JP2001523452A - 酵素活性が減少した組換えアレルゲン - Google Patents
酵素活性が減少した組換えアレルゲンInfo
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- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
Abstract
(57)【要約】
本発明は、減少した酵素活性を有する組換えアレルゲンの供給を含むアレルギーのための新規治療を供する。その変異アレルゲンを含むワクチンはアレルギーの又は未経験の個体においてＴｈ１型免疫応答を刺激し、それにより野生型アレルゲンと接触によるアレルギー応答についての可能性を減少させる。好ましくは、前記アレルゲンはＤｅｒＰ１である。
Description
【０００１】 本発明は、特定のアレルゲンに対するアレルギー応答に有効である新規治療剤
に関する。更に、本発明は、新規ポリヌクレオチド、それらによりコードされる
ポリペプチド並びに該ポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用、並びにそれら
の生産に関する。特に、ポリペプチドを含む新規ワクチン、並びにアレルギーを
患うヒトの治療及びアレルギーの危険性がある個体の予防における使用を供し、
好ましくは、前記ワクチンは、組換え変異デルマトファゴイデス・プテロニシヌ
ス（Dermatophagoides pteronyssinus) アレルゲンＤｅｒＰ１を含む。
に関する。更に、本発明は、新規ポリヌクレオチド、それらによりコードされる
ポリペプチド並びに該ポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用、並びにそれら
の生産に関する。特に、ポリペプチドを含む新規ワクチン、並びにアレルギーを
患うヒトの治療及びアレルギーの危険性がある個体の予防における使用を供し、
好ましくは、前記ワクチンは、組換え変異デルマトファゴイデス・プテロニシヌ
ス（Dermatophagoides pteronyssinus) アレルゲンＤｅｒＰ１を含む。
【０００２】 ヒトにおけるアレルギー応答は一般的であり、種々のアレルゲンにより誘発さ
れ得る。アレルギーの個体はアレルゲンに敏感であり、血清中の高レベルのアレ
ルゲン特異的ＩｇＥの存在を特徴とし、Ｔｈ２型サイトカイン（ＩＬ−４，ＩＬ
−５、及びＩＬ−１３）を作り出すアレルゲン特異的Ｔ細胞集団を有する。マス
ト細胞及び好塩基球の表面上に存在するＦｃレセプターへのアレルゲンの存在下
でのＩｇＥの結合は、細胞の迅速な脱顆粒、並びに後の、ヒスタミン並びに炎症
反応の他の予め形成され及び新しく形成された媒介体の遊離を導く。これに加え
て、Ｔ細胞記憶応答の刺激は、Ｂ細胞応答をアレルゲン特異的ＩｇＥ生産に更に
向かわせるようスイッチするのと一緒に共同して、ＩＬ−４及びＩＬ−１３を生
産する。初期及び後期のアレルギー応答の形成の詳細については、Joost Van Ne
evenら、1996, Immunology Today, 17, 526 を参照のこと。非アレルギー性固体
において、同じ抗原に対する免疫応答は、Ｔｈ１型サイトカイン、例えばＩＦＮ
−γを含む。これらのサイトカインは、高レベルのアレルゲン特異的ＩｇＥを含
む、高レベルのＴｈ２型免疫応答の阻害によりアレルギー反応の始まりを防ぐこ
とができる。この点で重要なのは、ＩｇＥ合成が、Ｂ細胞上のＣＤ２３レセプタ
ーへのＩｇＥ／アレルゲン複合体の結合により媒介される阻害フィードバックメ
カニズムにより調節され得るという事実である（Luo ら、J. Immunol., 1991, 1
46 (7), 2122-9 ; Yu ら、1994, Nature, 369 (b483) : 753〜6)。細胞の結合Ｃ
Ｄ２３を欠如するシステムにおいて、このＩｇＥ合成の阻害はおこらない。
れ得る。アレルギーの個体はアレルゲンに敏感であり、血清中の高レベルのアレ
ルゲン特異的ＩｇＥの存在を特徴とし、Ｔｈ２型サイトカイン（ＩＬ−４，ＩＬ
−５、及びＩＬ−１３）を作り出すアレルゲン特異的Ｔ細胞集団を有する。マス
ト細胞及び好塩基球の表面上に存在するＦｃレセプターへのアレルゲンの存在下
でのＩｇＥの結合は、細胞の迅速な脱顆粒、並びに後の、ヒスタミン並びに炎症
反応の他の予め形成され及び新しく形成された媒介体の遊離を導く。これに加え
て、Ｔ細胞記憶応答の刺激は、Ｂ細胞応答をアレルゲン特異的ＩｇＥ生産に更に
向かわせるようスイッチするのと一緒に共同して、ＩＬ−４及びＩＬ−１３を生
産する。初期及び後期のアレルギー応答の形成の詳細については、Joost Van Ne
evenら、1996, Immunology Today, 17, 526 を参照のこと。非アレルギー性固体
において、同じ抗原に対する免疫応答は、Ｔｈ１型サイトカイン、例えばＩＦＮ
−γを含む。これらのサイトカインは、高レベルのアレルゲン特異的ＩｇＥを含
む、高レベルのＴｈ２型免疫応答の阻害によりアレルギー反応の始まりを防ぐこ
とができる。この点で重要なのは、ＩｇＥ合成が、Ｂ細胞上のＣＤ２３レセプタ
ーへのＩｇＥ／アレルゲン複合体の結合により媒介される阻害フィードバックメ
カニズムにより調節され得るという事実である（Luo ら、J. Immunol., 1991, 1
46 (7), 2122-9 ; Yu ら、1994, Nature, 369 (b483) : 753〜6)。細胞の結合Ｃ
Ｄ２３を欠如するシステムにおいて、このＩｇＥ合成の阻害はおこらない。
【０００３】 このようなアレルギー応答の治療における現在のストラテジーには、抗ヒスタ
ミン治療及び／又は抗炎症性コルチコステロイドの局所的投与によりヒスタミン
放出の症状的効果を防ぐための手段がある。開発中である他のストラテジーには
、マスト細胞の脱顆粒を防ぐために宿主免疫系を用いるものがある（Stanworth
ら、EP 0 477 231 B1 ）。他の型の免疫療法も開示されている（Hoyne ら、J. E
xp. Med. 1993, 178, 1783〜1788 ; Holt ら、 Lanet, 1994, 344, 456〜458)。
ミン治療及び／又は抗炎症性コルチコステロイドの局所的投与によりヒスタミン
放出の症状的効果を防ぐための手段がある。開発中である他のストラテジーには
、マスト細胞の脱顆粒を防ぐために宿主免疫系を用いるものがある（Stanworth
ら、EP 0 477 231 B1 ）。他の型の免疫療法も開示されている（Hoyne ら、J. E
xp. Med. 1993, 178, 1783〜1788 ; Holt ら、 Lanet, 1994, 344, 456〜458)。
【０００４】 ミツバチ毒液、チリダニ類発散物及び寄生体タンパク質中に存在するいくつか
の一般的なアレルゲンは、マスト細胞脱顆粒を誘導すること、及びアレルゲン特
異的ＩｇＥの欠如下でさえインターロイキン−４合成及び分泌を刺激することが
見い出されている（Machado ら、 1996, Eur. J. Immunol. 26, 2972〜2980) 。
このタンパク質分解性アレルゲン、例えばミツバチ毒液ホスホリパーゼＡ２又は
チリダニ類発散物に関連するプロテアーゼは酵素活性に依存する。
の一般的なアレルゲンは、マスト細胞脱顆粒を誘導すること、及びアレルゲン特
異的ＩｇＥの欠如下でさえインターロイキン−４合成及び分泌を刺激することが
見い出されている（Machado ら、 1996, Eur. J. Immunol. 26, 2972〜2980) 。
このタンパク質分解性アレルゲン、例えばミツバチ毒液ホスホリパーゼＡ２又は
チリダニ類発散物に関連するプロテアーゼは酵素活性に依存する。
【０００５】 本発明は、野生型のタンパク質分解活性のアレルゲンに対して大きく減少した
タンパク質分解活性を有する組換え変異アレルゲン、及びそれをコードする核酸
、並びにアレルギーに対する予防又は免疫治療剤としてのそれらの使用を供する
。好ましいアレルゲンはチリダニアレルゲンＤｅｒｐ１である。 本発明は、（ＩＬ−４：ＩＦＮ−γ生産性ＤｅｒＰ１特異的Ｔ細胞の比の減少
、又はＩＬ−５：ＩＦＮ−γ比の減少により測定した）Ｔｈ２型からＴｈ１型の
応答へのシフトを介して、ＩｇＥの生産を下降制御するための手段を供すること
、及びアレルゲンに対する細胞媒介応答を改変することによる、アレルギーの治
療及びアレルギーの予防のための製剤の供給に関する。これは、酵素活性が損な
われた組換え変異アレルゲンの供給及び使用により達成される。
タンパク質分解活性を有する組換え変異アレルゲン、及びそれをコードする核酸
、並びにアレルギーに対する予防又は免疫治療剤としてのそれらの使用を供する
。好ましいアレルゲンはチリダニアレルゲンＤｅｒｐ１である。 本発明は、（ＩＬ−４：ＩＦＮ−γ生産性ＤｅｒＰ１特異的Ｔ細胞の比の減少
、又はＩＬ−５：ＩＦＮ−γ比の減少により測定した）Ｔｈ２型からＴｈ１型の
応答へのシフトを介して、ＩｇＥの生産を下降制御するための手段を供すること
、及びアレルゲンに対する細胞媒介応答を改変することによる、アレルギーの治
療及びアレルギーの予防のための製剤の供給に関する。これは、酵素活性が損な
われた組換え変異アレルゲンの供給及び使用により達成される。
【０００６】 チリダニ類（house dust mite ) デルマトファゴイデス・プテロニシヌス (De rmatophagoides pteronyssinus ）のグループ１プロテアーゼアレルゲンであるＤ
ｅｒＰ１（Tophamら、1994, Protein Engineering, 7, 7, 869〜894 ; Simpson
ら、1989, Protein Sequences and Data Analyses, 2, 17〜21) は１つのこのよ
うなアレルゲンである。それは３０kDa タンパク質であり、クローン化され、配
列決定されている (Chuaら、1988, J. Exp. Med., 167, 175〜182)。成熟タンパ
ク質中には２２２アミノ酸残基を含むことが知られている。ＤｅｒＰ１の配列は
パパインと３１％の相同性を有し、重要なのは、酵素的に活性な領域で相同性を
有しており、最も顕著なのはＣｙｓ３４−Ｈｉｓ１７０イオン対である（Topham
ら、前掲) 。ＤｅｒＰ１はダニ類の中腸内で生産され、その役割はおそらく食物
の消化に関連する。０．２ngまで又はタンパク質分解的に活性なＤｅｒＰ１が各
々直径約１０〜４０μｍである各々の糞便ペレットに組み込まれており、それゆ
え、ヒト呼吸管に容易に吸い込まれる。室温における精製されたＤｅｒＰ１調製
物の一晩の保存は、自己タンパク質分解により酵素活性をほぼ完全に喪失させる
（Machado ら、 1996, Eur. J. Immunol. 26, 2972〜2980) 。
ｅｒＰ１（Tophamら、1994, Protein Engineering, 7, 7, 869〜894 ; Simpson
ら、1989, Protein Sequences and Data Analyses, 2, 17〜21) は１つのこのよ
うなアレルゲンである。それは３０kDa タンパク質であり、クローン化され、配
列決定されている (Chuaら、1988, J. Exp. Med., 167, 175〜182)。成熟タンパ
ク質中には２２２アミノ酸残基を含むことが知られている。ＤｅｒＰ１の配列は
パパインと３１％の相同性を有し、重要なのは、酵素的に活性な領域で相同性を
有しており、最も顕著なのはＣｙｓ３４−Ｈｉｓ１７０イオン対である（Topham
ら、前掲) 。ＤｅｒＰ１はダニ類の中腸内で生産され、その役割はおそらく食物
の消化に関連する。０．２ngまで又はタンパク質分解的に活性なＤｅｒＰ１が各
々直径約１０〜４０μｍである各々の糞便ペレットに組み込まれており、それゆ
え、ヒト呼吸管に容易に吸い込まれる。室温における精製されたＤｅｒＰ１調製
物の一晩の保存は、自己タンパク質分解により酵素活性をほぼ完全に喪失させる
（Machado ら、 1996, Eur. J. Immunol. 26, 2972〜2980) 。
【０００７】 ＤｅｒＰ１は、ヒトＢリンパ球ＣＤ２３（Hewittら、 1995, J. Exp. Med., 1
82, 1537〜1544) 及びＣＤ２５（Schultz ら、J. Exp. Med. 1998, 187 (2) : 2
71-5）の表面から低アフィニティーイムノグロブリンＩｇＥ Ｆｃレセプターを
、ヒトＴ細胞インターロイキン−２レセプターからのサブユニットを開裂するこ
とが見い出されている。Ｂ細胞表面からのレセプターの開裂はその培養上清中の
可溶性ＣＤ２３中の平行した増加に関連していた。ＩｇＥ分泌性Ｂ細胞からの細
胞表面ＣＤ２３の損失は、ＩｇＥ合成を通常、制限する重要な阻害フィードバッ
クメカニズムを除去することによりＩｇＥ免疫応答を促進し、増強し得る。（He
wittら、1995, J. Exp. Med. 182, 1537〜1544) 。更に、可溶性ＣＤ２３はＩｇ
Ｅ生産を促進することが示されているので、ＤｅｒＰ１により遊離されるＣＤ２
３のフラグメントはＩｇＥの合成を直接、増強することができる。ＣＤ２３開裂
の効果に加えて、Ｔ細胞の表面からのＣＤ２５の開裂は、増殖及びＩＮＦ−γ分
泌の減少を誘導し、それは結果として免疫応答をＴｈ２型応答に向かわせる。Ｄ
ｅｒＰ１抗原に関する現在の論文は、Machado ら、Eur. J. Immunol. (1996) 26
;2972〜2980 ; Hewitt ら、J. Exp. Med. (1995) 182 : 1537〜1544 :及びSchu
lzら、 Eur. J. Immunol. (1995) 25 : 3191〜3194である。
82, 1537〜1544) 及びＣＤ２５（Schultz ら、J. Exp. Med. 1998, 187 (2) : 2
