PT1481991E - Proteína alergénica da borracha natural - Google Patents

Description

ΡΕ1481991 ι DESCRIÇÃO "PROTEÍNA ALERGÉNICA DA BORRACHA NATURAL" 1. Campo técnico do invento 0 presente invento está de forma genérica relacionado com uma proteína. 2. Fundamento do invento

No final dos anos 80 e nos anos 90, começaram a ser recebidas, cada vez com maior frequência, na Europa e na América, descrições de reacções alérgicas entre utilizadores de luvas cirúrgicas e de examinação feitas de látex e entre doentes com espinha bífida. O aumento significativo no número de descrições de alergia ao látex, na última década, também foi atribuída ao maior uso das luvas de látex nos cuidados de saúde em tandem com o aumento do número de casos de SIDA. A sensibilização ao látex entre os profissionais de saúde está claramente relacionada com o trabalho, a principal causa sendo as luvas de látex, ou especificamente, a proteína alergénica nas luvas de látex. No entanto, são conhecidas numerosas sensibilidades cruzadas entre alergénios proteicos do látex e vários alergénios dos alimentos e pólen. Não é portanto ΡΕ1481991 improvável que muitos doentes alérgicos ao látex possam ter sido inicialmente sensibilizados não só por proteínas de produtos do látex, como também por proteínas de outras fontes .

Existem centenas de proteínas encontradas no látex da borracha natural. Destas, apenas uma pequena mão cheia é alergénica (capaz de induzir alergia). Existe muito interesse na identificação das proteínas em látex de Hevea responsável pela alergia ao látex e tem sido gasto um esforço considerável no isolamento e purificação das proteínas alergénicas derivadas do látex de Hevea ou de produtos do látex. Para lá do ponto de vista académico, a elucidação dos principais alergénios do látex permitirá o desenvolvimento de anticorpos contra estas proteínas. A disponibilidade dos anticorpos facilitará o desenvolvimento de imunoensaios de látex, tanto para uso laboratorial como para uso comercial. Existem dois tipos principais de imunoensaios de látex. 1. Imunoensaios para diagnóstico de alergia ao látex

Estes diagnósticos são usados para determinar se alguém é alérgico ou sensível ao látex. Os ensaios podem ser do formato in vivo (testes de picadas na pele) . Estes ensaios são usados na pesquisa e nos cuidados de saúde. 3 ΡΕ1481991 2. Imunoensaios para a quantificação de alergénios do látex em produtos manufacturados

Estes ensaios quantitativos determinam a quantidade de proteínas alergénicas presentes nos produtos de látex. Eles são usados para testar os produtos de látex, tais como luvas de látex, para determinar o conteúdo de alergénios do látex susceptíveis de serem extraídos. Tais imunoensaios serão muito importantes na obtenção dos produtos de látex, particularmente nos aspectos de normalização e controlo de qualidade e segurança da qualidade. Os possíveis clientes de tais imunoensaios serão os fabricantes dos produtos de látex e agências reguladoras tendo a responsabilidade de assegurar a conformidade da especificação do produto. A identificação dos principais alergénios do látex serve uma outra função útil nos cuidados de saúde. Os alergénios do látex purificados podem ser usados em imunoterapia para des-sensibilizar os doentes alérgicos ao látex. Quando conseguido com êxito, 0 doente deixa de desenvolver uma reacção alérgica ao látex. Isto é especialmente importante quando o doente trabalha num ambiente (e.g. em cuidados de saúde) onde os produtos de látex são ubíquos.

Actualmente, a "International Union of Immuno-logical Societies" (IUIS) reconhece dez alergénios do látex, Hev b 1 a Hev b 10. (Existem outras proteínas do 4 ΡΕ1481991 látex sob consideração pela IUIS) . Se bem que exista um esforço para procurar alergénios de proteínas do látex importantes, muitos investigadores pensam que a maior parte dos alergénios proteicos do látex já foram descritas.

Em 1995, Dr Donald Beezhold no seu artigo apresentado ao "Int Conf on Látex Protein Allergy: The Latest Position" descreveu um novo alergénio do látex que tinha homologia proteica parcial com patatina, a principal proteína de reserva das batatas. A esta proteína de 43 KDa foi, posteriormente, atribuído pela WHO/IUIS o nome Hev b 7. Quando uma versão recombinante de Hev b 7 se tornou disponível, encontrou-se que é reactiva com IgE dos doentes alérgicos ao látex. No entanto, a proporção dos doentes que estão sensibilizados relativamente a Hev b 7 recombinante é muito mais baixo do que esperado. Transferências Western que apresentaram uma banda de proteína activa à volta de 43 KDa é mais vulgarmente encontrado do que poderá ser explicado pela ligação de IgE a Hev b 7. Assim, a proteína recombinante Hev b 7 poderá não ser responsável pela elevada frequência de sensibilidade ao látex relativamente a uma proteína de aproximadamente 43KDa. É, portanto, possível que exista um outro alergénio do látex à volta de 43 KDa. A pesquisa desta nova proteína desconhecida culminou no presente invento. Esta proteína tem carácter alergénico pois o contacto com a proteína alergénica do látex (ALP) pode induzir uma reacção alérgica em pessoas sensibilizadas com esta proteína. 5 ΡΕ1481991 3. Sumário do invento 0 presente invento está relacionado com uma proteína derivada do látex que pode induzir uma reacção alérgica em pessoas sensibilizadas com a proteína.

Assim, num primeiro aspecto, o presente invento proporciona uma proteína alergénica do látex (ALP), caracterizada por a proteína ter pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO:12.

De preferência, a proteína ou a sua variante molecular caracteriza-se por a proteína ter as seguintes propriedades: a) possuir um peso molecular de cerca de 42 000

Dalton; b) possuir um ponto isoeléctrico de aproximadamente 4,7; c) ligar-se a IgE de doentes sensibilizados para a proteína; e

d) possuir a sequência de aminoácidos da Figura 2 (SEQ ID NO. 12) ou variações menores desta sequência de aminoácidos que não resultam nas propriedades aler-génicas da proteína a ser substancialmente alte rada. O segundo aspecto do presente invento proporciona um processo para obtenção de uma proteína ou a sua variante molecular em que o processo compreende os seguintes passos: 6 ΡΕ1481991 a) centrifugação do látex para obtenção da fracção inferior; b) congelação-descongelação da fracção inferior para obtenção do soro B do látex; e c) isolamento e purificação da proteina a partir do soro B obtido em (b).

Além disso, o presente invento proporciona uma sequência de DNA codificadora da proteina ou uma porção da proteina em que a sequência de DNA é como na Figura 1 ou variações menores desta sequência.

