ES2280905T3 - Proteina alergenica del caucho natural. - Google Patents
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Abstract
Proteína alergénica del látex (ALP), caracterizada porque la proteína tiene al menos una identidad de secuencia del 80% con la SEQ ID NO. 12.
Description
Proteína alergénica del caucho natural.
La presente invención se refiere en general a
una proteína.
En los últimos años de 1980 y en los 90,
empezaron a recibirse informes, con una frecuencia creciente en
Europa y América, de reacciones alérgicas entre los usuarios de
guantes quirúrgicos y para exploración compuestos por látex y entre
los pacientes con espina bífida. El importante aumento en el número
de informes de alergia al látex en la última década también se ha
atribuido al aumento de la utilización de guantes de látex en la
atención sanitaria conjuntamente con los casos de SIDA en aumento.
La sensibilización al látex entre los profesionales sanitarios está
claramente relacionada con el trabajo, siendo la causa principal los
guantes de látex, o específicamente, la proteína alergénica en los
guantes de látex. No obstante, se conocen numerosas sensibilidades
cruzadas entre los alérgenos proteicos del látex y diversos
alérgenos de los alimentos y el polen. Por tanto, no es improbable
que muchos pacientes alérgicos al látex se hayan sensibilizado
inicialmente no sólo por proteínas procedentes de productos de
látex, sino también por proteínas procedentes de otras fuentes.
Existen cientos de proteínas que se encuentran
en el látex de caucho natural. De éstas, sólo unas cuantas son
alergénicas (que pueden inducir alergia). Ha habido mucho interés en
identificar las proteínas en látex de Hevea responsables de
la alergia al látex y se ha dedicado un esfuerzo considerable en el
aislamiento y purificación de las proteínas alergénicas del látex
de Hevea o productos de látex. Desde un punto de vista
distinto al académico, la elucidación de los principales alérgenos
en el látex permitiría que se desarrollaran anticuerpos contra
estas proteínas. La disponibilidad de los anticuerpos facilitaría el
desarrollo de inmunoensayos de látex, tanto para uso en laboratorio
como comercial. Existen dos tipos principales de inmunoensayos de
látex.
Estos diagnósticos se utilizan para determinar
si alguien es alérgico o está sensibilizado al látex. Estos ensayos
pueden ser o bien del formato in vitro (normalmente una
prueba serológica) o bien del formato in vivo (pruebas
cutáneas de punción). Estos ensayos se usan en investigación y en la
atención sanitaria.
Estos ensayos cuantitativos determinan la
cantidad de proteínas alergénicas presentes en los productos de
látex. Se usan para someter a prueba productos de látex tales como
guantes de látex para determinar el contenido de alérgenos del
látex extraíbles. Tales inmunoensayos serían muy valiosos en la
fabricación de productos de látex, particularmente en los aspectos
de normalización y control de calidad y garantía de calidad. Los
futuros clientes de tales inmunoensayos serían fabricantes de
productos de látex y agencias reguladoras que tienen la
responsabilidad de garantizar el cumplimiento de las
especificaciones de los productos.
La identificación de los principales alérgenos
del látex proporciona otra función útil en la atención sanitaria.
Los alérgenos del látex purificados pueden usarse en inmunoterapia
para desensibilizar a pacientes alérgicos al látex. Cuando se lleva
a cabo de manera satisfactoria, el paciente no desarrolla más una
reacción alérgica al látex. Esto es especialmente importante cuando
el paciente trabaja en un entorno (por ejemplo, en atención
sanitaria) en el que los productos de látex están omnipresentes.
Hoy en día, la Unión Internacional de Sociedades
Inmunológicas (IUIS) reconoce diez alérgenos del látex, Hev b 1 a
Hev b 10. (Existen otras proteínas del látex en consideración por la
IUIS). Aunque se está realizando un esfuerzo para buscar alérgenos
proteicos del látex importantes, muchos investigadores creen que se
ya ha dado cuenta de la mayoría de los principales alérgenos
proteicos del látex.
En 1995, el Dr. Donald Beezhold en su artículo
presentado en Int Conf on Latex Protein Allergy: The Latest
Position anunció un nuevo alérgeno del látex que tenía homología
proteica parcial con la patatina, la principal proteína de reserva
de las patatas. A esta proteína de 43 kDa se le asignó
posteriormente el nombre de la OMS/IUIS, Hev b 7. Cuando se dispuso
de una versión recombinante de Hev b 7, se encontró que era reactiva
con IgE procedente de pacientes alérgicos al látex. Sin embargo, la
proporción de pacientes que se sensibilizaron a Hev b 7
recombinante es mucho menor de lo esperado. En inmunotransferencias
de tipo Western que mostraron una banda de proteína activa a
aproximadamente 43 kDa, se encontró proteína de forma mucho más
común que lo que se podría explicar mediante la unión de IgE a Hev
b7. Así, el Hev b 7 recombinante no podía explicar la aparición muy
frecuente de sensibilidad al látex para una proteína de
aproximadamente 43 kDa. Por tanto, es posible que exista otro
alérgeno del látex desconocido de aproximadamente 43 kDa. La
búsqueda de esta proteína nueva y desconocida ha culminado en la
presente invención. Esta proteína es de naturaleza alergénica porque
el contacto con la proteína alergénica del látex (ALP,
"allergenic latex protein") puede inducir una reacción
alérgica en personas sensibilizadas a esta proteína.
La presente invención se refiere a una proteína
que se origina a partir del látex que puede inducir una reacción
alérgica en personas sensibilizadas a la proteína.
Por tanto, en un primer aspecto, la presente
invención proporciona una proteína alergénica del látex (ALP,
"allergenic latex protein"), caracterizada porque la proteína
tiene al menos una identidad de secuencia del 80% con la SEQ ID NO.
12.
Preferiblemente, la proteína o su variante
molecular se caracterizan porque la proteína tiene las siguientes
propiedades:
- a)
- tiene un peso molecular de aproximadamente 42.000 Dalton;
- b)
- tiene un punto isoeléctrico de aproximadamente 4,7;
- c)
- se une con IgE de pacientes sensibilizados a la proteína; y
- d)
- contiene la secuencia de aminoácidos como la de la figura 2 (SEQ ID NO. 12) o variaciones menores de esta secuencia de aminoácidos que no dan como resultado propiedades alergénicas de la proteína que se está alterando sustancialmente.