71-5）の表面から低アフィニティーイムノグロブリンＩｇＥ Ｆｃレセプターを
、ヒトＴ細胞インターロイキン−２レセプターからのサブユニットを開裂するこ
とが見い出されている。Ｂ細胞表面からのレセプターの開裂はその培養上清中の
可溶性ＣＤ２３中の平行した増加に関連していた。ＩｇＥ分泌性Ｂ細胞からの細
胞表面ＣＤ２３の損失は、ＩｇＥ合成を通常、制限する重要な阻害フィードバッ
クメカニズムを除去することによりＩｇＥ免疫応答を促進し、増強し得る。（He
wittら、1995, J. Exp. Med. 182, 1537〜1544) 。更に、可溶性ＣＤ２３はＩｇ
Ｅ生産を促進することが示されているので、ＤｅｒＰ１により遊離されるＣＤ２
３のフラグメントはＩｇＥの合成を直接、増強することができる。ＣＤ２３開裂
の効果に加えて、Ｔ細胞の表面からのＣＤ２５の開裂は、増殖及びＩＮＦ−γ分
泌の減少を誘導し、それは結果として免疫応答をＴｈ２型応答に向かわせる。Ｄ
ｅｒＰ１抗原に関する現在の論文は、Machado ら、Eur. J. Immunol. (1996) 26
;2972〜2980 ; Hewitt ら、J. Exp. Med. (1995) 182 : 1537〜1544 :及びSchu
lzら、 Eur. J. Immunol. (1995) 25 : 3191〜3194である。
【０００８】 本発明の一部を形成する減少したタンパク質分解活性を有する他の変異アレル
ゲンは他のグループＩシステインプロテアーゼ、例えばデルマトファゴイデス・
ファリナエ（Dermatophagoides farinae) （ＤｅｒＰ１と８０％の相同性）、及
びグループIII アレルゲン (セリンプロテアーゼ) 、例えばＤｅｒｐIII （Stew
art ら、1992, Immunology, 75, 29〜35) 及びＤｅｒｐIV (Yaseuda ら、1993,
Clin. Exp. Allergy, 23, 384-390); 及びグループIVアレルゲン (アミラーゼ)
に基づき得る。
ゲンは他のグループＩシステインプロテアーゼ、例えばデルマトファゴイデス・
ファリナエ（Dermatophagoides farinae) （ＤｅｒＰ１と８０％の相同性）、及
びグループIII アレルゲン (セリンプロテアーゼ) 、例えばＤｅｒｐIII （Stew
art ら、1992, Immunology, 75, 29〜35) 及びＤｅｒｐIV (Yaseuda ら、1993,
Clin. Exp. Allergy, 23, 384-390); 及びグループIVアレルゲン (アミラーゼ)
に基づき得る。
【０００９】 本発明のアレルゲンは、組換え生産される。Ｄｅｒｐ１タンパク質分解活性は
、酵素活性部位で、又はプロペプチドと成熟分子との間の開裂の部位で、ｃＤＮ
Ａ又はゲノムＤＮＡに変異を導入することにより害され得る。該変異アレルゲン
は、野生型アレルゲンに優る次の利点を有する：１）野生型アレルゲンにより刺
激されるものと比べてＴｈ１型の免疫応答を増加させ、それによりワクチン接種
した宿主のアレルギー能力の抑制を導き、２）減少したアレルゲン性を有し、そ
れにより高投与量の免疫原の全身投与のためにより適し、３）ネイティブＤｅｒ
Ｐ１の結合についてＩｇＥと競合するＤｅｒＰ１特異的ＩｇＧを誘導するであろ
う。
、酵素活性部位で、又はプロペプチドと成熟分子との間の開裂の部位で、ｃＤＮ
Ａ又はゲノムＤＮＡに変異を導入することにより害され得る。該変異アレルゲン
は、野生型アレルゲンに優る次の利点を有する：１）野生型アレルゲンにより刺
激されるものと比べてＴｈ１型の免疫応答を増加させ、それによりワクチン接種
した宿主のアレルギー能力の抑制を導き、２）減少したアレルゲン性を有し、そ
れにより高投与量の免疫原の全身投与のためにより適し、３）ネイティブＤｅｒ
Ｐ１の結合についてＩｇＥと競合するＤｅｒＰ１特異的ＩｇＧを誘導するであろ
う。
【００１０】 本発明のアレルゲンは、自己分解性分解の欠如により測定して、単離され又は
組換え体活性ＤｅｒＰ１よりも安定である。これにより本発明はアレルゲンの野
生型と比べて安定であるアレルゲンも供し、ここで該アレルゲンは、かなり減少
したタンパク質分解活性を有し、実質的に全長のタンパク質であり、任意に、該
アレルゲンは更にアレルゲンのプロ型を含む。
組換え体活性ＤｅｒＰ１よりも安定である。これにより本発明はアレルゲンの野
生型と比べて安定であるアレルゲンも供し、ここで該アレルゲンは、かなり減少
したタンパク質分解活性を有し、実質的に全長のタンパク質であり、任意に、該
アレルゲンは更にアレルゲンのプロ型を含む。
【００１１】 本発明の一態様は、上述の通り変異したＤｅｒｐ１をコードする核酸を供し、
そして本発明の更なる態様は、変異したＤｅｒｐ１自体を供する。本発明のなお
更なる態様は、実質的に安定な組換えＤｅｒＰ１を供する、前記安定なＤｅｒＰ
１は実質的に全長の成熟タンパク質であるか、又はプロＤｅｒＰ１分泌を更に含
む成熟タンパク質である。本発明の文脈における用語“安定な”とは、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析により証明して、タンパク質分解的に活性を野生型ＤｅｒＰ１と比
較して室温で一晩、インキュベートした時に自己タンパク質分解により実質的な
量の分解を行わない産物である。
そして本発明の更なる態様は、変異したＤｅｒｐ１自体を供する。本発明のなお
更なる態様は、実質的に安定な組換えＤｅｒＰ１を供する、前記安定なＤｅｒＰ
１は実質的に全長の成熟タンパク質であるか、又はプロＤｅｒＰ１分泌を更に含
む成熟タンパク質である。本発明の文脈における用語“安定な”とは、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析により証明して、タンパク質分解的に活性を野生型ＤｅｒＰ１と比
較して室温で一晩、インキュベートした時に自己タンパク質分解により実質的な
量の分解を行わない産物である。
【００１２】 本発明のなお更なる態様は、変異したＤｅｒｐ１タンパク質の調製のための方
法であって、組換え宿主細胞において前記タンパク質をコードするＤＮＡを発現
させ、そしてその産物を回収することを含む方法を供する。 変異したＤｅｒｐ１（又は他の変異したアレルゲン）をコードするＤＮＡ分子
は本発明の更なる態様を形成し、標準的なＤＮＡ合成技術により、例えばD.M. R
obertsら(Biochemistly 1985, 29, 5090〜5098）により記載される酵素的連結に
より、化学的合成により、試験管内酵素的重合により、又はこれらの技術の組合
せにより合成することができる。
法であって、組換え宿主細胞において前記タンパク質をコードするＤＮＡを発現
させ、そしてその産物を回収することを含む方法を供する。 変異したＤｅｒｐ１（又は他の変異したアレルゲン）をコードするＤＮＡ分子
は本発明の更なる態様を形成し、標準的なＤＮＡ合成技術により、例えばD.M. R
obertsら(Biochemistly 1985, 29, 5090〜5098）により記載される酵素的連結に
より、化学的合成により、試験管内酵素的重合により、又はこれらの技術の組合
せにより合成することができる。
【００１３】 ＤＮＡの酵素的重合は、一般に５０mL又はそれ未満の容量で、必要に応じて１
０°〜３７℃の温度で、ヌクレオシドトリホスフェートｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄ
ＧＴＰ及びｄＴＴＰを含む適切な緩衝液中でＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフ
ラグメント）を用いて試験管内で行うことができる。ＤＮＡフラグメントの酵素
による連結は、適切な緩衝液、例えば０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ（pH７．４）、０．
０１Ｍ ＭｇＣｌ2 ，０．０１Ｍジチオトレイトール、１mMスペルミジン、１mM
ＡＴＰ及び０．１mg／mLウシ血清アルブミン中で、４℃〜環境温度で、一般に
５０mL又はそれ未満の容量でＴ４ ＤＮＡのようなＤＮＡリガーゼを用いて行う
ことができる。ＤＮＡポリマー又はフラグメントの化学合成は、'Chemical and
Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual' (ed. H.G. G
assen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982)、又は他の科学出版物、
例えばM.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat、及びR.C. Titmas,
Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243 ; B.S. Sproat 及びW. Bannwarth,
Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771 ; M.D. Matteucci及びM.H Caruthers, T
etrahedron Letters, 1980, 21, 719 ; M.D. Matteucci及びM.H. Caruthers, Jo
urnal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185 ; S.P. Adamsら、
., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661 ; N.D. Sinha
, J. Biernat, J. McMannus 、及びH. Koester, Nucleic Acids Research, 1984
, 12, 4539 ; and H.W.D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801に記載
されるもののような固相技術を用いて、慣用的なホスホトリエステル、ホスファ
イト又はホスホルアミジト化学により行うことができる。
０°〜３７℃の温度で、ヌクレオシドトリホスフェートｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄ
ＧＴＰ及びｄＴＴＰを含む適切な緩衝液中でＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフ
ラグメント）を用いて試験管内で行うことができる。ＤＮＡフラグメントの酵素
による連結は、適切な緩衝液、例えば０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ（pH７．４）、０．
０１Ｍ ＭｇＣｌ2 ，０．０１Ｍジチオトレイトール、１mMスペルミジン、１mM
ＡＴＰ及び０．１mg／mLウシ血清アルブミン中で、４℃〜環境温度で、一般に
５０mL又はそれ未満の容量でＴ４ ＤＮＡのようなＤＮＡリガーゼを用いて行う
ことができる。ＤＮＡポリマー又はフラグメントの化学合成は、'Chemical and
Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual' (ed. H.G. G
assen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982)、又は他の科学出版物、
例えばM.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat、及びR.C. Titmas,
Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243 ; B.S. Sproat 及びW. Bannwarth,
Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771 ; M.D. Matteucci及びM.H Caruthers, T
etrahedron Letters, 1980, 21, 719 ; M.D. Matteucci及びM.H. Caruthers, Jo
urnal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185 ; S.P. Adamsら、
., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661 ; N.D. Sinha
, J. Biernat, J. McMannus 、及びH. Koester, Nucleic Acids Research, 1984
, 12, 4539 ; and H.W.D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801に記載
されるもののような固相技術を用いて、慣用的なホスホトリエステル、ホスファ
イト又はホスホルアミジト化学により行うことができる。
【００１４】 あるいは、そのコーディング配列は、周知の技術 (例えば相補的ｃＤＮＡ鎖を
作り出すためのｍＲＮＡの逆転写）；及び市販のｃＤＮＡキットを用いて、Ｄｅ
ｒＰ１ ｍＲＮＡから得ることができる。 本発明は特定の開示される配列に限定されないが、そのタンパク質分解活性の
いくつか又は全てを除去するように変異されているが野生型アレルゲンに対する
免疫応答を刺激する能力を保持するいずれのタンパク質分解性アレルゲンも含む
。変異体アレルゲンは、Shultzら、1995, European Journal of Immunology, 25
, 3191〜3194）に従うＣＤ２３開裂アッセイ、又はMachado ら、 1996, Eur. J.
