ”）も
また使用してよい。ミエローマ細胞は、通常、３倍から
２０倍過剰の被免疫動物由来の脾臓細胞と、約１０００
から４０００ダルトンの分子量を持つＰＥＧを約３０〜
５０％含む溶液中で融合される。細胞に対する毒性を防
ぐために、ＰＥＧの接触は約２分から３分が適当と思わ
れる。約３７℃の温度が推奨されている。融合の後、細
胞は分割され、選択ＨＡＴ培地で培養される。
シルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、或いは、酵素
チミジンキナーゼ（ＴＫ）を欠損し、ヒポキサンチン、
アミノプテリン及びチミジンを含む選択培地（ＨＡＴ培
地）では生存しないミエローマ細胞を使用することが出
来る。ＨＡＴ培地では生存せず、いかなるイムノグロブ
リン、或いはその部分を分泌しないミエローマ細胞及び
それから生成された細胞系、例えば、ＸＳ６３細胞系も
また使用することが出来る（ＸＳ６３細胞は、American
Type Culture Collection, Rockville, Maryland, ATC
C# TIB17から入手可能である）。種々の融合プロモー
タ、例えば、センダイウイルス或いは他のパラミクソウ
イルス、希望すれば紫外線（ＵＶ）処理した不活性型と
して、カルシウムイオン、イソレシチンの様な界面活性
脂質、或いはポリエチレングリコール（“ＰＥＧ”）も
また使用してよい。ミエローマ細胞は、通常、３倍から
２０倍過剰の被免疫動物由来の脾臓細胞と、約１０００
から４０００ダルトンの分子量を持つＰＥＧを約３０〜
５０％含む溶液中で融合される。細胞に対する毒性を防
ぐために、ＰＥＧの接触は約２分から３分が適当と思わ
れる。約３７℃の温度が推奨されている。融合の後、細
胞は分割され、選択ＨＡＴ培地で培養される。
【００３８】ハイブリッド細胞の成育に適当な培地は、
通例の標準培地、例えば、ＰＲＭＩ培地、或いは、抗生
物質を追加したウシ胎児血清を２０％含む培地である。
通例の標準培地、例えば、ＰＲＭＩ培地、或いは、抗生
物質を追加したウシ胎児血清を２０％含む培地である。
【００３９】細胞生長の初期には、いわゆるフィーダー
細胞（例えば、正常マウスの腹膜の滲出細胞、脾臓細
胞、骨髄のマクロファージ或いはそれに類似の細胞）を
追加することが出来る。通常のミエローマ細胞の過剰生
長によってハイブリッド細胞の生長が抑制されるのを防
止するため、一定の期間をおいて、培地に選択ＨＡＴ培
地を追加してもよい。ＨＡＴ選別に耐えたハイブリッド
細胞の細胞培養上清は所期の単クローン性抗体の存在の
有無について検査される。細胞上清は、単クローン性抗
体の目下関心のある抗原への結合を証明するイムノアッ
セイ、例えば、酵素イムノアッセイで検査されると都合
がよい。
細胞（例えば、正常マウスの腹膜の滲出細胞、脾臓細
胞、骨髄のマクロファージ或いはそれに類似の細胞）を
追加することが出来る。通常のミエローマ細胞の過剰生
長によってハイブリッド細胞の生長が抑制されるのを防
止するため、一定の期間をおいて、培地に選択ＨＡＴ培
地を追加してもよい。ＨＡＴ選別に耐えたハイブリッド
細胞の細胞培養上清は所期の単クローン性抗体の存在の
有無について検査される。細胞上清は、単クローン性抗
体の目下関心のある抗原への結合を証明するイムノアッ
セイ、例えば、酵素イムノアッセイで検査されると都合
がよい。
【００４０】次いで、初期の特異性ならびに熱安定性の
ような他の特性を備えた抗体を産生するこれらのハイブ
リドーマは、成育性培養として、及び／或いは貯蔵のた
め凍結状態で維持される。
ような他の特性を備えた抗体を産生するこれらのハイブ
リドーマは、成育性培養として、及び／或いは貯蔵のた
め凍結状態で維持される。
【００４１】また、大量の初期の単クローン性抗体は、
インビボで、ハイブリドーマ細胞を増殖して得ることが
出来る。この目的のため、抗体産生ハイブリドーマを同
系の哺乳動物の腹腔内に接種して、１乃至３週間後、こ
れらの哺乳動物の腹水液から分離される。例えば、ＣＤ
−１マウス起源のハイブリッド細胞は、腹腔からの液の
滲出を防止するため、予め２，６，１０，１４−テトラ
メチルペンタデカン［プリスタン（pristane) ] の様な
炭化水素を腹腔内に注射して前処置をしたＣＤ−１マウ
スの腹腔内に注射することが出来、８乃至１０日後、腹
水がこれらの動物から採取される。
インビボで、ハイブリドーマ細胞を増殖して得ることが
出来る。この目的のため、抗体産生ハイブリドーマを同
系の哺乳動物の腹腔内に接種して、１乃至３週間後、こ
れらの哺乳動物の腹水液から分離される。例えば、ＣＤ
−１マウス起源のハイブリッド細胞は、腹腔からの液の
滲出を防止するため、予め２，６，１０，１４−テトラ
メチルペンタデカン［プリスタン（pristane) ] の様な
炭化水素を腹腔内に注射して前処置をしたＣＤ−１マウ
スの腹腔内に注射することが出来、８乃至１０日後、腹
水がこれらの動物から採取される。
【００４２】本発明は、本明細書記載の抗体の特性を示
す全ての単クローン性抗体を包含する。言い換えると、
本書に説明されている反応性の型を持つ抗体は、それら
が所属するイムノグロブリンのクラス、或いはそのサブ
クラスに拘らず、本発明の特許請求範囲内に包含され
る。例えば、本明細書記載の特性を示す単クローン性抗
体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧａ、ＩｇＧｂ、ＩｇＧ３のクラ
ス、或いは、ＩｇＭ、ＩｇＡのクラス、或いは既知のＩ
ｇクラスのものであってもよい。さらに、ある既知のマ
ウスのミエローマと、免疫されたある既知の系のマウス
由来の脾臓細胞から生成されたハイブリッド細胞系は、
その特定のハイブリッド細胞系によって生成される抗体
と照合する以外には更に同定することは出来ないが、前
記の反応特性を持つ抗体を産生するすべてのハイブリッ
ド細胞系は、本発明内に含まれる。
す全ての単クローン性抗体を包含する。言い換えると、
本書に説明されている反応性の型を持つ抗体は、それら
が所属するイムノグロブリンのクラス、或いはそのサブ
クラスに拘らず、本発明の特許請求範囲内に包含され
る。例えば、本明細書記載の特性を示す単クローン性抗
体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧａ、ＩｇＧｂ、ＩｇＧ３のクラ
ス、或いは、ＩｇＭ、ＩｇＡのクラス、或いは既知のＩ
ｇクラスのものであってもよい。さらに、ある既知のマ
ウスのミエローマと、免疫されたある既知の系のマウス
由来の脾臓細胞から生成されたハイブリッド細胞系は、
その特定のハイブリッド細胞系によって生成される抗体
と照合する以外には更に同定することは出来ないが、前
記の反応特性を持つ抗体を産生するすべてのハイブリッ
ド細胞系は、本発明内に含まれる。
【００４３】多クローン性抗体 本発明の多クローン性抗体は、当業者には一般的に周知
の種々の方法によって生成することが出来る(Sambrook
et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2n
d edn., Cold Spring Harbor Lboratory Press, Cold S
pring Harbor,New York; Harlow et al., A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, New York)。一般に、この方法には、
適当な哺乳動物の関心のある抗原による免疫、哺乳動物
の飼育、及び当該動物の血液からの抗血清の調製が含ま
れる。免疫処置は、通常、精製抗原を用いて行われる。
免疫処置に通常用いられる哺乳動物はウサギであるが、
ヤギ、及びマウスも又使用することが出来る。抗体は、
膝窩リンパ節を介して、皮内に、皮下に、或いは単一の
筋肉内の部位に注射される。
の種々の方法によって生成することが出来る(Sambrook
et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2n
d edn., Cold Spring Harbor Lboratory Press, Cold S
pring Harbor,New York; Harlow et al., A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, New York)。一般に、この方法には、
適当な哺乳動物の関心のある抗原による免疫、哺乳動物
の飼育、及び当該動物の血液からの抗血清の調製が含ま
れる。免疫処置は、通常、精製抗原を用いて行われる。
免疫処置に通常用いられる哺乳動物はウサギであるが、
ヤギ、及びマウスも又使用することが出来る。抗体は、
膝窩リンパ節を介して、皮内に、皮下に、或いは単一の
筋肉内の部位に注射される。
【００４４】免疫日程は、抗原の性質、入手出来る抗原
量、抗原の免疫原性、及び使用される哺乳動物に従って
変わるが、ウサギについての合理的な日程は次の通りで
ある。１００μｇの抗原を、抗原が溶解する０．５ｍｌ
の緩衝液に溶解し、この溶液を等量のフロイントアジュ
バントで乳状化する。０．５ｍｌの乳状化した抗原−ア
ジュバントを、動物の２本の脚の夫々に注射し、４〜６
週後、０．２５ｍｌの乳状化した抗原−アジュバントを
他の脚に注射する。各追加免疫注射の７〜１０日後に４
０ｍｌの血液を２０本採取し、血清を調製して、抗体の
存在を標準の方法によって検査すべきである（ＥＬＩＳ
Ａ、ウエスタン、ＲＩＡ、或いは免疫沈降法）。免疫応
答した動物は、より高い抗体価が得られる迄、規定の期
間をおいて追加免疫することが出来る。次いで、血液
（４０ｍｌ）を抗体価が低下する迄、毎週採取すること
が出来る。
量、抗原の免疫原性、及び使用される哺乳動物に従って
変わるが、ウサギについての合理的な日程は次の通りで
ある。１００μｇの抗原を、抗原が溶解する０．５ｍｌ
の緩衝液に溶解し、この溶液を等量のフロイントアジュ
バントで乳状化する。０．５ｍｌの乳状化した抗原−ア
ジュバントを、動物の２本の脚の夫々に注射し、４〜６
週後、０．２５ｍｌの乳状化した抗原−アジュバントを
他の脚に注射する。各追加免疫注射の７〜１０日後に４
０ｍｌの血液を２０本採取し、血清を調製して、抗体の
存在を標準の方法によって検査すべきである（ＥＬＩＳ
Ａ、ウエスタン、ＲＩＡ、或いは免疫沈降法）。免疫応
答した動物は、より高い抗体価が得られる迄、規定の期
間をおいて追加免疫することが出来る。次いで、血液
（４０ｍｌ）を抗体価が低下する迄、毎週採取すること
が出来る。
【００４５】抗血清を調製するために、血液を数時間絶
食させた動物から採集し、次いで、室温で凝固するに任
せる。次いで、ガラス棒、或いは封管したパスツールピ
ペットを用いて血餅を巻き付ける（“ｒｉｎｇ”）。次
の数時間内に、血餅は元の容積の約半分に収縮し、抗血
清を藁色の液体として残す。次いで、抗血清を新しい試