El segundo aspecto de la presente invención
proporciona un procedimiento para obtener una proteína o su variante
molecular en el que el procedimiento comprende las siguientes
etapas:
- a)
- centrifugar el látex para obtener la fracción inferior;
- b)
- congelar - descongelar la fracción inferior para obtener el suero B del látex; y
- c)
- aislar y purificar la proteína del suero B obtenido en (b).
Además, la presente invención proporciona una
secuencia de ADN que codifica para la proteína o una parte de la
proteína en la que la secuencia de ADN es como en la figura 1 o
variaciones menores de esta secuencia.
Además, la presente invención proporciona un
método para la producción de una proteína o sus variantes
moleculares en forma recombinante insertando el ADN que codifica
para la proteína o una variante de la proteína en un vector
apropiado e induciendo que el vector exprese la proteína
recombinante o en forma recombinante de dicha variante de la
proteína, mediante lo cual en este caso, la secuencia de aminoácidos
de la secuencia de ADN traducida anterior es como en la figura 2
(SEQ ID NO. 12).
La figura 1 muestra la secuencia de ADN del clon
de ADNc de longitud completa que codifica para la ALP. La figura 1
también se muestra en la SEQ ID NO. 11.
La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos
de la ALP derivada de la traducción del clon de ADNc que codifica
para la ALP. La figura 2 también se muestra en la SEQ ID NO. 12.
La figura 3 muestra el espectro de
espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida
por matriz (EM-MALDI) de la proteína alergénica del
látex, ALP.
La figura 4 muestra una inmunotransferencia de
tipo Western tras la separación de la proteína mediante
electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. La
proteína se tiñe con azul de Coomassie para mostrar la presencia y
la migración electroforética de ALP (carril 2). La unión de IgE
humana de pacientes sensibilizados a ALP en la inmunotransferencia
de tipo Western (carril 3), anticuerpos policlonales desarrollados
contra ALP (carril 4) y un anticuerpo monoclonal desarrollado
contra ALP (carril 5).
La figura 5 muestra una inmunotransferencia de
tipo Western tras la separación de la proteína mediante
electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. La
proteína se tiñe con azul de Coomassie para mostrar la presencia y
la migración electroforética de ALP (carril 2). Se lleva a cabo una
reacción específica para determinar la presencia de hidratos de
carbono, para demostrar la glucosilación de ALP (carril 3).
La figura 6 muestra una inmunotransferencia de
tipo Western de la proteína de fusión MBP-ALP
recombinante tras separación mediante SDS-PAGE. La
proteína se tiñe con azul de Coomassie para mostrar la migración
electroforética de la proteína de fusión de ALP recombinante
(carril 3). También se muestra la unión de ALP a anticuerpos
monoclonales (carril 4) y policlonales (carril 5) desarrollados
contra ALP nativa.
La presente invención se refiere a una proteína
aislada del suero B de látex centrifugado obtenido mediante
incisión en el árbol del caucho, Hevea brasiliensis. La
siguiente descripción detalla cómo puede aislarse, purificarse y
caracterizarse la proteína, y cómo podría usarse en la clonación del
ADNc que codifica para la proteína, cómo pueden obtenerse versiones
recombinantes de la proteína, cómo podrían desarrollarse anticuerpos
a partir de la proteína y cómo puede usarse la proteína en
inmunoensayo e inmunoterapia.
La invención se extiende a cualquier péptido o
polipéptido, términos que se usan de manera intercambiable en el
presente documento, excepto cuando se requiere lo contrario, que
tiene identidad sustancial con la ALP precursora o madura. Los
polipéptidos con identidad sustancial incluyen variantes, tales como
variantes alélicas.
Una "variante" tal como se utiliza el
término en el presente documento, puede referirse a un
polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o
polipéptido de referencia respectivamente, pero conserva
propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido
difiere en la secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de
referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la
variante pueden alterar o no la secuencia de aminoácidos de un
polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los
cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones,
adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en
el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, tal como
se trata más adelante. Una variante típica de un polipéptido
difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de
referencia. Generalmente, las diferencias son limitadas de modo que
las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son
enormemente similares en general y, en muchas regiones, idénticas.
Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la
secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones,
deleciones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácido
sustituido o insertado puede ser o no uno codificado por el código
genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser
una que se produce de manera natural tal como una variante alélica,
o puede ser una variante que no se sabe que se produce de manera
natural. Pueden prepararse variantes que no se producen de manera
natural de polinucleótidos y polipéptidos mediante técnicas de
mutagénesis o mediante síntesis directa.
Dentro de las variantes se incluyen polipéptidos
y polinucleótidos alterados. Las secuencias de ácido nucleico
"alteradas" que codifican para ALP incluyen aquellas secuencias
con deleciones, inserciones, o sustituciones de diferentes
nucleótidos, dando como resultado un polinucleótido igual a ALP o un
polipéptido con al menos una característica funcional de ALP. Están
incluidos dentro de esta definición los polimorfismos que pueden
detectarse fácilmente o no usando una sonda de oligonucleótido
particular de ALP, y la hibridación incorrecta o inesperada con
variantes alélicas, con un locus distinto al locus cromosómico
normal para la secuencia de polinucleótido que codifica para ALP.
La proteína codificada también puede "alterarse," y puede
contener deleciones, inserciones, o sustituciones de residuos de
aminoácidos que producen un cambio silencioso y dan como resultado
una ALP funcionalmente equivalente. Pueden realizarse sustituciones
de aminoácidos deliberadas basándose en la similitud de polaridad,
carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza
anfipática de los residuos, siempre que se conserve la actividad
biológica o inmunológica de ALP. Por ejemplo, los aminoácidos
cargados negativamente pueden incluir ácido aspártico y ácido
glutámico, los aminoácidos cargados positivamente pueden incluir
lisina y arginina, y los aminoácidos con grupos de cabeza polar no
cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares pueden
incluir leucina, isoleucina, y valina; glicina y alanina; asparagina
y glutamina; serina y treonina; y fenilalanina y tirosina.
