DE69833460T2

DE69833460T2 - Rekombinantes allergen mit reduzierter enzymatischer aktivität

Info

Publication number: DE69833460T2
Application number: DE69833460T
Authority: DE
Inventors: Claudine Bruck; Alex Bollen; Paul Jacobs; Marc Massaer
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1997-11-19
Filing date: 1998-11-16
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2018-11-17
Also published as: ES2257825T3; EP1674576A1; EP1032669A2; DE69833460D1; GB9724531D0; EP2017342A1; EP1032669B1; WO1999025823A2; CA2309885A1; JP2001523452A; US7348009B1; WO1999025823A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue therapeutische Formulierungen, wobei die Formulierungen wirksam in der Reduzierung allergischer Reaktionen auf spezifische Allergene sind. Ferner betrifft diese Erfindung neue Polynukleotide, durch sie codierte Polypeptide und die Verwendung solcher Polynukleotide und Polypeptide und ihre Herstellung. Insbesondere werden neue Impfstoffe bereitgestellt, die Polypeptide umfassen, und ihre Verwendung in der Behandlung von Menschen, die an Allergien leiden, oder zur Prävention von Individuen, die einem Risiko an Allergien unterliegen, wobei die Impfstoffe bevorzugt ein rekombinantes mutiertes Pro-Dermatophagoides pteronyssinus-Allergen DerP1 umfassen.
Allergische Reaktionen in Menschen sind häufig und können durch eine Vielzahl von Allergenen ausgelöst werden. Allergische Individuen sind gegen Allergene sensibilisiert und sind durch die Gegenwart hoher Mengen an Allergen-spezifischem IgE im Serum gekennzeichnet und besitzen Allergen-spezifische T-Zell-Populationen, die Cytokine vom Th2-Typ (IL-4, IL-5 und IL-13) erzeugen. Die Bindung von IgE in Gegenwart von Allergen an auf der Oberfläche von Mastzellen und Basophilen vorhandenen Fc-Rezeptoren führt zur schnellen Degranulation der Zellen und anschließenden Freisetzung von Histamin und anderen vorgebildeten und neugebildeten Mediatoren der inflammatorischen Reaktion. Zusätzlich führt die Stimulation der T-Zell-Abrufreaktion zur Erzeugung von IL-4 und IL-13, die durch Zusammenwirkung B-Zell-Reaktionen weiter zur Allergen-spezifischen IgE-Erzeugung schalten. Für Einzelheiten der Erzeugung der allergischen Reaktionen der frühen und späten Phase siehe Joost Van Neeven et al., 1996, Immunology Today, 17, 526. Bei nicht-allergischen Individuen kann die Immunreaktion auf die gleichen Antigene zusätzlich Cytokine vom Th1-Typ wie IFN-γ einschließen. Diese Cytokine können das Einsetzen von allergischen Reaktionen durch die Inhibierung hoher Grade von Immunreaktionen vom Th2-Typ verhindern, einschließlich hoher Mengen von Allergen-spezifischem IgE. Bedeutend in dieser Hinsicht ist die Tatsache, daß die IgE-Synthese durch einen inhibitorischen Rückkopplungsmechanismus gesteuert werden kann, der durch die Bindung von IgE/Allergen-Komplexen an den CD23-Rezeptor auf B-Zellen vermittelt werden kann (Luo et al., J. Immunol., 1991, 146 (7), 2122-9; Yu et al., 1994, Nature, 369 (6483); 753-6). In Systemen, denen zellulär gebundenes CD23 fehlt, tritt diese Inhibierung der IgE-Synthese nicht auf.
Derzeitige Strategien in der Behandlung solcher allergischen Reaktionen schließen Mittel zur Prävention der symptomatischen Wirkungen der Histaminfreisetzung durch Behandlungen mit Antihistaminika und/oder lokale Verabreichung von entzündungshemmenden Kortikosteroiden ein. Andere Strategien, die sich in der Entwicklung befinden, schließen diejenigen ein, die das Immunsystem des Wirts zur Prävention der Degranulation der Mastzellen verwenden, Stanworth et al., EP 0 477 231 B1 . Andere Formen von Immuntherapie wurden beschrieben (Hoyne et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 1783-1788; Holt et al., Lancet, 1994, 344, 456-458).
Es wurde festgestellt, daß einige gemeinsame Allergene, die in Bienengift, Ausscheidungen der Hausstaubmilbe und Parasitenproteinen vorhanden sind, die Mastzelldegranulation induzieren und die Interleukin-4-Synthese und -Sekretion stimulieren, selbst in Abwesenheit von Allergen-spezifischem IgE (Machado et al., 1996, Eur. J. Immunol. 26, 2972-2980).
Diese nicht-immunologische Degranulation durch proteolytische Allergene wie Bienengift-Phospholipase A2 oder Proteasen, die mit Ausscheidungen der Hausstaubmilbe verbunden sind, hängt von enzymatischer Aktivität ab.
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante mutierte Allergene mit signifikant reduzierter proteolytischer Aktivität relativ zum proteolytisch aktiven Allergen vom Wildtyp sowie Nukleinsäuren, die diese codieren, und ihre Verwendung als prophylaktisches oder immuntherapeutisches Mittel gegen Allergie bereit. Ein bevorzugtes Allergen ist das Hausstaubmilben-Allergen DerP1.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Bereitstellung von Formulierungen zur Behandlung und Prophylaxe von Allergie durch Bereitstellen von Mitteln zur Abregulation der Produktion von IgE sowie Modifizierung der Zell-vermittelten Reaktion auf das Allergen durch eine Verschiebung von einer Reaktion vom Th2-Typ zum Th1-Typ (gemessen durch die Reduzierung des Verhältnisses von IL-4:IFN-γ-erzeugenden DerP1-spezifischen T-Zellen oder alternativ eine Reduktion des IL-5:IFN-γ-Verhältnisses). Dies wird durch die Bereitstellung und Verwendung von rekombinanten mutierten Allergenen mit beeinträchtigter enzymatischer Aktivität erreicht.
DerP1, ein Protease-Allergen der Gruppe 1 der Hausstaubmilbe Dermatophagoides pteronyssinus (Topham et al., 1994, Protein Engineering, 7, 7, 869-894; Simpson et al., 1989, Protein Sequences and Data Analyses, 2, 17-21), ist ein solches Allergen. Es ist ein Protein mit 30 KDa und wurde kloniert und sequenziert (Chua et al., 1988, J. Exp. Med., 167, 175-182). Es enthält bekanntermaßen 222 Aminosäure-Reste im reifen Protein. Die Sequenz von DerP1 teilt 31 % Homologie mit Papain und teilt in bedeutender Weise Homologie in den enzymatisch aktiven Regionen, am bemerkenswertesten das Cys35-His170-Ionenpaar (Topham et al., siehe oben). DerP1 wird im Mitteldarm der Milbe erzeugt, wo seine Rolle wahrscheinlich mit der Verdauung von Nahrung in Beziehung steht. Bis zu 0,2 ng proteolytisch aktives DerP1 sind in jedem Kotpellet mit einem Durchmesser von jeweils ca. 10-40 μm vorhanden und werden deshalb leicht in die menschlichen Atemwege eingeatmet. Lagerung von gereinigten DerP1-Zubereitungen bei Raumtemperatur über Nacht führt zu einem fast vollständigem Verlust an enzymatischer Aktivität aufgrund autoproteolytischen Abbaus (Machado et al., 1996, Eur. J. Immunol. 26, 2972-2980).