験管に移して、血餅を１５００ｇで１０分間、室温で遠
心分離する。上清を以前に除いた抗血清と混合し、血餅
は廃棄して、抗血清は凍結乾燥粉末として−２０℃、−
７０℃で、或いは０．０２％のナトリウムアチドの存在
下に４℃で保存される。
食させた動物から採集し、次いで、室温で凝固するに任
せる。次いで、ガラス棒、或いは封管したパスツールピ
ペットを用いて血餅を巻き付ける（“ｒｉｎｇ”）。次
の数時間内に、血餅は元の容積の約半分に収縮し、抗血
清を藁色の液体として残す。次いで、抗血清を新しい試
験管に移して、血餅を１５００ｇで１０分間、室温で遠
心分離する。上清を以前に除いた抗血清と混合し、血餅
は廃棄して、抗血清は凍結乾燥粉末として−２０℃、−
７０℃で、或いは０．０２％のナトリウムアチドの存在
下に４℃で保存される。
【００４６】インビトロ、或いはインビボで生成された
単クローン性、及び多クローン性抗体は両方とも、種々
の方法、例えば、親和クロマトグラフィー、ゲル濾過ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、或
いはＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィーを用いて
精製される。所期の抗体を含め、培養上清、或いは腹水
に存在する選別されたタンパク質は、特定濃度の硫安、
或いはその類似のものを用いて、クロマトグラフィーに
かける前に任意に沈殿させてもよい。
単クローン性、及び多クローン性抗体は両方とも、種々
の方法、例えば、親和クロマトグラフィー、ゲル濾過ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、或
いはＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィーを用いて
精製される。所期の抗体を含め、培養上清、或いは腹水
に存在する選別されたタンパク質は、特定濃度の硫安、
或いはその類似のものを用いて、クロマトグラフィーに
かける前に任意に沈殿させてもよい。
【００４７】Ｃ．ＡＤ診断に有用な抗体をスクリーニン
グする方法 有用な抗体のスクリーニングは、イムノアッセイを用い
て達成出来る。本発明のイムノアッセイ法は、好適には
修飾酵素イムノアッセイ、例えば、阻害ＥＬＩＳＡ、ウ
エスタンブロット、免疫沈降、スロット或いはブロット
アッセイに基づくものである。
グする方法 有用な抗体のスクリーニングは、イムノアッセイを用い
て達成出来る。本発明のイムノアッセイ法は、好適には
修飾酵素イムノアッセイ、例えば、阻害ＥＬＩＳＡ、ウ
エスタンブロット、免疫沈降、スロット或いはブロット
アッセイに基づくものである。
【００４８】採用される特定の実験計画(protocol)次第
で、抗体の非標識、或いは酵素標識された誘導体が用い
られる。特定の抗体が酵素標識されない場合、別の検出
可能なマーカー、例えば、一次抗体に結合能を持つ酵素
標識された抗体を用いてもよい。高度に精製されたｐ３
３を、試料中のｐ３３の未知の濃度を計算するための標
準物質として用いることが出来る。定量されるべき試料
は、固相体に結合されるか、固定された抗体と反応する
か、或いは特異的抗体と予めインキュベートして抗原−
抗体複合体を形成する。
で、抗体の非標識、或いは酵素標識された誘導体が用い
られる。特定の抗体が酵素標識されない場合、別の検出
可能なマーカー、例えば、一次抗体に結合能を持つ酵素
標識された抗体を用いてもよい。高度に精製されたｐ３
３を、試料中のｐ３３の未知の濃度を計算するための標
準物質として用いることが出来る。定量されるべき試料
は、固相体に結合されるか、固定された抗体と反応する
か、或いは特異的抗体と予めインキュベートして抗原−
抗体複合体を形成する。
【００４９】本発明のイムノアッセイがどの様に施行さ
れ得るかを説明するために、阻害ＥＬＩＳＡ法を以下詳
細に述べる。先ず、精製ｐ３３が固相担体に固定され
る。イムノアッセイに用いられる通常のいかなる担体を
使用してもよい。適当な固相担体には、例えば、ガラス
管内壁、及びポリスチレンを基材とした微量定量プレー
ト、又は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレ
ン、及びガラスの様な種々の部材で作られた固体粒子が
含まれる。試料を予め一次抗体とインキュベートした
後、試料溶液中に存在する抗原と複合体を形成しない遊
離の一次抗体は、固定されたタンパク質に結合する。こ
の段階で、結合しない試料中のいかなる物質も固相担体
から洗い除かれる。次いで、固相担体は、固定された抗
原に結合した一次抗体に結合する能力のある酵素標識さ
れた二次抗体と接触させられる。未結合の酵素標識され
た二次抗体は、すべて固相担体から分離した後、複合体
を酵素標識された二次抗体の酵素と反応出来る酵素基質
とインキュベートして検出可能な反応生成物を生成す
る。酵素反応の生成物を、次いで、測定して、既知濃度
の抗原の標準曲線の値と関連づける。試料中のｐ３３の
量は、標準曲線から算定される。
れ得るかを説明するために、阻害ＥＬＩＳＡ法を以下詳
細に述べる。先ず、精製ｐ３３が固相担体に固定され
る。イムノアッセイに用いられる通常のいかなる担体を
使用してもよい。適当な固相担体には、例えば、ガラス
管内壁、及びポリスチレンを基材とした微量定量プレー
ト、又は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレ
ン、及びガラスの様な種々の部材で作られた固体粒子が
含まれる。試料を予め一次抗体とインキュベートした
後、試料溶液中に存在する抗原と複合体を形成しない遊
離の一次抗体は、固定されたタンパク質に結合する。こ
の段階で、結合しない試料中のいかなる物質も固相担体
から洗い除かれる。次いで、固相担体は、固定された抗
原に結合した一次抗体に結合する能力のある酵素標識さ
れた二次抗体と接触させられる。未結合の酵素標識され
た二次抗体は、すべて固相担体から分離した後、複合体
を酵素標識された二次抗体の酵素と反応出来る酵素基質
とインキュベートして検出可能な反応生成物を生成す
る。酵素反応の生成物を、次いで、測定して、既知濃度
の抗原の標準曲線の値と関連づける。試料中のｐ３３の
量は、標準曲線から算定される。
【００５０】本発明のイムノアッセイは、又、特定の実
験計画次第で、ｐ３３と結合する抗体の、非標識の、或
いは放射標識された誘導体を、単独で或いは組合わせて
用いることが出来る。ラジオイムノアッセイ（“ＲＩ
Ａ”）のいかなる既知の修飾法、例えば、均一系ＲＩ
Ａ、不均一系ＲＩＡ、競争結合系ＲＩＡ、及びサンドイ
ッチＲＩＡを用いてもよい。
験計画次第で、ｐ３３と結合する抗体の、非標識の、或
いは放射標識された誘導体を、単独で或いは組合わせて
用いることが出来る。ラジオイムノアッセイ（“ＲＩ
Ａ”）のいかなる既知の修飾法、例えば、均一系ＲＩ
Ａ、不均一系ＲＩＡ、競争結合系ＲＩＡ、及びサンドイ
ッチＲＩＡを用いてもよい。
【００５１】本発明のイムノアッセイ法は、又、他の既
知のイムノアッセイ法、例えば、フルオレッセイン又は
ローダミンの様な蛍光基質の抗体複合体或いは抗原複合
体、オクタロニー二重拡散分析、及びアビヂン−ビオチ
ン或いはストレプトアビヂン−ビオチン検出系を用いた
蛍光イムノアッセイでもよい。
知のイムノアッセイ法、例えば、フルオレッセイン又は
ローダミンの様な蛍光基質の抗体複合体或いは抗原複合
体、オクタロニー二重拡散分析、及びアビヂン−ビオチ
ン或いはストレプトアビヂン−ビオチン検出系を用いた
蛍光イムノアッセイでもよい。
【００５２】抗体は、コーティングをした或いはしてい
ないガラスビーズ、或いはセファロース、セファデック
ス、或いはアクリルビーズの様な固体物質に結合しても
よい。これらの抗体に結合した抗原は、ビーズ上で、或
いは膜上に溶出した後（スロットブロット）或いはＥＬ
ＩＳＡ−プレート上（阻害エリザ）で検出される。
ないガラスビーズ、或いはセファロース、セファデック
ス、或いはアクリルビーズの様な固体物質に結合しても
よい。これらの抗体に結合した抗原は、ビーズ上で、或
いは膜上に溶出した後（スロットブロット）或いはＥＬ
ＩＳＡ−プレート上（阻害エリザ）で検出される。
【００５３】Ｄ． ＡＤの診断に対する抗体の利用 前記のイムノアッセイにおいて有用と認められた抗体
は、発症患者におけるＡＤの診断に用いることが出来
る。前記のイムノアッセイはいずれも、患者から標準の
方法によって採取された腰椎性脳脊髄液（ＣＳＦ）の分
析に使用することが出来る(The Merck Manual 12th ed
n., D.N. Holvey, Ed., Merck Sharp and Dohne Resear
ch Labs Publishing, New Jersey, 1972. pp. 1746-174
8) 。
は、発症患者におけるＡＤの診断に用いることが出来
る。前記のイムノアッセイはいずれも、患者から標準の
方法によって採取された腰椎性脳脊髄液（ＣＳＦ）の分
析に使用することが出来る(The Merck Manual 12th ed
n., D.N. Holvey, Ed., Merck Sharp and Dohne Resear
ch Labs Publishing, New Jersey, 1972. pp. 1746-174
8) 。
【００５４】前記の有用な抗体は、又、ＡＤの死後の診
断にも用いることが出来る。前に列挙したイムノアッセ
イは、脳室性ＣＳＦ(Appleyard et al., Brain 110:130
9, 1987; Webster et al., Journal of Neurochemistry
54:1148, 1990) 及び脳のホモジェネート(Takeuchi et
al., J. Neurochemistry 58:1526 1992) の分析に使用
出来る。更に、脳組織切片の免疫染色も行うことが出来
る(Immunohistochedmistry, A.C. Cuello, Ed., John W
iley and Sons, New York, 1983, p. 501)。
断にも用いることが出来る。前に列挙したイムノアッセ
イは、脳室性ＣＳＦ(Appleyard et al., Brain 110:130
9, 1987; Webster et al., Journal of Neurochemistry
54:1148, 1990) 及び脳のホモジェネート(Takeuchi et
al., J. Neurochemistry 58:1526 1992) の分析に使用
出来る。更に、脳組織切片の免疫染色も行うことが出来
る(Immunohistochedmistry, A.C. Cuello, Ed., John W
iley and Sons, New York, 1983, p. 501)。