Igualmente, o presente invento proporciona um método para a produção de uma proteina ou suas variantes moleculares na forma recombinante através da inserção do DNA codificador da proteina, ou de uma variante da proteina, num vector adequado e indução do vector para expressar a proteina recombinante, ou a forma recombinante da referida variante da proteina, pelo que neste caso a sequência de aminoácidos da sequência de DNA atrás traduzida é a da Figura 2 (SEQ ID NO. 12). 4. Breve descrição das Figuras

Figura 1 mostra a sequência de DNA do clone de cDNA de tamanho completo codificador de alp. a Figura 1 está também apresentada em SEQ ID NO. 11. 7 ΡΕ1481991

Figura 2 mostra a sequência de aminoácidos de ALP derivada da tradução do clone de cDNA codificador de ALP. A Figura 2 está também apresentada em SEQ ID NO. 12.

Figura 3 mostra o espectro da espectrometria de massa de ionização desabsorção de laser auxiliada por matriz da proteína de látex alergénica, ALP.

Figura 4 mostra uma transferência Western de ALP após separação da proteína por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida. A proteína foi corada com azul Coo-massie para mostrar a presença e migração electrofo-rética de ALP (pista 2). Ligação de IgE humana de doentes sensibilizados contra ALP na transferência Western (pista 3), anticorpos policlonais desenvolvidos contra ALP (pista 4) e um anticorpo monoclonal desenvolvido contra ALP (pista 5).

Figura 5 mostra uma transferência Western de ALP após separação da proteína por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida. A proteína foi corada com azul Coomassie para mostrar a presença e migração electro-forética de ALP (pista 2) . Uma reacção específica para a presença de hidratos de carbono foi realizada para demonstrar a glicosilação de ALP (pista 3).

Figura 6 mostra uma transferência Western de MBP-ALP após separação por SDS-PAGE. A proteína foi corada com azul Coomassie para mostrar a migração electroforética ΡΕ1481991 da proteína recombinante de fusão com ALP (pista 3) . Está igualmente apresentada a ligação de ALP recombinante aos anticorpos monoclonais (pista 4) e policlo-nais (pista 5) desenvolvida contra ALP nativa.

Descrição detalhada do invento 0 presente invento está relacionado com uma proteína isolada a partir do soro B de látex centrifugado obtido por sangria da árvore da borracha, Hevea brasi-liensis. A descrição que se segue descreve detalhadamente como a proteína pode ser isolada, purificada e carac-terizada e como deverá ser usada na clonagem do cDNA codificador da proteína, como podem ser obtidas versões recombinantes da proteína, como os anticorpos podem ser desenvolvidos a partir da proteína e como a proteína pode ser usada em imunoensaio e imunoterapia. 0 invento estende-se a qualquer peptídeo ou polipeptídeo, termos que aqui são usados indiferentemente, excepto quando de outra forma necessário, que possua identidade substancial com ALP precursora ou madura. Os polipeptídeos com identidade substancial incluem variantes, tais como variantes alélicas.

Uma "variante" como o termo aqui é usado, pode referir-se a um polinucleótido ou polipeptídeo que difere de um polinucleótido ou polipeptídeo de referência respectivamente, mas que mantém as propriedades essenciais. 9 ΡΕ1481991

Uma variante típica de um polinucleótido difere na sequência nucleotídica de um outro, polinucleotídeo de referência. Alterações na sequência nucleotídica da variante podem ou não alterar a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado pelo polinucleótido de referência. As alterações nucleotídicas podem resultar em substituições, adições, deleções, fusões e truncagens de aminoácidos no polipeptídeo codificado pela sequência de referência, como discutido abaixo. Uma variante típica de um polipeptídeo difere na sequência de aminoácidos de um outro polipeptídeo de referência. De um modo geral, as diferenças são limitadas de forma a que as sequências do polipeptídeo de referência e da variante sejam estreitamente semelhantes na sua globalidade e, em muitas regiões, idênticas. Um polipeptídeo variante e de referência podem diferir na sequência de aminoácidos em uma ou mais substituições, adições, deleções em qualquer combinação. Um resíduo de aminoácido substituído ou inserido pode ou não ser codificado pelo código genético. Uma variante de um polinucleótido ou polipeptídeo pode ser natural, como seja uma variante alélica, ou pode ser uma variante não natural. As variantes não naturais dos polinucleótidos e poli-peptídeos podem ser preparadas por técnicas de mutagénese ou por síntese directa.

Dentro das variantes incluímos polipeptídeos ou polinucleótidos alterados. Sequências de ácidos nucleicos "alteradas" codificadoras de ALP incluem as sequências com deleções, inserções ou substituições de diferentes nucleó- 10 ΡΕ1481991 tidos, resultando num polinucleótido igual a ALP ou num polipeptideo com pelo menos uma característica funcional de ALP. Incluídos nesta definição estão os polimorfismos que podem ou não ser facilmente detectados usando uma sonda oligonucleotidica particular de ALP e hibridação incorrecta ou inesperada com variantes alélicas, com um locus diferente do locus cromossómico normal para a sequência polinucleotidia codificadora de ALP. A proteína codificada pode também ser "alterada" e pode conter deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácidos que produzem uma alteração silenciosa e resultam numa ALP funcionalmente equivalente. Substituições de aminoácidos deliberadas podem ser preparadas com base na semelhança da polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidro-filicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos, desde que a actividade biológica ou imunológica de ALP seja mantida. Por exemplo, aminoácidos com carga negativa podem incluir ácido aspártico e ácido glutâmico, aminoácidos carregados positivamente podem incluir lisina e arginina e aminoácidos com grupos de cabeça polar não carregada tendo valores de hidrofilicidade semelhantes podem incluir leucina, iso-leucina e valina; glicina e alanina; asparagina e gluta-mina; serina e treonina; e fenilalanina e tirosina.

Os fragmentos de ALP podem tomar várias formas, e são igualmente descritos nesta descrição. Um fragmento é um polipeptideo tendo uma sequência de aminoácidos que na sua totalidade é o mesmo que parte, mas não a totalidade, da sequência de aminoácidos de ALP ou uma sua variante. Os 11 ΡΕ1481991 fragmentos podem ser "livres" ou estar inseridos dentro de um polipeptideo maior do qual constituem uma parte ou uma região, mais de preferência como uma única região continua. Exemplos representativos de fragmentos de polipeptideos incluem, por exemplo, fragmentos compreendidos entre os aminoácidos 1-20, 21-40, 41-60, 61-80, 81-100 e 101 até ao fim do polipeptideo ALP. Neste contexto "cerca de" inclui as gamas particularmente descritas com mais ou menos 5, 4, 3, 2 ou 1 aminoácidos num ou noutro extremo ou nos dois extremos.