Es wurde festgestellt, daß DerP1 den niedrigaffinen Immunglobulin-IgE-Fc-Rezeptor von der Oberfläche von humanen B-Lymphozyten (CD23, Hewitt et al., 1995, J. Exp. Med., 182, 1537-1544) und CD25 (Schultz et al., J. Exp. Med., 1998, 187(2):271-5), der alpha-Untereinheit des humanen T-Zell-Interleukin-2-Rezeptors, spaltet. Spaltung des Rezeptors von der B-Zelloberfläche wurde mit einer parallelen Zunahme von löslichem CD23 im Kulturüberstand in Verbindung gebracht. Es wurde nahegelegt, daß der Verlust von Zelloberflächen-CD23 aus IgE-sezernierenden B-Zellen IgE-Immunreaktionen durch Abtragen des wichtigen inhibitorischen Rückkopplungsmechanismus fördern und steigern kann, der normalerweise die IgE-Synthese beschränkt (Hewitt et al., 1995, J. Exp. Med., 182, 1537-1544). Da außerdem gezeigt wurde, daß lösliches CD23 die IgE-Erzeugung fördert, können Fragmente von CD23, die durch DerP1 freigesetzt werden, direkt die Synthese von IgE steigern. Zusätzlich zu den Wirkungen der CD23-Spaltung induziert die Spaltung von CD25 von der Oberfläche von T-Zellen eine Abnahme der Proliferation und INF-gamma-Sekretion, die entsprechend die Immunreaktion hin zu einer Reaktion vom Th2-Typ beeinflussen kann. Kürzliche Veröffentlichungen in bezug auf das DerP1-Antigen sind Machado et al., Eur. J. Immunol (1996) 26:2972- 2980; Hewitt et al., J. Exp. Med. (1995) 182: 1537-1544; und Schulz et al., Eur. J. Immunol. (1995) 25: 3191-3194.
Andere mutierte Allergene mit reduzierter proteolytischer Aktivität, die einen Teil der vorliegenden Erfindung bilden, können auf anderen Cysteinproteasen der Gruppe I beruhen, wie Derf1 aus Dermatophagoides farinae (80 % Homologie mit DerP1), sowie auf Allergenen der Gruppe III (Serinproteasen), einschließlich DerpIII (Stewart et al., 1992, Immunology, 75, 29-35) und DerpIV (Yaseuda et al., 1993, Clin. Exp. Allergy, 23, 384-390); und auf den Allergenen der Gruppe IV (Amylasen).
Die Allergene der vorliegenden Erfindung werden rekombinant erzeugt. Die DerP1-proteolytische Aktivität kann durch Einführen von Mutationen in die cDNA oder genomische DNA entweder am enzymatisch aktiven Zentrum oder am Spaltort zwischen dem Propeptid und dem reifen Molekül beeinträchtigt werden, wobei das mutierte Allergen die folgenden Vorteile gegenüber dem Allergen vom Wildtyp hat: 1) Zunahme des Aspekts vom Th1-Typ der Immunreaktionen im Vergleich mit denjenigen, die durch das Allergen vom Wildtyp stimuliert werden, was dadurch zur Unterdrückung des allergischen Potentials des geimpften Wirtes führt, und 2) reduzierte Allergenität, wodurch es somit geeigneter für die systemische Verabreichung von hohen Dosen des Immunogens ist, 3) es wird DerP1-spezifisches IgG induzieren, das mit IgE um die Bindung von nativem DerP1 konkurriert.
Die erfindungsgemäßen Allergene sind auch stabiler als isoliertes oder rekombinantes aktives DerP1 gemäß Messung durch den Mangel an autoproteolytischem Abbau. Somit stellt die vorliegende Erfindung auch Allergene bereit, die stabil im Vergleich zur Form des Allergens vom Wildtyp sind, wobei die Allergene eine signifikant reduzierte proteolytische Aktivität haben und im wesentlichen Proteine voller Länge sind, wobei die Allergene gegebenenfalls ferner die Proform des Allergens umfassen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine Nukleinsäure bereit, die mutiertes Pro-DerP1 wie oben ausgeführt codiert, und ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt mutiertes Pro-DerP1 als solches bereit. Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt im wesentlichen stabiles rekombinantes DerP1 bereit, wobei das stabile DerP1 das reife Protein im wesentlichen voller Länge ist, das ferner den Pro-DerP1-Abschnitt umfaßt. Der Begriff "stabil" im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung ist ein Produkt, das keinen wesentlichen Zersetzungsbeitrag durch Autoproteolyse bei Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur im Vergleich mit proteolytisch aktivem DerP1 vom Wildtyp erfährt, gemäß Nachweis durch SDS-PAGE-Analyse.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines mutierten Pro-DerP1-Proteins bereit, wobei das Verfahren das Exprimieren von DNA, die das Protein codiert, in einer rekombinanten Wirtszelle und das Gewinnen des Produkts umfaßt.
Ein DNA-Molekül, das ein mutiertes Pro-DerP1 (oder ein anderes mutiertes Allergen) codiert, bildet einen weiteren Aspekt der Erfindung und kann durch Standard-DNA-Synthesetechniken, wie zum Beispiel durch enzymatische Ligation, wie beschrieben von D.M. Roberts et al., Biochemistry 1985, 24, 5090-5098, durch chemische Synthese, durch enzymatische Polymerisation in vitro oder durch eine Kombination dieser Techniken synthetisiert werden.
Die enzymatische Polymerisation von DNA kann in vitro unter Verwendung einer DNA-Polymerase wie DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) in einem geeigneten Puffer durchgeführt werden, der die Nukleosidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP nach Bedarf enthält, bei einer Temperatur von 10-37°C, allgemein in einem Volumen von 50 ml oder weniger. Die enzymatische Ligation von DNA-Fragmenten kann unter Verwendung einer DNA-Ligase wie T4-DNA-Ligase in einem geeigneten Puffer wie 0,05 M Tris (pH 7,4), 0,01 M MgCl₂, 0,01 M Dithiothreit, 1 mM Spermidin, 1 mM ATP und 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin bei einer Temperatur von 4°C bis Umgebungstemperatur durchgeführt werden, allgemein in einem Volumen von 50 ml oder weniger. Die chemische Synthese des DNA-Polymers oder von Fragmenten kann durch herkömmliche Phosphotriester-, Phosphit- oder Phosphoramidit-Chemie unter Verwendung von Festphasentechniken wie denjenigen durchgeführt werden, die beschrieben werden in "Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments – A Laboratory Manual" (Hrsg. H.G. Gassen und A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), oder in anderen wissenschaftlichen Veröffentlichungen, zum Beispiel M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sporat und R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sporat und W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. Matteucci und M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci und M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus und H. Koster, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; und H.W.D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801.