Immunol. 26, 2972〜2980に記載される基質の酵素による分解により野生型と比
較することができる。変異アレルゲンの免疫原性は、種々の免疫学アッセイによ
り野生型アレルゲンのそれと比較することができる。その変異体及び野生型アレ
ルゲンの交差反応は、変異体又は野生型アレルゲンでのワクチン接種の後の試験
管内Ｔ細胞アッセイによりアッセイすることができる。要約すると、ワクチン接
種動物から単離した脾臓Ｔ細胞は、変異体又は野生型アレルゲンて試験管内で再
刺激し、次に市販のＥＬＩＳＡアッセイでサイトカイン生産を測定することがで
き、又はアレルゲン特異的Ｔ細胞の増殖は、トリチウム化チミジンの組込みによ
り、経時的にアッセイすることができる。また、免疫原性は、ＥＬＩＳＡアッセ
イにより測定することができ、その詳細な当業者により容易に決定され得る。要
約すると、ＥＬＩＳＡアッセイの２つの型が考えられる。第１は、野生型Ｄｅｒ
ｐ１で免疫化したマウスの血清により変異ＤｅｒＰ１の認識を評価することであ
り、そして第２は、変異アレルゲンで免疫化した動物の血清により野生型Ｄｅｒ
Ｐ１アレルゲンの認識による。要約すると、各々のウェルは１００ngの精製した
野生型又は変異したＤｅｒｐ１で４℃で一晩、コートされるであろう。ブロッキ
ング溶液（０．１％ ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ０．１％）とインキュ
ベートした後、血清の連続希釈物は１時間、３７℃でインキュベートされよう。
それらウェルは５回、洗浄され、全ＩｇＧはアルカリホスファターゼとコンジュ
ゲートした抗ＩｇＧ抗体とインキュベートすることにより示される。
作り出すためのｍＲＮＡの逆転写）；及び市販のｃＤＮＡキットを用いて、Ｄｅ
ｒＰ１ ｍＲＮＡから得ることができる。 本発明は特定の開示される配列に限定されないが、そのタンパク質分解活性の
いくつか又は全てを除去するように変異されているが野生型アレルゲンに対する
免疫応答を刺激する能力を保持するいずれのタンパク質分解性アレルゲンも含む
。変異体アレルゲンは、Shultzら、1995, European Journal of Immunology, 25
, 3191〜3194）に従うＣＤ２３開裂アッセイ、又はMachado ら、 1996, Eur. J.
Immunol. 26, 2972〜2980に記載される基質の酵素による分解により野生型と比
較することができる。変異アレルゲンの免疫原性は、種々の免疫学アッセイによ
り野生型アレルゲンのそれと比較することができる。その変異体及び野生型アレ
ルゲンの交差反応は、変異体又は野生型アレルゲンでのワクチン接種の後の試験
管内Ｔ細胞アッセイによりアッセイすることができる。要約すると、ワクチン接
種動物から単離した脾臓Ｔ細胞は、変異体又は野生型アレルゲンて試験管内で再
刺激し、次に市販のＥＬＩＳＡアッセイでサイトカイン生産を測定することがで
き、又はアレルゲン特異的Ｔ細胞の増殖は、トリチウム化チミジンの組込みによ
り、経時的にアッセイすることができる。また、免疫原性は、ＥＬＩＳＡアッセ
イにより測定することができ、その詳細な当業者により容易に決定され得る。要
約すると、ＥＬＩＳＡアッセイの２つの型が考えられる。第１は、野生型Ｄｅｒ
ｐ１で免疫化したマウスの血清により変異ＤｅｒＰ１の認識を評価することであ
り、そして第２は、変異アレルゲンで免疫化した動物の血清により野生型Ｄｅｒ
Ｐ１アレルゲンの認識による。要約すると、各々のウェルは１００ngの精製した
野生型又は変異したＤｅｒｐ１で４℃で一晩、コートされるであろう。ブロッキ
ング溶液（０．１％ ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ０．１％）とインキュ
ベートした後、血清の連続希釈物は１時間、３７℃でインキュベートされよう。
それらウェルは５回、洗浄され、全ＩｇＧはアルカリホスファターゼとコンジュ
ゲートした抗ＩｇＧ抗体とインキュベートすることにより示される。
【００１５】 酵素的に活性をアレルゲン又はＤｅｒＰ１の削減は、不活性化された変異体を
組換え生産する前に、ネイティブ配列に変異を導入することにより行うことがで
きる。これは、活性部位に置換、欠失、又は付加を導入することにより；不活性
なプロ酵素を活性な成熟タンパク質にプロセッシングする領域中の残基を挿入、
欠失又は置換することにより；又は酵素活性が失われるようにタンパク質の３次
元構造を変えることにより行うことができ、これは、とりわけ、フラグメントに
おいてタンパク質を発現することにより、又はジスルフィド架橋形成に関与する
システイン残基を削除することにより、又はタンパク質の３次構造を実質的に変
えるように、残基を削除又は付加することにより達成することができる。あるい
は、結果として生ずる十分に折りたたまれた組換えタンパク質中の（プレプロタ
ンパク質の位置１３２及び２６８に各々相当する）成熟タンパク質の各々位置３
４及び１７０において、ＣｙｓとＨｉｓ残基との間の相互作用を変化させる効果
を伴う変異を形成することができる。
組換え生産する前に、ネイティブ配列に変異を導入することにより行うことがで
きる。これは、活性部位に置換、欠失、又は付加を導入することにより；不活性
なプロ酵素を活性な成熟タンパク質にプロセッシングする領域中の残基を挿入、
欠失又は置換することにより；又は酵素活性が失われるようにタンパク質の３次
元構造を変えることにより行うことができ、これは、とりわけ、フラグメントに
おいてタンパク質を発現することにより、又はジスルフィド架橋形成に関与する
システイン残基を削除することにより、又はタンパク質の３次構造を実質的に変
えるように、残基を削除又は付加することにより達成することができる。あるい
は、結果として生ずる十分に折りたたまれた組換えタンパク質中の（プレプロタ
ンパク質の位置１３２及び２６８に各々相当する）成熟タンパク質の各々位置３
４及び１７０において、ＣｙｓとＨｉｓ残基との間の相互作用を変化させる効果
を伴う変異を形成することができる。
【００１６】 本発明は、本明細書に詳述され、これらに限らないが、タンパク質分解的に不
活性なＤｅｒＰ１の例として供される３つの特定の変異にある。第１に、Ｄｅｒ
Ｐ１の酵素活性は、活性部位におけるシステイン残基をアラニンに置換すること
により排除される。この置換はプロＤｅｒＰ１タンパク質配列のＣｙｓ１３２→
Ａｌａ１３２でおこり、配列番号：１に示される。
活性なＤｅｒＰ１の例として供される３つの特定の変異にある。第１に、Ｄｅｒ
Ｐ１の酵素活性は、活性部位におけるシステイン残基をアラニンに置換すること
により排除される。この置換はプロＤｅｒＰ１タンパク質配列のＣｙｓ１３２→
Ａｌａ１３２でおこり、配列番号：１に示される。
【００１７】 第２に、ＤｅｒＰ１アレルゲンは組換え発現され、プロ及び成熟タンパク質間
のリンカー領域における４つのアミノ酸残基の削除によりその不活性なプロタン
パク質形態を保持する。この削除はＰｒｏ−ＤｅｒＰ１タンパク質配列からの部
位９６〜９９からアミノ酸残基ＮＡＥＴをもとめて除去する。この配列は配列番
号：２に示す。第３に、ＤｅｒＰ１の酵素活性は、活性部位中のヒスチジン残基
をアラニンに置換することにより排除される。この置換はプロＤｅｒＰ１タンパ
ク質配列のＨｉｓ２６８→Ａｌａ２６８でおこり、配列番号：３に示される。
のリンカー領域における４つのアミノ酸残基の削除によりその不活性なプロタン
パク質形態を保持する。この削除はＰｒｏ−ＤｅｒＰ１タンパク質配列からの部
位９６〜９９からアミノ酸残基ＮＡＥＴをもとめて除去する。この配列は配列番
号：２に示す。第３に、ＤｅｒＰ１の酵素活性は、活性部位中のヒスチジン残基
をアラニンに置換することにより排除される。この置換はプロＤｅｒＰ１タンパ
ク質配列のＨｉｓ２６８→Ａｌａ２６８でおこり、配列番号：３に示される。
【００１８】 各々の野生型酵素アレルゲンの活性部位は、文献から、又は相同性を引用する
ことにより決定することができる。例えば、システインプロテアーゼであるＤｅ
ｒＰ１の活性部位は、パパインのような他の周知のシステインを引用することに
より予想として推定される。ＤｅｒＰ１は、カテプシンＢを含む他のパパイン様
システインプロテイナーゼと、本質的な構造及びメカニズムの特徴を共有する。
活性部位チオレート−イミダゾリウムイオン対は、Ｃｙｓ３４及びＨｉｓ１７０
の側鎖を含む（Tophamら、1994, Protein Engineering, 7, 7, 869〜894)。
ことにより決定することができる。例えば、システインプロテアーゼであるＤｅ
ｒＰ１の活性部位は、パパインのような他の周知のシステインを引用することに
より予想として推定される。ＤｅｒＰ１は、カテプシンＢを含む他のパパイン様
システインプロテイナーゼと、本質的な構造及びメカニズムの特徴を共有する。
活性部位チオレート−イミダゾリウムイオン対は、Ｃｙｓ３４及びＨｉｓ１７０
の側鎖を含む（Tophamら、1994, Protein Engineering, 7, 7, 869〜894)。
【００１９】 Ｄｅｒｐ１の変異型は、G. Winter ら(Nature 1982, 299 1756〜758)又はZo
ller及びSmith (1982 ; Nucl. Acids Res., 10, 6487〜6500) により記載される
方法のような慣用的な方法、又はChan及びSmith (Nucl. Acids Res., 1984, 12 , 2407〜2419) 又はWinterら (Biochem. Soc. Trans, 1984 12, 224〜225) に
より記載されるような欠失変異誘発によりＤｅｒｐ１タンパク質をコードするｃ
ＤＮＡの部位特異的変異誘発により調製することができる。
ller及びSmith (1982 ; Nucl. Acids Res., 10, 6487〜6500) により記載される
方法のような慣用的な方法、又はChan及びSmith (Nucl. Acids Res., 1984, 12 , 2407〜2419) 又はWinterら (Biochem. Soc. Trans, 1984 12, 224〜225) に
より記載されるような欠失変異誘発によりＤｅｒｐ１タンパク質をコードするｃ
ＤＮＡの部位特異的変異誘発により調製することができる。
【００２０】 本発明の方法は、Maniatisら、Molecular Cloning - A Laboratory Manual ;
Cold Spring Harbor, 1982-1989 に記載されるような慣用的な組換え技術により
行うことができる。 特に、その方法は次のステップを含む： １．宿主細胞において、前記変異Ｄｅｒｐ１タンパク質をコードするヌクレオ
チド配列を含むＤＮＡポリマーを発現することができる複製可能な又は組込み可
能な発現ベクターを調製し； ２．次の技術のうちの１つにより生じたタンパク質の酵素活性を変化させ：部
位特異的変異誘発を用いて活性部位からのシステイン又はヒスチジン残基（又は
その活性部位内の他の残基と相互作用する他の残基）をアラニン残基におきかえ
；その配列が天然のものと異なるオリゴヌクレオチドの対によりｃＤＮＡフラグ
メントを置換し；又は部位特異的変異誘発を用いてプロペプチドと成熟酵素との
間の連結部において４つの残基を削除し； ３．宿主細胞を前記ベクターで形質転換し； ４．ＤＮＡポリマーの発現を許容する条件下でその形質転換された宿主細胞を
培養してタンパク質を作り出し；そして ５．そのタンパク質を回収する。
Cold Spring Harbor, 1982-1989 に記載されるような慣用的な組換え技術により
行うことができる。 特に、その方法は次のステップを含む： １．宿主細胞において、前記変異Ｄｅｒｐ１タンパク質をコードするヌクレオ
チド配列を含むＤＮＡポリマーを発現することができる複製可能な又は組込み可
能な発現ベクターを調製し； ２．次の技術のうちの１つにより生じたタンパク質の酵素活性を変化させ：部
位特異的変異誘発を用いて活性部位からのシステイン又はヒスチジン残基（又は
その活性部位内の他の残基と相互作用する他の残基）をアラニン残基におきかえ
；その配列が天然のものと異なるオリゴヌクレオチドの対によりｃＤＮＡフラグ
メントを置換し；又は部位特異的変異誘発を用いてプロペプチドと成熟酵素との
間の連結部において４つの残基を削除し； ３．宿主細胞を前記ベクターで形質転換し； ４．ＤＮＡポリマーの発現を許容する条件下でその形質転換された宿主細胞を
培養してタンパク質を作り出し；そして ５．そのタンパク質を回収する。
【００２１】 用語“形質転換”は、本明細書において、例えばGenetic Engineering ; Eds.