【００５５】前記のアッセイは、このアッセイの遂行に
必要な試薬を含んだキットにより容易にすることが出来
る。アッセイに使用出来る種々の抗体は、種々のアッセ
イで夫々、異なった総結合レベルを持つであろう。従っ
て、ＡＤ患者から採取した試料に結合する抗体のレベル
は、対照患者からの試料に結合する抗体のレベルと比較
すべきである。対照試料と比較して、ＡＤ試料における
１５０％の増加は、ＡＤ罹患症状を示すものと考えられ
る。
必要な試薬を含んだキットにより容易にすることが出来
る。アッセイに使用出来る種々の抗体は、種々のアッセ
イで夫々、異なった総結合レベルを持つであろう。従っ
て、ＡＤ患者から採取した試料に結合する抗体のレベル
は、対照患者からの試料に結合する抗体のレベルと比較
すべきである。対照試料と比較して、ＡＤ試料における
１５０％の増加は、ＡＤ罹患症状を示すものと考えられ
る。
【００５６】ＩＶ． ｐ３３のレベルを低下する成分の
同定 我々は、ｐ３３が、対照と比較して、アルツハイマー病
患者からのＣＳＦ及び脳ホモジェネートに特異的に豊富
であることを示した。従って、ｐ３３のレベルを減少す
る化合物の投与は、アルツハイマー病の治療に有用であ
る。
同定 我々は、ｐ３３が、対照と比較して、アルツハイマー病
患者からのＣＳＦ及び脳ホモジェネートに特異的に豊富
であることを示した。従って、ｐ３３のレベルを減少す
る化合物の投与は、アルツハイマー病の治療に有用であ
る。
【００５７】ｐ３３レベルを減少する能力に対する化合
物のスクリーニングは、以下の様に遂行される。先ず、
化合物は培養細胞で検査される。次に、培養細胞で陽性
と評価された化合物は、動物モデル系で検査される。
物のスクリーニングは、以下の様に遂行される。先ず、
化合物は培養細胞で検査される。次に、培養細胞で陽性
と評価された化合物は、動物モデル系で検査される。
【００５８】細胞培養アッセイにおいて、ｐ３３を発現
する細胞（例えば、Ａ４−Ｃでトランスフェクトされた
ＰＣ１２細胞、方法については、下記の例１参照、或い
は、患者からの繊維芽細胞試料。繊維芽細胞は、各個人
より、Willers et al., Pathobiology 59:357, 1991 の
手法（本明細書に参考として採用されている）に従って
採取してもよい。又、Ham et al., In Vitro 14:11, 19
78を参照のこと。彼等は、細胞培養における繊維芽細胞
の成育法を教示している。約０．０５から０．１ｇの繊
維芽細胞が分析の遂行に必要である）が候補化合物の存
在下に培養される。細胞のｐ３３のレベルは、下記の方
法によって決定される（例１参照）。
する細胞（例えば、Ａ４−Ｃでトランスフェクトされた
ＰＣ１２細胞、方法については、下記の例１参照、或い
は、患者からの繊維芽細胞試料。繊維芽細胞は、各個人
より、Willers et al., Pathobiology 59:357, 1991 の
手法（本明細書に参考として採用されている）に従って
採取してもよい。又、Ham et al., In Vitro 14:11, 19
78を参照のこと。彼等は、細胞培養における繊維芽細胞
の成育法を教示している。約０．０５から０．１ｇの繊
維芽細胞が分析の遂行に必要である）が候補化合物の存
在下に培養される。細胞のｐ３３のレベルは、下記の方
法によって決定される（例１参照）。
【００５９】細胞培養アッセイでｐ３３レベルを減少す
ると見出だされた化合物は、更に動物モデル系で検査さ
れる。候補化合物は、ｐ３３を発現する動物に投与され
る。ｐ３３レベルに対する化合物の効果は、マウス脳の
ホモジェネートのウエスタン分析（下記の例１参照）に
よって決定される。全脳は脊椎脱臼によって殺したマウ
スから切開採取される。ホモジェネートの調製は、下記
のヒト脳ホモジェネート調製の様にして行われる（下
記、例２、又、Takeuchi et. al., Journal of Neuroch
emistry 58:1526, 1992 も参照) 。マウス脳から調製し
た薄切片の免疫染色もまたｐ３３レベルを決定するため
に行うことが出来る (Immunohistochemistry, A.C. Cue
llo, Ed., John Wiley and Sons, New York, 1983, p.
501)。
ると見出だされた化合物は、更に動物モデル系で検査さ
れる。候補化合物は、ｐ３３を発現する動物に投与され
る。ｐ３３レベルに対する化合物の効果は、マウス脳の
ホモジェネートのウエスタン分析（下記の例１参照）に
よって決定される。全脳は脊椎脱臼によって殺したマウ
スから切開採取される。ホモジェネートの調製は、下記
のヒト脳ホモジェネート調製の様にして行われる（下
記、例２、又、Takeuchi et. al., Journal of Neuroch
emistry 58:1526, 1992 も参照) 。マウス脳から調製し
た薄切片の免疫染色もまたｐ３３レベルを決定するため
に行うことが出来る (Immunohistochemistry, A.C. Cue
llo, Ed., John Wiley and Sons, New York, 1983, p.
501)。
【００６０】Ｖ．アルツハイマー病の治療における化合
物の応用 本発明は、ｐ３３のレベルを減少する化合物を確定する
方法を提供する。従って、この方法によって確定された
化合物は、患者の治療に用いることが出来る。化合物
は、特定の化合物に適当ないかなる方法、例えば、経口
的、静脈内、非経口的、経皮的、或いは経粘膜的に、患
者に投与することが出来る。治療用量は、各化合物に対
して特異的に決定される。大抵の化合物は、体重ｋｇ当
り０．００１〜１００．０ｍｇの範囲内で、或いは当業
者によって臨床的に適当と決定された範囲内で投与され
る。
物の応用 本発明は、ｐ３３のレベルを減少する化合物を確定する
方法を提供する。従って、この方法によって確定された
化合物は、患者の治療に用いることが出来る。化合物
は、特定の化合物に適当ないかなる方法、例えば、経口
的、静脈内、非経口的、経皮的、或いは経粘膜的に、患
者に投与することが出来る。治療用量は、各化合物に対
して特異的に決定される。大抵の化合物は、体重ｋｇ当
り０．００１〜１００．０ｍｇの範囲内で、或いは当業
者によって臨床的に適当と決定された範囲内で投与され
る。
【００６１】以下の諸例は、本発明の方法と構成を説明
するためのもので、これに制限することを意図するもの
ではない。他の適当な修飾変更、及び、免疫診断薬にお
いて通常遭遇する当業者には自明の種々の条件並びにパ
ラメータは本発明の思想と権利範囲に含まれる。
するためのもので、これに制限することを意図するもの
ではない。他の適当な修飾変更、及び、免疫診断薬にお
いて通常遭遇する当業者には自明の種々の条件並びにパ
ラメータは本発明の思想と権利範囲に含まれる。
【００６２】例 ［例１． ＴＣ２抗体の分離と特性決定］ ＡＰＰのペプチドＣ２（アミノ酸６４４番から６７６
番）をペプチド合成機４３０型(Applied Biosystems)で
合成して、逆相ＨＰＬＣで精製した。合成Ｃ２ペプチド
をキーホールヘモシアニン（ＫＬＨ）とグルタールアル
デヒドで共役して免疫処置に使用した。抗体は、ＩｇＧ
として精製した後、ペプチドを共役したカラムで親和精
製した (MaKinney et al., J. Immunology 96:271, 198
7)。
番）をペプチド合成機４３０型(Applied Biosystems)で
合成して、逆相ＨＰＬＣで精製した。合成Ｃ２ペプチド
をキーホールヘモシアニン（ＫＬＨ）とグルタールアル
デヒドで共役して免疫処置に使用した。抗体は、ＩｇＧ
として精製した後、ペプチドを共役したカラムで親和精
製した (MaKinney et al., J. Immunology 96:271, 198
7)。
【００６３】ＴＣ２抗体は、ウエスタンブロット分析で
特性を検討した。ＴＣ２抗体は、Ａ４−Ｃでトランスフ
ェクトされたＰＣ１２細胞から調製した溶解液（図３、
４、４、６、７及び１０参照）、Ａ４−Ｃで形質転換を
受けたマウスの脳ホモジェネート（図４）、精製ｐ３３
（図７及び１０参照）、及び精製アネキシンＶ（図１０
参照）の中にあるｐ３３ｋＤタンパク質を検出した。Ｐ
Ｃ１２細胞溶解液の調製及びウエスタンブロット分析を
以下に述べる。
特性を検討した。ＴＣ２抗体は、Ａ４−Ｃでトランスフ
ェクトされたＰＣ１２細胞から調製した溶解液（図３、
４、４、６、７及び１０参照）、Ａ４−Ｃで形質転換を
受けたマウスの脳ホモジェネート（図４）、精製ｐ３３
（図７及び１０参照）、及び精製アネキシンＶ（図１０
参照）の中にあるｐ３３ｋＤタンパク質を検出した。Ｐ
Ｃ１２細胞溶解液の調製及びウエスタンブロット分析を
以下に述べる。
【００６４】｛細胞培養とトランスフェクション｝ ＰＣ１２細胞は、５％の正常ウマ血清、５％のウシ胎児
血清（ＦＢＳ）、及び０．１ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシ
ンを補足したＤＭＥＭ中、ラット尾のコラーゲンで被覆
したポリスチレン培養皿で培養された。細胞培養は、１
０％ＣＯ2 を含む含湿気相中、３７℃で維持された。Ｐ
Ｃ１２細胞は、１％のＦＢＳ及びＩＴＳ(insulin trans
ferrin-sodium selenite medium suppplement, Sigma)
を含むＤＭＥＭ培地中、５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ(Boehr
inger Mannheim) で分化された。Ａ４−Ｃを過剰発現す
るＰＣ１２細胞は、前述の様にして生成された(Marotta
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:337, 1989)
。
血清（ＦＢＳ）、及び０．１ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシ
ンを補足したＤＭＥＭ中、ラット尾のコラーゲンで被覆
したポリスチレン培養皿で培養された。細胞培養は、１
０％ＣＯ2 を含む含湿気相中、３７℃で維持された。Ｐ
Ｃ１２細胞は、１％のＦＢＳ及びＩＴＳ(insulin trans
ferrin-sodium selenite medium suppplement, Sigma)
を含むＤＭＥＭ培地中、５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ(Boehr
inger Mannheim) で分化された。Ａ４−Ｃを過剰発現す
るＰＣ１２細胞は、前述の様にして生成された(Marotta
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:337, 1989)
。
【００６５】｛細胞溶解液の調製｝ １培養皿（１００ｍｌ）のトランスフェクトされた細胞