Os fragmentos preferidos incluem, por exemplo, polipeptideos truncados tendo a sequência de aminoácidos do polipeptideo ALP, excepto a deleção de uma série continua de resíduos que inclui o extremo amina ou uma série contínua de resíduos que inclui o extremo carboxilo ou deleção de duas séries contínuas de resíduos, uma incluindo o extremo amina e a outra incluindo o extremo carboxilo. São igualmente preferidos os fragmentos caracterizados por atributos estruturais ou funcionais tais como fragmentos que compreendem hélices alfa e regiões formadoras de hélices alfa, folhas beta e regiões formadoras de hélice beta, voltas e regiões formadoras de voltas, enrolamentos e regiões formadoras de enrolamentos, regiões hidrofílicas, regiões hidrofóbicas, regiões anfipáticas alfa, regiões anfipáticas beta, regiões flexíveis, regiões formadoras de superfícies, regiões de ligação a substratos e regiões com índice antigénico elevado. Outros fragmentos preferidos são fragmentos biologicamente activos. Fragmentos biologica- 12 ΡΕ1481991 mente activos são aqueles que medeiam a actividade de receptor, incluindo os que possuem uma actividade semelhante ou uma actividade melhorada, ou com uma actividade indesejável diminuída. Estão também incluídos os que são antigénicos ou imunogénicos num animal, especialmente no homem, caso se pretenda bloquear a ligação a ALP, por exemplo.

De preferência, todos estes fragmentos polipeptí-dicos mantêm a actividade biológica de ALP, incluindo actividade antigénica. As variantes da sequência definida e fragmentos também fazem parte da presente descrição. São preferidas as variantes que variam das referências em substituições de aminoácidos conservadas - i.e., as que substituem um resíduo por outro com características semelhantes. Tais substituições típicas estão entre Ala, Vai, Leu e Ile; entre Ser e Thr; entre os resíduos ácidos Asp e Glu; entre Asn e Gin; e entre os resíduos básicos Lys e Arg; ou resíduos aromáticos Phe e Tyr. São particularmente preferidas as variantes em que vários aminoácidos, 5-10, 1-5 ou 1-2, são substituídos, eliminados ou adicionados em qualquer combinação.

Polipeptídeos substancialmente idênticos formam uma realização preferida do presente invento, e incluem os que possuem variação em pelo menos uma parte da molécula, com a opção de manter inalterada uma outra parte da molécula. Assim, por exemplo, se o polipeptídeo substancialmente idêntico for para simular a actividade de ALP, 13 ΡΕ1481991 então pode ser preferível manter sub-regiões particulares inalteradas, ao mesmo tempo que se adopta alterações numa ou mais sub-regiões, caso se pretenda. As alterações podem incluir deleção de tais sub-regiões, dando assim fragmentos activos.

Os polipeptídeos com identidade substancial, de preferência, possuem pelo menos 80% de identidade com um polipeptídeo correspondente que é ALP precursora ou madura. Mais de preferência, existe pelo menos 90% de identidade, como seja pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade. A identidade de sequência é adequadamente determinada através de um programa de computador, apesar de existirem outros métodos. Preferimos que a identidade seja avaliada usando o programa Gap do Genetic Computer Group (1994), (ver o Manual de Programas para o Wisconsin Package, Versão 8, Madison Wisconsin, USA). "Identidade" é uma medida da identidade de sequências nucleotídicas ou sequências de aminoácidos. Em geral, as sequências são alinhadas de forma a que seja obtido o melhor alinhamento possível. "Identidade" per se tem um significado conhecido na área e pode ser calculada usando técnicas publicadas. Ver: e.g.: COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A M., ed., Oxford Uniersity Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D. w., ed.: Academic Press, New York,, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART 1, Griffin, A.M., e Griffin, H. G., eds., Humana Pres, New Jersey, 14 ΡΕ1481991 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991) .

Se bem que exista uma série de métodos para medir a identidade entre duas sequências polinucleotidicas ou polipeptidicas, o termo "identidade" é bem conhecido dos familiarizados com a área (Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48:1073). Os métodos normalmente empreques para determinar a identidade ou semelhança entre duas sequências incluem, mas não estão limitadas aos descritos em Guide to Huge Computers, Marlin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994 e Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J Aplied Math (1988) 48:1073. Os métodos para determinar a identidade e semelhança são codificados em programas de computador. Métodos de programa de computador preferidos para determinar identidade e semelhança entre duas sequências incluem, mas não estão limitados ao pacote de programas GCS (Devereux, J., Nucleic AcidS Research (1984) 12(1):387); BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F. et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403).

Como exemplo, por um polinucleótido tendo uma sequência nucleotidica possuindo pelo menos, por exemplo, 95% de "identidade" com uma sequência nucleotidica de referência de SEQ ID NO:11, pretende-se que a sequência nucleotidica do polinucleótido seja idêntica à sequência de referência, excepto essa sequência polinucleotídica poder 15 ΡΕ1481991 incluir até cinco mutações pontuais em cada 100 nucleótidos da sequência nucleotidica de referência de SEQ ID NO:11. Por outras palavras, para se obter um polinucleótido tendo uma sequência nucleotidica pelo menos 95% idêntica a uma sequência nucleotidica de referência, até 5% dos nucleótidos na sequência de referência podem ser eliminados ou substituídos por um outro nucleótido, ou uma série de nucleótidos até 5% do total de nucleótidos na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Estas mutações da sequência de referência podem ocorrer em posições do extremo 5' ou 3' da sequência nucleotidica de referência ou em qualquer lugar entre estas posições terminais, dispersas individualmente entre nucleótidos na sequência de referência ou num ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

De forma semelhante, por um polipeptídeo tendo pelo menos, por exemplo, 95% de "identidade" com uma sequência de aminoácidos de referência de SEQ ID NO: 12 pretende-se significar que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo é idêntica à sequência de referência, excepto a sequência polipeptídica poder incluir até cinco alterações de aminoácidos por cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácidos de referência de SEQ ID NO:12. Por outras palavras, para se obter um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos de referência, até 5% dos resíduos de aminoácidos na sequência de referência pode ser eliminado ou substituído com outros aminoácidos ou um número de aminoácidos até 5% do total de resíduos de 16 ΡΕ1481991 aminoácidos na sequência de referência pode ser inserido na sequência de referências. Estas alterações da sequência de referência pode ocorrer nas posições do extremo amina ou carboxilo, ou algures entre aquelas posições terminais, dispersas individualmente entre os resíduos na sequência de referência ou num ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

Os polipeptídeos deste invento podem estar inseridos dentro de uma sequência mais longa, na forma de uma proteína de fusão, por exemplo. Assim, os polipeptídeos podem estar na forma da proteína "madura" ou podem ser parte de uma proteína maior, como seja uma proteína de fusão. É muitas vezes vantajoso incluir uma sequência de aminoácidos adicional que contem sequências secretórias ou líder, pro-sequências, sequências que ajudam à purificação, como sejam múltiplos resíduos de histidina ou uma sequência adicional para conferir estabilidade à produção do recombinante.