Los fragmentos de ALP pueden adoptar diversas
formas, y también se dan a conocer en la descripción. Un fragmento
es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es
completamente la misma como parte, pero no toda, de la secuencia de
aminoácidos de ALP, o una variante de la misma. Los fragmentos
pueden ser "independientes", o estar comprendidos en un
polipéptido mayor del que forman una parte o región, lo más
preferiblemente como una única región continua. Ejemplos
representativos de fragmentos de polipéptido incluyen, por ejemplo,
fragmentos de desde aproximadamente el número de aminoácido
1-20, 21-40, 41-60,
61-80, 81-100, y 101 hasta el final
del polipéptido de ALP. En este contexto, "aproximadamente"
incluye los intervalos citados particularmente mayores o menores en
varios, 5, 4, 3, 2 ó 1 aminoácido en cualquier extremo o en ambos
extremos.
Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo,
polipéptidos de truncamiento que tienen la secuencia de aminoácidos
del polipéptido de ALP, excepto por la deleción de una serie
continua de residuos que incluye el extremo
amino-terminal, o una serie continua de residuos
que incluye el extremo carboxi-terminal o la
deleción de dos series continuas de residuos, incluyendo una el
extremo amino-terminal e incluyendo la otra el
extremo carboxi-terminal. También se prefieren
fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales
tales como fragmentos que comprenden hélices alfa y regiones que
forman hélices alfa, láminas beta y regiones que forman láminas
beta, giros o regiones que forman giros, espirales o regiones que
forman espirales, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas,
regiones anfipáticas alfa, regiones anfipáticas beta, regiones
flexibles, regiones que forman superficies, regiones de unión a
sustratos y regiones de alto índice antigénico. Otros fragmentos
preferidos son fragmentos biológicamente activos. Los fragmentos
biológicamente activos son aquellos que median en la actividad del
receptor, incluyendo aquellos con una actividad similar o una
actividad mejorada, o con una actividad disminuida no deseada.
También están incluidos aquellos que son antigénicos o inmunogénicos
en un animal, especialmente en un ser humano si se desea, por
ejemplo, bloquear la unión a ALP.
Preferiblemente, todos estos fragmentos de
polipéptido conservan la actividad biológica de ALP, incluyendo la
actividad antigénica. Las variantes de la secuencia y fragmentos
definidos también forman parte de la presente descripción. Las
variantes preferidas son aquellas que pueden variar de las
referencias en sustituciones de aminoácidos conservativas, es
decir, aquellas que sustituyen un residuo por otro de
características similares. Tales sustituciones típicas son entre
Ala, \/at, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre los residuos ácidos Asp
y Glu; entre Asn y Gln; y entre los residuos básicos Lys y Arg; o
los residuos aromáticos Phe y Tyr. Se prefieren particularmente las
variantes en las que se sustituyen, eliminan o añaden varios,
5-10, 1-5, o 1-2
aminoácidos, en cualquier combinación.
Sustancialmente, los polipéptidos idénticos
forman una realización preferida de la presente invención, e
incluyen aquellos con una variación en al menos una parte de la
molécula, con la opción de conservar inalterada otra parte de la
molécula. Por tanto y por ejemplo, si el polipéptido sustancialmente
idéntico es para imitar la actividad de ALP, entonces puede ser
preferible conservar inalteradas subregiones particulares, mientras
adoptan cambios en una o más de las otras subregiones, si se desea.
Los cambios pueden incluir la deleción de tales subregiones,
proporcionando así fragmentos activos.
Los polipéptidos con identidad sustancial tienen
preferiblemente al menos una identidad del 80% con un polipéptido
correspondiente que es ALP precursora o madura. Más preferiblemente,
existe al menos una identidad del 90%, tal como al menos una
identidad del 95% o al menos del 98%. La identidad de secuencia se
determina de manera adecuada mediante un programa informático,
aunque hay otros métodos disponibles. Se prefiere que se evalúe la
identidad usando el programa Gap del Genetic Computer Group
("Grupo Informático para Genética") (1994), (véase el manual
del programa para el paquete Wisconsin, versión 8, Madison
Wisconsin, EE.UU.).
La "identidad" es una medición de la
identidad de secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos.
En general, las secuencias se alinean de modo que se obtenga la
coincidencia de orden superior. "Identidad" per se tiene
un significado reconocido en la técnica y puede calcularse usando
técnicas publicadas. Véase: por ejemplo: (COMPUTATIONAL MOLECULAR
BIOLOGY, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988;
BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D.W., ed.:
Academic Press, Nueva York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE
DATA, PARTE 1, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press,
Nueva Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von
Heinje, G., Academic Press, 1987; y SEQUENCE ANALYSIS PRIMER,
Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York,
1991).
Aunque existen varios métodos para medir la
identidad entre dos secuencias de polinucleótido o polipéptido, el
término "identidad" se conoce bien por los expertos en la
técnica (Carillo, H., y Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988)
48:1073). Los métodos empleados comúnmente para determinar la
identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se
limitan a, los descritos en Guide to Huge Computers, Marlin J.
Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo, H., y
Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48:1073. Los métodos para
determinar la identidad y la similitud se codifican en programas
informáticos. Los métodos de programas informáticos preferidos para
determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias
incluyen, pero no se limitan al paquete de programas GCS (Devereux,
J., et al., Nucleic Acids Research (1984) 12(1):387);
BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F. et al., J Mol. Biol.
(1990) 215:403).