培養を採集し、ＴＢＳで３回洗浄した。溶解用緩衝液
［１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％（w/v)のトリトンＸ−１
００、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭの
ＰＭＳＦ、１ｍＭのベンズアミジン、２μｇ／ｍｌのロ
イペプチン及び２μＭのペプスタチンを含む２０ｍＭの
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）］を細胞ペレットに加
え、２０秒の超音波処理の後、４℃でインキュベートし
た。上清をウエスタンブロット分析にかけた。
培養を採集し、ＴＢＳで３回洗浄した。溶解用緩衝液
［１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％（w/v)のトリトンＸ−１
００、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭの
ＰＭＳＦ、１ｍＭのベンズアミジン、２μｇ／ｍｌのロ
イペプチン及び２μＭのペプスタチンを含む２０ｍＭの
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）］を細胞ペレットに加
え、２０秒の超音波処理の後、４℃でインキュベートし
た。上清をウエスタンブロット分析にかけた。
【００６６】｛ゲル電気泳動｝ウエスタンブロット分析
の試料を２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び
５％の２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）と５分
間、９５℃で前処理し、次いでLaemmli のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ(Schagger et al., Analytical Biochemistry 166:
369, 1987)で分画した。
の試料を２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び
５％の２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）と５分
間、９５℃で前処理し、次いでLaemmli のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ(Schagger et al., Analytical Biochemistry 166:
369, 1987)で分画した。
【００６７】｛ウエスタンブロット分析｝エレクトロブ
ロッティングはTowbin et al.(Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 76:4350, 1979) の方法に従い、１５％のメタノー
ル、２５ｍＭのトリス、及び１９２ｍＭのグリシン、ｐ
Ｈ８．３を含む転移緩衝液中で行われた。タンパク質
は、電気泳動により、１アンペアの定電流を２時間、４
℃でかけて、ポリビニリデンジフルオリド膜(Immobilon
-P, Millipore Corp., Bedford, MA, U.S.A.) に転移さ
れた。ブロットは、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
７．４中に２ｍＭのＥＧＴＡと０．１５ＭのＮａＣｌを
含む５％の無脂肪乾燥ミルク溶液（ブロッキング緩衝
液）と１時間、室温でインキュベートした。ブロット
は、ＴＣ２抗血清（１：７，５００）と４℃で１晩イン
キュベートしてから、アルカリホスファターゼと共役し
たヤギの抗ウサギ免疫グロブリンＧ(Promega) と５時
間、４℃でインキュベートした。ブロットを５０ｍＭの
トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、と０．１５ＭのＮａＣｌ
で数回洗浄した後、アルカリホスファターゼを標準の方
法で顕示した(Harlow et al., Antibodies, A Laborato
ry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Co
ld Spring Harbor, New York) 。
ロッティングはTowbin et al.(Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 76:4350, 1979) の方法に従い、１５％のメタノー
ル、２５ｍＭのトリス、及び１９２ｍＭのグリシン、ｐ
Ｈ８．３を含む転移緩衝液中で行われた。タンパク質
は、電気泳動により、１アンペアの定電流を２時間、４
℃でかけて、ポリビニリデンジフルオリド膜(Immobilon
-P, Millipore Corp., Bedford, MA, U.S.A.) に転移さ
れた。ブロットは、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
７．４中に２ｍＭのＥＧＴＡと０．１５ＭのＮａＣｌを
含む５％の無脂肪乾燥ミルク溶液（ブロッキング緩衝
液）と１時間、室温でインキュベートした。ブロット
は、ＴＣ２抗血清（１：７，５００）と４℃で１晩イン
キュベートしてから、アルカリホスファターゼと共役し
たヤギの抗ウサギ免疫グロブリンＧ(Promega) と５時
間、４℃でインキュベートした。ブロットを５０ｍＭの
トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、と０．１５ＭのＮａＣｌ
で数回洗浄した後、アルカリホスファターゼを標準の方
法で顕示した(Harlow et al., Antibodies, A Laborato
ry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Co
ld Spring Harbor, New York) 。
【００６８】［例２． ＴＣ２抗体はＡＤ罹患者からの
脳のホモジェネートに３３ｋＤの診断バンドを検出す
る］死後のヒトの脳は、マクリーン病院、脳組織供給セ
ンター [McLean HospitalBrain Tissue Resource Cente
r (Belmont, MA, U.S.A.; Dr. Edward Bird, directo
r)]から入手した。１０個の対照脳（平均年齢±平均値
の標準誤差＝６９．４±３．７）及び５個のアルツハイ
マー病患者からのＡＤ脳（７２．２±２．７）が用いら
れた。組織は、０．３２Ｍのスクロース、２ｍＭのＥＤ
ＴＡ、２ｍＭのＤＤＴ、１ｍＭのふっ化フェニルメチル
スルホニル、及び１ｍＭのベンズアミジンを含む１０倍
容の冷２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４（０．３
２Ｍスクロース緩衝液）中で切開した後、直ちにホモジ
ェネートにされた。ホモジェネートは、１５，０００ｇ
で３０分間、４℃で遠心分離された。上清画分（可溶性
画分）を集めてウエスタンブロット分析で検査した（図
１１（Ａ）参照）。ペレットを０．３２Ｍスクロース緩
衝液に再懸濁し、１５，０００ｇで、３０分間、４℃で
遠心分離した。上清は捨て、次いでペレット（膜画分）
をウエスタンブロット分析で検査した（図１１（Ａ）参
照）。ＴＣ２抗体を用いた可溶性及び膜画分のウエスタ
ン分析は、ヒトの脳に３３ｋＤタンパク質が存在するこ
とを明らかにし、又、対照の脳に比べ、ＡＤ脳で３３ｋ
Ｄタンパク質が、可溶性画分（１８．９％、ｐ＜０．０
５）及び膜画分（９７．７％、ｐ＜０．０１）の両方で
増加していることを示した（図１１（Ｂ）参照）。
脳のホモジェネートに３３ｋＤの診断バンドを検出す
る］死後のヒトの脳は、マクリーン病院、脳組織供給セ
ンター [McLean HospitalBrain Tissue Resource Cente
r (Belmont, MA, U.S.A.; Dr. Edward Bird, directo
r)]から入手した。１０個の対照脳（平均年齢±平均値
の標準誤差＝６９．４±３．７）及び５個のアルツハイ
マー病患者からのＡＤ脳（７２．２±２．７）が用いら
れた。組織は、０．３２Ｍのスクロース、２ｍＭのＥＤ
ＴＡ、２ｍＭのＤＤＴ、１ｍＭのふっ化フェニルメチル
スルホニル、及び１ｍＭのベンズアミジンを含む１０倍
容の冷２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４（０．３
２Ｍスクロース緩衝液）中で切開した後、直ちにホモジ
ェネートにされた。ホモジェネートは、１５，０００ｇ
で３０分間、４℃で遠心分離された。上清画分（可溶性
画分）を集めてウエスタンブロット分析で検査した（図
１１（Ａ）参照）。ペレットを０．３２Ｍスクロース緩
衝液に再懸濁し、１５，０００ｇで、３０分間、４℃で
遠心分離した。上清は捨て、次いでペレット（膜画分）
をウエスタンブロット分析で検査した（図１１（Ａ）参
照）。ＴＣ２抗体を用いた可溶性及び膜画分のウエスタ
ン分析は、ヒトの脳に３３ｋＤタンパク質が存在するこ
とを明らかにし、又、対照の脳に比べ、ＡＤ脳で３３ｋ
Ｄタンパク質が、可溶性画分（１８．９％、ｐ＜０．０
５）及び膜画分（９７．７％、ｐ＜０．０１）の両方で
増加していることを示した（図１１（Ｂ）参照）。
【００６９】［例３． ＴＣ２はＡＤ患者の脳室性ＣＳ
Ｆ中の３３ｋＤタンパク質を特異的に検出する］脳室性
ＣＳＦは、ＡＤ（患者番号、Ｂ１３３８）及び対照（患
者番号、１５３３）患者から標準方法で採取された (Th
e Merck Manual 12th ED. D.N. Holvey,Ed., Merck Sha
rp and Dohme Res. Labs Publishing, New Jersey, 197
2, pp 1746-1748) 。患者Ｂ１３３８の死後切開薄片
は、老人班、及び前前頭皮質(anterior frontal corte
x) 、後前頭皮質(posterior frontal cortex)、側頭壁
皮質(parietal cortex) 、後頭皮質(occipital corte
x)、海馬、尾状核、被穀(putamen) 、accumbens 、及び
扁桃の神経繊維変形、並びに、被穀及び淡蒼球(globus
pallidus) の老人班と原形老人班(protoplaque) の存在
を示した。ＡＤ及び対照患者からの脳室性ＣＳＦを１０
倍濃縮して夫々、タンパク質濃度２．８ｍｇ／ｍｌ及び
１．０４ｍｇ／ｍｌとした（タンパク質濃度は、Bradfo
rd, Analytical Biochemistry 72:248, 1976の方法によ
り決定した) 。各試料の７０μｌを４〜１２％の勾配の
ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥ(Laemmli, Nature 227:680,
1970) により分画した。ウエスタンブロット分析は例１
に記載の様にして行われた（図１２参照）。ＡＤのＣＳ
Ｆ中にＴＣ２によって検出された３３ｋＤタンパク質の
レベルは、対照のＣＳＦ中よりも３００％高かった。
Ｆ中の３３ｋＤタンパク質を特異的に検出する］脳室性
ＣＳＦは、ＡＤ（患者番号、Ｂ１３３８）及び対照（患
者番号、１５３３）患者から標準方法で採取された (Th
e Merck Manual 12th ED. D.N. Holvey,Ed., Merck Sha
rp and Dohme Res. Labs Publishing, New Jersey, 197
2, pp 1746-1748) 。患者Ｂ１３３８の死後切開薄片
は、老人班、及び前前頭皮質(anterior frontal corte
x) 、後前頭皮質(posterior frontal cortex)、側頭壁
皮質(parietal cortex) 、後頭皮質(occipital corte
x)、海馬、尾状核、被穀(putamen) 、accumbens 、及び
扁桃の神経繊維変形、並びに、被穀及び淡蒼球(globus
pallidus) の老人班と原形老人班(protoplaque) の存在
を示した。ＡＤ及び対照患者からの脳室性ＣＳＦを１０
倍濃縮して夫々、タンパク質濃度２．８ｍｇ／ｍｌ及び
１．０４ｍｇ／ｍｌとした（タンパク質濃度は、Bradfo
rd, Analytical Biochemistry 72:248, 1976の方法によ
り決定した) 。各試料の７０μｌを４〜１２％の勾配の
ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥ(Laemmli, Nature 227:680,
1970) により分画した。ウエスタンブロット分析は例１
に記載の様にして行われた（図１２参照）。ＡＤのＣＳ
Ｆ中にＴＣ２によって検出された３３ｋＤタンパク質の
レベルは、対照のＣＳＦ中よりも３００％高かった。
【００７０】［例４． アネキシンＶ抗体（４４３１）
はＡＤ患者からの脳室性ＣＳＦ中の３３ｋＤタンパク質
を特異的に検出する］アネキシン抗体による脳室性ＣＳ
Ｆの分析は、ブロットをＴＣ２の代わりに抗体４４３１
とインキュベートすること以外は、例３に記載の方法に
より行われた（図１２参照）。ＡＤのＣＳＦ中で抗体４
４３１によって検出された３３ｋＤタンパク質のレベル
は、対照のＣＳＦ中よりも２００％高かった。
はＡＤ患者からの脳室性ＣＳＦ中の３３ｋＤタンパク質
を特異的に検出する］アネキシン抗体による脳室性ＣＳ
Ｆの分析は、ブロットをＴＣ２の代わりに抗体４４３１
とインキュベートすること以外は、例３に記載の方法に
より行われた（図１２参照）。ＡＤのＣＳＦ中で抗体４
４３１によって検出された３３ｋＤタンパク質のレベル
は、対照のＣＳＦ中よりも２００％高かった。
【００７１】［他の例］従って、上記の特例は単に本開
示の説明のためのものと解釈されるべきで、本開示の残
余の部分に何ら制限を加えるものではない。
示の説明のためのものと解釈されるべきで、本開示の残
余の部分に何ら制限を加えるものではない。
【００７２】前記述により、当業者は本発明の本質的な
特性を容易に把握し、本発明の精神と領域から逸脱する
ことなく、本発明の種々の変更と修飾を行い、様々な利
用と条件に適用することが出来る。本文に引用されたす
べての文献は、そのまま完全に本文に参考として採用さ
れている。
特性を容易に把握し、本発明の精神と領域から逸脱する
ことなく、本発明の種々の変更と修飾を行い、様々な利
用と条件に適用することが出来る。本文に引用されたす
べての文献は、そのまま完全に本文に参考として採用さ
れている。
【００７３】他の例は、特許請求の範囲に記載されてい
る。
る。
【図１】ＡＰＰ及びＡ４−Ｃペプチドの概略図であり、
抗体が生成された対象であるＡＰＰ内のペプチド部分が
提示されている図である。
抗体が生成された対象であるＡＰＰ内のペプチド部分が
提示されている図である。
【図２】５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦの非存在下（パネルＡ
とＣ）、或いは存在下（パネルＢとＤ）に７日間培養さ
れたＡ４−Ｃを発現しているＰＣ１２細胞（パネルＡと
Ｂ）、及び標準対象のＰＣ１２細胞（パネルＣとＤ）の
位相差顕微鏡写真を表すす図である。
とＣ）、或いは存在下（パネルＢとＤ）に７日間培養さ
れたＡ４−Ｃを発現しているＰＣ１２細胞（パネルＡと
Ｂ）、及び標準対象のＰＣ１２細胞（パネルＣとＤ）の
位相差顕微鏡写真を表すす図である。
【図３】標準対象のＰＣ１２細胞（レイン１）、及びＡ
４−Ｃを発現しているＰＣ１２細胞（レイン２と３）か
ら得られた細胞溶解液をＡ４（パネルＡ）及びＴＣ２
（パネルＢ）抗体で探索したイムノブロットを表す図で
ある。
４−Ｃを発現しているＰＣ１２細胞（レイン２と３）か
ら得られた細胞溶解液をＡ４（パネルＡ）及びＴＣ２
（パネルＢ）抗体で探索したイムノブロットを表す図で
ある。
【図４】Ａ４−Ｃでトランスフェクトされた、及び標準
対照であるＰＣ−１２細胞の溶解液、並びに、Ａ４−Ｃ
形質転換遺伝子を持つ、及び標準対照のマウスの脳ホモ
ジェネートをＴＣ２で探索したイムノブロットを表す図
である。
対照であるＰＣ−１２細胞の溶解液、並びに、Ａ４−Ｃ
形質転換遺伝子を持つ、及び標準対照のマウスの脳ホモ
ジェネートをＴＣ２で探索したイムノブロットを表す図
である。
【図５】ＣＮＢｒ切断前後の精製ｐ３３ｋＤタンパク質
のイムノブロットを表す図である。ブロットは、提示さ
れている抗体で探索されたものである。
のイムノブロットを表す図である。ブロットは、提示さ
れている抗体で探索されたものである。
【図６】３３ｋＤタンパク質のグリコシル化の分析結果
を示す図である。
を示す図である。
【図７】３３ｋＤタンパク質の精製度を示すクーマシー
染色、及びイムノブロット分析（ＴＣ２プローブによ
る）の結果を示す図である。
染色、及びイムノブロット分析（ＴＣ２プローブによ
る）の結果を示す図である。
【図８】トランスフェクトされた細胞の溶解液から精製
された３３ｋＤタンパク質のＮ末端配列分析の概略図で
ある。
された３３ｋＤタンパク質のＮ末端配列分析の概略図で
ある。
【図９】ラットのアネキシンＶの配列を示す図である。
リシルエンドペプチダーゼで切断された３３ｋＤタンパ
ク質から配列決定されたペプチドは下線を引かれ、太字
で示されている。
リシルエンドペプチダーゼで切断された３３ｋＤタンパ
ク質から配列決定されたペプチドは下線を引かれ、太字
で示されている。
【図１０】標準対照の、及びＡ４−Ｃでトランスフェク
トされたＰＣ１２細胞の溶解液、インビトロで翻訳され
たＡ４−Ｃ、バキュロウイルスで生成されたＡ４−Ｃ、
精製３３ｋＤタンパク質、及び精製アネキシンＶのイム
ノブロットを表す図である。ブロットは、Ｃ８、ＴＣ
２、及びアネキシンＶ抗体で探索されたものである。
トされたＰＣ１２細胞の溶解液、インビトロで翻訳され
たＡ４−Ｃ、バキュロウイルスで生成されたＡ４−Ｃ、
精製３３ｋＤタンパク質、及び精製アネキシンＶのイム
ノブロットを表す図である。ブロットは、Ｃ８、ＴＣ
２、及びアネキシンＶ抗体で探索されたものである。
【図１１】図１１（Ａ）は、標準対照の、及びＡＤのヒ
トの脳から調製されたホモジェネートの可溶性、並びに
膜画分のイムノブロットを表す図である。ブロットはＴ
Ｃ２で探索された。図１１（Ｂ）は、８Ａで検出された
３３ｋＤタンパク質の定量の概略図である。
トの脳から調製されたホモジェネートの可溶性、並びに
膜画分のイムノブロットを表す図である。ブロットはＴ
Ｃ２で探索された。図１１（Ｂ）は、８Ａで検出された
３３ｋＤタンパク質の定量の概略図である。
【図１２】ＴＣ２、及びアネキシンＶに対する抗体（４
４３１）で探索された脳室性ＣＳＦのイムノブロットを
表す図である。
４３１）で探索された脳室性ＣＳＦのイムノブロットを
表す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年１月３１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】これらの方法は、アルツハイマー病診断の
目的に対し、患者から得られた腰椎性ＣＳＦ、脳室性Ｃ
ＳＦ、脳組織ホモジェネート、或いは脳薄切片を含む、
これに限定されないが、生物学的試料に存在するｐ３３
の検出を可能にする。腰椎性ＣＳＦの分析は、生きてい
る患者から得られた試料を用いて施行可能であるので特
に有用である。これまでは、生きている患者でＡＤを検
出する診断法はなかった。
目的に対し、患者から得られた腰椎性ＣＳＦ、脳室性Ｃ
ＳＦ、脳組織ホモジェネート、或いは脳薄切片を含む、
これに限定されないが、生物学的試料に存在するｐ３３
の検出を可能にする。腰椎性ＣＳＦの分析は、生きてい
る患者から得られた試料を用いて施行可能であるので特
に有用である。これまでは、生きている患者でＡＤを検
出する診断法はなかった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】ここに用いられている様に、“実質的に純
粋”という術語は、ある化合物、例えば、タンパク質或
いはポリペプチド、例えば、ｐ３３タンパク質或いはそ
の断片、或いはＡＰＰのＣ２ペプチドが、天然ではそれ
に付随している諸成分から分離されていることを表現す
るものである。一般的に、試料中の全物質の少なくとも
１０％、さらに好適には少なくとも２０％、さらに好適
には少なくとも５０％、さらに好適には少なくとも６０
％、さらに好適には少なくとも７５％、さらに好適には
少なくとも９０％、及び最も好適には少なくとも９９％
が（容量、湿重量或いは乾重量、或いはモルパーセント
或いはモル分率上）所期の化合物である場合に、ある化
合物は実質的に純粋である。純度は、何らかの適切な方
法、例えば、ポリペプチドの場合は、カラムクロマトグ
ラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、或いはＨ
ＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）分析によって
測定することが出来る。ある化合物も又、例えば、ある
タンパク質は、それが天然では付随している成分を本質
的に含まない場合、或いは、自然の状態ではそれに付随
している天然の汚染物質から分離されている場合、本質
的に純粋にされている。
粋”という術語は、ある化合物、例えば、タンパク質或
いはポリペプチド、例えば、ｐ３３タンパク質或いはそ
の断片、或いはＡＰＰのＣ２ペプチドが、天然ではそれ
に付随している諸成分から分離されていることを表現す