Alternativ kann die codierende Sequenz aus DerP1-mRNA unter Verwendung bekannter Techniken (z.B. reverse Transkription von mRNA, um einen komplementären cDNA-Strang zu erzeugen) und handelsüblicher cDNA-Kits abgeleitet werden.
Die proteolytische Aktivität der mutierten Allergene kann mit dem Wildtyp durch einen CD23-Spalttest gemäß Schultz et al., 1995, European Journal of Immunology, 25, 3191-3194, oder enzymatischen Abbau von Substraten verglichen werden, beschrieben in Machado et al., 1996, Euro. J. Immunol. 26, 2972-2980. Die Immunogenität des mutierten Allergens kann mit derjenigen des Allergens vom Wildtyp durch verschiedene immunologische Tests verglichen werden. Die Kreuzreaktivität der mutierten und Wildtyp-Allergene kann durch In-vitro-T-Zell-Assays nach Impfung mit entweder mutierten oder Wildtyp-Allergenen getestet werden. Kurz gesagt können aus geimpften Tieren isolierte T-Zellen aus der Milz in vitro mit entweder mutiertem oder Wildtyp-Allergen restimuliert werden, gefolgt von Messung der Cytokinerzeugung mit handelsüblichen ELISA-Assays, oder die Vermehrung von Allergen-spezifischen T-Zellen kann im Zeitverlauf durch die Aufnahme von tritiiertem Thymidin getestet werden. Auch kann die Immunogenität durch ELISA-Assay bestimmt werden, dessen Einzelheiten leicht durch den Fachmann bestimmt werden können. Kurz gesagt werden zwei Typen von ELISA-Assays erwogen. Zuerst die Bewertung der Erkennung des mutierten DerP1 durch Seren von Mäusen, die mit dem DerP1 vom Wildtyp immunisiert wurden; und zweitens durch Erkennung des DerP1-Allergens vom Wildtyp durch die Seren von Tieren, die mit dem mutierten Allergen immunisiert wurden. Kurz gesagt werden jeweilige Vertiefungen mit 100 ng von gereinigtem Wildtyp- oder mutiertem DerP1 über Nacht bei 4°C beschichtet. Nach Inkubation mit einer Blockierungslösung (TBS – Tween 0,1 % mit 1 % BSA) werden aufeinanderfolgende Verdünnungen von Seren bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Die Vertiefungen werden 5-mal gewaschen und das Gesamt-IgG durch Inkubieren mit einem mit alkalischer Phosphatase konjugierten Anti-IgG-Antikörper dargestellt.
Die Reduzierung von enzymatisch aktivem Allergen oder DerP1 kann durch Einführen von Mutationen in die native Sequenz vor der rekombinanten Erzeugung der inaktivierten Mutanten durchgeführt werden. Die kann erreicht werden durch:
Einführen von Substitutionen, Deletionen oder Additionen in die aktiven Zentren; durch Inserieren, Deletieren oder Substituieren von Resten in Regionen der Reifung des inaktiven Proenzyms zum aktiven reifen Protein; oder durch Veränderung der dreidimensionalen Struktur des Proteins, so daß die enzymatische Aktivität verlorengeht. Dies kann unter anderem durch Exprimieren des Proteins in Fragmenten oder durch Deletieren von Cystein-Resten, die an der Disulfidbrückenbildung beteiligt sind, oder durch Deletieren oder Addieren von Resten erreicht werden, so daß die Tertiärstruktur des Proteins substantiell verändert wird. Alternativ können Mutationen mit der Wirkung der Veränderung der Wechselwirkung zwischen den Cys- und den His-Resten in den Positionen 34 bzw. 170 des reifen Proteins (entsprechend den Positionen 132 bzw. 268 des Prä-Pro-Proteins) im resultierenden vollständig gefalteten rekombinanten Protein erzeugt werden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt drei spezifische Mutationen, die als Beispiele für proteolytisch inaktives Pro-DerP1 angegeben werden. Erstens wird die enzymatische Aktivität von DerP1 durch Substituieren eines Cystein-Restes im aktiven Zentrum für ein Alanin aufgehoben. Diese Substitution erfolgt bei Cys132→Ala132 der Pro-DerP1-Proteinsequenz und ist in SEQ ID NO:1 dargestellt. Zweitens wird das DerP1-Allergen rekombinant exprimiert und in seiner inaktiven Pro-Proteinform durch Deletion von vier Aminosäure-Resten in der Linker-Region zwischen den Pro- und reifen Proteinen bewahrt. Diese Deletion entfernt die Aminosäure-Reste NAET aus dem Ort 96 bis einschließlich 99 aus der Pro-DerP1-Proteinsequenz. Diese Sequenz ist in SEQ ID NO:2 dargestellt. Drittens wird die enzymatische Aktivität von DerP1 durch Substituieren eines Histidin-Restes im aktiven Zentrum für ein Alanin aufgehoben. Diese Substitution erfolgt bei His268→Ala268 der Pro-DerP1-Proteinsequenz und ist in SEQ ID NO:3 dargestellt.
Die aktiven Zentren jedes enzymatischen Allergens vom Wildtyp können aus der Literatur oder durch Verweis auf Homologe bestimmt werden. Zum Beispiel können die aktiven Zentren von DerP1, das eine Cysteinprotease ist, mutmaßlich durch Verweis auf andere bekannte Cysteinproteasen wie Papain abgeleitet werden. DerP1 teilt wesentliche strukturelle und mechanistische Merkmale mit anderen Papain-artigen Cysteinproteinasen, einschließlich Cathepsin B. Das Thiolat-Imidazolium-Ionenpaar des aktiven Zentrums umfaßt die Seitenketten von Cys34 und His170 (Topham et al., 1994, Protein Engineering, 7, 7, 869-894).
Mutierte Versionen von DerP1 können durch ortsgerichtete Mutagenese der cDNA hergestellt werden, die für das DerP1-Protein codiert, durch herkömmliche Verfahren wie diejenigen, die beschrieben werden von G. Winter et al., Nature 1982, 299, 756-758, oder von Zoller und Smith 1982, Nucl. Acids Res., 10, 6487-6500, oder durch Deletionsmutagenese, wie beschrieben von Chan und Smith, Nucl. Acids Res., 1984, 12, 2407-2419, oder von G. Winter et al., Biochem. Soc. Trans., 1984, 12, 224-225.
Das Verfahren der Erfindung kann durch herkömmliche rekombinante Techniken durchgeführt werden, wie beschrieben in Maniatis et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989.
Insbesondere kann das Verfahren die folgenden Schritte umfassen:

1. Herstellen eines replizierbaren oder integrierenden Expressionsvektors, der in einer Wirtszelle ein DNA-Polymer exprimieren kann, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die das mutierte DerP1-Protein codiert;
2. Verändern der enzymatischen Aktivität des resultierenden Proteins durch eine der folgenden Techniken: Ersetzen der Cystein- oder Histidin-Reste (oder anderer Reste, die mit anderen Resten innerhalb des aktiven Zentrums wechselwirken) aus dem aktiven Zentrum mit einem Alanin-Rest unter Verwendung von ortsgerichteter Mutagenese; Ersatz eines cDNA-Fragments durch ein Paar von Oligonukleotiden, deren Sequenz sich von der natürlichen unterscheidet; oder alternativ Deletieren von 4 Resten am Knotenpunkt zwischen dem Propeptid und dem reifen Enzym oder Verwendung ortsgerichteter Mutagenese;
3. Transformieren einer Wirtszelle mit dem Vektor;
4. Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des DNA-Polymers zur Erzeugung des Proteins erlauben; und
5. Gewinnen des Proteins.

Der Begriff "transformieren" wird hier verwendet, um die Einführung von Fremd-DNA in eine Wirtszelle durch Transformation, Transfektion oder Infektion mit einem geeigneten Plasmid oder viralen Vektor unter Verwendung von zum Beispiel herkömmlichen Techniken zu bezeichnen, wie beschrieben in Genetic Engineering; Hrsg. S.M. Kingsman und A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988. Der Begriff "transformiert" oder "Transformante" wird hier nachfolgend auf die resultierende Wirtszelle zutreffen, die das interessierende Fremdgen enthält und exprimiert.
Der Expressionsvektor ist neu und bildet auch einen Teil der Erfindung.
Der replizierbare Expressionsvektor kann erfindungsgemäß durch Spalten eines mit der Wirtszelle kompatiblen Vektors, um ein lineares DNA-Segment mit einem intakten Replikon bereitzustellen, und Kombinieren des linearen Segments mit einem oder mehreren DNA-Molekülen hergestellt werden, die zusammen mit dem linearen Segment das gewünschte Produkt codieren, wie zum Beispiel das DNA-Polymer, das das DerP1-Protein codiert, unter ligierenden Bedingungen.
Somit kann das DNA-Polymer während der Konstruktion des Vektors nach Wunsch vorgebildet oder gebildet werden.
Die Wahl des Vektors wird zum Teil durch die Wirtszelle bestimmt werden, die prokaryontisch oder eukaryontisch sein kann. Geeignete Vektoren schließen Plasmide, Bakteriophagen, Cosmide und rekombinante Viren ein.
Die Herstellung des replizierbaren Expressionsvektors kann herkömmlich mit geeigneten Enzymen zur Restriktion, Polymerisation und Ligation der DNA durch Verfahren durchgeführt werden, die zum Beispiel in Maniatis et al. (siehe oben) beschrieben werden.
Die rekombinante Wirtszelle wird erfindungsgemäß durch Transformieren einer Wirtszelle mit einem replizierbaren Expressionsvektor der Erfindung unter transformierenden Bedingungen hergestellt. Geeignete transformierende Bedingungen sind herkömmlich und werden zum Beispiel in Maniatis et al. (siehe oben) oder "DNA Cloning", Bd. II, D.M. Glover, Hrsg., IRL Press Ltd., 1985, beschrieben.
Die Wahl der Transformationsbedingungen wird durch die Wirtszelle bestimmt. So kann ein bakterieller Wirt wie E. coli mit einer Lösung von CaCl₂ (Cohen et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69, 2110) oder mit einer Lösung, die eine Mischung aus RbCl, MnCl₂, Kaliumacetat und Glycerin umfaßt, und dann mit 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure, RbCl und Glycerin behandelt werden. Säugetierzellen in Kultur können durch Calcium-Kopräzipitation der Vektor-DNA auf die Zellen, durch Lipofektion oder Elektroporation transformiert werden. Die Erfindung erstreckt sich auch auf eine Wirtszelle, die mit einem replizierbaren Expressionsvektor der Erfindung transformiert ist.
Das Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des DNA-Polymers erlauben, wird herkömmlich durchgeführt wie zum Beispiel in Maniatis et al. und "DNA Cloning" (oben zitiert) beschrieben. So wird die Zelle bevorzugt mit Nährmittel versorgt und bei einer Temperatur von unter 45°C kultiviert.
Das Produkt wird durch herkömmliche Verfahren gemäß der Wirtszelle gewonnen. Wenn die Wirtszelle bakteriell ist, wie zum Beispiel E. coli, kann sie somit physikalisch, chemisch oder enzymatisch lysiert und das Proteinprodukt aus dem resultierenden Lysat isoliert werden. wenn die Wirtszelle aus Säugetier ist, kann das Produkt allgemein aus dem Nährmittelmedium oder aus zellfreien Extrakten isoliert werden. Herkömmliche Proteinisolierungstechniken schließen selektive Präzipitation, Absorptionschromatographie und Affinitätschromatographie, einschließlich einer monoklonalen Antikörper-Affinitätssäule, ein.
Alternativ kann die Expression in Insektenzellen unter Verwendung eines geeigneten Vektors wie ein Baculovirus, in transformierten Drosophila-Zellen oder Säugetier-CHO-Zellen durchgeführt werden. Das neue Protein der Erfindung kann auch in Hefezellen exprimiert werden, wie für das CS-Protein in EP-A-0 278 941 beschrieben.
Der Impfstoff der Erfindung umfaßt eine immunprotektive Menge der mutierten Version des allergenen Pro-DerP1-Proteins wie in den Ansprüchen beschrieben. Der Begriff "immunprotektiv" bezeichnet die notwendige Menge, um eine Immunreaktion gegen eine anschließende Exposition hervorzurufen, so daß eine allergische Erkrankung abgewendet oder gelindert wird. Im Impfstoff der Erfindung kann eine wäßrige Lösung des Proteins direkt verwendet werden. Alternativ kann das Protein mit oder ohne vorhergehende Lyophilisierung mit beliebigen der verschiedenen bekannten Hilfsstoffe vermischt, adsorbiert oder kovalent verbunden werden. Bevorzugt kann der Hilfsstoff ein bevorzugter Induktor von Immunreaktionen vom Th1-Typ sein.
Eine Immunreaktion wird gegen ein Antigen durch Wechselwirkung des Antigens mit den Zellen des Immunsystems hervorgerufen. Die resultierende Immunreaktion kann allgemein durch zwei extreme Kategorien unterschieden werden, die humorale oder zellvermittelte Immunreaktionen sind (herkömmlich gekennzeichnet durch Antikörper- bzw. zelluläre Effektormechanismen des Schutzes). Diese Kategorien der Reaktion wurden als Reaktionen vom Th1-Typ (zellvermittelte Reaktion) und Immunreaktionen vom Th2-Typ (humorale Reaktion) bezeichnet. In Mäusen sind Reaktionen vom Th1-Typ durch die Erzeugung von Antikörpern des IgG2a-Subtyps gekennzeichnet, während diese im Menschen Antikörpern vom IgG1-Typ entsprechen. Immunreaktionen vom Th2-Typ sind durch die Erzeugung eines breiten Spektrums von Immunglobulinisotypen gekennzeichnet, die in Mäusen IgE, IgG1, IgA und IgM einschließen.