Como ilustración, por un polinucleótido que
tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos, por ejemplo,
una "identidad" del 95% con una secuencia de nucleótidos de
referencia de la SEQ ID NO: 11 se pretende que la secuencia de
nucleótidos del polinucleótido sea idéntica a la secuencia de
referencia excepto en que la secuencia del polinucleótido puede
incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de
la secuencia de nucleótidos de referencia de la SEQ ID NO: 11. En
otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una
secuencia de nucleótidos al menos idéntica en un 95% a una secuencia
de nucleótidos de referencia, pueden eliminarse o sustituirse por
otro nucleótido hasta el 5% de los nucleótidos en la secuencia de
referencia, o pueden insertarse en la secuencia de referencia
varios nucleótidos hasta el 5% de los nucleótidos totales en la
secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de
referencia pueden producirse en las posiciones 5 ó 3 terminales de
la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier sitio entre
esas posiciones terminales, intercaladas o bien individualmente
entre nucleótidos en la secuencia de referencia o bien en uno o más
grupos contiguos dentro de la secuencia de
referencia.
referencia.
De manera similar, por un polipéptido que tiene
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos, por ejemplo, una
"identidad" del 95% con una secuencia de aminoácidos de
referencia de la SEQ ID NO: 12 se pretende que la secuencia de
aminoácidos del polipéptido sea idéntica a la secuencia de
referencia excepto en que la secuencia del polipéptido puede
incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100
aminoácidos de los aminoácidos de referencia de la SEQ ID NO: 12.
En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una
secuencia de aminoácidos al menos idéntica en un 95% a una
secuencia de aminoácidos de referencia, pueden eliminarse o
sustituirse por otro aminoácido hasta el 5% de los residuos de
aminoácidos en la secuencia de referencia, o pueden insertarse en
la secuencia de referencia varios aminoácidos hasta el 5% de los
aminoácidos totales en la secuencia de referencia. Estas
alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las
posiciones amino o carboxi-terminales de la
secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier sitio entre
esas posiciones terminales, intercaladas o bien individualmente
entre residuos en la secuencia de referencia o bien en uno o más
grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Los polipéptidos de esta invención pueden
incluirse dentro de una secuencia más larga, en la forma de una
proteína de fusión, por ejemplo. Por tanto, los polipéptidos pueden
estar en la forma de la proteína "madura", o pueden ser parte
de una proteína mayor, tal como una proteína de fusión. A menudo, es
ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que
contiene secuencias secretoras o líder, secuencias pro, secuencias
que ayudan en la purificación, tales como múltiples residuos de
histidina, o una secuencia adicional para la estabilidad durante la
producción recombinante.
Los polipéptidos que son fragmentos conservan
preferiblemente la función deseada de ALP. Los fragmentos comprenden
de manera adecuada al menos 10 aminoácidos, más preferiblemente al
menos 20 aminoácidos, y normalmente al menos 40 aminoácidos.
Ejemplo
1
Se recoge látex fresco de árboles de Hevea
brasiliensis (clon RRIM 600) en recipientes enfriados. Se
centrifuga el látex a 19.000 r.p.m. (43.000 g) en una centrífuga de
alta velocidad Sorvall RC 5C durante 1 h a 4-7°C
para separarlo en tres fracciones principales: la fracción superior
que es la de crema de caucho ("rubber cream"), la fracción
pesada inferior y el suero C situado entremedias. El suero B de
látex se prepara basándose en el método de Hsia (1958) Trans
Instn Rubb Ind. Se lava la fracción inferior de látex procedente
del látex centrifugado mediante resuspensión en manitol 0,4 M y se
recupera por centrifugación. Se somete entonces la fracción
inferior lavada a congelación y descongelación repetidas para romper
los lutoides que son sus componentes principales. Se recupera el
fluido de los lutoides, el suero B, como el sobrenadante tras una
nueva centrifugación.
Se dializa el suero B durante la noche frente a
borato de sodio 0,3 mM y ácido bórico 0,016 M pH 7 en la sala fría.
Esto va seguido por filtración a través de papel de filtro Whatman
nº 1. Se cargan diez ml del suero B filtrado en una columna de
carboximetilcelulosa CM32 (Whatman) (20 cm x 1,5 cm) equilibrada con
borato de sodio 0,09 M y ácido bórico 0,016 M, pH 8,6. Se eluyen
las proteínas con un gradiente de 150 ml de borato de sodio 0,09 M
y ácido bórico 0,016 M, pH 8,6 frente a 150 ml de borato de sodio
0,9 M y ácido bórico 0,16 M, pH 8,6. Se recogen fracciones de dos
ml a una velocidad de 2,6 min/fracción. Se cargan los materiales no
retardados (es decir, fracciones 3 a 11) en una columna DE 52
(Whatman) (12 cm x 1,5 cm) equilibrada con Tris-HCl
0,1 M, pH 8. Se eluye la proteína con un gradiente de NaCl 0 - 0,5 M
en el mismo tampón. Se someten a prueba las fracciones que
contienen proteínas de aproximadamente 43 kDa, según se determina
mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida, para determinar la unión de la
inmunoglobulina IgE con suero de pacientes alérgicos al látex. Se
identifican y reúnen las fracciones que contienen ALP. El peso
molecular aproximado de ALP determinado comparando la migración de
ALP con la de diversos marcadores de calibración es de 42 kDa
(figura 4, carril 2).
Ejemplo
2
El peso molecular exacto de la proteína
alergénica del látex, ALP, determinado mediante espectrometría de
masas es de 42975. En la figura 3 se muestra el espectro de
espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida
por matriz (EM-MALDI) de la muestra de proteína.
El punto isoeléctrico (pI) de ALP se determina
mediante isoelectroenfoque (IEF, "isoelectric focusing"). Se
mide la migración de la proteína sobre el gel de IEF y se compara
con patrones de calibración de proteínas de pI conocido. Se estima
que el pI de ALP es de 4,7.
Se encuentra que la proteína está bloqueada en
el extremo N-terminal. La digestión in situ
mediante tripsina dio como resultado varios fragmentos. Las
secuencias de aminoácidos parciales se obtienen para tres de estos
fragmentos.
Secuencia 1 (SEQ ID NO. 1): YLDVQYSQFR
Secuencia 2 (SEQ ID NO. 2): YSLFSEPEK
Secuencia 3 (SEQ ID NO. 3): LPTTIIPAHGGFSSR
en las que las letras del alfabeto
son abreviaturas aceptadas para los aminoácidos
individuales.