るものである。一般的に、試料中の全物質の少なくとも
１０％、さらに好適には少なくとも２０％、さらに好適
には少なくとも５０％、さらに好適には少なくとも６０
％、さらに好適には少なくとも７５％、さらに好適には
少なくとも９０％、及び最も好適には少なくとも９９％
が（容量、湿重量或いは乾重量、或いはモルパーセント
或いはモル分率上）所期の化合物である場合に、ある化
合物は実質的に純粋である。純度は、何らかの適切な方
法、例えば、ポリペプチドの場合は、カラムクロマトグ
ラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、或いはＨ
ＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）分析によって
測定することが出来る。ある化合物も又、例えば、ある
タンパク質は、それが天然では付随している成分を本質
的に含まない場合、或いは、自然の状態ではそれに付随
している天然の汚染物質から分離されている場合、本質
的に純粋にされている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４１】また、大量の所期の単クローン性抗体は、
インビボで、ハイブリドーマ細胞を増殖して得ることが
出来る。この目的のため、抗体産生ハイブリドーマを同
系の哺乳動物の腹腔内に接種して、１乃至３週間後、こ
れらの哺乳動物の腹水液から分離される。例えば、ＣＤ
−１マウス起源のハイブリッド細胞は、腹腔からの液の
滲出を防止するため、予め２，６，１０，１４−テトラ
メチルペンタデカン［プリスタン（pristane) ] の様な
炭化水素を腹腔内に注射して前処置をしたＣＤ−１マウ
スの腹腔内に注射することが出来、８乃至１０日後、腹
水がこれらの動物から採取される。
インビボで、ハイブリドーマ細胞を増殖して得ることが
出来る。この目的のため、抗体産生ハイブリドーマを同
系の哺乳動物の腹腔内に接種して、１乃至３週間後、こ
れらの哺乳動物の腹水液から分離される。例えば、ＣＤ
−１マウス起源のハイブリッド細胞は、腹腔からの液の
滲出を防止するため、予め２，６，１０，１４−テトラ
メチルペンタデカン［プリスタン（pristane) ] の様な
炭化水素を腹腔内に注射して前処置をしたＣＤ−１マウ
スの腹腔内に注射することが出来、８乃至１０日後、腹
水がこれらの動物から採取される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＰＰ及びＡ４−Ｃペプチドの概略図であり、
抗体が生成された対象であるＡＰＰ内のペプチド部分が
提示されている図である。図中（Ａ）は、このポスター
に使用された抗体が認識するＡＰＰ上の領域。Ａ２８と
ＴＡ１； Ａ４（１−２８）、Ａ１７； Ａ４（１２−
２８）、Ａ４；Ａ４（１−４０）、ＴＣ２； ＡＰＰ
（６４４−６７６）とＣ８； ＡＰＰ（６７６−６９
５）。（Ｂ）と（Ｃ）は、夫々、トランスフェクトされ
たＰＣ１２細胞及び形質転換マウスに発現されたＡ４−
Ｃ断片。斜線をほどこした横棒はベクター由来の配列を
示す。
抗体が生成された対象であるＡＰＰ内のペプチド部分が
提示されている図である。図中（Ａ）は、このポスター
に使用された抗体が認識するＡＰＰ上の領域。Ａ２８と
ＴＡ１； Ａ４（１−２８）、Ａ１７； Ａ４（１２−
２８）、Ａ４；Ａ４（１−４０）、ＴＣ２； ＡＰＰ
（６４４−６７６）とＣ８； ＡＰＰ（６７６−６９
５）。（Ｂ）と（Ｃ）は、夫々、トランスフェクトされ
たＰＣ１２細胞及び形質転換マウスに発現されたＡ４−
Ｃ断片。斜線をほどこした横棒はベクター由来の配列を
示す。
【図２】５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦの非存在下（パネルＡ
とＣ）、或いは存在下（パネルＢとＤ）に７日間培養さ
れたＡ４−Ｃを発現しているＰＣ１２細胞（パネルＡと
Ｂ）、及び標準対象のＰＣ１２細胞（パネルＣとＤ）の
位相差顕微鏡写真である。
とＣ）、或いは存在下（パネルＢとＤ）に７日間培養さ
れたＡ４−Ｃを発現しているＰＣ１２細胞（パネルＡと
Ｂ）、及び標準対象のＰＣ１２細胞（パネルＣとＤ）の
位相差顕微鏡写真である。
【図３】標準対象のＰＣ１２細胞（レイン１）、及びＡ
４−Ｃを発現しているＰＣ１２細胞（レイン２と３）か
ら得られた細胞溶解液をＡ４（パネルＡ）及びＴＣ２
（パネルＢ）抗体で探索したイムノブロットを表す電気
ゲル泳動の写真である。対照ＰＣ１２細胞（レイン１）
及び２つのトランスフェクトされた細胞系（２と３）が
ウエスタンブロットで分析された。（Ａ）抗アミロイド
抗体(BoehringerMannheim) 及び（Ｂ）ＡＰＰ６４４−
６７５に対するＴＣ２抗体が用いられた。Ａ４−Ｃでト
ランスフェクトされた２つの細胞系が１６ｋＤタンパク
質を過剰発現してアミロイド抗体で染色された。ＴＣ抗
体はトランスフェクトされた細胞の溶解液中の３３ｋＤ
タンパク質を染色した。矢印は１６ｋＤと３３ｋＤのバ
ンドを示す。
４−Ｃを発現しているＰＣ１２細胞（レイン２と３）か
ら得られた細胞溶解液をＡ４（パネルＡ）及びＴＣ２
（パネルＢ）抗体で探索したイムノブロットを表す電気
ゲル泳動の写真である。対照ＰＣ１２細胞（レイン１）
及び２つのトランスフェクトされた細胞系（２と３）が
ウエスタンブロットで分析された。（Ａ）抗アミロイド
抗体(BoehringerMannheim) 及び（Ｂ）ＡＰＰ６４４−
６７５に対するＴＣ２抗体が用いられた。Ａ４−Ｃでト
ランスフェクトされた２つの細胞系が１６ｋＤタンパク
質を過剰発現してアミロイド抗体で染色された。ＴＣ抗
体はトランスフェクトされた細胞の溶解液中の３３ｋＤ
タンパク質を染色した。矢印は１６ｋＤと３３ｋＤのバ
ンドを示す。
【図４】Ａ４−Ｃでトランスフェクトされた、及び標準
対照であるＰＣ−１２細胞の溶解液、並びに、Ａ４−Ｃ
形質転換遺伝子を持つ、及び標準対照のマウスの脳ホモ
ジェネートをＴＣ２で探索したイムノブロットを表す電
気ゲル泳動の写真である。対照ＰＣ１２細胞とトランス
フェクトされた細胞の溶解液（左、４本のレイン）、及
び対照マウスと形質転換されたマウスの脳ホモジェネー
トが（右、４本のレイン）ＴＣ２抗体を用いるウエスタ
ンブロットで分析された。３３ｋＤタンパク質（矢印で
示された）は主にトランスフェクトされた細胞の溶解液
及び形質転換されたマウスの脳ホモジェネートに存在し
た。合成ペプチドＣ２による前吸収処理はこの染色を減
少した（Ａｂｓ）。
対照であるＰＣ−１２細胞の溶解液、並びに、Ａ４−Ｃ
形質転換遺伝子を持つ、及び標準対照のマウスの脳ホモ
ジェネートをＴＣ２で探索したイムノブロットを表す電
気ゲル泳動の写真である。対照ＰＣ１２細胞とトランス
フェクトされた細胞の溶解液（左、４本のレイン）、及
び対照マウスと形質転換されたマウスの脳ホモジェネー
トが（右、４本のレイン）ＴＣ２抗体を用いるウエスタ
ンブロットで分析された。３３ｋＤタンパク質（矢印で
示された）は主にトランスフェクトされた細胞の溶解液
及び形質転換されたマウスの脳ホモジェネートに存在し
た。合成ペプチドＣ２による前吸収処理はこの染色を減
少した（Ａｂｓ）。
【図５】ＣＮＢｒ切断前後の精製ｐ３３ｋＤタンパク質
のイムノブロットを表す電気ゲル泳動の写真である。ブ
ロットは、提示されている抗体で探索されたものであ
る。３３ｋＤタンパク質がゲル中でＣＮＢｒで切断さ
れ、ウエスタンブロットで再分析された。未処理の３３
ｋＤタンパク質（前）及び切断された３３ｋＤタンパク
質（後）を４種の抗体、ＴＣ２、ＴＡ１、Ａ１７並びに
Ａ２８で染色処理した。タンパク質は１２％のトリス−
トリシンＰＡＧＥにより分画され、ＰＶＤＦ膜に転移さ
れた。ＣＮＢｒ切断後、３３ｋＤタンパク質は全く染色
されなかったが、一方、より小分子の２１ｋＤバンド
は、ＡＰＰのアミロイド領域に対する２種の抗体（ＴＡ
１及びＡ１７）で染色された。これらの結果は、３３ｋ
Ｄタンパク質がアミロイド領域を含むことを示した。矢
印は３３、２１及び１４ｋＤバンドを示す。
のイムノブロットを表す電気ゲル泳動の写真である。ブ
ロットは、提示されている抗体で探索されたものであ
る。３３ｋＤタンパク質がゲル中でＣＮＢｒで切断さ
れ、ウエスタンブロットで再分析された。未処理の３３
ｋＤタンパク質（前）及び切断された３３ｋＤタンパク
質（後）を４種の抗体、ＴＣ２、ＴＡ１、Ａ１７並びに
Ａ２８で染色処理した。タンパク質は１２％のトリス−
トリシンＰＡＧＥにより分画され、ＰＶＤＦ膜に転移さ
れた。ＣＮＢｒ切断後、３３ｋＤタンパク質は全く染色
されなかったが、一方、より小分子の２１ｋＤバンド
は、ＡＰＰのアミロイド領域に対する２種の抗体（ＴＡ
１及びＡ１７）で染色された。これらの結果は、３３ｋ
Ｄタンパク質がアミロイド領域を含むことを示した。矢
印は３３、２１及び１４ｋＤバンドを示す。
【図６】３３ｋＤタンパク質のグリコシル化の分析結果
を示す電気ゲル泳動の写真である。Ａ４Ｃ上には共通の
Ｎ−グリコシル化部位は存在しないが、グリコシル化の
可能性を検討した。グリコシル化の分析はＤＩＧグリカ
ン検出キット(BoehringerMnnheim)）によって行われた
（左）。３３ｋＤタンパク質にはグリコシル化のシグナ
ルは検出されなかったが、トランスフェリン（ＴＦ、陽
性対照）上のグリコシル化は、０．１μｇの少量のタン
パク質にも常に検出された。細菌に発現されたクレアテ
ィナーゼ（ＮＣ）が陰性対照として用いられた。ＴＦ；
トランスフェリン（０．１μｇ、陽性対照）及びＮＣ；
E. coli に産生されたクレアティナーゼ（０．５μｇ、
陰性対照）。レイン１から３は、夫々、トランスフェク
トされた細胞、形質転換されたマウスの脳、及びヒトの
脳からの精製３３ｋＤタンパク質である。矢印は３３ｋ
Ｄタンパク質の位置を示す。
を示す電気ゲル泳動の写真である。Ａ４Ｃ上には共通の
Ｎ−グリコシル化部位は存在しないが、グリコシル化の
可能性を検討した。グリコシル化の分析はＤＩＧグリカ
ン検出キット(BoehringerMnnheim)）によって行われた
（左）。３３ｋＤタンパク質にはグリコシル化のシグナ
ルは検出されなかったが、トランスフェリン（ＴＦ、陽
性対照）上のグリコシル化は、０．１μｇの少量のタン
パク質にも常に検出された。細菌に発現されたクレアテ
ィナーゼ（ＮＣ）が陰性対照として用いられた。ＴＦ；
トランスフェリン（０．１μｇ、陽性対照）及びＮＣ；
E. coli に産生されたクレアティナーゼ（０．５μｇ、
陰性対照）。レイン１から３は、夫々、トランスフェク
トされた細胞、形質転換されたマウスの脳、及びヒトの
脳からの精製３３ｋＤタンパク質である。矢印は３３ｋ
Ｄタンパク質の位置を示す。
【図７】３３ｋＤタンパク質の精製度を示すクーマシー
染色、及びイムノブロット分析（ＴＣ２プローブによ
る）の結果を示す電気ゲル泳動の写真である。３３ｋＤ
タンパク質はトランスフェクトされたタンパク質から精