S.M. Kingsman及びA.J. Kingsman ; Blackwell Scientific Publications ; Ox
ford, England, 1988 に記載される慣用的な技術を用いて、適切なプラスミド又
はウィルスベクターでの形質転換、トランスフェクション又は感染により、外来
ＤＮＡを宿主細胞に導入することを意味する。用語“形質転換された”又は“形
質転換体”は、以後、関心ある外来遺伝子を含み、それを発現する結果として生
じた宿主細胞に適用されよう。
S.M. Kingsman及びA.J. Kingsman ; Blackwell Scientific Publications ; Ox
ford, England, 1988 に記載される慣用的な技術を用いて、適切なプラスミド又
はウィルスベクターでの形質転換、トランスフェクション又は感染により、外来
ＤＮＡを宿主細胞に導入することを意味する。用語“形質転換された”又は“形
質転換体”は、以後、関心ある外来遺伝子を含み、それを発現する結果として生
じた宿主細胞に適用されよう。
【００２２】 その発現ベクターは新規であり、これも本発明の一部を形成する。 複製可能な発現ベクターは、宿主細胞と適合するベクターを開裂して完全なレ
プリコンを有する直鎖ＤＮＡセグメントを供し、そしてその直鎖セグメントを、
その直鎖セグメントと一緒に、Ｄｅｒｐ１タンパク質をコードするＤＮＡポリマ
ーのような要求される産物をコードする１又は複数のＤＮＡ分子と、連結条件下
で組み合わせることにより、本発明に従って調製することができる。
プリコンを有する直鎖ＤＮＡセグメントを供し、そしてその直鎖セグメントを、
その直鎖セグメントと一緒に、Ｄｅｒｐ１タンパク質をコードするＤＮＡポリマ
ーのような要求される産物をコードする１又は複数のＤＮＡ分子と、連結条件下
で組み合わせることにより、本発明に従って調製することができる。
【００２３】 これにより、そのＤＮＡポリマーは、必要に応じて、予め形成され、又はベク
ターの作製の間に形成され得る。 ベクターの選択は、原核生物又は真核生物であり得る宿主細胞により部分的に
決定されるであろう。適切なベクターには、プラスミド、バクテリオファージ、
コスミド及び組換えウィルスがある。
ターの作製の間に形成され得る。 ベクターの選択は、原核生物又は真核生物であり得る宿主細胞により部分的に
決定されるであろう。適切なベクターには、プラスミド、バクテリオファージ、
コスミド及び組換えウィルスがある。
【００２４】 複製可能な発現ベクターの調製は、便利には、例えば上述のManiatisらに記載
される手順により、ＤＮＡの制限、重合及び連結のための適切な酵素で行うこと
ができる。 組換え宿主細胞は、宿主細胞を本発明の複製可能な発現ベクターで形質転換条
件下で形質転換することにより、本発明に従って調製される。適切な形質転換条
件は慣用的であり、例えば上述のManiatisら、又は“DNA Cloning" Vol. II, D.
M. Glover ed., IRL Press. Ltd, 1985 に記載される。
される手順により、ＤＮＡの制限、重合及び連結のための適切な酵素で行うこと
ができる。 組換え宿主細胞は、宿主細胞を本発明の複製可能な発現ベクターで形質転換条
件下で形質転換することにより、本発明に従って調製される。適切な形質転換条
件は慣用的であり、例えば上述のManiatisら、又は“DNA Cloning" Vol. II, D.
M. Glover ed., IRL Press. Ltd, 1985 に記載される。
【００２５】 形質転換条件の選択は宿主細胞により決定される。これにより、大腸菌のよう
な細菌宿主は、ＣａＣｌ2 の溶液（Cohen ら、Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69 , 2110) で又はＲｂＣｌ，ＭｎＣｌ2 、酢酸カリウムの混合物を含む溶液で、
次に３−〔Ｎ−モルホリノ〕−プロパン−スルホン酸、ＲｂＣｌ及びグリセロー
ルで処理することができる。培養中の哺乳動物細胞は、ベクターＤＮＡの細胞へ
のカルシウム同時沈降により、リポフェクションにより、又はエレクトロポレー
ションにより形質転換することができる。本発明は、本発明の複製可能な発現ベ
クターで形質転換された宿主細胞も包含する。
な細菌宿主は、ＣａＣｌ2 の溶液（Cohen ら、Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69 , 2110) で又はＲｂＣｌ，ＭｎＣｌ2 、酢酸カリウムの混合物を含む溶液で、
次に３−〔Ｎ−モルホリノ〕−プロパン−スルホン酸、ＲｂＣｌ及びグリセロー
ルで処理することができる。培養中の哺乳動物細胞は、ベクターＤＮＡの細胞へ
のカルシウム同時沈降により、リポフェクションにより、又はエレクトロポレー
ションにより形質転換することができる。本発明は、本発明の複製可能な発現ベ
クターで形質転換された宿主細胞も包含する。
【００２６】 ＤＮＡポリマーの発現を許容する条件下での形質転換された宿主細胞の培養は
、慣用的には、例えばManiatisら及び上述の "DNA Cloning ”に記載されるよう
に行われる。これにより、好ましくは、細胞には栄養素が補給され、４５℃未満
の温度で培養される。 その産物は、宿主細胞に従って慣用的な方法により回収される。これにより、
宿主細胞が細菌、例えば大腸菌である場合、それは物理的、化学的又は酵素的に
溶解することができ、そのタンパク質産物は、生じたライセンスから単離するこ
とができる。宿主細胞が哺乳動物である場合、その産物は一般に、栄養培地から
又は無細胞抽出物から単離することができる。慣用的なタンパク質単離技術には
、沈降法、吸着クロマトグラフィー、及びモノクローナル抗体アフィニティーカ
ラムを含むアフィニティークロマトグラフィーがある。
、慣用的には、例えばManiatisら及び上述の "DNA Cloning ”に記載されるよう
に行われる。これにより、好ましくは、細胞には栄養素が補給され、４５℃未満
の温度で培養される。 その産物は、宿主細胞に従って慣用的な方法により回収される。これにより、
宿主細胞が細菌、例えば大腸菌である場合、それは物理的、化学的又は酵素的に
溶解することができ、そのタンパク質産物は、生じたライセンスから単離するこ
とができる。宿主細胞が哺乳動物である場合、その産物は一般に、栄養培地から
又は無細胞抽出物から単離することができる。慣用的なタンパク質単離技術には
、沈降法、吸着クロマトグラフィー、及びモノクローナル抗体アフィニティーカ
ラムを含むアフィニティークロマトグラフィーがある。
【００２７】 あるいは、発現は、バキュロウィルスのような適切なベクターを用いて昆虫細
胞において、形質転換されたドロソフィラ細胞又は哺乳動物ＣＨＯ細胞において
、行うことができる。本発明の新規タンパク質は、ＥＰ−Ａ−０ ２７８ ９４
１においてＣＳタンパク質について記載されるようにイースト細胞において発現
させることもできる。
胞において、形質転換されたドロソフィラ細胞又は哺乳動物ＣＨＯ細胞において
、行うことができる。本発明の新規タンパク質は、ＥＰ−Ａ−０ ２７８ ９４
１においてＣＳタンパク質について記載されるようにイースト細胞において発現
させることもできる。
【００２８】 本発明のワクチンは、免疫保護量のＤｅｒｐ１（又は他の）アレルゲンタンパ
ク質の変異型を含む。用語“免疫保護”とは、アレルギー疾患が回避され又は和
げられるように、後の攻撃に対する免疫応答を誘発するのに必要な量をいう。あ
るいは、先に凍結乾燥を行った、又は行っていないタンパク質は、種々の周知の
アジュバントのいずれかと混合し、吸着し、又は共有結合させることができる。
好ましくは、アジュバントは、Ｔｈ１型免疫応答の選択的インジケーターであり
得る。
ク質の変異型を含む。用語“免疫保護”とは、アレルギー疾患が回避され又は和
げられるように、後の攻撃に対する免疫応答を誘発するのに必要な量をいう。あ
るいは、先に凍結乾燥を行った、又は行っていないタンパク質は、種々の周知の
アジュバントのいずれかと混合し、吸着し、又は共有結合させることができる。
好ましくは、アジュバントは、Ｔｈ１型免疫応答の選択的インジケーターであり
得る。
【００２９】 免疫応答は、免疫系の細胞との抗原の相互作用を介して抗原に対して形成され
る。生じた免疫応答は、広くは２つの最終的なカテゴリーに分離することができ
、それらは、（伝統的に各々抗体及び保護の細胞エフェクターメカニズムを特徴
とする）体性又は細胞媒介性免疫応答である。これらの応答のカテゴリーはＴｈ
１型応答（細胞媒介応答）、及びＴｈ２型免疫応答（体性応答）と呼ばれる。マ
ウスにおいて、Ｔｈ１型応答はＩｇＧ２ａサブタイプの抗体の形成を特徴とし、
一方ヒトにおいてはこれらはＩｇＧ１型抗体に相当する。Ｔｈ２型免疫応答はマ
ウスＩｇＥ，ＩｇＧ１，ＩｇＡ、及びＩｇＭを含む広範囲のイムノグロブリンア
イソタイプの形成を特徴とする。
る。生じた免疫応答は、広くは２つの最終的なカテゴリーに分離することができ
、それらは、（伝統的に各々抗体及び保護の細胞エフェクターメカニズムを特徴
とする）体性又は細胞媒介性免疫応答である。これらの応答のカテゴリーはＴｈ
１型応答（細胞媒介応答）、及びＴｈ２型免疫応答（体性応答）と呼ばれる。マ
ウスにおいて、Ｔｈ１型応答はＩｇＧ２ａサブタイプの抗体の形成を特徴とし、
一方ヒトにおいてはこれらはＩｇＧ１型抗体に相当する。Ｔｈ２型免疫応答はマ
ウスＩｇＥ，ＩｇＧ１，ＩｇＡ、及びＩｇＭを含む広範囲のイムノグロブリンア
イソタイプの形成を特徴とする。
【００３０】 これらの２つの型の免疫応答に隠れた駆動力は、免疫系の細胞を助けるよう機
能し、Ｔｈ１又はＴｈ２応答に対する最終的な免疫応答を指揮するいくつかの同
定されたタンパク質メッセンジャーであるサイトカインである。これにより、Ｔ
ｈ２型サイトカインは所定の抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導するが、Ｔ
ｈ２型サイトカインは抗原に対する体性免疫応答を誘導する。
能し、Ｔｈ１又はＴｈ２応答に対する最終的な免疫応答を指揮するいくつかの同
定されたタンパク質メッセンジャーであるサイトカインである。これにより、Ｔ
ｈ２型サイトカインは所定の抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導するが、Ｔ
ｈ２型サイトカインは抗原に対する体性免疫応答を誘導する。
【００３１】 Ｔｈ１及びＴｈ２型免疫応答の区別は絶対的でないことを思い出すことが重要
である。実際、個体は、Ｔｈ１優勢又はＴｈ２優勢であるとして記述される免疫
応答を支持するであろう。しかしながら、Mosmann 及びCoffman (Mosmann, T.R.
及びCoffman, R.L. (1989)ＴＨ１及びＴＨ２細胞： different patterns of lym
phokine secretion lead to different fuactional properties : Annual Revie
w of Immunology, 7, p145〜173)により、ネズミＣＤ４Ｔ細胞クローンにおいて
記述されるものの意味においてサイトカインのファミリーを考えることがしばし
ば便利である。伝統的に、Ｔｈ１型応答は、細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ）のよ
うな細胞媒介性エフェクターメカニズムに関連しており、Ｔリンパ球によるＩＮ
Ｆ−γ及びＩＬ−２サイトカインの生産を特徴とし得る。Ｔｈ１型免疫応答の誘
導にしばしば直接、関連しない他のサイトカイン、例えばＩＬ−１２はＴ細胞に
より生産されない。対照的に、Ｔｈ２型応答は、体性メカニズム、並びにＩＬ−
４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−１０及び腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）の分泌
に関連する。
である。実際、個体は、Ｔｈ１優勢又はＴｈ２優勢であるとして記述される免疫
応答を支持するであろう。しかしながら、Mosmann 及びCoffman (Mosmann, T.R.