Es kann erwogen werden, daß die treibende Kraft hinter der Entwicklung dieser zwei Typen von Immunreaktionen Cytokine sind, eine Reihe von identifizierten Proteinboten, die zur Unterstützung der Zellen des Immunsystems und zur Ausrichtung der letztlichen Immunreaktion als eine entweder Th1- oder Th2-Reaktion dienen. So induzieren Cytokine vom Th1-Typ eine zellvermittelte Immunreaktion auf das gegebene Antigen, während Cytokine vom Th2-Typ eine humorale Immunreaktion auf das Antigen induzieren.
Es ist wichtig zu bedenken, daß die Unterscheidung von Immunreaktionen vom Th1- und Th2-Typ nicht absolut ist. In der Realität wird ein Individuum eine Immunreaktion unterstützen, die als vorherrschend Th1 oder vorherrschend Th2 beschrieben wird. Jedoch ist es häufig zweckmäßig, die Familien von Cytokinen im Hinblick auf diejenigen zu betrachten, die in murinen CD4-T-Zellklonen von Mosmann und Coffman beschrieben wurden (T.R. Mosmann und R.L. Coffman, (1989), TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, S. 145-173). Herkömmlich sind Reaktionen vom Th1-Typ mit zellvermittelten Effektormechanismen wie cytotoxischen Lymphozyten (CTL) verbunden und können durch die Erzeugung der Cytokine INF-γ und IL-2 durch T-Lymphozyten charakterisiert werden. Andere Cytokine, die häufig direkt mit der Induktion von Immunreaktionen vom Th1-Typ in Verbindung gebracht werden, werden nicht durch T-Zellen erzeugt, wie IL-12. Im Gegensatz sind Reaktionen vom Th2-Typ mit humoralen Mechanismen und der Sekretion von IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und Tumornekrosefaktor-β (TNF-β) assoziiert.
Es ist bekannt, daß bestimmte Impfstoffhilfsstoffe besonders geeignet zur Stimulation von Cytokinreaktionen vom entweder Th1- oder Th2-Typ sind. Diese Gewichtung der Cytokinproduktion überträgt sich in die Erzeugung von Immunreaktionen vom entweder vorherrschend Th1-Typ oder vorherrschend Th2-Typ. Herkömmlich schließt der beste Indikator für das Th1:Th2-Gleichgewicht der Immunreaktion nach einer Impfung oder Infektion die direkte Messung der Produktion von Th1- oder Th2-Cytokinen durch T-Lymphozyten in vitro nach Restimulation mit Antigen und Messung des IgG1:IgG2a-Verhältnisses von antigenspezifischen Antikörperreaktionen ein.
So ist ein Hilfsstoff vom Th1-Typ ein solcher, der isolierte T-Zell-Populationen zur Erzeugung hoher Mengen von Cytokinen vom Th1-Typ bei Restimulation mit Antigen in vitro stimuliert und antigenspezifische Immunglobulinreaktionen induziert, die mit Mechanismen vom Th1-Typ assoziiert sind (IgG2a in Mäusen, IgG1 im Menschen).
Hilfsstoffe schließen ohne Beschränkung Aluminiumhydroxid, Muramyldipeptid und Saponine wie Quil A, 3D-MPL (3-O-desacyliertes Monophosphoryllipid A) oder TDM ein. Als eine weitere exemplarische Alternative kann das Protein in Mikropartikeln wie Liposomen verkapselt werden. Besonders bevorzugte Hilfsstoffe, die vorzugsweise Immunreaktionen vom Th1-Typ stimulieren, sind Kombinationen aus 3D-MPL und QS21 ( EP 0 671 948 B1 ), Öl-in-Wasser-Emulsionen, die 3D-MPL und QS21 umfassen (WO 95/17210), mit anderen Trägern formuliertes 3D-MPL ( EP 0 689 454 B1 ) oder in cholesterinhaltigen Liposomen (WO 96/33739) oder immunstimulatorischen Oligonukleotiden (WO 96/02555) formuliertes QS21. In noch einer anderen exemplarischen Alternative kann das Protein an ein Trägerprotein konjugiert werden, das T-Zell-Unterstützung für die Erzeugung der Anti-Allergen-Immunreaktion liefern kann, wie zum Beispiel Tetanustoxoid. Die Verwendung von Quil A wird von Dalsgaard et al. offenbart, Acta Vet. Scand. 18:349 (1977).
Die Impfstoffherstellung wird allgemein beschrieben in New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al. (Hrsg.), University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978. Die Verkapselung in Liposomen wird von Fullerton beschrieben, US-PS 4,235,877. Die Konjugation von Proteinen mit Makromolekülen wird zum Beispiel von Likhite, US-PS 4,372,945, und Armor et al., US-PS 4,474,757, offenbart.
Die Menge des erfindungsgemäßen Proteins, die in jeder Impfstoffdosis vorhanden ist, wird als eine Menge ausgewählt, die eine immunprotektive Reaktion ohne signifikante nachteilige Nebenwirkungen in typischen Impflingen induziert. Eine solche Menge wird abhängig davon variieren, welches spezifische Immunogen eingesetzt und ob der Impfstoff mit Hilfsstoff versetzt wird oder nicht. Allgemein wird erwartet, daß jede Dosis 1-1000 μg Protein umfassen wird, bevorzugt 1-200 μg. Eine optimale Menge für einen besonderen Impfstoff kann durch Standardstudien sichergestellt werden, die die Beobachtung von Antikörpertitern und anderen Reaktionen in Probanden involvieren. Nach einer Erstimpfung werden die Probanden eine Auffrischung nach ca. 4 Wochen erhalten, gefolgt von wiederholten Auffrischungen alle 6 Monate, solange ein Risiko allergischer Reaktionen besteht.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können an Erwachsene oder Kinder verabreicht werden, jedoch ist es bevorzugt, Individuen bald nach der Geburt zu impfen, vor dem Einstellen von substantiellen Erinnerungsreaktionen vom Th2-Typ.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine Verwendung eines rekombinanten mutierten Pro-DerP1-Allergens wie in den Ansprüchen beschrieben in der Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Linderung einer allergischen Erkrankung im Menschen bereit.
Die folgenden Beispiele sind illustrativ, aber ohne Beschränkung der Erfindung. Restriktionsenzyme und andere Reagentien wurden im wesentlichen unter Befolgen der Anbieteranweisungen verwendet.
Beispiel 1 – Expression in Pichia pastoris
Konstruktion von pNIV4811
pNIV4811 wird geschaffen, um die Expression von reifem DerP1 in Fusion mit dem Präpropeptid von Pichia pastoris MFα zu fördern. Plasmid ATCC87307 enthält die Sequenz für reifes DerP1. Die vollständige DerP1-Restriktionskarte ist in 7 angegeben.
Ligieren mit T4-DNA-Ligase:

– SphI-XhoI aus pPIC9k (INVITROGEN V175-20)
– XhoI-PstI-Oligonukleotide, deren Sequenzen folgen (Nr. 97038 und Nr. 97039)
– PstI-XbaI aus pNIV4810 (Plasmid ATCC87307)
– AvrII-SphI aus pIC9k

Sequenzen der Oligonukleotide:

Nr. 97038 ^5'TCGAGAAAAGAGAGGCGTGAAGCTACTAACGCCTGCA^3'
Nr. 97039 ^5'GGCGTTAGTAGCTTCAGCCTCTCTTTTC^3'

Ergebnisse
Pichia Pastoris, transfiziert mit pNIV4811, führt zur Expression eines Proteins mit 43 kD, das ungespaltenes ProMFα-reifes DerP1-Fusionsprotein umfaßt, detektiert in verschiedenen Klonen (1).
Konstruktion von pNIV4817
pNIV4817 wird aus pNIV4811 abgeleitet. Es wird geschaffen, um die Expression des reifen DerP1 in Fusion mit dem Präpeptid von Pichia pastoris MFα zu fördern.

Ligieren: – BstEII-BamHI aus pNIV4811 – BamHI-PstI-Oligonukleotide Nr. 97262 und Nr. 97263, deren Sequenz folgt – PstI-BstEII aus pNIV4811
Sequenzen der Oligonukleotide
Ergebnisse
Mehrere Klone exprimierten die reife Form von DerP1-Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 30 kDa, das in den Überstand sezerniert wurde (2).
Konstruktion von pNIV4815

Ausgehend von pNIV4811 wird die folgende Konstruktion geschaffen, um vier Reste [N-A-E-T (T ist der erste Rest des reifen Proteins)] am Knotenpunkt zwischen den Propeptid und dem reifen Enzym zu deletieren.

Ligieren:

BlnI-BamHI-Fragment aus pPIC9k (der für die Expression in P. pastoris verwendete Vektor) BamHI-EaeI-Fragment aus pNIV4811 EaeI-EcoRI-Fragment, erzeugt durch RT-PCR mit den Primern Nr. 97142 und 97143. Reste: A₆ bis E₇₄. EcoRI-PstI-Oligonukleotide, deren Sequenz folgt (Nr. 97140 und 97141). Reste: F75 bis C102, augenommen N96AET99 PstI-XbaI-Fragment aus pNIV4810.

Sequenz der Oligonukleotide, die die NAET-Deletion erlaubt:
Konstruktion von pNIV4819

Ausgehend von pNIV4817, einem Expressionsplasmid, das zur Erzeugung der reifen Form von DerP1 in Pichia pastoris geschaffen wird, wird die folgende Konstruktion durchgeführt, um den Cystein-Rest aus dem aktiven Zentrum durch einen Alanin-Rest zu ersetzen (entsprechend der Cys34-Mutation im reifen Protein).

Ligieren:

– Bpu1102I-AseI-Fragment aus pNIV4817 – synthetisches AseI-TfiI-Fragment, das aus der Hybridisierung der Oligonukleotide Nr. 97121 und Nr. 97122 resultiert, deren Sequenz folgt: entsprechend den Resten I₁₀₄ bis E₁₄₂ von Pro-DerP1 (I₆ des reifen DerP1-Proteins). – TfiI-BstEII-Fragment aus pNIV4810 (ATCC 87307) – BstEII-Bpu1102I-Fragment aus pNIV4817

Sequenzen der Oligonukleotide
Konstruktion von pNIV4815

Ausgehend von pNIV4811 wird die folgende Konstruktion durchgeführt, um vier Reste [N-A-E-T (T ist der erste Rest des reifen Proteins)] am Knotenpunkt zwischen dem Propeptid und dem reifen Enzym zu deletieren.

Ligieren:

BlnI-BamHI-Fragment aus pPIC9K (der für die Expression in Pichia pastoris verwendete Vektor)

BamHI-EaeI-Fragment aus pNIV4811 EaeI-EcoRI-Fragment, erzeugt durch RT-PCR mit den Primern Nr. 97142 und 97143. Reste: A₆ bis E₇₄. EcoRI-PstI-Oligonukleotide, deren Sequenz folgt (Nr. 97140 und 97141). Reste: F75 bis C102, ausgenommen N96AET99 PstI-XbaI-Fragment aus pNIV4810.

Sequenz der Oligonukleotide: erlaubt die NAET-Deletion.
Beispiel 2 – Expression in Säugetierzellen
Konstruktion von pNIV4812
pNIV4812, ein Expressionsplasmid auf Basis von pEE14 (CellTech, Cockett et al., 1990 Biotechnology, Bd. 8, 622-667), geschaffen zur Erzeugung der reifen Form von DerP1 in CHO-K1, codiert für ein Prä-DerP1, gefolgt von der reifen DerP1-Sequenz (kein Pro-Protein).

Ligieren: – HindIII-XbaI aus pEE14 – HindIII-PstI-Oligonukleotide Nr. 97040 und 97041, deren Sequenz folgt – PstI-XbaI aus pNIV4810 (Plasmid ATCC87307)
Sequenz der Oligonukleotide
Ergebnisse
Die Expression eines Proteins mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 30 kDa wurde in mehreren Extrakten detektiert (3). Kein Protein wurde in den Kulturüberständen detektiert (Daten nicht gezeigt), was nahelegt, daß das Protein nicht aus CHO-K1-Zellen sezerniert wurde.
Konstruktion von pNIV4814

Ausgehend von pNIV4812 wird die folgende Konstruktion durchgeführt, um den Cystein-Rest aus dem aktiven Zentrum durch einen Alanin-Rest zu ersetzen.

Ligieren:

– AflII-AseI-Fragment aus pNIV4812. – AseI-TfiI-Oligonukleotide wie in der pNIV4819-Konstruktion (Nr. 97121 und 97122) – TfiI-BstEII-Fragment aus pNIV4810 (ATCC 87307) – BstEII-AflII-Fragment aus pNIV4812.