La secuencia 1 se deriva de un péptido de 1319
Da. Los datos de la secuencia de aminoácidos obtenidos mediante
espectrometría de masas se comparan frente a la base de datos de
secuencias de proteínas del Centro Nacional de Información
Biotecnológica (NCBI, "National Centre for Biotechnology
Information"), EE.UU., usando el algoritmo BLAST. La búsqueda
reveló que la secuencia de aminoácidos tenía homología parcial con
la "proteína específica de nódulos tempranos" ("early
nodule-specific protein") de Glycine
max.
La secuencia 2 se deriva de un péptido de 1100
Da. La secuencia mostró homología parcial con "proteína específica
de nódulos tempranos" de Medicago truncatula.
La secuencia 3 se deriva de un péptido de 1556
Da. La secuencia mostró homología parcial con "proteína específica
de nódulos tempranos" de Glycine max.
Ejemplo
3
Para demostrar que está unido un hidrato de
carbono a la proteína ALP (convirtiendo ALP en una "proteína
glucosilada" o glucoproteína), las proteínas purificadas se
separan mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) sobre
geles al 15% y se transfieren de manera electroforética a una
membrana de nitrocelulosa para obtener una inmunotransferencia de
tipo Western. Se lava la membrana con solución salina tamponada con
fosfato (PBS) y luego se sumerge en peryodato de sodio 10 mM/EDTA
con agitación en la oscuridad durante 20 min. Después de esto, se
lava la membrana tres veces con PBS durante 10 minutos en cada
ciclo. A continuación, se transfiere la membrana a una disolución
compuesta por biotina-hidrazida en acetato de
sodio/EDTA y se lleva a cabo una agitación durante 60 min. Después
de tres ciclos de lavado con solución salina tamponada con Tris
(TBS), se bloquea la membrana y luego se lava otras tres veces con
TBS. Luego, se sumerge la membrana en
estreptavidina-fosfatasa alcalina durante 60 min.
Tras otros tres ciclos de lavado con TBS, se sumerge la membrana en
una disolución de sustrato de fosfato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo/azul
de nitrotetrazolio (BCIP/NBY). El aspecto del producto de reacción
con fosfatasa alcalina coloreado indicó la presencia del componente
de hidrato de carbono de la glucoproteína (figura 5).
Ejemplo
4
Se desarrollan satisfactoriamente tanto
anticuerpos policlonales como anticuerpos monoclonales contra
ALP.
Se mezcla una preparación pura de ALP
(aproximadamente 0,5 ml de 0,5 mg de ALP/ml) en solución salina
tamponada con fosfato (PBS) con un volumen igual de adyuvante
completo de Freund y esta mezcla de antígeno se inyecta por vía
subcutánea en el lomo de conejos. Se administran siete dosis de
administración de refuerzo de la misma formulación de antígeno,
pero con adyuvante incompleto de Freund, a intervalos de dos
semanas. Se extrae sangre de los conejos para obtener el
anti-suero que contenía anticuerpos policlonales
contra ALP.
Para demostrar la unión del anticuerpo
policlonal a ALP, se prepara una inmunotransferencia de tipo Western
de la proteína sobre membrana de nitrocelulosa, tal como en el
ejemplo 3. La membrana de nitrocelulosa se bloquea con leche
desnatada al 5% en PBS y después se incuba durante 90 min. con
anticuerpos policlonales anti-ALP (diluidos 1:800
en PBS-leche) como el anticuerpo primario. Tras tres
ciclos de lavado con PBS-leche, la membrana de
nitrocelulosa se incuba durante 1 h con el anticuerpo secundario,
anti-IgG de conejo conjugado con fosfatasa
alcalina. Tras tres ciclos de lavado adicionales con
PBS-leche, la membrana de nitrocelulosa se incuba
durante 10 min. en solución salina tamponada con Tris (TBS) antes de
sumergirse en sustrato de fosfato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo/azul
de nitrotetrazolio (BCIP/NBT) para generar el producto de reacción
con fosfatasa alcalina coloreado. En la figura 5, se muestra la
unión de los anticuerpos policlonales a ALP en una
inmunotransferencia de tipo Western de la proteína tras la
separación de la proteína mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida (carril 4).
Se fusionan células de bazo de un ratón Balb/c
inmunizado con suero C de látex con células de mieloma de ratón
siguiendo los protocolos descritos anteriormente por Kohler y
Milstein (12, 13). Se seleccionan las células de hibridoma
resultantes para determinar anticuerpos específicos contra proteínas
del suero C. Se vuelven a clonar dos veces los hibridomas
seleccionados y se utilizan los anticuerpos monoclonales secretados,
o bien en forma no purificada en los sobrenadantes de células de
hibridoma, o bien como preparaciones purificadas mediante
cromatografía de
afinidad.
afinidad.
Para demostrar la unión del anticuerpo
monoclonal a ALP, se utiliza una inmunotransferencia de tipo Western
de la proteína sobre membrana de nitrocelulosa y se trata como para
el anticuerpo policlonal, excepto en que se utiliza el anticuerpo
monoclonal contra ALP como el anticuerpo primario, mientras que el
anti-IgG de ratón conjugado con fosfatasa alcalina
se utiliza como el anticuerpo secundario. En la figura 4, se muestra
la unión de los anticuerpos monoclonales a ALP en una
inmunotransferencia de tipo Western de la proteína tras la
separación de la proteína mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida (carril 5).
Una variación prevista del anticuerpo monoclonal
convencional es el anticuerpo recombinante, mediante lo cual puede
generarse el anticuerpo utilizando un segmento específico de ADN que
codifica para la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o un
fragmento funcional del anticuerpo, tal como un fragmento variable
de cadena sencilla. Hay varios enfoques para el desarrollo de
anticuerpos recombinantes, de los que se explica un ejemplo en el
presente documento. En primer lugar, se construyen bibliotecas
genéticas de anticuerpos, por ejemplo, mediante amplificación por
PCR a partir de ADNc de linfocitos B. Para seleccionar estas
bibliotecas, los anticuerpos se presentan sobre la superficie de
microorganismos que contienen el gen del anticuerpo (presentación en
fago). Se exponen a la proteína antigénica para identificar clones
específicos que producen un anticuerpo que se une a esta proteína.