及びCoffman, R.L. (1989)ＴＨ１及びＴＨ２細胞： different patterns of lym
phokine secretion lead to different fuactional properties : Annual Revie
w of Immunology, 7, p145〜173)により、ネズミＣＤ４Ｔ細胞クローンにおいて
記述されるものの意味においてサイトカインのファミリーを考えることがしばし
ば便利である。伝統的に、Ｔｈ１型応答は、細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ）のよ
うな細胞媒介性エフェクターメカニズムに関連しており、Ｔリンパ球によるＩＮ
Ｆ−γ及びＩＬ−２サイトカインの生産を特徴とし得る。Ｔｈ１型免疫応答の誘
導にしばしば直接、関連しない他のサイトカイン、例えばＩＬ−１２はＴ細胞に
より生産されない。対照的に、Ｔｈ２型応答は、体性メカニズム、並びにＩＬ−
４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−１０及び腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）の分泌
に関連する。
【００３２】 特定のワクチンアジュバントがＴｈ１又はＴｈ２型サイトカイン応答の刺激に
特に適していることが知られている。このサイトカイン生産の重みは、Ｔｈ１型
又はＴｈ２型免疫応答優勢の形成に翻訳される。伝統的に、ワクチン接種又は感
染後の免疫応答のＴｈ１：Ｔｈ２バランスの最も優れたインジケーターには、抗
原の再刺激後の試験管内でのＴリンパ球によるＴｈ１又はＴｈ２サイトカインの
生産の直接の測定、及び抗原特異的抗体応答のＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比の測定が
ある。
特に適していることが知られている。このサイトカイン生産の重みは、Ｔｈ１型
又はＴｈ２型免疫応答優勢の形成に翻訳される。伝統的に、ワクチン接種又は感
染後の免疫応答のＴｈ１：Ｔｈ２バランスの最も優れたインジケーターには、抗
原の再刺激後の試験管内でのＴリンパ球によるＴｈ１又はＴｈ２サイトカインの
生産の直接の測定、及び抗原特異的抗体応答のＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比の測定が
ある。
【００３３】 これにより、Ｔｈ１型アジュバントは、単離されたＴ細胞集団を刺激して、試
験管内で抗原で再刺激した時に高レベルのＴｈ１型サイトカインを作り出し、そ
してＴｈ１型メカニズムに関連した抗原特異的イムノグロブリン応答を誘導する
（マウスにおけるＩｇＧ２ａ、ヒトにおけるＩｇＧ１）ものである。 アジュバントには、これらに限らないが、水酸化アルミニウム、ムラミルジペ
プチド及びサポニン、例えばＱｕｉｌＡ，３Ｄ−ＭＰＬ（３−Ｏ−脱アシル化モ
ノホスホリル脂質Ａ）、又はＴＤＭがある。更なるかわりの例として、タンパク
質は、リポソームのような微小粒子内に被包することができる。Ｔｈ１型免疫応
答を選択的に刺激する特に好ましいアジュバントは、３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１
の組合せ（ＥＰ ０ ６７１ ９４８ Ｂ１）、３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１を含
む水中油エマルション（ＷＯ９５／１７２１０）、他の担体と共に調剤された３
Ｄ−ＭＰＬ（ＥＰ ０ ６８９ ４５４ Ｂ１）、又はコレステロール含有リポ
ソーム中に調剤したＱＳ２１（ＷＯ９６／３３７３９）、又は免疫刺激性オリゴ
ヌクレオチド（ＷＯ９６／０２５５５）である。なお、別の例において、タンパ
ク質は、破傷風毒素のような抗アレルゲン免疫応答の形成の助けとなるＴ細胞を
供することができる担体タンパク質にコンジュゲートさせることができる。Ｑｕ
ｉｌＡの使用はDalsgaard ら (Acta Vet Scand. 18 : 349 (1977）により開示さ
れる。
験管内で抗原で再刺激した時に高レベルのＴｈ１型サイトカインを作り出し、そ
してＴｈ１型メカニズムに関連した抗原特異的イムノグロブリン応答を誘導する
（マウスにおけるＩｇＧ２ａ、ヒトにおけるＩｇＧ１）ものである。 アジュバントには、これらに限らないが、水酸化アルミニウム、ムラミルジペ
プチド及びサポニン、例えばＱｕｉｌＡ，３Ｄ−ＭＰＬ（３−Ｏ−脱アシル化モ
ノホスホリル脂質Ａ）、又はＴＤＭがある。更なるかわりの例として、タンパク
質は、リポソームのような微小粒子内に被包することができる。Ｔｈ１型免疫応
答を選択的に刺激する特に好ましいアジュバントは、３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１
の組合せ（ＥＰ ０ ６７１ ９４８ Ｂ１）、３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１を含
む水中油エマルション（ＷＯ９５／１７２１０）、他の担体と共に調剤された３
Ｄ−ＭＰＬ（ＥＰ ０ ６８９ ４５４ Ｂ１）、又はコレステロール含有リポ
ソーム中に調剤したＱＳ２１（ＷＯ９６／３３７３９）、又は免疫刺激性オリゴ
ヌクレオチド（ＷＯ９６／０２５５５）である。なお、別の例において、タンパ
ク質は、破傷風毒素のような抗アレルゲン免疫応答の形成の助けとなるＴ細胞を
供することができる担体タンパク質にコンジュゲートさせることができる。Ｑｕ
ｉｌＡの使用はDalsgaard ら (Acta Vet Scand. 18 : 349 (1977）により開示さ
れる。
【００３４】 ワクチン調製は、一般に、New Trends and Developments in Vaccine, Voller
ら (eds), University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978に記載される。
リポソームでの被包は、Fullerton の米国特許４，２３５，８７７に記述される
。タンパク質の高分子へのコンジュゲーションは、例えばLikhite の米国特許４
，３７２，９４５及びArmor らの米国特許４，４７４，７５７により開示される
。
ら (eds), University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978に記載される。
リポソームでの被包は、Fullerton の米国特許４，２３５，８７７に記述される
。タンパク質の高分子へのコンジュゲーションは、例えばLikhite の米国特許４
，３７２，９４５及びArmor らの米国特許４，４７４，７５７により開示される
。
【００３５】 各々のワクチン投与において存在する本発明のタンパク質の量は、典型的なワ
クチンにおいて大きな悪い副作用なく免疫保護応答を誘導する量として選択され
る。このような量は、用いる特定の免疫原、及びワクチンにアジュバントを加え
るか否かに依存して種々であろう。一般に、各々の投与には、１〜１０００μｇ
、好ましくは１〜２００μｇのタンパク質を含むであろう。特定のワクチンのた
めの最適な量は、被検体における抗体タイター及び他の応答の観察に関する標準
的な研究によって確認することができる。最初のワクチン接種の後、被検体には
、好ましくは、約４週目にブーストが与えられ、次にアレルギー応答が存在する
危険がある限り６ケ月毎にくり返しブーストが与えられよう。
クチンにおいて大きな悪い副作用なく免疫保護応答を誘導する量として選択され
る。このような量は、用いる特定の免疫原、及びワクチンにアジュバントを加え
るか否かに依存して種々であろう。一般に、各々の投与には、１〜１０００μｇ
、好ましくは１〜２００μｇのタンパク質を含むであろう。特定のワクチンのた
めの最適な量は、被検体における抗体タイター及び他の応答の観察に関する標準
的な研究によって確認することができる。最初のワクチン接種の後、被検体には
、好ましくは、約４週目にブーストが与えられ、次にアレルギー応答が存在する
危険がある限り６ケ月毎にくり返しブーストが与えられよう。
【００３６】 本発明のワクチンは、成熟体にも幼児（非成熟体）にも投与することができる
が、好ましくは実質的なＴｈ２型記憶応答の確立前の生まれた直後に個体にワク
チン接種する。 本発明の更なる態様は、ヒトにおいてアレルギー疾患を防止し又は和らげる方
法であって、必要な被検体に、免疫原として有効な量の本発明の変異アレルゲン
又は本発明によるワクチンを投与することを含む方法を供する。
が、好ましくは実質的なＴｈ２型記憶応答の確立前の生まれた直後に個体にワク
チン接種する。 本発明の更なる態様は、ヒトにおいてアレルギー疾患を防止し又は和らげる方
法であって、必要な被検体に、免疫原として有効な量の本発明の変異アレルゲン
又は本発明によるワクチンを投与することを含む方法を供する。
【００３７】 以下の例は本発明を詳述するが、限定するものではない。制限酵素及び他の試
薬は実質的に販売元の説明に従って用いた。 実施例１−ピキア・パストリスにおける発現： ｐＮＩＶ４８１１の作製 ｐＮＩＶ４８１１を、ピキア・パストリスＭＦαのプレプロペプチドとの融合
体において成熟Ｄｅｒｐ１の発現を促進するようデザインする。プラスミドＡＴ
ＣＣ８７３０７は成熟ＤｅｒＰ１のための配列を含む。全Ｄｅｒｐ１制限地図を
図７に供する。
薬は実質的に販売元の説明に従って用いた。 実施例１−ピキア・パストリスにおける発現： ｐＮＩＶ４８１１の作製 ｐＮＩＶ４８１１を、ピキア・パストリスＭＦαのプレプロペプチドとの融合
体において成熟Ｄｅｒｐ１の発現を促進するようデザインする。プラスミドＡＴ
ＣＣ８７３０７は成熟ＤｅｒＰ１のための配列を含む。全Ｄｅｒｐ１制限地図を
図７に供する。
【００３８】 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼとの連結： −ｐＰＩＣ９ｋ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ Ｖ１７５−２０）からのＳｐｈＩ− ＸｈｏＩ −その配列が下記の通りであるＸｈｏＩ−ＰｓｔＩオリゴヌクレオチド（ｎｏ
．９７０３８及びｎｏ. ９７０３９） −ｐＮＩＶ４８１０からのＰｓｔＩ−ＸｂａＩ（プラスミドＡＴＣＣ８７３０
７） −ｐＰＩＣ９ｋからのＡｖｒII−ＳｐｈＩ オリゴヌクレオチドの配列：
．９７０３８及びｎｏ. ９７０３９） −ｐＮＩＶ４８１０からのＰｓｔＩ−ＸｂａＩ（プラスミドＡＴＣＣ８７３０
７） −ｐＰＩＣ９ｋからのＡｖｒII−ＳｐｈＩ オリゴヌクレオチドの配列：
【００３９】
【化１】
【００４０】 結果 ｐＮＩＶ４８１１をトランスフェクトしたピキア・パストリスは、開裂されて
いないプロＭＦα−成熟Ｄｅｒｐ１融合タンパク質を含む４３kDのタンパク質の
発現を導き、いくつかのクローンにおいて検出された（図１）。 ｐＮＩＶ４８１７の作製 ｐＮＩＶ４８１７はｐＮＩＶ４８１１から得られる。それは、ピキア・パスト
リスＭＦαのプレペプチドとの融合体において成熟Ｄｅｒｐ１の発現を促進する
ようデザインされる。
いないプロＭＦα−成熟Ｄｅｒｐ１融合タンパク質を含む４３kDのタンパク質の
発現を導き、いくつかのクローンにおいて検出された（図１）。 ｐＮＩＶ４８１７の作製 ｐＮＩＶ４８１７はｐＮＩＶ４８１１から得られる。それは、ピキア・パスト
リスＭＦαのプレペプチドとの融合体において成熟Ｄｅｒｐ１の発現を促進する
ようデザインされる。
【００４１】 連結：−ｐＮＩＶ４８１１からのＢｓｔＥII−ＢａｍＨＩ −その配列が下記の通りであるＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩオリゴヌクレオチ
ド（ｎｏ．９７２６２及びｎｏ. ９７２６３） −ｐＮＩＶ４８１１からのＰｓｔＩ−ＢｓｔＥII オリゴヌクレオチドの配列：
ド（ｎｏ．９７２６２及びｎｏ. ９７２６３） −ｐＮＩＶ４８１１からのＰｓｔＩ−ＢｓｔＥII オリゴヌクレオチドの配列：
【００４２】
【化２】
【００４３】 結果 見掛け分子量３０kDa のＤｅｒｐ１タンパク質の成熟型をいくつかのクローン
は発現し、それは上清に分泌された（図２）。 ｐＮＩＶ４８１５の作製 ｐＮＩＶ４８１１から出発して、以下の構成物を、プロペプチドと成熟酵素と
の間の連結部において４つの残基〔Ｎ−Ａ−Ｅ−Ｔ（Ｔは成熟タンパク質の最初
の残基である）〕を削除するようデザインする。
は発現し、それは上清に分泌された（図２）。 ｐＮＩＶ４８１５の作製 ｐＮＩＶ４８１１から出発して、以下の構成物を、プロペプチドと成熟酵素と
の間の連結部において４つの残基〔Ｎ−Ａ−Ｅ−Ｔ（Ｔは成熟タンパク質の最初
の残基である）〕を削除するようデザインする。
【００４４】 連結：ｐＰＩＣ９ｋ（Ｐ．パストリスにおける発現のために用いるベクター）
からのＢｌｎＩ−ＢａｍＨＩフラグメント ｐＮＩＶ４８１１からのＢａｍＨＩ−ＥａｅＩフラグメント プライマーＮｏ．９７１４２及び９７１４３でのＲＴ−ＰＣＲにより形
成されたＥａｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント。残基：Ａ6 からＥ74 その配列が下記の通りであるＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩオリゴヌクレオチド
（Ｎｏ．９７１４０及び９７１４１）。残基：Ｎ９６ＡＥＴ９９を除きＦ７５か
らＣ１０２ ｐＮＩＶ４８１０からのＰｓｔＩ−ＸｂａＩフラグメント ＮＡＥＴ削除を許容するオリゴヌクレオチドの配列：
からのＢｌｎＩ−ＢａｍＨＩフラグメント ｐＮＩＶ４８１１からのＢａｍＨＩ−ＥａｅＩフラグメント プライマーＮｏ．９７１４２及び９７１４３でのＲＴ−ＰＣＲにより形
成されたＥａｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント。残基：Ａ6 からＥ74 その配列が下記の通りであるＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩオリゴヌクレオチド
（Ｎｏ．９７１４０及び９７１４１）。残基：Ｎ９６ＡＥＴ９９を除きＦ７５か
らＣ１０２ ｐＮＩＶ４８１０からのＰｓｔＩ−ＸｂａＩフラグメント ＮＡＥＴ削除を許容するオリゴヌクレオチドの配列：
【００４５】
【化３】
【００４６】 ｐＮＩＶ４８１９の作製 ｐＮＩＶ４８１７から出発して、次の構成の、ピキア・パストリス中のＤｅｒ
ｐ１の成熟形態を作り出すようデザインした発現プラスミドを、（成熟タンパク
質中のＣｙｓ３４変異に相当する）活性部位のシステイン残基をアラニン残基に
より置換するよう作り出す。
ｐ１の成熟形態を作り出すようデザインした発現プラスミドを、（成熟タンパク
質中のＣｙｓ３４変異に相当する）活性部位のシステイン残基をアラニン残基に
より置換するよう作り出す。
【００４７】 連結：−ｐＮＩＶ４８１７からのＢｐｕ１１０２Ｉ−ＡｓｅＩフラグメント −その配列が下記の通りであるオリゴヌクレオチドｎｏ．９７１２１及
びｎｏ．９７１２２のハイブリダイゼーションから生じたＡｓｅＩ−ＴｆｉＩ合
成フラグメント：プロＤｅｒＰ１の残基Ｉ104 〜Ｅ142 に対応（成熟ＤｅｒＰ１
タンパク質のＩ6 −） −ｐＮＩＶ４８１０（ＡＴＣＣ８７３０７）からのＴｆｉＩ−ＢｓｔＥ II フラグメント −ｐＮＩＶ４８１７からのＢｓｔＥII−Ｂｐｕ１１０２Ｉフラグメント オリゴヌクレオチドの配列：
びｎｏ．９７１２２のハイブリダイゼーションから生じたＡｓｅＩ−ＴｆｉＩ合
成フラグメント：プロＤｅｒＰ１の残基Ｉ104 〜Ｅ142 に対応（成熟ＤｅｒＰ１
タンパク質のＩ6 −） −ｐＮＩＶ４８１０（ＡＴＣＣ８７３０７）からのＴｆｉＩ−ＢｓｔＥ II フラグメント −ｐＮＩＶ４８１７からのＢｓｔＥII−Ｂｐｕ１１０２Ｉフラグメント オリゴヌクレオチドの配列：
【００４８】
【化４】
【００４９】 ｐＮＩＶ４８１５の作製 ｐＮＩＶ４８１１から出発して、以下の構成物を、プロペプチドと成熟酵素と
の間の連結部において４つの残基〔Ｎ−Ａ−Ｅ−Ｔ（Ｔは成熟タンパク質の最初
の残基である）〕を削除するように作る。 連結：ｐＰＩＣ９ｋ（ＰＰＩＣｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける発現のため
に用いるベクター) からのＢｌｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメント ｐＮＩＶ４８１１からのＢａｍＨＩ−ＥａｅＩフラグメント プライマーＮｏ．９７１４２及び９７１４３でのＲＴ−ＰＣＲにより形
成されたＥａｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント。残基：Ａ6 からＥ74 その配列が下記の通りであるＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩオリゴヌクレオチド
（Ｎｏ．９７１４０及び９７１４１）。残基：Ｎ９６ＡＥＴ９９を除きＦ７５か
らＣ１０２ ｐＮＩＶ４８１０からのＰｓｔＩ−ＸｂａＩフラグメント オリゴヌクレオチドの配列：ＮＡＥＴ削除を許容：
の間の連結部において４つの残基〔Ｎ−Ａ−Ｅ−Ｔ（Ｔは成熟タンパク質の最初
の残基である）〕を削除するように作る。 連結：ｐＰＩＣ９ｋ（ＰＰＩＣｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける発現のため
に用いるベクター) からのＢｌｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメント ｐＮＩＶ４８１１からのＢａｍＨＩ−ＥａｅＩフラグメント プライマーＮｏ．９７１４２及び９７１４３でのＲＴ−ＰＣＲにより形
成されたＥａｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント。残基：Ａ6 からＥ74 その配列が下記の通りであるＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩオリゴヌクレオチド
（Ｎｏ．９７１４０及び９７１４１）。残基：Ｎ９６ＡＥＴ９９を除きＦ７５か
らＣ１０２ ｐＮＩＶ４８１０からのＰｓｔＩ−ＸｂａＩフラグメント オリゴヌクレオチドの配列：ＮＡＥＴ削除を許容：
【００５０】
【化５】
【００５１】 実施例２−哺乳動物細胞における発現 ｐＮＩＶ４８１２の作製 ＣＨＯ−Ｋ１においてＤｅｒｐ１の成熟型を作り出すようデザインしたｐＥＥ
１４（CellTech, Cockett ら、 1990, Biotechnology, vol 8, 662〜667)に基づ
く発現プラスミドであるｐＮＩＶ４８１２は、プレＤｅｒｐ１、次に成熟Ｄｅｒ
ｐ１配列（プロタンパク質でない）をコードする。
１４（CellTech, Cockett ら、 1990, Biotechnology, vol 8, 662〜667)に基づ
く発現プラスミドであるｐＮＩＶ４８１２は、プレＤｅｒｐ１、次に成熟Ｄｅｒ
ｐ１配列（プロタンパク質でない）をコードする。
【００５２】 連結：−ｐＥＥ１４からのＨｉｎｄIII −ＸｂａＩ −その配列は下記の通りであるＨｉｎｄIII −ＰｓｔＩオリゴヌクレオ
チドｎｏ．９７０４０及び９７０４１ −ｐＮＩＶ４８１０（プラスミドＡＴＣＣ８７３０７）からのＰｓｔＩ −ＸｂａＩ オリゴヌクレオチドの配列：
チドｎｏ．９７０４０及び９７０４１ −ｐＮＩＶ４８１０（プラスミドＡＴＣＣ８７３０７）からのＰｓｔＩ −ＸｂａＩ オリゴヌクレオチドの配列：
【００５３】
【化６】
【００５４】 結果 ３０kDa の見掛け分子量のタンパク質の発現がいくつかの抽出物中で検出され
た（図３）。培養上清中にはタンパク質は検出されなかった。このことは、その
タンパク質はＣＨＯ−Ｋ１細胞から分泌されなかったことを示す。 ｐＮＩＶ４８１４の作製 ｐＮＩＶ４８１２から出発して、以下の構成物を、活性部位からのシステイン
残基をアラニン残基に置換するよう作った。
た（図３）。培養上清中にはタンパク質は検出されなかった。このことは、その
タンパク質はＣＨＯ−Ｋ１細胞から分泌されなかったことを示す。 ｐＮＩＶ４８１４の作製 ｐＮＩＶ４８１２から出発して、以下の構成物を、活性部位からのシステイン
残基をアラニン残基に置換するよう作った。
【００５５】 連結：−ｐＮＩＶ４８１２からのＡｓｅＩフラグメント −ｐＮＩＶ４８１９構成物中のＡｓｅＩ−ＴｆｉＩオリゴヌクレオチド
（Ｎｏ．９７１２１及び９７１２２） −ｐＮＩＶ４８１０（ＡＴＣＣ８７３０７）からのＴｆｉＩ−ＢｓｔＥ II フラグメント −ｐＮＩＶ４８１２からのＢｓｔＥII−ＡｆｌIIフラグメント ｐＮＩＶ４８１９及びｐＮＩＶ４８１４の作製は、ｐＮＩＶ４８１０において
その成熟タンパク質のイソロイシン６をコードするコドンがＡＴＣでなくＡＴＴ
であったという公開された発見のおかげで可能になった。この配列は、ＡｓｅＩ 制限部位の存在の原因である。
（Ｎｏ．９７１２１及び９７１２２） −ｐＮＩＶ４８１０（ＡＴＣＣ８７３０７）からのＴｆｉＩ−ＢｓｔＥ II フラグメント −ｐＮＩＶ４８１２からのＢｓｔＥII−ＡｆｌIIフラグメント ｐＮＩＶ４８１９及びｐＮＩＶ４８１４の作製は、ｐＮＩＶ４８１０において
その成熟タンパク質のイソロイシン６をコードするコドンがＡＴＣでなくＡＴＴ
であったという公開された発見のおかげで可能になった。この配列は、ＡｓｅＩ 制限部位の存在の原因である。
【００５６】 ｐＮＩＶ４８１６の作製 ＣＨＯ−Ｋ１内で発現するようデザインしたｐＮＩＶ４８１２から出発して、
ｐＮＩＶ４８１６はｐＮＩＶ４８１５についてと同じ削除を有する。この構成物
は、プロ及び成熟タンパク質の間の連結部からのＮＡＥＴ残基の削除を有する組
換えプロＤｅｒＰ１を生産する。
ｐＮＩＶ４８１６はｐＮＩＶ４８１５についてと同じ削除を有する。この構成物
は、プロ及び成熟タンパク質の間の連結部からのＮＡＥＴ残基の削除を有する組
換えプロＤｅｒＰ１を生産する。
【００５７】 連結：ｐＥＥ１４からのＸｂａＩ−ＡｆｌIIフラグメント ｐＮＩＶ４８１２からのＡｆｌII−ＥａｅＩフラグメント プライマーＮｏ．９７１４２及び９７１４３を用いるＲＴ−ＰＣＲによ
り形成されたＥａｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩオリゴヌクレオチドＮｏ．９７１４０及び９７１
４１（ｐＮＩＶ４８１５に用いたのと同じオリゴヌクレオチド） ｐＮＩＶ４８１０からのＰｓｔＩ−ＸｂａＩフラグメント 実施例３−ドロソフィラ細胞における発現 ｐＮＩＶ４８２７の作製 ｐＮＩＶ４８２７を、バキュロウィルスに感染した昆虫細胞からの成熟Ｄｅｒ
ｐ１の発現及び分泌を促進するようにデザインした。
り形成されたＥａｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩオリゴヌクレオチドＮｏ．９７１４０及び９７１
４１（ｐＮＩＶ４８１５に用いたのと同じオリゴヌクレオチド） ｐＮＩＶ４８１０からのＰｓｔＩ−ＸｂａＩフラグメント 実施例３−ドロソフィラ細胞における発現 ｐＮＩＶ４８２７の作製 ｐＮＩＶ４８２７を、バキュロウィルスに感染した昆虫細胞からの成熟Ｄｅｒ
ｐ１の発現及び分泌を促進するようにデザインした。
【００５８】 連結：ＰｓｔＩで直鎖化したｐＡｃＧＰ６７Ａベクター ｐＮＩＶ４８１０（ＡＴＣＣ８７３０７）からのＰｓｔＩフラグメント ｐＮＩＶ４８２７からのＤｅｒｐ１の発現をウエスタン・ブロットにより証明
した。 ｐＮＩＶ４８２８の作製 ｐＮＩＶ４８２８を、バキュロウィルスに感染した昆虫細胞からのＰｒｏＤｅ
ｒｐ１の発現及び分泌を促進するようデザインした。
した。 ｐＮＩＶ４８２８の作製 ｐＮＩＶ４８２８を、バキュロウィルスに感染した昆虫細胞からのＰｒｏＤｅ
ｒｐ１の発現及び分泌を促進するようデザインした。
【００５９】 連結：ｂＡｃＧＰ６７Ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｒ ｒｅｆ．２１２２０Ｐ）か
らのＳａｐＩ−ＢａｍＨＩ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ １７２bp合成フラグメント ｐＮＩＶ４８２０からのＥｃｏＲＩ−ＢｓｓＳＩ ｐＮＩＶ４８２７からのＢｓｓＳＩ−ＳａｐＩ 合成フラグメントの配列：
らのＳａｐＩ−ＢａｍＨＩ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ １７２bp合成フラグメント ｐＮＩＶ４８２０からのＥｃｏＲＩ−ＢｓｓＳＩ ｐＮＩＶ４８２７からのＢｓｓＳＩ−ＳａｐＩ 合成フラグメントの配列：
【００６０】
【化７】
【００６１】 ｐＮＩＶ４８２８からのＰｒｏＤｅｒｐ１の発現を、ウエスタン・ブロットに
より証明した。 ｐＮＩＶ４８３２の作製 このプラスミドはＤｅｒｐ１プロペプチド及びその後に成熟Ｄｅｒｐ１（Ｐｒ
ｏＤｅｒｐ１）配列をコードし、ドロソフィラ細胞において発現されるようデザ
インする。
より証明した。 ｐＮＩＶ４８３２の作製 このプラスミドはＤｅｒｐ１プロペプチド及びその後に成熟Ｄｅｒｐ１（Ｐｒ
ｏＤｅｒｐ１）配列をコードし、ドロソフィラ細胞において発現されるようデザ
インする。
【００６２】 連結：−発現ベクターｐＤＳ４７１Ｖ５−Ｈｉｓ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ Ｖ
４１１５〜２０）からのＡｓｐ７１８−ＢａｍＨＩフラグメント −９８０２３及び９８０２４オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーシ
ョンから生じたＡｓｐ７１８−ＳｐｅＩ合成フラグメント −ｐＮＩＶ４８２８からのＳｐｅＩ−ＢｇｌIIフラグメント オリゴヌクレオチドの配列
４１１５〜２０）からのＡｓｐ７１８−ＢａｍＨＩフラグメント −９８０２３及び９８０２４オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーシ
ョンから生じたＡｓｐ７１８−ＳｐｅＩ合成フラグメント −ｐＮＩＶ４８２８からのＳｐｅＩ−ＢｇｌIIフラグメント オリゴヌクレオチドの配列
【００６３】
【化８】
【００６４】 ＮＢ：ｐＮＩＶ４８２８はｇｐ６７シグナルペプチドに融合したプロＤｅｒｐ
１を発現する組換えバキュロウィルスの単離のためにデザインしたプラスミド。 結果 ドロソフィラ細胞におけるプロＤｅｒＰ１の一時的発現が検出された（データ
は示さない）。