Die Konstruktion von pNIV4819 und pNIV4814 wurde dank der Entdeckung möglich gemacht, daß in pNIV4810 das Codon, das Isoleucin 6 des reifen Proteins codiert, ATT anstelle von ATC wie veröffentlicht war. Diese Sequenz ist verantwortlich für die Gegenwart des AseI-Restriktionsorts.
Konstruktion von pNIV4816

Ausgehend von pNIV4812, geschaffen zur Expression in CHO-K1, hat pNIV4816 die gleiche Deletion wie für pNIV4815. Dieses Konstrukt führt zur Erzeugung von rekombinantem Pro-DerP1 mit der Deletion der NAET-Reste aus dem Knotenpunkt zwischen dem Pro- und reifen Protein.

Ligieren:

XbaI-AflII-Fragment aus pEE14 AflII-EaeI-Fragment aus pNIV4812 EaeI-EcoRI-Fragment, erzeugt durch RT-PCR unter Verwendung der Primer Nr. 97142 und 97143 EcoRI-PstI-Oligonukleotide Nr. 97140 und 97141

(gleiche Oligonukleotide wie in pNIV4815 verwendet) PstI-XbaI-Fragment aus pNIV4810

Beispiel 3 – Expression in Drosophila-Zellen
Konstruktion von pNIV4827
pNIV4827 wurde zur Förderung der Expression und der Sekretion von reifem DerP1 aus mit Baculovirus infizierten Insektenzellen geschaffen.

Ligieren: poAcGP67A-Vektor, linearisiert mit PstI PstI-Fragment aus pNIV4810 (ATCC 87307)
Die Expression von DerP1 aus pNIV4827 wurde durch Western-Blot gezeigt.
Konstruktion von pNIV4828
pNIV4828 wurde zur Förderung der Expression und Sekretion von Pro-DerP1 aus mit Baculovirus infizierten Insektenzellen geschaffen.

Ligieren: SapI-BamHI aus pAcGP67A (Pharmingen Ref. 21220P) BamHI-EcoRI 172 bp synthetisches Fragment EcoRI-BssSi aus pNIV4820 BssSI-SapI aus pNIV4827
Sequenz des synthetischen Fragments:
a) Codierendes Oligonukleotid Nr. 97520
b) Komplementäre Sequenz Nr. 97521
Die Expression von Pro-DerP1 aus pNIV4828 wurde durch Western-Blot gezeigt.
Konstruktion von pNIV4832

Dieses Plasmid codiert für ein DerP1-Propeptid, gefolgt von der reifen DerP1-(Pro-DerP1)-Sequenz, und wird zur Expression in Drosophila-Zellen geschaffen.

Ligieren:

– Asp718-BamHI-Fragment aus Expressionsvektor pDS47/V5-His (INVITROGEN V4115-20) – synthetisches Asp718-SpeI-Fragment, das aus der Hybridisierung der Oligonukleotide 98023 und 98024 resultiert – SpeI-BglII-Fragment aus pNIV4828

Sequenzen der Oligonukleotide

Nr. 98023 ^5'GTA CCC TTA AGA TGC TA^3'
Nr. 98024 ^5' CTA GTA GCA TCT TAA GG^3'

Bemerkung: pNIV4828 ist ein für die Isolierung von rekombinanten Baculoviren geschaffenes Plasmid, die das an das gp67-Signalpeptid fusionierte Pro-DerP1 exprimieren.
Ergebnisse
Die vorübergehende Expression von Pro-DerP1 in Drosophila-Zellen wurde detektiert (Daten nicht gezeigt).
Konstruktion von pNIV4840
pNIV4840 unterscheidet sich von pNIV4832, indem der verwendete Expressionsvektor stabil und induzierbar ist (pMT/V5-His).

Ligieren: – Asp718-NotI-Fragment aus pNIV4832 – NotI-Asp718 aus pMT/V5-His (INVITROGEN V4120-20)
Die Expression von Pro-DerP1 in Drosophila-Zellen wurde gezeigt (4).
Konstruktion von pNIV4842

pNIV4842 wurde zur Förderung der Expression und Sekretion von Pro-DerP1 aus rekombinanten Drosophila-Zellen geschaffen. Die Pro-DerP1-codierende Sequenz wurde gentechnisch manipuliert, um die Spaltung des Propeptids zu beeinträchtigen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden vier Nukleotidtripletts, die für NAET codieren, einschießlich des Spaltorts, deletiert.

Ligieren:

– NotI-EcoRI aus pNIV4840 – synthetisches EcoRI-PstI-Fragment, das aus der Hybridisierung der Oligonukleotide Nr. 98136 und Nr. 98137 resultiert – PstI-BstEII aus pNIV4840 – BstEII-NotI aus pNIV4840

Sequenz der synthetischen Oligonukleotide
a) Codierende Sequenz
Ergebnisse
Die Detektion von DerP1 in Fusion mit seinem Propeptid wurde in den Überständen nach Induktion nachgewiesen (5). Die Sequenz dieses rekombinanten mutierten DerP1 ist in SEQ ID NO:4 angegeben.
Konstruktion von pNIV4843
pNIV4843 wurde zur Förderung der Expression und Sekretion aus rekombinanten Drosophila-Zellen einer Pro-DerP1-Form geschaffen, in der der Cystein-Rest des aktiven Zentrums zu einem Alanin mutiert wurde.