Os polipeptídeos que sejam fragmentos, preferencialmente, mantêm a função pretendida de ALP. Os fragmentos adequadamente compreendem pelo menos 10 aminoácidos, mais de preferência pelo menos 20 aminoácidos, e tipicamente pelo menos 40 aminoácidos.

Exemplo 1. Isolamento e purificação de proteínas Látex fresco derivado de árvores de Hevea brasi-liensis (clone RRIM 600) foi colhido para recipientes 17 ΡΕ1481991 refrigerados. 0 látex foi centrifugado a 19 000 rpm (43 000 g) numa centrífuga de alta velocidade Sorvall RC 5C durante lha 4-7°C para separá-lo em três fracções principais: a fracção superior que é o creme de borracha, a fracção inferior pesada e o soro C localizado entre as anteriores. O soro B do látex é preparado com base no método de Hsia (1958) Trans Instn Rubb Ind. A fracção inferior de látex derivada do látex centrifugado foi lavada através da res-suspensão em manitol 0,4M e recuperada por centrifugação. A fracção inferior lavada foi então sujeita a congelação e descongelação repetida para destruir os lutóides que são os seus principais constituintes. O fluido lutóidico, o soro B, foi recuperado como sobrenadante após nova centrifugação . O soro B foi dialisado durante a noite contra borato de sódio 0,3mM e ácido bórico 0,16 M, pH 7 na câmara fria. Isto foi seguido de filtração através de papel de filtro Whatman N° 1. Dez ml do soro B filtrado foi aplicado numa coluna (20 cm x 1,5 cm) de carboximetilcelulose CM32 (Whatman) equilibrada com borato de sódio 0,09M e ácido bórico 0,016M, pH 8,6. As proteínas foram eluidas com um gradiente de 150 ml de borato de sódio 0,09M e ácido bórico 0,016M, pH 8,6 contra 150 ml de borato de sódio 0,9M e ácido bórico 0,16M, pH 8,6. Fracções de 2 ml foram colhidas a uma velocidade de 2,6 min/fracção. Os materiais não retidos (í.e. fracções 3 a 11) foram aplicados numa coluna (12 cm x 1,5 cm) DE 52 (Whatman) equilibrada com Tris-HCl 0,1M, pH 8. A proteína foi eluída com um gradiente de 0- 18 ΡΕ1481991 0,5M NaCl no mesmo tampão. As fracções contendo proteínas de aproximadamente 43 KDa, conforme determinado por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, foram testadas relativamente à ligação à imunoglobulina IgE com soro de doentes alérgicos ao látex. As fracções contendo ALP foram identificadas e reunidas. 0 peso molecular aproximado de ALP determinado por comparação da migração de ALP com vários marcadores de calibração é 42 KDa (Figura 4 pista 2) .

Exemplo 2. Determinação do peso molecular e ponto isoeléctrico e sequenciação de aminoácidos 0 peso molecular preciso da proteína do látex alergénica, ALP, determinado por espectrometria de massa é de 42 975. 0 espectro da espectrometria de massa por ionização desabsorção com laser assistida por matriz (MALDI-MS) da amostra proteica está apresentado na Figura 3. 0 ponto isoeléctrico (pi) de ALP foi determinado por focagem isoeléctrica (IEF) . A migração da proteína no gel de IEF foi medida e comparada com os padrões de calibração de proteínas de pi conhecido. 0 pi de ALP foi calculado como sendo 4,7.

Encontrou-se que a proteína estava bloqueada no extremo N. A digestão in situ por tripsina resultou em vários fragmentos. As sequências parciais de aminoácidos foram obtidas para três destes fragmentos. 19 ΡΕ1481991

Sequência 1 (SEQ ID N0:1): YLDVQYSQFR

Sequência 2 (SEQ ID N0:2): YSLFSEPEK

Sequência 3 (SEQ ID N0:3): LPTTIIPAHGGFSSR em que as letras do alfabeto são abreviaturas aceites para os aminoácidos individuais.

Sequência 1 deriva de um peptideo de 1 319 Da. Os dados de sequências de aminoácidos obtidos por espectro-metria de massa foram comparados contra a base de dados da sequência proteica do National Centre for Biotechnology Information (NCBI), USA, usando o algoritmo BLAST. A pesquisa revelou que as sequências de aminoácidos tinham homologia parcial com a "proteína específica de nódulos precoces" de Glycine max.

Sequência 2 deriva de um peptideo de 1100 Da. A sequência mostrou homologia parcial com "proteína específica de nódulos precoces" de Medícago truncatula.

Sequência 3 deriva de um peptideo de 1556 Da. A sequência mostrou homologia parcial com "proteína específica de nódulos precoces" de Glycine max.

Exemplo 3. Determinação de glicosilação de ALP

Para demonstrar que um hidrato de carbono está ligado à proteína ALP (tornando ALP uma "proteína glico-silada" ou glicoproteína), proteínas purificadas foram ΡΕ1481991 separadas por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) em géis de 15% e transferidas electrofore-ticamente para uma membrana de nitrocelulose para se obter uma transferência Western. A membrana foi lavada com soro fisiológico tamponado com fosfatos (PBS) e depois imerso em periodato de sódo 10 mM/EDTA com agitação no escuro durante 20 min. Após isto, a membrana foi lavada três vezes com PBS durante 10 minutos em cada ciclo. A membrana foi em seguida transferida para uma solução de biotina-hidrazida em acetato de sódio/EDTA e a agitação decorreu durante 60 min. Após três ciclos de lavagem com soro fisiológico tamponado com Tris (TBS), a membrana foi bloqueada e depois lavada em mais três ciclos com TBS. A membrana foi então imersa em estreptavidina-fosfatase alcalina durante 60 min. Após mais três ciclos de lavagem com TBS, a membrana foi imersa numa solução de substrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/azul de nitro tetrazólio (BCIP/NBT). O aparecimento do produto corado da reacção de fosfatase alcalina indicou a presença do componente hidrato de carbono da glicoproteína (Figura 5) .

Exemplo 4. Produção de anticorpos contra ALP

Ambos os anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais foram desenvolvidos com êxito contra ALP.

Anticorpos policlonais contra ALP

Uma preparação pura de ALP (aproximadamente 0,5 ml de 0,5 mg/mg de ALP/ml) em soro fisiológico tamponado ΡΕ1481991 com fosfatos (PBS) foi misturada com um volume igual de adjuvante completo de Freund e esta mistura de antigénios foi injectada subcutaneamente no dorso de coelhos. Sete doses de reforço da mesma formulação de antigénios, mas com adjuvante incompleto de Freund, foram administradas com intervalos de duas semanas. Colheu-se sangue dos coelhos de forma a obter o anti-soro que continha anticorpos policlonais contra ALP.