１を発現する組換えバキュロウィルスの単離のためにデザインしたプラスミド。 結果 ドロソフィラ細胞におけるプロＤｅｒＰ１の一時的発現が検出された（データ
は示さない）。
【００６５】 ｐＮＩＶ４８４０の作製 ｐＮＩＶ４８４０は、用いる発現ベクターが安定であり誘導性である点でｐＮ
ＩＶ４８３２と異なる（ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ）。 連結：−ｐＮＩＶ４８３２からのＡｓｐ７１８−ＮｏｔＩ −ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ Ｖ４１２０−２０）
からのＮｏｔＩ−Ａｓｐ７１８ ドロソフィラ細胞におけるプロＤｅｒｐ１の発現を示した（図４）。
ＩＶ４８３２と異なる（ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ）。 連結：−ｐＮＩＶ４８３２からのＡｓｐ７１８−ＮｏｔＩ −ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ Ｖ４１２０−２０）
からのＮｏｔＩ−Ａｓｐ７１８ ドロソフィラ細胞におけるプロＤｅｒｐ１の発現を示した（図４）。
【００６６】 ｐＮＩＶ４８４２の作製 ｐＮＩＶ４８４２を、組換えドロソフィラ細胞からのＰｒｏＤｅｒｐ１の発現
及び分泌を促進するようデザインした。ＰｒｏＤｅｒｐ１コーディング配列をそ
のプロペプチドの開裂を害するように工作した。この目的を達成するために、そ
の開裂を含むＮＡＥＴをコードする４つのヌクレオチドトリプレットを削除した
。
及び分泌を促進するようデザインした。ＰｒｏＤｅｒｐ１コーディング配列をそ
のプロペプチドの開裂を害するように工作した。この目的を達成するために、そ
の開裂を含むＮＡＥＴをコードする４つのヌクレオチドトリプレットを削除した
。
【００６７】 連結：−ｐＮＩＶ４８４０からのＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ −オリゴヌクレオチドｎｏ．９８１３６及びｎｏ．９８１３７のハイブ
リダイゼーションから生じたＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ合成フラグメント −ｐＮＩＶ４８４０からのＰｓｔＩ−ＢｓｔＥII −ｐＮＩＶ４８４０からのＢｓｔII−ＮｏｔＩ 合成オリゴヌクレオチドの配列
リダイゼーションから生じたＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ合成フラグメント −ｐＮＩＶ４８４０からのＰｓｔＩ−ＢｓｔＥII −ｐＮＩＶ４８４０からのＢｓｔII−ＮｏｔＩ 合成オリゴヌクレオチドの配列
【００６８】
【化９】
【００６９】 結果 そのプロペプチドとの融合体におけるＤｅｒｐ１の検出を誘導後に上清中で行
った（図５）。この組換え変異ＤｅｒＰ１の配列は配列番号：４に供される。 ｐＮＩＶ４８４３の作製 ｐＮＩＶ４８４３を、活性部位のシステイン残基がアラニンに変異されている
ＰｒｏＤｅｒｐ１形態の組換えドロソフィラ細胞からの発現及び分泌を促進する
ようにデザインした。
った（図５）。この組換え変異ＤｅｒＰ１の配列は配列番号：４に供される。 ｐＮＩＶ４８４３の作製 ｐＮＩＶ４８４３を、活性部位のシステイン残基がアラニンに変異されている
ＰｒｏＤｅｒｐ１形態の組換えドロソフィラ細胞からの発現及び分泌を促進する
ようにデザインした。
【００７０】 連結：−ｐＭＴ／Ｖ５−ＨｉｓからのＮｏｔＩ−Ａｓｐ７１８ −ｐＮＩＶ４８３２からのＡｓｐ７１８−ＰｓｔＩ −ｐＮＩＶ４８１９からのＰｓｔＩ−ＴｆｉＩ −ｐＮＩＶ４８３２からのＴｆｉＩ−ＮｏｔＩ 結果 そのプロペプチドとの融合体におけるＤｅｒｐ１の検出を、誘導後に上清にお
いて検出した（図６）。この組換え変異ＤｅｒＰ１の配列を配列番号：５に示す
。
いて検出した（図６）。この組換え変異ＤｅｒＰ１の配列を配列番号：５に示す
。
【００７１】 実施例３：組換えドロソフィラ細胞から分泌される組換えＰｒｏＤｅｒｐ１の 精製手順 消費した培養培地（１リッター）からのタンパク質を、一晩の硫酸アンモニウ
ム沈降により４℃で６０％飽和まで濃縮した。１７０００ｇで３０分の遠心の後
、その沈殿を２０mLの２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．０中に再度懸濁し、同
緩衝液５リッターに対して透析した。２００００ｇでの３０分の遠心により不溶
性タンパク質を捨てた。その透析物を、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．０で
平衡化したＱ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬカラム（３×１．６cm、Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）に流した。そのカラムを同緩衝液で洗った後、結合したタンパク質をＮ
ａＣｌ濃度の１００mM増加のステップにより溶出した。ＰｒｏＤｅｒｐ１は主に
２００mM ＮａＣｌで溶出された。ＰｒｏＤｅｒｐ１が豊富な画分をプールし、
５mMリン酸カリウム緩衝液pH７．０でならしたヒドロキシアパタイトタイプ１カ
ラム（１×１．６cm、Ｂｉｏｒａｄ）に流した。ＰｒｏＤｅｒｐ１を含む未結合
材料をＯｍｅｇａ膜（カットオフ：１０kD，Ｆｉｌｔｏｎ）を用いて限外ろ過に
より濃縮した。その濃縮物をＰＢＳ pH７．３中でｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ＦＰ
ＬＣカラム（３０×１cm、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に流した。そのゲルろ過カラム
から溶出されたＰｒｏＤｅｒｐ１は８０％超の純度であった。
ム沈降により４℃で６０％飽和まで濃縮した。１７０００ｇで３０分の遠心の後
、その沈殿を２０mLの２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．０中に再度懸濁し、同
緩衝液５リッターに対して透析した。２００００ｇでの３０分の遠心により不溶
性タンパク質を捨てた。その透析物を、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．０で
平衡化したＱ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬカラム（３×１．６cm、Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）に流した。そのカラムを同緩衝液で洗った後、結合したタンパク質をＮ
ａＣｌ濃度の１００mM増加のステップにより溶出した。ＰｒｏＤｅｒｐ１は主に
２００mM ＮａＣｌで溶出された。ＰｒｏＤｅｒｐ１が豊富な画分をプールし、
５mMリン酸カリウム緩衝液pH７．０でならしたヒドロキシアパタイトタイプ１カ
ラム（１×１．６cm、Ｂｉｏｒａｄ）に流した。ＰｒｏＤｅｒｐ１を含む未結合
材料をＯｍｅｇａ膜（カットオフ：１０kD，Ｆｉｌｔｏｎ）を用いて限外ろ過に
より濃縮した。その濃縮物をＰＢＳ pH７．３中でｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ＦＰ
ＬＣカラム（３０×１cm、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に流した。そのゲルろ過カラム
から溶出されたＰｒｏＤｅｒｐ１は８０％超の純度であった。
【００７２】 実施例４．ワクチン製剤 変異ＤｅｒＰ１又はアレルゲンを含むワクチンは、多くの一般のアジュバント
と一緒に調剤することができる。１つの好ましいアジュバントシステムは、以下
に記載の水中油エマルションである： 本発明に用いる水中油エマルションアジュバント製剤は、次の水中油エマルシ
ョン成分：５％スクアレン、５％α−トコフェロール、２．０％ポリオキシエチ
レンソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ８０）を含むよう作製する。そのエ
マルションは、２倍濃縮物として調製する。免疫学的実験に用いた全ての例は、
更なる成分及び希釈剤を加えて１×濃度（２４０：１のスクアレン：ＱＳ２１に
等しい）又はその更なる希釈物を供した。
と一緒に調剤することができる。１つの好ましいアジュバントシステムは、以下
に記載の水中油エマルションである： 本発明に用いる水中油エマルションアジュバント製剤は、次の水中油エマルシ
ョン成分：５％スクアレン、５％α−トコフェロール、２．０％ポリオキシエチ
レンソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ８０）を含むよう作製する。そのエ
マルションは、２倍濃縮物として調製する。免疫学的実験に用いた全ての例は、
更なる成分及び希釈剤を加えて１×濃度（２４０：１のスクアレン：ＱＳ２１に
等しい）又はその更なる希釈物を供した。
【００７３】 要約すると、ＴＷＥＥＮ８０をリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）に溶かしてＰＢ
Ｓ中２％溶液を供する。１００mLの２倍濃度エマルションを供するために、５mL
のＤＬα−トコフェロール及び５mLのスクアレンをボルテキシングして十分に混
合する。９５mLのＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ溶液をその油に加えて十分に混合する。次
に、生じたエマルションをシリンジ針に通し、最後にＭ１１０Ｓ Ｍｉｃｒｏｆ
ｌｕｉｄｉｃｓ機を用いることによりマイクロフルード化する。生じた油滴は約
１４５〜１８０nmの大きさを有する（ＰＣＳにより測定してｚａｖ．として表す
）。他ののアジュバント／ワクチン成分（ＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ及び抗原）を
単一混合物中にエマルションに加える。
Ｓ中２％溶液を供する。１００mLの２倍濃度エマルションを供するために、５mL
のＤＬα−トコフェロール及び５mLのスクアレンをボルテキシングして十分に混
合する。９５mLのＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ溶液をその油に加えて十分に混合する。次
に、生じたエマルションをシリンジ針に通し、最後にＭ１１０Ｓ Ｍｉｃｒｏｆ
ｌｕｉｄｉｃｓ機を用いることによりマイクロフルード化する。生じた油滴は約
１４５〜１８０nmの大きさを有する（ＰＣＳにより測定してｚａｖ．として表す
）。他ののアジュバント／ワクチン成分（ＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ及び抗原）を
単一混合物中にエマルションに加える。
【００７４】 本明細書に用いる抗原含有ワクチンは、十分な量のＳＢ６２アジュバントと調
剤して高スクアレン：ＱＳ２１比（２４０：１）を供するか、又は少い量のＳＢ
６２と調剤して低比率製剤（４８：１）を供する。他のワクチンは、任意に、そ
のエマルションの油相にコレステロールを加えて調剤することができる。 これらのワクチンは、Ｂａｌｂ／ｃマウスのグループにおいてアッセイする。
要約すると、１０のマウスのグループを、水中油エマルションアジュバントと組
み合わせた２μｇ変異アレルゲンで、３週間間隔で筋内に２回、免疫化する。２
回目の免疫化後１４日目に、サイトカイン（ＩＬ−４，ＩＬ−５及びＩＦＮ−γ
）の生産を、脾臓及びリンパ節のアレルゲンでの試験管内再刺激の後に分析する
。野生型アレルゲンに対する抗体応答及び誘導されたアイソタイププロフィール
をII後２１日目及びIV後１４日目にＥＬＩＳＡによりモニターする。
剤して高スクアレン：ＱＳ２１比（２４０：１）を供するか、又は少い量のＳＢ
６２と調剤して低比率製剤（４８：１）を供する。他のワクチンは、任意に、そ
のエマルションの油相にコレステロールを加えて調剤することができる。 これらのワクチンは、Ｂａｌｂ／ｃマウスのグループにおいてアッセイする。
要約すると、１０のマウスのグループを、水中油エマルションアジュバントと組
み合わせた２μｇ変異アレルゲンで、３週間間隔で筋内に２回、免疫化する。２
回目の免疫化後１４日目に、サイトカイン（ＩＬ−４，ＩＬ−５及びＩＦＮ−γ
）の生産を、脾臓及びリンパ節のアレルゲンでの試験管内再刺激の後に分析する
。野生型アレルゲンに対する抗体応答及び誘導されたアイソタイププロフィール
をII後２１日目及びIV後１４日目にＥＬＩＳＡによりモニターする。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１１年１１月１０日（１９９９．１１．１０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項２２】 アレルギー応答を治療し又は防止する方法であって、アレ
ルギーを患う又はそれにかかりやすい個体に、請求項１８に記載のワクチンを投
与することを含む方法。
ルギーを患う又はそれにかかりやすい個体に、請求項１８に記載のワクチンを投