Ligieren: – NotI-Asp718 aus pMT/V5-His – Asp718-PstI aus pNIV4832 – PstI-TfiI aus pNIV4819 – TfiI-NotI aus pNIV4832
Ergebnisse
Die Detektion von DerP1 in Fusion mit seinem Propeptid wurde in den Überständen nach Induktion nachgewiesen (6). Die Sequenz dieses rekombinanten mutierten DerP1 ist in SEQ ID NO:5 angegeben.
Beispiel 4 – Reinigungsverfahren für aus rekombinanten Drosophila-Zellen serzerniertes rekombinantes Pro-DerP1
Proteine aus dem verbrauchten Kulturmedium (1 l) wurden bei 4°C durch Ammoniumsulfat-Präzipitation auf 60 % Sättigung über Nacht aufkonzentriert. Nach Zentrifugieren mit 17 000 g über 30 min wurde die Ausfällung in 20 ml von 20 mM Tris-HCl pH 8,0 resuspendiert und gegen 5 l des gleichen Puffers dialysiert. Unlösliche Proteine wurden durch Zentrifugieren mit 20 000 g über 30 min verworfen. Das Dialysat wurde auf eine Q Sepharose XL-Säule (3 × 1,6 cm, Pharmacia), äquilibriert in 20 mM Tris-HCl pH 8,0, aufgetragen. Nach Waschen der Säule mit dem gleichen Puffer wurden gebundene Proteine durch Schritte von 100 mM-Inkrementen der NaCl-Konzentration eluiert. Pro-DerP1 eluierte hauptsächlich mit 200 mM NaCl. Angereicherte Pro-DerP1-Fraktionen wurden vereinigt und auf eine Hydroxylapatit-Säule vom Typ 1 (1 × 1,6 cm, Biorad) aufgetragen, die in 5 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 konditioniert worden war. Ungebundenes Material, das Pro-DerP1 enthielt, wurde durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Omega-Membran (Grenzwert: 10 kD, Filtron) auf konzentriert. Das Konzentrat wurde auf eine Superdex 75 FPLC-Säule (30 × 1 cm, Pharmacia) in PBS pH 7,3 aufgetragen. Eluiertes Pro-DerP1 aus der Gelfiltrationssäule war mehr als 80 % rein.
Beispiel 5 – Impfstofformulierung
Impfstofformulierungen, die das mutierte DerP1 oder Allergene umfassen, können mit vielen üblichen Hilfsstoffen formuliert werden. Ein bevorzugtes Hilfsstoffsystem ist eine nachfolgend beschriebene Öl-in-Wasser-Emulsion:
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Öl-in-Wasser-Emulsion-Hilfsstofformulierungen werden hergestellt, die die folgende Öl-in-Wasser-Emulsionskomponente umfassen: 5 % Squalen, 5 % α-Tocopherol, 2,0 % Polyoxyethylensorbitanmonooleat (TWEEN 80). Die Emulsionen werden als doppeltes Konzentrat hergestellt. Alle in den immunologischen Experimenten verwendeten Beispiele werden werden durch Zugabe von zusätzlichen Komponenten und Verdünnungsmitteln verdünnt, um entweder eine einfache Konzentration (entsprechend einem Squalen:QS21-Verhältnis (G/G) von 240:1) oder weitere Verdünnungen daraus zu ergeben.
Kurz gesagt wird TWEEN 80 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst, um eine 2%ige Lösung im PBS zu ergeben. Zur Bereitstellung von 100 ml einer zweifach konzentrierten Emulsion werden 5 ml DL-alpha-Tocopherol und 5 ml Squalen verwirbelt, um sie sorgfältig zu vermischen. 95 ml PBS/TWEEN-Lösung werden zum Öl gegeben und sorgfältig vermischt. Die resultierende Emulsion wird dann durch eine Spritzennadel geleitet und schließlich unter Verwendung einer M110S Microfluidics-Vorrichtung mikrofluidisiert. Die resultierenden Öltröpfchen haben eine Größe von ca. 145-180 nm (ausgedrückt als z-Mittelwert, gemessen durch PCS). Die anderen Hilfsstoff/Impfstoff-Komponenten (QS21, 3D-MPL und Antigen) werden zur Emulsion in einfacher Beimischung gegeben.
Die hier verwendeten Antigen-haltigen Impfstoffe werden entweder mit einem SB62-Impfstoff voller Dosis formuliert, um ein hohes Squalen:QS21-Verhältnis (240:1) zu ergeben, oder mit einer geringeren Menge SB62, um eine Formulierung mit niedrigem Verhältnis (48:1) zu ergeben. Andere Impfstoffe können optional unter Zugabe von Cholesterin zur Ölphase der Emulsion formuliert werden.
Diese Impfstoffe werden in Gruppen von Balb/c-Mäusen untersucht. Kurz gesagt werden Gruppen von 10 Mäusen intramuskulär zweimal in dreiwöchigen Intervallen mit 2 μg mutiertem Allergen in Kombination mit Öl-in-Wasser-Emulsion-Hilfsstoff immunisiert. 14 Tage nach der zweiten Immunisierung wird die Erzeugung von Cytokinen (IL-4, IL-5 und IFN-γ) nach In-vitro-Restimulierung von Milz- und Lymphknotenzellen mit Allergen analysiert. Die Antikörperreaktion auf Allergen vom Wildtyp und das induzierte Isotypenprofil werden durch ELISA 21 Tage nach II und 14 Tage nach IV überwacht.
SEQ ID NO:1
Sequenz des vollständigen mutierten DerP1, einschließlich Prä-Protein. Mutation des aktiven Zentrusm Cys132→Ala132, entsprechend Cys34→Ala34 des reifen Proteins. Sequenz schließt codierende und komplementäre DNA und Aminosäuresequenzen ein.
SEQ ID NO:2
Sequenz des vollständigen mutierten DerP1, einschließlich Prä-Protein, das eine Deletion am Propeptid-Spaltort enthält (NAET). Sequenz schließt codierende und komplementäre DNA und Aminosäuresequenzen ein.
SEQ ID NO:3
Sequenz des vollständigen mutierten DerP1, einschließlich Prä-Protein. Mutation des aktiven Zentrums His268→Ala268, entsprechend His170→Ala170 des reifen Proteins. Sequenz schließt codierende und komplementäre DNA und Aminosäuresequenzen ein.
SEQ ID NO:4
Aminosäuresequenz für das mutierte DerP1 wie von pNIV4842 codiert und in 5 gezeigt.
SEQ ID NO:5
Aminosäuresequenz für das mutierte DerP1 wie von pNIV4843 codiert und in 6 gezeigt.

Claims

Rekombinantes mutiertes Pro-DerP1-Allergen aus Dermatophagoides pteronyssinus, das eine oder mehrere der folgenden Mutationen aufweist: (i) eine Alanin-Substitution des Cys 132-Restes von Pro-DerP1, (ii) eine Alanin-Substitution des His 268-Restes von Pro-DerP1, (iii) eine Mutation am Ort der Spaltung zwischen dem Propeptid und dem reifen Molekül.
Rekombinantes mutiertes Pro-DerP1-Allergen gemäß Anspruch 1, worin die Mutation am Ort der Spaltung zwischen dem Propeptid und dem reifen Molekül eine Deletion der Reste NAET umfaßt.
Rekombinantes mutiertes Pro-DerP1-Allergen mit der in SEQ ID NO: 1 aufgeführten Sequenz.
Rekombinantes mutiertes Pro-DerP1-Allergen mit der in SEQ ID NO: 2 aufgeführten Sequenz.
Rekombinantes mutiertes Pro-DerP1-Allergen mit der in SEQ ID NO: 3 aufgeführten Sequenz.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein Allergen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert.
Impfstoff, der ein rekombinantes mutiertes Pro-DerP1-Allergen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 und einen Hilfsstoff umfaßt.
Impfstoff gemäß Anspruch 7, worin der Hilfsstoff ein bevorzugter Stimulator von Immunreaktionen vom Th1-Typ ist.
Impfstoff gemäß Anspruch 8, worin der Hilfsstoff eines oder beide aus QS21 und 3-O-desacyliertem Monosphosphoryllipid A umfaßt.
Verwendung eines rekombinanten mutierten Pro-DerP1-Allergens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Allergie.
Verwendung eines Impfstoffs, der ein rekombinantes mutiertes Pro-DerP1-Allergen umfaßt, gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Allergie.