製された。トランスフェクトされた細胞の全溶解液、Ｑ
−セファロースカラムからの溶出液、及びフェニルセフ
ァロースカラムからの素通り液がＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
析された。タンパク質はＣＢＢで染色された。ウエスタ
ンブロットはＴＣ２抗体で染色された。
染色、及びイムノブロット分析（ＴＣ２プローブによ
る）の結果を示す電気ゲル泳動の写真である。３３ｋＤ
タンパク質はトランスフェクトされたタンパク質から精
製された。トランスフェクトされた細胞の全溶解液、Ｑ
−セファロースカラムからの溶出液、及びフェニルセフ
ァロースカラムからの素通り液がＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
析された。タンパク質はＣＢＢで染色された。ウエスタ
ンブロットはＴＣ２抗体で染色された。
【図８】トランスフェクトされた細胞の溶解液から精製
された３３ｋＤタンパク質のＮ末端配列分析の概略図で
ある。トランスフェクトされた細胞の溶解液から精製さ
れた３３ｋＤタンパク質のＮ末端の配列決定がされた。
各サイクル毎に２つのＰＴＨアミノ酸が検出され、この
画分が少なくとも２つのペプチドを含むことを示唆し
た。これらの配列は、推定形質転換遺伝子の産物のＮ末
端に一致した。これらの配列は、内在性ＡＰＰの配列と
は異なったので、これらのペプチドは形質転換転換遺伝
子の産物に由来することが確認された。
された３３ｋＤタンパク質のＮ末端配列分析の概略図で
ある。トランスフェクトされた細胞の溶解液から精製さ
れた３３ｋＤタンパク質のＮ末端の配列決定がされた。
各サイクル毎に２つのＰＴＨアミノ酸が検出され、この
画分が少なくとも２つのペプチドを含むことを示唆し
た。これらの配列は、推定形質転換遺伝子の産物のＮ末
端に一致した。これらの配列は、内在性ＡＰＰの配列と
は異なったので、これらのペプチドは形質転換転換遺伝
子の産物に由来することが確認された。
【図９】ラットのアネキシンＶの配列を示す図である。
リシルエンドペプチダーゼで切断された３３ｋＤタンパ
ク質から配列決定されたペプチドは下線を引かれ、太字
で示されている。精製３３ｋＤタンパク質をリシルエン
ドペプチダーゼで消化した後、内部配列が分析された。
下線を付けた４つのペプチドの配列が決定された。
リシルエンドペプチダーゼで切断された３３ｋＤタンパ
ク質から配列決定されたペプチドは下線を引かれ、太字
で示されている。精製３３ｋＤタンパク質をリシルエン
ドペプチダーゼで消化した後、内部配列が分析された。
下線を付けた４つのペプチドの配列が決定された。
【図１０】標準対照の、及びＡ４−Ｃでトランスフェク
トされたＰＣ１２細胞の溶解液、インビトロで翻訳され
たＡ４−Ｃ、バキュロウイルスで生成されたＡ４−Ｃ、
精製３３ｋＤタンパク質、及び精製アネキシンＶのイム
ノブロットを表す電気ゲル泳動の写真である。ブロット
は、Ｃ８、ＴＣ２、及びアネキシンＶ抗体で探索された
ものである。対照ＰＣ１２細胞（１）及び２種のトラン
スフェクトされた細胞系（２と３）、インビトロ系で翻
訳されたＡ４−Ｃ断片（４）、バキュロウイルス系で合
成されたＡ４−Ｃ断片（５）、精製ｐ３３ｋＤタンパク
質（６）、及び精製アネキシンＶ（７）がウエスタンブ
ロットで分析された。（Ａ）Ｃ８、（Ｂ）ＴＣ２、なら
びに（Ｃ）アネキシンＶ抗体が使用された。ＴＣ２抗体
はインビトロの翻訳系で合成された１６ｋＤのＡ４−Ｃ
タンパク質を殆ど認識しなかったが、３３ｋＤバンドを
染色した。トランスフェクトされた細胞から精製された
３３ｋＤタンパク質はＴＣ２及びアネキシンＶ抗体で染
色された。精製アネキシンＶはＴＣ２抗体で染色された
が、Ｃ８抗体ではされなかった。
トされたＰＣ１２細胞の溶解液、インビトロで翻訳され
たＡ４−Ｃ、バキュロウイルスで生成されたＡ４−Ｃ、
精製３３ｋＤタンパク質、及び精製アネキシンＶのイム
ノブロットを表す電気ゲル泳動の写真である。ブロット
は、Ｃ８、ＴＣ２、及びアネキシンＶ抗体で探索された
ものである。対照ＰＣ１２細胞（１）及び２種のトラン
スフェクトされた細胞系（２と３）、インビトロ系で翻
訳されたＡ４−Ｃ断片（４）、バキュロウイルス系で合
成されたＡ４−Ｃ断片（５）、精製ｐ３３ｋＤタンパク
質（６）、及び精製アネキシンＶ（７）がウエスタンブ
ロットで分析された。（Ａ）Ｃ８、（Ｂ）ＴＣ２、なら
びに（Ｃ）アネキシンＶ抗体が使用された。ＴＣ２抗体
はインビトロの翻訳系で合成された１６ｋＤのＡ４−Ｃ
タンパク質を殆ど認識しなかったが、３３ｋＤバンドを
染色した。トランスフェクトされた細胞から精製された
３３ｋＤタンパク質はＴＣ２及びアネキシンＶ抗体で染
色された。精製アネキシンＶはＴＣ２抗体で染色された
が、Ｃ８抗体ではされなかった。
【図１１】図１１（Ａ）は、標準対照の、及びＡＤのヒ
トの脳から調製されたホモジェネートの可溶性、並びに
膜画分のイムノブロットを表す電気ゲル泳動の写真であ
る。ブロットはＴＣ２で探索された。図１１（Ｂ）は、
８Ａで検出された３３ｋＤタンパク質の定量の概略図で
ある。１０個の対照者（平均年齢±平均値の標準誤差＝
６９．４±３．７）と５個のＡＤ患者（７２．２±２．
７）からの脳が用いられた。（Ａ）可溶性及び不溶性画
分がＴＣ２抗体を用いウエスタンブロットで分析され
た。（Ｂ）３３ｋＤタンパク質の量は、ウエスタンブロ
ット後、定量された。対照の脳においては、３３ｋＤは
主として可溶性画分に存在した。しかしながら、３３ｋ
Ｄタンパク質の量は、ＡＤ脳において、可溶性（ｐ＜
０．０５、スチュ−デント ｔ−検定）ならびにペレッ
ト画分（ｐ＜０．００５）の両方で著明に増大した。数
値は対照可溶性画分中の量に基準化して示された。
トの脳から調製されたホモジェネートの可溶性、並びに
膜画分のイムノブロットを表す電気ゲル泳動の写真であ
る。ブロットはＴＣ２で探索された。図１１（Ｂ）は、
８Ａで検出された３３ｋＤタンパク質の定量の概略図で
ある。１０個の対照者（平均年齢±平均値の標準誤差＝
６９．４±３．７）と５個のＡＤ患者（７２．２±２．
７）からの脳が用いられた。（Ａ）可溶性及び不溶性画
分がＴＣ２抗体を用いウエスタンブロットで分析され
た。（Ｂ）３３ｋＤタンパク質の量は、ウエスタンブロ
ット後、定量された。対照の脳においては、３３ｋＤは
主として可溶性画分に存在した。しかしながら、３３ｋ
Ｄタンパク質の量は、ＡＤ脳において、可溶性（ｐ＜
０．０５、スチュ−デント ｔ−検定）ならびにペレッ
ト画分（ｐ＜０．００５）の両方で著明に増大した。数
値は対照可溶性画分中の量に基準化して示された。
【図１２】ＴＣ２、及びアネキシンＶに対する抗体（４
４３１）で探索された脳室性ＣＳＦのイムノブロットを
表す電気ゲル泳動の写真である。この実験は、抗アネキ
シンＶ及びＴＣ−２抗体が共にＡＤ患者並びに対照者か
らの脳室性ＣＳＦ中のｐ３３を染色することを示す。 ─────────────────────────────────────────────────────
４３１）で探索された脳室性ＣＳＦのイムノブロットを
表す電気ゲル泳動の写真である。この実験は、抗アネキ
シンＶ及びＴＣ−２抗体が共にＡＤ患者並びに対照者か
らの脳室性ＣＳＦ中のｐ３３を染色することを示す。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年１月３１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図１１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ // Ａ６１Ｂ 10/00 Ｈ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (24)
- 【請求項１】 ヒト患者におけるアルツハイマー病を診
断する方法であって、当該患者の生物学的試料中のｐ３
３の量を測定して非罹患者からの対照試料と比較し、当
該ヒト患者における上記ｐ３３の相対的レベルが前記対
照試料より５０％高い場合、アルツハイマー病の診断を
示唆する方法からなることを特徴とする。 - 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、前記測
定はイムノアッセイを利用し、当該イムノアッセイは、
上記ｐ３３をｐ３３結合能を持つ抗体と接触させ、上記
結合を測定することからなることを特徴とする。 - 【請求項３】 請求項１に記載の方法であって、当該生
物学的試料が前記患者の腰椎性ＣＳＦ（脳脊髄液）であ
ることを特徴とする。 - 【請求項４】 請求項１に記載の方法であって、当該生
物学的試料が前記患者の脳室性ＣＳＦであることを特徴
とする。 - 【請求項５】 請求項１に記載の方法であって、当該生
物学的試料が前記患者の脳組織のホモジェネートである
ことを特徴とする。 - 【請求項６】 請求項１に記載の方法であって、当該生
物学的試料が前記患者の脳組織の薄切片であることを特
徴とする。 - 【請求項７】 請求項２に記載の方法であって、当該接
触がウエスタンブロット分析によることを特徴とする。 - 【請求項８】 請求項６に記載の方法であって、当該接
触が免疫染色であることを特徴とする。 - 【請求項９】 請求項２に記載の方法であって、当該抗
体がＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）のアミノ酸
６４４番〜６７６番からなるペプチドを認識することを
特徴とする。 - 【請求項１０】 請求項９に記載の方法であって、当該
抗体がＴＣ２であることを特徴とする。 - 【請求項１１】 請求項２に記載の方法であって、当該
抗体がアネキシンＶ或いはその断片を認識することを特
徴とする。 - 【請求項１２】 請求項１１に記載の方法であって、当
該抗体が４４３１であることを特徴とする。 - 【請求項１３】 本質的に純粋なｐ３３及びその断片を
特徴とする。 - 【請求項１４】 本質的に純粋なペプチドがＡＰＰのア
ミノ酸６４４番〜６７６番からなることを特徴とする。 - 【請求項１５】 ｐ３３を特異的に認識する抗体を生成
する方法であって、当該方法が、 （ａ）哺乳動物をｐ３３で免疫して、 （ｂ）前記哺乳動物からｐ３３に対する結合能を持つ上
記抗体を精製することからなることを特徴とする。 - 【請求項１６】 ｐ３３を特異的に認識する抗体を生成
する方法であって、 当該方法が、 （ａ）哺乳動物をＡＰＰのＣ２断片で免疫して、 （ｂ）前記哺乳動物からｐ３３に対する結合能を持つ上
記抗体を精製することからなることを特徴とする。 - 【請求項１７】 アルツハイマー病のインビトロ診断キ
ットであって、当該キットがｐ３３を特異的に結合する
能力を持つ抗体を含むことを特徴とする。 - 【請求項１８】 請求項１７に記載のキットであって、
当該抗体がＡＰＰのアミノ酸６４４番から６７６番を認