Para demonstrar a ligação do anticorpo policlonal contra ALP, uma transferência Western da proteína para membrana de nitrocelulose foi preparada como no Exemplo 3. A membrana de nitrocelulose foi bloqueada com 5% de leite desnatado em PBS e depois incubada durante 90 min com anticorpos policlonais anti-ALP (diluído a 1:800 em pbs-leite) como o anticorpo primário. Após três ciclos de lavagem com PBS-leite, a membrana de nitrocelulose foi incubada durante 1 h com o anticorpo secundário, anticorpos anti-IgG de coelho conjugados com fosfatase alcalina. Após mais três ciclos de lavagem com PBS-leite, a membrana de nitrocelulose foi incubada durante 10 min em soro fisiológico tamponado com Tris (TBS) antes de ser imerso em substrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro azul tetrazólio (BCIP/NBT) para gerar o produto corado da reacção de fosfatase alcalina. A ligação dos anticorpos policlonais a ALP numa transferência Western da proteína após separação da proteína por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida está apresentada na Figura 5 (pista 4). 22 ΡΕ1481991

Anticorpos monoclonais contra ALP Células do baço derivadas de ratinhos Balb/c imunizados com soro C de látex foram fundidas com células de mieloma de ratinho seguindo protocolos anteriormente descritos por Kohler e Milstein (12, 13) . As células de hibridoma resultantes foram testadas relativamente a anticorpos específicos contra a proteína do soro C. Os hibridomas seleccionados foram reclonados duas vezes e os anticorpos monoclonais secretados foram usados na forma não purificada nos sobrenadantes de células de hibridoma ou como preparações de purificadas por cromatografia de afinidade.

Para demonstrar a ligação do anticorpo monoclonal a ALP, uma transferência Western da proteína para membrana de nitrocelulose foi processada como para o anticorpo policlonal, excepto o anticorpo monoclonal contra ALP ser usado como anticorpo primário, enquanto o anticorpo anti-IgG de ratinho conjugado com fosfatase alcalina foi usado como anticorpo secundário. A ligação de anticorpos monoclonais a ALP numa transferência Western da proteína após separação da proteína por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida está apresentada na Figura 4 (pista 5).

Anticorpos monoclonais recombinantes contra ALP

Uma variação antecipada do anticorpo monoclonal convencional é o anticorpo recombinante pelo qual o anticorpo pode ser gerado usando um segmento específico de 23 ΡΕ1481991 DNA que codifica a sequência de aminoácidos do anticorpo ou um fragmento funcional do anticorpo, como seja um fragmento variável de cadeia simples. Existem várias abordagens ao desenvolvimento de anticorpos recombinantes, das quais está aqui descrito um exemplo. Foram primeiro construídas bibliotecas de genes de anticorpos, por exemplo, através da amplificação por PCR a partir de cDNA de linfócitos B. Para o rastreio destas bibliotecas, os anticorpos são apresentados na superfície de microorganismos contendo o gene dos anticorpos (apresentação em fagos). Eles foram testados com a proteína do antigénio para identificar clones específicos produtores de um anticorpo que se ligua a esta proteína. Uma vez identificado o organismo portador do gene de anticorpo, clones específicos podem então ser amplificados e usados para produzir o fragmento de anticorpo em E. coli ou outro organismo adequado.

Exemplo 5. Demonstração da alergenicidade da proteína

Uma transferência Western da proteína purificada foi incubada com soro do sangue de doentes alérgicos ao látex para determinar se IgE (a imunoglobulina que medeia a reacção alérgica) se ligou à proteina. A ligação de IgE à proteína indicou que a proteina é alergénica.

Para detectar a ligação proteina-lgE em transferências Western, foi seguido um procedimento semelhante ao do Exemplo 2, excepto a membrana de nitrocelulose ser incubada durante a noite com soro reunido a partir de ΡΕ1481991 vários doentes alérgicos ao látex (diluído a 1:5,25 em PBS-leite e 0,05% de azida de sódio) como anticorpo primário. Anticorpo anti-lgG humana conjugado com fosfatase alcalina serviu como anticorpo secundário. A ligação de IgE humana a ALP numa transferência Western da proteína após separação da proteína numa electroforese em gel de SDS-poliacrilamida está apresentada na Figura 4 (pista 3).

Exemplo 6. Preparação e clonagem do cDNA codificador de ALP O DNA complementar (cDNA) codificador da sequência de aminoácidos de ALP pode ser clonado e multiplicado num hospedeiro como seja um microrganismo. O microrganismo pode ser seleccionado do grupo consistindo em bactérias, leveduras e virus. Células de plantas superiores podem ser igualmente usadas como vectores. A proteína ALP, na forma recombinante, pode então ser sintetizada no mesmo hospedeiro ou num hospedeiro alternativo. Segue-se uma descrição do método usado para clonar o cDNA de ALP. Métodos convencionais foram usados na preparação e purificação de DNA mini- e maxipreparações, purificação de DNA, digestões com endonucleases de restrição, electroforeses em géis de agarose, ligações, transformações e isolamento de mRNA poli(A)+ por cromatografia em coluna de oligo(dT) celulose.

Preparação de mRNA de látex

Colheu-se látex por sangria da árvore Hevea brasiliensis. Antes da árvore ser sangrada, é dotada com um 25 ΡΕ1481991 vaso de drenagem esterilizado. Imediatamente após sangria, a incisão e vaso são lavados com cerca de 20 ml de tampão de extracção de RNA 2X (Tris-HCl 0,1 mol, LiCl 0,3 mol, EDTA 0,01 mol, 10% SDS, pH 9,5). O látex foi então lavado com 10 0 ml de tampão de extracção de RNA para um volume colhido total de 200 ml num frasco cónico estéril. No laboratório, o látex foi bem decantado e centrifugado em tubos de polialómero a 112 700 xg durante 30 minutos a 15°C. A fase aquosa foi decantada suavemente para tubos de centrífuga estéreis e subsequente processamento da fase aquosa para isolar o RNA total foi realizado de acordo com o método de Prescott and Martin (1987) Plant Mol Biol Rep.