Una vez que se identifica el microorganismo que lleva el gen del
anticuerpo, pueden amplificarse entonces clones específicos y
utilizarse para producir el fragmento del anticuerpo en E.
coli u otro microorganismo adecuado.
Ejemplo
5
Se incuba una inmunotransferencia de tipo
Western de la proteína purificada con suero sanguíneo procedente de
pacientes alérgicos al látex para determinar si la IgE (la
inmunoglobulina que media la reacción alérgica) se une a la
proteína. La unión de IgE a la proteína indicó que la proteína es
alergénica.
Para detectar la unión
proteína-IgE en las inmunotransferencias de tipo
Western, se sigue un procedimiento similar al del ejemplo 2,
excepto en que la membrana de nitrocelulosa se incuba durante la
noche con suero reunido de varios pacientes alérgicos al látex
(diluido 1:5,25 en PBS-leche y 0,05% de azida de
sodio) como el anticuerpo primario. El anti-IgE
humano conjugado con fosfatasa alcalina sirvió como el anticuerpo
secundario. En la figura 4, se muestra la unión de la IgE humana a
ALP en una inmunotransferencia de tipo Western de la proteína tras
la separación de la proteína mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida (carril 3).
Ejemplo
6
El ADN complementario (ADNc) que codifica para
la secuencia de aminoácidos de ALP puede clonarse y multiplicarse
en un huésped, tal como un microorganismo. El microorganismo puede
seleccionarse del grupo que consiste en bacterias, levaduras y
virus. Las células de plantas superiores también pueden utilizarse
como vectores. La proteína ALP, en forma recombinante, puede
sintetizarse entonces en el mismo huésped o en un huésped
alternativo. A continuación, se da una descripción del método
utilizado para clonar el ADNc de ALP. Se utilizan métodos
convencionales en la preparación y purificación de ADN, mini y
maxipreparaciones, purificación de ADN, digestiones con
endonucleasas de restricción, electroforesis en gel de agarosa,
ligaciones, transformaciones y aislamiento de
poli(A)^{+} ARNm mediante cromatografía en columna
de oligo(dT)-celulosa.
Se recoge látex haciendo un sangrado en el árbol
Hevea brasiliensis. Antes de realizar el sangrado en el
árbol, se le fija una boquilla de drenaje esterilizada.
Inmediatamente tras el sangrado, la incisión y la boquilla se lavan
con aproximadamente 20 ml de 2x tampón de extracción de ARN
(Tris-HCl 0,1 mol, LiCl 0,3 mol, EDTA 0,01 mol, 10%
de SDS, pH 9,5). El látex se lava entonces con 100 ml de tampón de
extracción de ARN hasta un volumen total recogido de 200 ml en un
matraz cónico estéril. En el laboratorio, el látex se mezcla bien y
se centrifuga en tubos de polialómero a 112.700 g durante 30 minutos
a 15°C. Se decanta suavemente la fase acuosa en tubos de centrífuga
estériles y se realiza el tratamiento posterior de la fase acuosa
para aislar el ARN total según el método de Prescott y Martin
(1987) Plant Mol Biol Rep.
Se prepara la síntesis de ADNc de primera hebra
mediante la transcripción inversa de 1 microgramo de ARN de látex
total en un volumen de 20 \mul utilizando el kit GeneRacer™
(Invitrogen, EE.UU.) según las instrucciones del vendedor. Se lleva
a cabo la síntesis de ADNc mediante amplificación por PCR.
Se amplifica el ADNc por PCR sin purificación
previa. Se realiza cada reacción en un volumen de 50 \mul que
contiene 2 \mul de la reacción de primera hebra anterior, 12,5
\muM de cebador 3' GeneRacer™
(5'-GCTGTCAACGA
TACGCTACGTAACG-3' (SEQ ID NO. 4) en la que A, G, C y T son las abreviaturas para las bases de nucleótidos adenina, guanina, citosina y timina, respectivamente), 12,5 \muM de cebador específico, dATP 0,2 mMol, dTTP 0,2 mMol, dCTP 0,2 mMol, dGTP 0,2 mMol, pH 7,5, 1 unidad de Taq High Fidelity (Roche Diagnostics GmbH), Tris-HCl 10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 50 mM, pH 8,3,y se recubre con 50 \mul de aceite mineral. La reacción de PCR tuvo lugar en un termociclador siguiendo las instrucciones del fabricante. Se realiza una segunda tanda de PCR igual que anteriormente pero utilizando 5 \mul de la PCR de la primera tanda como molde. Se utilizan 20 \mul del producto de amplificación por PCR para el análisis en un gel de agarosa al 1,0% teñido con bromuro de etidio.
TACGCTACGTAACG-3' (SEQ ID NO. 4) en la que A, G, C y T son las abreviaturas para las bases de nucleótidos adenina, guanina, citosina y timina, respectivamente), 12,5 \muM de cebador específico, dATP 0,2 mMol, dTTP 0,2 mMol, dCTP 0,2 mMol, dGTP 0,2 mMol, pH 7,5, 1 unidad de Taq High Fidelity (Roche Diagnostics GmbH), Tris-HCl 10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 50 mM, pH 8,3,y se recubre con 50 \mul de aceite mineral. La reacción de PCR tuvo lugar en un termociclador siguiendo las instrucciones del fabricante. Se realiza una segunda tanda de PCR igual que anteriormente pero utilizando 5 \mul de la PCR de la primera tanda como molde. Se utilizan 20 \mul del producto de amplificación por PCR para el análisis en un gel de agarosa al 1,0% teñido con bromuro de etidio.
El producto de la PCR (aproximadamente 1,5 Kb de
tamaño) se liga en el vector TOPO® (Invitrogen, EE.UU.) según las
instrucciones del vendedor. El ligado (2 \mul) se utiliza para la
transformación de Escherichia coli químicamente competente
One Shot® TOP10 (Invitrogen, EE.UU.) para determinar la resistencia
a la ampicilina. Tras incubar durante toda la noche a 37°C en medio
agar que contiene ampicilina (100 \mug/ml), se recogieron los
transformantes mediante selección de color en Xgal (80
\mug/ml)/IPTG (3 mmol/L). Se seleccionan los clones recogidos
mediante ensayo de minipreparaciones utilizando el sistema de
purificación de ADN Wizard® SV Minipreps (Promega, EE.UU.) según
las instrucciones del vendedor. Entonces se envía 1 \mug de los
clones seleccionados para la secuenciación del ácido nucleico.