識することを特徴とする。 - 【請求項１９】 請求項１８に記載のキットであって、
当該抗体がＴＣ２であることを特徴とする。 - 【請求項２０】 請求項１７に記載のキットであって、
当該抗体がアネキシンＶ或いはその断片を認識すること
を特徴とする。 - 【請求項２１】 請求項２０に記載のキットであって、
当該抗体が４４３１であることを特徴とする。 - 【請求項２２】 脳組織におけるｐ３３のレベルを減少
する方法であって、当該方法が前記脳組織をｐ３３のレ
ベルを減少する化合物と接触させることを特徴とする。 - 【請求項２３】 候補化合物がｐ３３レベルを減少する
能力を測定する方法であって、当該方法が、 （ａ）ｐ３３を発現する細胞を提供し （ｂ）前記細胞を上記候補化合物と接触させて （ｃ）前記細胞中のｐ３３のレベルを決定する段階から
なることを特徴とする。 - 【請求項２４】 候補化合物がｐ３３レベルを減少する
能力を測定する方法であって、当該方法が、 （ａ）ｐ３３を発現する哺乳動物を提供し （ｂ）前記哺乳動物を上記化合物と接触させて （ｃ）前記哺乳動物中のｐ３３レベルを決定する段階か
らなることを特徴とする。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/149,975 US5849600A (en) | 1993-11-10 | 1993-11-10 | Diagnostic assays for Alzheimer's disease |
| US149975 | 1993-11-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07253429A true JPH07253429A (ja) | 1995-10-03 |
Family
ID=22532601
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6276715A Pending JPH07253429A (ja) | 1993-11-10 | 1994-11-10 | アルツハイマー病の診断検査方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5849600A (ja) |
| EP (1) | EP0655626A1 (ja) |
| JP (1) | JPH07253429A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013506852A (ja) * | 2009-10-02 | 2013-02-28 | ブランシェット・ロックフェラー・ニューロサイエンスィズ・インスティテュート | アルツハイマー病の診断のための繊維芽細胞成長パターン |
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|---|---|---|---|---|
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| US7635680B2 (en) * | 2001-02-21 | 2009-12-22 | Alavita Pharmaceuticals, Inc. | Attenuation of reperfusion injury |
| US7635676B2 (en) * | 2001-02-21 | 2009-12-22 | Alavita Pharmaccuticals, Inc. | Modified annexin proteins and methods for their use in organ transplantation |
| US20090291086A1 (en) * | 2001-02-21 | 2009-11-26 | Alavita Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and Methods for Treating Cerebral Thrombosis and Global Cerebral Ischemia |
| US7645739B2 (en) * | 2001-02-21 | 2010-01-12 | Alavita Pharmaceuticals, Inc. | Modified annexin compositions and methods of using same |
| EP1839670A3 (en) * | 2001-02-21 | 2009-11-11 | Alavita Pharmaceuticals, Inc. | Modified Annexin Proteins and their use against thrombosis |
| US20050222030A1 (en) * | 2001-02-21 | 2005-10-06 | Anthony Allison | Modified annexin proteins and methods for preventing thrombosis |
| US7684859B2 (en) | 2002-04-25 | 2010-03-23 | Brainsgate Ltd. | Stimulation of the OTIC ganglion for treating medical conditions |
| WO2004043218A2 (en) | 2002-11-14 | 2004-05-27 | Brainsgate Ltd. | Surgical tools and techniques for stimulation |
| AU2003237870A1 (en) * | 2002-06-07 | 2003-12-22 | The Brigham & Women's Hospital, Inc. | Method and composition for inhibing or slowing blood coagulation |
| ATE422671T1 (de) * | 2002-07-30 | 2009-02-15 | David Gladstone Inst | Verfahren zur diagnose von morbus alzheimer |
| US7771956B2 (en) * | 2003-06-30 | 2010-08-10 | Brigham & Women's Hospital, Inc. | Method for detecting the presence of a phospholipid |
| US8055347B2 (en) | 2005-08-19 | 2011-11-08 | Brainsgate Ltd. | Stimulation for treating brain events and other conditions |
| US8010189B2 (en) * | 2004-02-20 | 2011-08-30 | Brainsgate Ltd. | SPG stimulation for treating complications of subarachnoid hemorrhage |
| US9233245B2 (en) | 2004-02-20 | 2016-01-12 | Brainsgate Ltd. | SPG stimulation |
| WO2008148493A2 (en) * | 2007-06-04 | 2008-12-11 | F. Hoffman-La Roche Ag | Annexin a5 and annexin a6 as biomarkter for alzheimer's disease |
| US7860569B2 (en) | 2007-10-18 | 2010-12-28 | Brainsgate, Ltd. | Long-term SPG stimulation therapy for prevention of vascular dementia |
| US9675796B2 (en) | 2013-11-10 | 2017-06-13 | Brainsgate Ltd. | Implant and delivery system for neural stimulator |
| EP3093043B1 (en) | 2015-05-13 | 2018-11-14 | Brainsgate Ltd. | Implant and delivery system for neural stimulator |
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| US5262332A (en) * | 1989-04-05 | 1993-11-16 | Brigham And Women's Hospital | Diagnostic method for Alzheimer's disease: examination of non-neural tissue |
| US5234814A (en) * | 1989-06-01 | 1993-08-10 | Du Pont Merck Pharmaceutical Company | Diagnostic assay for alzheimer's disease |
-
1993
- 1993-11-10 US US08/149,975 patent/US5849600A/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-11-10 JP JP6276715A patent/JPH07253429A/ja active Pending
- 1994-11-10 EP EP94308309A patent/EP0655626A1/en not_active Ceased
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013506852A (ja) * | 2009-10-02 | 2013-02-28 | ブランシェット・ロックフェラー・ニューロサイエンスィズ・インスティテュート | アルツハイマー病の診断のための繊維芽細胞成長パターン |
| JP2017102118A (ja) * | 2009-10-02 | 2017-06-08 | ブランシェット・ロックフェラー・ニューロサイエンスィズ・インスティテュート | アルツハイマー病の診断のための繊維芽細胞成長パターン |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5849600A (en) | 1998-12-15 |
| EP0655626A1 (en) | 1995-05-31 |
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