Síntese de cDNA de ALP A sintese da primeira cadeia de cDNA foi preparada por transcrição reversa de 1 micrograma de RNA total de látex num volume de 20 μΐ usando o kit GeneRacer™ (Invitrogen, USA) de acordo com as instruções do vendedor. A sintese do cDNA foi conseguida através da amplificação por PCR. O cDNA foi amplificado por PCR sem purificação prévia. Cada uma das reacções foi realizada num volume de 50 μΐ contendo 2 μΐ da reacção da primeira cadeia, 12,5 μΜ de Iniciador 3' GeneRacer™ (5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3') (SEQ id NO.4) em que A, G, C e τ são as abreviaturas para as bases de nucleótidos adenina, guanina, citosina e timidina respectivamente), 12,5 μΜ de sequência iniciadora 26 ΡΕ1481991 específica, dATP 0,2 mMol, dCTP 0,2 mM. DGTP 0,2 mMol, pH 7,5, 1 unidade de Taq High Fidelity (Roche Diagnostics

GmbH), Tris-HCl 10 mM, MgCl2 1,5 mM, KC1 50 mM, pH 8,3, e coberto com 50 μΐ de óleo mineral. A reacção de PCR teve lugar num termociclador, seguindo as instruções do fabricante. Um segundo ciclo de PCR foi realizado como anteriormente, mas usando 5 μΐ do primeiro ciclo de PCR como matriz. 20 μΐ do produto de amplificação por PCR foi usado para análise um gel de 1,0% de agarose corado com brometo de etídio.

Clonagem do cDNA de ALP O produto de PCR (cerca de 1,5 Kb, de tamanho) foi ligado ao vector TOPO® (Invitrogen, USA) de acordo com as intruções do vendedor. A mistura de ligação (2 μΐ) foi usada para a transformação de Escherichia coli quimicamente competente One Shot® TOP10 (Invitrogen, USA) relativamente à resistência à ampicilina. Após incubação durante a noite a 37°C em meio de agar contendo ampicilina (100 μρ/ιηΐ), picaram-se transformantes através de selecção de cor com Xgal (80 μρ/ιη1)/ΙΤΟ (3 mmol/1) . Os clones picados foram testados através de ensaio de minipreparações usando o sistema de purificação de DNA Wizard® SV Minipreps (Promega, USA) de acordo com as instruções do vendedor. 1 μg dos clones seleccionados foram então mandados para sequenciação.

As sequências de DNA (1394 pares de bases, Figura 27 ΡΕ1481991 1 e SEQ ID NO. 11) foram traduzidas nos aminoácidos que codificam (Figura 2 e SEQ ID NO. 12) . A sequência de aminoácidos incluem os seguintes segmentos: 1) ctaccaactactattatacctgctcatggtggattagt (SEQ ID NO.5: na posição 384 a 422) codifica o peptideo LPTTIIPAHGGFS (SEQ ID NO.6) . 2) taccttgatgtccaatattcgcaattccgg (SEQ ID NO. 7: na posição 429 a 458) codifica o peptideo YLDVQYSQFR (SEQ ID NO. 8) 3) tattctttattcagtgagccagaaaaa (SEQ ID NO. 9: na posição 897 a 923) codifica o peptideo YSLFSEPEK (SEQ ID NO. 10) em que a, g, c e t são as abreviaturas das bases de nucle-ótidos adenina, guanina, citosina e timina respectivamente. Conforme referido mais atrás, estes três domínios proteicos tinham sido independentemente identificados por espectro-metria de massa. Os requerentes notam que variações menores da sequência de DNA não alterarão substancialmente as características básicas do peptideo que o DNA codifica.

Exemplo 7. Sobre-expressão de ALP recomblnante

Existem vários kits comerciais que podem ser usados para a sobre-expressão da proteína alergénica do látex. Neste exemplo, a proteína de fusão pMAL-c2 e o sistema de purificação (New England Biolabs, USA) foi usado para sobre-expressar proteína recombinante a partir do seu ΡΕ1481991 cDNA clonado. Os procedimentos usados para a indução da sobreprodução da proteína de fusão, purificação por cromatografia de afinidade, clivagem da proteína de fusão pela protease factor Xa e purificação da proteína alvo por cromatografia em hidroxilapatite estão de acordo com as instruções do vendedor. Neste exemplo, foi usado isopropil-tiogalactósido (IPTG) como indutor do sistema de expressão. 0 cDNA de ALP foi subclonado no vector pMAL-c2 na mesma grelha de leitura de tradução do gene malE do vector. As células bacterianas foram crescidas durante a noite a 37°C numa placa de LB indicadora contendo 100 μρ/πιΐ de ampicilina, isopropiltiogalactósido (IPTG) 10 μηιοί e 10 μρ/ιηΐ de Xgal. Colónias brancas foram picadas e testadas quanto à presença do plasmídeo de fusão MBP através de um ensaio de minipreparações. Um clone positivo foi então considerado para a sobreprodução da proteína REF. As células E. coli induzidas com IPTG foram rebentadas através de um ciclo de congelação (-20°C)/descongelação (temperatura ambiente) e sonicação (Vibra Cell, Sonics & Materials Inc., USA) num banho de água com gelo, com pulsos de 15 segundos durante 3 minutos. A libertação da proteína de fusão eluída da coluna de amilose foi controlada testando a proteína. Se bem que a sequência de aminoácidos do peptídeo seja determinada pela sequência de cDNA no vector de expressão, os requerentes observaram que pequenas alterações na sequência de cDNA não alterarão substancialmente as características básicas da proteína recombinante. Figura 6 mostra a proteína recombinante expressa e a sua ligação aos anticorpos que foram desenvolvidos contra a sua contraparte ΡΕ1481991 nativa (natural) purificada a partir de látex de borracha natural.

Exemplo 8. Utilização de alp em imunoensaios ALP nativa ou recombinante ou a sua variante molecular (uma proteína semelhante a ALP, mas diferindo ligeiramente, por exemplo, em poucos aminoácidos) pode ser usada por si só, ou em combinação com um anticorpo desenvolvido contra ALP ou sua variante molecular, em imunoensaios. Variantes moleculares de ALP podem ocorrer naturalmente na borracha ou podem existir como resultado de manipulação laboratorial. Tais variantes de ALP podem diferir apenas ligeiramente umas das outras (e.g. em alguns aminoácidos) e possuem funções ou características básicas substancialmente semelhantes, incluindo alergenicidade. Tais imunoensaios podem ser construídos em muitos formatos diferentes, mas baseiam-se essencialmente na reacção imunológica entre um anticorpo e o seu antigénio. O anticorpo neste caso pode ser um anticorpo contra ALP ou sua variante molecular, ou IgE humana. 0 seu antigénio pode ser ALP nativa ou recombinante ou sua variante molecular, ou um peptídeo que inclua o epitopo de ALP ou sua variante molecular. 0 imunensaio pode ser usado para o diagnóstico ou para o diagnóstico de alergia a ALP ou alergia ao látex em geral. Num formato diferente, o imunensaio pode ser usado para a detecção de alp em látex ou produtos de látex. ΡΕ1481991 30