Las secuencias de ADN (1394 pares de bases,
figura 1 y SEQ ID NO. 11) se traducen en los aminoácidos para los
que codifican (figura 2 y SEQ ID NO. 12). La secuencia de
aminoácidos englobó los siguientes segmentos:
1) ctaccaactactattatacctgctcatggtggatttagt (SEQ
ID NO. 5: en la posición 384 a 422) codifica para el péptido
LPT
TIIPAHGGFS (SEQ ID NO. 6).
TIIPAHGGFS (SEQ ID NO. 6).
2) taccttgatgtccaatattcgcaattccgg (SEQ ID NO. 7:
en la posición 429 a 458) codifica para el péptido YLDVQYSQ
FR (SEQ ID NO. 8)
FR (SEQ ID NO. 8)
3) tattctttattcagtgagccagaaaaa (SEQ ID NO. 9: en
la posición 897 a 923) codifica para el péptido YSLFSEPEK (SEQ ID
NO. 10),
en las que a, g, c y t son las abreviaturas para
las bases de nucleótidos adenina, guanina, citosina y timina,
respectivamente. Tal como se observó anteriormente, estos tres
dominios de proteína se han identificado anteriormente mediante
espectrometría de masas. Los solicitantes observan que variaciones
menores de la secuencia de ADN no alterarían sustancialmente las
características básicas del péptido para el que codifica el ADN.
Ejemplo
7
Hay varios kits comerciales que pueden
utilizarse para la sobreexpresión de la proteína alergénica del
látex. En este ejemplo, se utiliza el sistema de purificación y
fusión de la proteína pMAL-c2 (New England Biolabs,
EE.UU.) para sobreexpresar proteína recombinante a partir de su ADNc
clonado. Los procedimientos utilizados para la sobreproducción de
la proteína de fusión, purificación mediante cromatografía de
afinidad, escisión de la proteína de fusión mediante la proteasa
factor Xa y purificación de la proteína objetivo mediante
cromatografía en hidroxiapatita, son según las instrucciones del
vendedor. En este ejemplo, se utiliza isopropiltiogalactósido
(IPTG) como inductor para el sistema de expresión.
El ADNc de ALP se subclona en el vector
pMAL-c2 en el mismo marco de lectura de traducción
que el gen malE del vector. Las células bacterianas se hacen
crecer durante la noche a 37°C sobre una placa indicadora LB que
contiene ampicilina 100 \mug/ml, isopropiltiogalactósido (IPTG) 10
\mumol y Xgal 10 \mug/ml. Se recogen y se seleccionan las
colonias blancas para detectar la presencia del plásmido de fusión
MBP mediante ensayo de minipreparaciones. Entonces se toma un clon
positivo para la sobreproducción de la proteína REF. Se rompen
células de E. coli inducidas por IPTG mediante un ciclo de
congelación (-20°C)/descongelación (temperatura ambiente) y
sonicación (Vibra Cell, Sonics & Materials Inc., EE.UU.), en un
baño de agua con hielo con pulsos de 15 segundos durante 3 minutos.
Se monitoriza la liberación de la proteína de fusión eluida de la
columna de amilosa sometiendo a ensayo la proteína. Aunque la
secuencia de aminoácidos del péptido está determinada por la
secuencia del ADNc en el vector de expresión, los solicitantes
observan que cambios menores en las secuencia de ADNc no alterarían
sustancialmente las características básicas de la proteína
recombinante. La figura 6 muestra la proteína recombinante
expresada y su unión a anticuerpos que se habían desarrollado contra
su homólogo nativo (natural) purificado a partir del látex de
caucho natural.
Ejemplo
8
La ALP natural o recombinante o su variante
molecular (una proteína similar a ALP, pero que difiere ligeramente,
por ejemplo, en algunos aminoácidos) puede utilizarse por sí misma,
o en combinación con un anticuerpo desarrollado contra ALP o su
variante molecular, en inmunoensayos. Las variantes moleculares de
ALP pueden producirse de manera natural en el látex o pueden
existir como resultado de la manipulación de laboratorio. Tales
variantes de ALP pueden diferir sólo ligeramente unas de otras (por
ejemplo, en algunos aminoácidos) y pueden tener sustancialmente
funciones o características básicas sustancialmente similares,
incluyendo la alergenicidad. Tales inmunoensayos pueden construirse
en muchos formatos diferentes, pero básicamente se basan en la
reacción inmunológica entre un anticuerpo y su antígeno. En este
caso, el anticuerpo puede ser un anticuerpo contra ALP o su
variante molecular, o IgE humana. Su antígeno puede ser ALP natural
o recombinante o su variante molecular, o un péptido que incorpora
el sitio del epítopo de ALP o su variante molecular.
El inmunoensayo puede utilizarse para el
diagnóstico de la alergia a ALP o alergia al látex en general. En
un formato diferente, el inmunoensayo puede utilizarse para la
detección de ALP en látex o productos de látex.
Ejemplo
9
La inmunoterapia es un tratamiento preventivo
para las reacciones alérgicas que se lleva a cabo administrando
gradualmente dosis crecientes del alérgeno al que la persona es
alérgica. Los aumentos por incrementos del alérgeno hacen que el
sistema inmunológico se haga menos sensible a la sustancia cuando se
encuentre con la sustancia en el futuro. Hay varios protocolos de
tratamiento para inmunoterapia. Como ejemplo, la inmunoterapia con
ALP puede llevarse a cabo inyectando una muestra purificada de ALP
en la piel del brazo. Puede administrarse una inyección una vez a
la semana durante aproximadamente 30 semanas, tras lo cual pueden
administrarse inyecciones cada dos semanas. Finalmente, las
inyecciones pueden administrarse cada cuatro semanas. La duración
del tratamiento puede ser de tres o cuatro años, a veces más larga.