Exemplo 9. Utilização de ALP em imunoterapia A imunoterapia é um tratamento preventivo para reacções alérgicas que é realizado administrando, gradualmente, doses crescentes do alergénio a que a pessoa é alérgica. Os aumentos crescentes do alergénio fazem com que o sistema imune se torne menos sensível à substância quando a substância for encontrada no futuro. Existem vários protocolos de tratamento para imunoterapia. Como exemplo, a imunoterapia com ALP pode ser realizada através da injecção de uma amostra purificada de ALP na pele do braço. Uma injecção pode ser dada uma vez por semana durante cerca de 30 semanas, após o que as injecções podem ser administradas de duas em duas semanas. Eventualmente, as injecções podem ser dadas de quatro em quatro semanas. A duração da terapia pode ser três ou quatro anos, por vezes mais longas. Em lugar da ALP nativa, a imunoterapia pode também ser realizada com uma ALP recombinante adequada ou com a variante molecular de ALP (uma proteína semelhante a ALP, mas diferindo ligeiramente, por exemplo, em alguns amino-ácidos) ou um peptídeo representando uma porção de ALP ou sua variante molecular. A partir da descrição feita, os familiarizados com a matéria podem facilmente determinar as caracterís-ticas essenciais do presente invento e sem se afastarem do espírito e âmbito do invento, podem fazer várias alterações e modificações do invento para adaptá-lo a várias usos e condições. 31 ΡΕ1481991 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Malaysian Rubber Board <120> Uma proteína <130> EPP89347 <150> Pedido de Patente Malaia N° P1200307 <151> 2003-02-28 <160> 12 <170> Patent In versão 3.2

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Lisboa, 4 de Abril de 2007

Claims (21)

1. ΡΕ1481991 1 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína alergénica do látex (ALP), caracte-rizada por a proteína ter pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO. 12.
2. 2. uma proteína alergénica do látex (ALP) de acordo com a reivindicação 1, tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO. 12.
3. 3. Uma proteína alergénica do látex (ALP) de acordo com a reivindicação 2, tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID NO. 12.
4. 4. Uma proteína alergénica do látex (ALP) de acordo com a reivindicação 3, tendo pelo menos 98% de identidade com SEQ ID NO. 12.
5. 5. Uma proteína alergénica do látex (ALP) de acordo com a reivindicação 4, consistindo na sequência de SEQ ID NO. 12.
6. 6. Uma proteína alergénica do látex (ALP) de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, capaz de induzir uma reacção alérgica em pessoas sensibilizadas com a proteína.
7. 7. Uma proteínas alergénica do látex (ALP) de 2 ΡΕ1481991 acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a sequência de DNA codificadora da proteína é SEQ ID NO. 11.
8. 8. Uma proteína alergénica do látex (ALP) de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a proteína tem as seguintes propriedades: a. um peso molecular de aproximadamente 42 000 Dalton; b. um ponto isoeléctrico de aproximadamente 4,7; e c. liga-se a igE de doentes sensibilizados com a proteína.
9. 9. Uma proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que ainda compreende uma sequência de aminoácidos adicional que possui sequências secre-tórias ou líderes, pro-sequências, sequências que ajudem à purificação ou uma sequência adicional para a estabilidade durante a produção recombinante.
10. 10. Uma proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, a qual é uma proteína de fusão.
11. 11. Um processo para a obtenção de uma proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o processo compreende os seguintes passos: a) centrifugação do látex para obtenção de uma fracção inferior; 3 ΡΕ1481991 b) congelação-descongelação da fracção inferior para a obtenção do soro B do látex; e c) isolamento e purificação da proteína a partir do soro B obtido no passo (b).
12. 12. Um processo de acordo com a reivindicação 11, em que o isolamento e purificação da proteína são realizados através de uma série de separações cromatográficas.
13. 13. Um processo de acordo com a reivindicação 12, em que a separação cromatográfica é uma cromatografia de permuta iónica e filtração em gel.
14. 14. Uma sequência de DNA codificadora da proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, em que a sequência de DNA é a de SEQ ID NO. 11 ou uma variante tendo pelo menos 95% de identidade de sequências com ela.
15. 15. Um método para a produção de uma proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, na forma recombinante, compreendendo os passos de: a. inserção do DNA codificador da proteína num vector virai ou célula hospedeira adequada; b. indução do vector virai ou célula hospedeira para expressar uma proteína recombinante.
16. 16. Um método para a produção de uma proteína na forma recombinante de acordo com a reivindicação 15, em que o DNA codificador da proteína é SEQ ID NO. 11. 4 ΡΕ1481991
17. 17. Um método para a produção de uma proteína recombinante de acordo com a reivindicação 15 ou 16, em que a célula hospedeira é um microrganismo, uma planta ou um animal.
18. 18. Um método para a produção de uma proteína na forma recombinante de acordo com a reivindicação 17, em que o microrganismo é uma bactéria ou uma levedura.
19. 19. Um método para a produção de uma proteína na forma recombinante de acordo com a reivindicação 18, em que o microrganismo é Escherichia coli.
20. 20. Um método para a produção de uma proteína na forma recombinante de acordo com a reivindicação 15, em que o indutor é, de preferência, isopropil tiogalactósido (IPTG) ou qualquer indutor adequado.
21. 21. Uma proteína nativa de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10 para usar em imunoensaio e imunoterapia. Lisboa, 4 de Abril de 2007 01 01 3 3 »4 1/4 tSSfAf· - aaae.eafi.ta,&G&acéêfeã tcá ts*':l.L.LL7.G3r.LetLaStat^ca -.-A™—-----i—.-3-----1— ÈS«; SSGSB^ÍSÍtAtlSÍÍ^t-CISJi^BSeSfcellSAttetecB^éáBSÔiStjíBBÍSttB^ --1-..,-1-,.,.-1-,,—1,,,,1,.,,,.,.1.,,,,1..,-1---1----1--- .1.,--1-.-.1----1-.-,-,-1----1-,,-3,-,,,-,3,,,,1,.,.1,,., ΓΚΛ: *víc Li ct to. iaj4ja.jS*St·t« S· f ΐ·B«4A$3t.ct.j X------1 — 1— -1:— — l------1—.---1 — i EKÍA·: Bl^BAijçfíiçeiSiaLegrSttttistçgccgagoBJtttÈBBíftl.ííííAtAtí ----1-..-1,,,.1....5., .,4,,.-1---1--1------1------1- ÍSÍÍS.: ΐ^Λ^Βρ.β3ί*ϊοϊω5έ.Κ·ΐ!ΐ!ϊ;ΐ^'ξ(ΐ:»*$Γί:*<ίθ:ί.ί«ίΐ·κ»,SBtggtçcafalt --4,,,,1,--1----1---li-—— — -3,-,3.,- 5»W: ttsseeaEaçe*gíjátse*iSc«4fe»«»S!l«>::!Mtsçt:aetattafcacct^ctn ----1----1-----1 — 8MÃÍ «KtBSÍW*t5ta3£®s*ASsfcseciigat#t«6*áAAA7«$KíB*ÍSee$Sf« »i>----Í-----A-----í-----i----A----1 — . 1—A—1 — BNA: ΰύ-çça ticccsx^j.x Ç L\-< ::»i}m: tΛ a·.; C -,-g ^ ^';'C O t Λ11 1-----1..--1--1--1..,,,,.1..,.,-3-3-3--1------1 ί.<ΠΆ -* tJi ci..'!, t-'T<: t Çfi t a,.*-,,:·»11 c^o!; » —- -3, v v, 1 v .. -1.. ..3... -1 — -1 - —1— „3—» »J ,,. -j . ÇSTA : tLgii —3-, „-1 „,, ,3 ,-.-1--1------1... ...5—1 .„.„3- — -i- - Éíís: Κ<5««1ι5ιΐι;»Λ.!;1ίιΒιϊΐΈΒ9ϊίϋ:ΐί3ίΐίβ»Ι.Β3ίεΐ3έϊΕΒ(ϊί*«»Ε$ί;!;«*^κ —1 — ,1.,.,3,-,,1-.,-1---1,,-1-1- BSS; *Bíiíaí.»Eçstí:t,gçg»gGLa5saMtt;tt3içttLÍ:e*<;*íç*í!*5fg«t:eiia -5. —1 —--;--.-1-,.--1--.,,j ,, ,,).........).......1........1---- ; fct.^tt^fcB&lAGaAls.ãL^SlaaE^EsAtEtEiEGrLggifia&gaa.aalpíjafca 1- — -i ——1—3.— . ..3.,..,,,1---1-— .-ι—,-ι—-i——i : iit l·: tt c-vcsaty ,Λ·3ΐ: t ΐ ! ,.ϊ-ό.ίι:.:,::6 .—.; ,t—*—i—í-----1-—1——3—-j——s—..-1- ÍSWA; agt ¢^.0,,¾¾CCJ*:. ;:g 1.V.:;::6 I, 66 ,Λ,ρ^1: t.2116 Λ::]22 0 2.62 -1-1---------i----3—3— Wíít: i;L'^l.s«:*ifgLt§ssat!statt.e:tçrt.!5aa<fLatt«íSe«Stfi«<ítç»9a.esír -3..-3-,-.1-----1----1-------3.----1-.,.,.,1.,...,-1.,-..,,3,- £Sft: «M*»safi9gt«Ke«a$tttee*e«««««S«S)tt4tl4^(í^i|9«S9** ·· >......1-----1----i----1------1----3-3,--1.--3.,-- βκΛι asçtaeááttttAijtijWaeAeeteselsitssíagstaçasttaçaçeaçaaij 1—1—Ϊ—-3--3,..,..,1--1-.3-,-3,,..1....3 »»6: *e«8«»««»«** sasttç 1¾¾¾ tSKB tg tgett^iÈ*!«-M6t-t*ia»s4<M. .-••."3.----i.......1---,1-.,.1.-..1..-1---1-.,,(,,,,1. IBfft.: atts^g-a e-jgsr&fTGÇãsaGKaGSftG t7!'B&.7S2Lg«o;aa Açaa Latt 1 r.t- 2.-:,,.:0.:2:-1----1......1......t----1......j,......3, —i~ i-EA; ,*Λ|«Ç 2 t 2-22>-2.\3 92.3022 Sçt etga tçcGçàtç£ SGG-ã t Êgà« Sã SoJ^-sa 4 —1---1—,4.,,-,,3--,.,,3,,,,,3.,-1„--1—-1—-i — δ*»: gfceata*Motg»»t«*tfcg*g«»«*tti*«eo:Mrt:«4#AHW4t*t*tgM -1----1--1-3-.5.-3-.--3--1..,.1..--1-- 3ΝΆ; -292:222: M; -,:3-:1:c.í.^ -::-:,-2.-0 5.Λ Α.Ίϋ 2-:}λ.·;2 62 Lao 2.65 2*62M:2Í62|3 1—i—3— -1--..1-— 1—--1-.Z-1—1 ——i——3 inA; aaGeastçjaSttaiaiÍÍlaJiipaE-çíiaGítgglLSJEt.s.Ls.atAitfl.at^feai.ai. ----1---.3----3—1----3---.3—t—3—1----1- C«A: ^ttsjt.atata!;aaGaJ3St.g'3*i;<;aa*t»9Sst.st.t.g3j|ist*aagac6:ttíLc —i------1_—-1 i.-.v--1,,,,--.3----3----5--.,-1--.,3,, 5.i.í<:L£,-^':;r.LLEC2ta ..1 — -1—-I— , 103 153 Ϊ04 3Í3 3íí: 3S3 iJS 453 St® sai sia U3 414 TSS 014 363 4ÍS MS 132« 13Ϊ1 11.33 U33 1Í34 Αϊΐ» 1336 1373 ΡΕ1481991 2/4 ASAíiTiiísrcFsiyíiKifPBtsífiSíPr ϊ ϊί-s wev .....,.£,... ,.. ,¾.....¾..... ----3.-* —t-----1----$β <^^p?®ô»UAr^«it>1f^?ira5m!^.ifss3im.i:3:ta?;rAsspei» ----:-----1----i----1.....1......i-----1— ,3..,.--..-1..,--1 1S3 ?i!sms3i6ss?KHew5?A'?».a«:j:«j>mtí?«RSW?sp»rsíRV'CiYss ------1--,..-..1......1.......1- · · - 1----1----1-----1-----1------1 iss !ίΐ»όηί»ίόηϊΐ.>ϊ7ί!®ι?»ϊϊτνΐ'35ϊ«τ?ϊί!!»ι.'ϊϊϊ®ϊβ®«ιΐ[.ϊ&«?«ί&·ί -----1------1.....·.....α.....1----·;----1----1-.-1----5 2(53 ^SS^Síi^PíltfSSFSJWRSlTO^STmBílTGÇISClSÍPSlTlKPW .. . . . |. —1 - - - -1-----(----1-.-.- 1 v - -1 - .- .·., 1 ·. .... -. 1 ·. . . . í 15: ç -1--,.-1- - · ,1.,.,., ,1.....S... . . -1------1------1-----i-----Ί 1£>S v,,.,.1.,.-,,1,..,,..1—i—i.....i — i—-i -- --Ί·—5 !.·:-3 çm^VS»Ba^TMAmfP&&£ST8)UPSl>ím«iK»»CHKT3SSiiR?í. -,-.1..,...,¾—v- ..5...-1,---1—í—1-..-,1-,-,.i loa Μ?·*γί * Kft^spUK^iiKEOLí&osrrmjs * »s itxxvssíss: ----1-----1-----1---. -1----,1.....1--- -1------1------1-----1 <50

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