En lugar de ALP natural, la inmunoterapia también puede llevarse a
cabo con una ALP recombinante adecuada o la variante molecular de
ALP (una proteína similar a ALP, pero que difiere ligeramente, por
ejemplo, en algunos aminoácidos), o un péptido que representa una
parte de ALP o su variante molecular.
A partir de la descripción anterior, un experto
en la técnica puede establecer fácilmente las características
esenciales de la presente invención, y sin apartarse del espíritu y
el alcance de la misma, puede realizar diversos cambios y
modificaciones de la invención para adaptarla a diversos usos y
condiciones.
<110> Malaysian Rubber Board (Consejo del
Caucho Malayo)
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Documento EPP89347
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Solicitud de patente malaya nº
PI200307
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 28/02/2003
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hevea brasiliensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Leu Asp Val Gln Tyr Ser Gln Phe
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hevea brasiliensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Ser Leu Phe Ser Glu Pro Glu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hevea brasiliensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Pro Thr Thr Ile Ile Pro Ala His Gly Gly
Phe Ser Ser Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hevea brasiliensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgtcaacg atacgctacg taacg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hevea brasiliensis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaccaacta ctattatacc tgctcatggt ggatttagt
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hevea brasiliensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Pro Thr Thr Ile Ile Pro Ala His Gly Gly
Phe Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hevea brasiliensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaccttgatg tccaatattc gcaattccgg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hevea brasiliensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Try Leu Asp Val Gln Tyr Ser Gln Phe
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hevea brasiliensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaattctttat tcagtgagcc agaaaaa
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hevea brasiliensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Ser Leu Phe Ser Glu Pro Glu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1394
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hevea brasiliensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1.5cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 464
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hevea brasiliensis
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (404)..(404)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se produce de manera natural
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (407)..(407)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se produce de manera natural
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (418)..(418)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se produce de manera natural
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (438)..(439)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se produce de manera natural
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (451)..(451)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se produce de manera natural
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (21)
1. Proteína alergénica del látex (ALP),
caracterizada porque la proteína tiene al menos una identidad
de secuencia del 80% con la SEQ ID NO. 12.
2. Proteína alergénica del látex (ALP) según la
reivindicación 1, que tiene al menos una identidad de secuencia del
90% con la SEQ ID NO. 12.
3. Proteína alergénica del látex (ALP) según la
reivindicación 2, que tiene al menos una identidad de secuencia del
95% con la SEQ ID NO. 12.
4. Proteína alergénica del látex (ALP) según la
reivindicación 3, que tiene al menos una identidad de secuencia del
98% con la SEQ ID NO. 12.
5. Proteína alergénica del látex (ALP) según la
reivindicación 4, que consiste en la secuencia de SEQ ID NO.
12.
6. Proteína alergénica del látex (ALP) según
cualquier reivindicación anterior, que puede inducir una reacción
alérgica en personas sensibilizadas a la proteína.
7. Proteína alergénica al látex (ALP) según
cualquier reivindicación anterior, en la que la secuencia de ADN
que codifica para la proteína es la SEQ ID NO. 11.
8. Proteína alergénica al látex (ALP) según
cualquier reivindicación anterior, en la que la proteína tiene las
siguientes propiedades:
- a)
- un peso molecular de aproximadamente 42.000 Dalton;
- b)
- un punto isoeléctrico de aproximadamente 4,7; y
- c)
- se une con IgE de pacientes sensibilizados a la proteína.
9. Proteína según cualquier reivindicación
anterior, que comprende además una secuencia de aminoácidos
adicional que contiene secuencias líder o secretoras, prosecuencias
y secuencias que ayudan en la purificación, o una secuencia
adicional para la estabilidad durante la producción
recombinante.
10. Proteína según cualquier reivindicación
anterior, que es una proteína de fusión.
11. Procedimiento para obtener una proteína
según cualquier reivindicación anterior, en el que el procedimiento
comprende las etapas siguientes:
- a)
- centrifugar el látex para obtener la fracción inferior;
- b)
- congelar - descongelar la fracción inferior para obtener el suero B del látex; y
- c)
- aislar y purificar la proteína del suero B obtenido en la etapa (b).
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que el aislamiento y la purificación de la proteína se llevan a
cabo mediante una serie de separaciones cromatográficas.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que la separación cromatográfica es cromatografía de intercambio
iónico y filtración en gel.
14. Secuencia de ADN que codifica para la
proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 10, en la que
la secuencia de ADN es la de la SEQ ID NO. 11 o una variante que
tiene al menos una identidad de secuencia del 95% con ella.
15. Método para la producción de una proteína,
según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 10, en forma
recombinante, que comprende las etapas de:
- a)
- insertar el ADN que codifica para la proteína en un vector viral o célula huésped apropiados; e
- b)
- inducir el vector viral o la célula huésped para que expresen una proteína recombinante.
16. Método para la producción de una proteína en
forma recombinante según la reivindicación 15, en el que el ADN que
codifica para la proteína es la SEQ ID. NO. 11.
\newpage
17. Método para la producción de una proteína en
forma recombinante según la reivindicación 15 ó 16, en el que la
célula huésped es un microorganismo, una planta o un animal.
18. Método para la producción de una proteína en
forma recombinante según la reivindicación 17, en la que el
microorganismo es una bacteria o una levadura.
19. Método para la producción de una proteína en
forma recombinante según la reivindicación 18, en el que el
microorganismo es Escherichia coli.
20. Método para la producción de una proteína en
forma recombinante según la reivindicación 15, en el que el
inductor es preferiblemente isopropiltiogalactósido (IPTG) o
cualquier otro inductor adecuado.
21. Proteína nativa según cualquiera de las
reivindicaciones 1 - 10 para su uso en inmunoensayos e
inmunoterapia.
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|---|---|---|---|
| MY0300734 | 2003-02-28 | ||
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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| BRPI0804885A2 (pt) * | 2008-06-26 | 2010-03-09 | Pele Nova Biotecnologia Sa | preparado protéico, composição, uso de um preparado protéico e uso de uma composição |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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