与することを含む方法。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１２月１３日（２０００．１２．１３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００１】 本発明は、特定のアレルゲンに対するアレルギー応答の削減に有効である新規
治療剤に関する。更に、本発明は、新規ポリヌクレオチド、それらによりコード
されるポリペプチド並びに該ポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用、並びに
それらの生産に関する。特に、ポリペプチドを含む新規ワクチン、並びにアレル
ギーを患うヒトの治療及びアレルギーの危険性がある個体の予防における使用を
供し、好ましくは、前記ワクチンは、組換え変異デルマトファゴイデス・プテロ
ニシヌス（Dermatophagoides pteronyssinus) アレルゲンＤｅｒＰ１を含む。
治療剤に関する。更に、本発明は、新規ポリヌクレオチド、それらによりコード
されるポリペプチド並びに該ポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用、並びに
それらの生産に関する。特に、ポリペプチドを含む新規ワクチン、並びにアレル
ギーを患うヒトの治療及びアレルギーの危険性がある個体の予防における使用を
供し、好ましくは、前記ワクチンは、組換え変異デルマトファゴイデス・プテロ
ニシヌス（Dermatophagoides pteronyssinus) アレルゲンＤｅｒＰ１を含む。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】 本発明の一部を形成する減少したタンパク質分解活性を有する他の変異アレル
ゲンは他のグループＩシステインプロテアーゼ、例えばデルマトファゴイデス・
ファリナエ（Dermatophagoides farinae) からのＤｅｒｆ１（ＤｅｒＰ１と８０
％の相同性）、及びグループIII アレルゲン (セリンプロテアーゼ) 、例えばＤ
ｅｒｐIII （Stewart ら、1992, Immunology, 75, 29〜35) 及びＤｅｒｐIV (Ya
seuda ら、1993, Clin. Exp. Allergy, 23, 384-390); 及びグループIVアレルゲ
ン (アミラーゼ) に基づき得る。
ゲンは他のグループＩシステインプロテアーゼ、例えばデルマトファゴイデス・
ファリナエ（Dermatophagoides farinae) からのＤｅｒｆ１（ＤｅｒＰ１と８０
％の相同性）、及びグループIII アレルゲン (セリンプロテアーゼ) 、例えばＤ
ｅｒｐIII （Stewart ら、1992, Immunology, 75, 29〜35) 及びＤｅｒｐIV (Ya
seuda ら、1993, Clin. Exp. Allergy, 23, 384-390); 及びグループIVアレルゲ
ン (アミラーゼ) に基づき得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２６】 ＤＮＡポリマーの発現を許容する条件下での形質転換された宿主細胞の培養は
、慣用的には、例えばManiatisら及び上述の“DNA Cloning ”に記載されるよう
に行われる。これにより、好ましくは、細胞には栄養素が補給され、４５℃未満
の温度で培養される。 その産物は、宿主細胞に従って慣用的な方法により回収される。これにより、
宿主細胞が細菌、例えば大腸菌である場合、それは物理的、化学的又は酵素的に
溶解することができ、そのタンパク質産物は、生じたライゼートから単離するこ
とができる。宿主細胞が哺乳動物である場合、その産物は一般に、栄養培地から
又は無細胞抽出物から単離することができる。慣用的なタンパク質単離技術には
、沈降法、吸着クロマトグラフィー、及びモノクローナル抗体アフィニティーカ
ラムを含むアフィニティークロマトグラフィーがある。
、慣用的には、例えばManiatisら及び上述の“DNA Cloning ”に記載されるよう
に行われる。これにより、好ましくは、細胞には栄養素が補給され、４５℃未満
の温度で培養される。 その産物は、宿主細胞に従って慣用的な方法により回収される。これにより、
宿主細胞が細菌、例えば大腸菌である場合、それは物理的、化学的又は酵素的に
溶解することができ、そのタンパク質産物は、生じたライゼートから単離するこ
とができる。宿主細胞が哺乳動物である場合、その産物は一般に、栄養培地から
又は無細胞抽出物から単離することができる。慣用的なタンパク質単離技術には
、沈降法、吸着クロマトグラフィー、及びモノクローナル抗体アフィニティーカ
ラムを含むアフィニティークロマトグラフィーがある。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７４】 本明細書に用いる抗原含有ワクチンは、十分な量のＳＢ６２アジュバントと調
剤して高スクアレン：ＱＳ２１比（２４０：１）を供するか、又は少い量のＳＢ
６２と調剤して低比率製剤（４８：１）を供する。他のワクチンは、任意に、そ
のエマルションの油相にコレステロールを加えて調剤することができる。 これらのワクチンは、Ｂａｌｂ／ｃマウスのグループにおいてアッセイする。
要約すると、１０のマウスのグループを、水中油エマルションアジュバントと組
み合わせた２μｇ変異アレルゲンで、３週間間隔で筋内に２回、免疫化する。２
回目の免疫化後１４日目に、サイトカイン（ＩＬ−４，ＩＬ−５及びＩＦＮ−γ
）の生産を、脾臓及びリンパ節のアレルゲンでの試験管内再刺激の後に分析する
。野生型アレルゲンに対する抗体応答及び誘導されたアイソタイププロフィール
をII後２１日目及びIV後１４日目にＥＬＩＳＡによりモニターする。
剤して高スクアレン：ＱＳ２１比（２４０：１）を供するか、又は少い量のＳＢ
６２と調剤して低比率製剤（４８：１）を供する。他のワクチンは、任意に、そ
のエマルションの油相にコレステロールを加えて調剤することができる。 これらのワクチンは、Ｂａｌｂ／ｃマウスのグループにおいてアッセイする。
要約すると、１０のマウスのグループを、水中油エマルションアジュバントと組
み合わせた２μｇ変異アレルゲンで、３週間間隔で筋内に２回、免疫化する。２
回目の免疫化後１４日目に、サイトカイン（ＩＬ−４，ＩＬ−５及びＩＦＮ−γ
）の生産を、脾臓及びリンパ節のアレルゲンでの試験管内再刺激の後に分析する
。野生型アレルゲンに対する抗体応答及び誘導されたアイソタイププロフィール
をII後２１日目及びIV後１４日目にＥＬＩＳＡによりモニターする。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ボラン，アレー ベルギー国，ベ−1400 ニブル，リュ ド ュ ランデュストリー 24，ユニベルシテ リブル デュ ブリュッセル−セルビス デュ ジェネティク アプリケ (72)発明者 ジャコブ，パウル ベルギー国，ベ−1400 ニブル，リュ ド ュ ランデュストリー 24，ユニベルシテ リブル デュ ブリュッセル−セルビス デュ ジェネティク アプリケ (72)発明者 マセル，マルク ベルギー国，ベ−1400 ニブル，リュ ド ュ ランデュストリー 24，ユニベルシテ リブル デュ ブリュッセル−セルビス デュ ジェネティク アプリケ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 BA38 CA01 HA01 4C085 AA02 AA03 BB03 BB11 DD62 DD86 4H045 AA11 BA10 CA50 DA83 DA86 EA22 FA74
Claims (22)
- 【請求項１】 野生型アレルゲンと比べて減少した酵素活性を有する組換え
変異アレルゲン。 - 【請求項２】 前記アレルゲンがＩ型システインプロテアーゼアレルゲンに
基づくことを特徴とする請求項１に記載の組換え変異アレルゲン。 - 【請求項３】 前記アレルゲンがデルマトファゴイデス・プテロニシヌス（ Dermatophagoides pteronyssinus ) からのＤｅｒＰ１に基づくことを特徴とする
請求項１に記載の組換え変異アレルゲン。 - 【請求項４】 前記変異ＤｅｒＰ１が活性部位変異体を含むことを特徴とす
る請求項３に記載の組換え変異アレルゲン。 - 【請求項５】 前記活性部位変異ＤｅｒＰ１がＣｙｓ３４残基の変異を含む
ことを特徴とする請求項４に記載の組換え変異アレルゲン。 - 【請求項６】 前記Ｃｙｓ３４残基の変異がアラニン置換を含むことを特徴
とする請求項５に記載の組換え変異アレルゲン。 - 【請求項７】 前記活性部位変異ＤｅｒＰ１がＨｉｓ１７０残基の変異を含
むことを特徴とする請求項４に記載の組換え変異アレルゲン。 - 【請求項８】 前記変異ＤｅｒＰ１が、そのプロペプチドと成熟分子との間
の開裂の部位において変異を含むことを特徴とする請求項３に記載の組換え変異
アレルゲン。 - 【請求項９】 前記プロペプチドと成熟分子との間の開裂の部位における変
異が、残基ＮＡＥＴの欠失を含むことを特徴とする請求項８に記載の組換え変異
アレルゲン。 - 【請求項１０】 前記変異が、ジスルフィド架橋形成に関与するシステイン
残基の欠失又は置換を含むことを特徴とする請求項３に記載の組換え変異アレル
ゲン。 - 【請求項１１】 安定な組換えＤｅｒＰ１。
- 【請求項１２】 配列番号：１に記載の配列を有する組換え変異アレルゲン
。 - 【請求項１３】 配列番号：２に記載の配列を有する組換え変異アレルゲン
。 - 【請求項１４】 配列番号：３に記載の配列を有する組換え変異アレルゲン
。 - 【請求項１５】 配列番号：４に記載の配列を有する組換え変異アレルゲン
。 - 【請求項１６】 配列番号：５に記載の配列を有する組換え変異アレルゲン
。 - 【請求項１７】 請求項１〜１６のいずれか一に記載のアレルゲンの変異型
をコードする単離された核酸分子。 - 【請求項１８】 請求項１〜１７のいずれか一に記載の組換え変異アレルゲ
ン、及びアジュバントを含むワクチン。 - 【請求項１９】 前記アジュバントが、Ｔｈ１型免疫応答の選択的刺激物質
であることを特徴とする請求項１８に記載のワクチン。 - 【請求項２０】 前記アジュバントが、ＱＳ２１及び３−Ｏ−脱アシル化モ
ノホスホリル脂質Ａのうちの一方又は両方を含むことを特徴とする請求項１８に
記載のワクチン。 - 【請求項２１】 アレルギーの治療のための薬剤の製造における組換え変異
アレルゲンの使用。 - 【請求項２２】 アレルギー応答を治療し又は防止する方法であって、アレ
ルギーを患う又はそれにかかりやすい個体に、請求項１８に記載のワクチンを投
与することを含む方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9724531.0A GB9724531D0 (en) | 1997-11-19 | 1997-11-19 | Novel compounds |
| GB9724531.0 | 1997-11-19 | ||
| PCT/EP1998/007521 WO1999025823A2 (en) | 1997-11-19 | 1998-11-16 | Recombinant allergen with reduced enzymatic activity |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001523452A true JP2001523452A (ja) | 2001-11-27 |
Family
ID=10822365
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000521189A Pending JP2001523452A (ja) | 1997-11-19 | 1998-11-16 | 酵素活性が減少した組換えアレルゲン |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7348009B1 (ja) |
| EP (3) | EP1674576A1 (ja) |
| JP (1) | JP2001523452A (ja) |
| CA (1) | CA2309885A1 (ja) |
| DE (1) | DE69833460T2 (ja) |
| ES (1) | ES2257825T3 (ja) |
| GB (1) | GB9724531D0 (ja) |
| WO (1) | WO1999025823A2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007525150A (ja) * | 2003-02-26 | 2007-09-06 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ヤケヒョウヒダニ由来の低アレルゲン性ＤｅｒＰ１およびＤｅｒＰ３タンパク質 |
| WO2009048133A1 (ja) * | 2007-10-12 | 2009-04-16 | National Institute Of Agrobiological Sciences | ダニ抗原米 |
Families Citing this family (9)
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|---|---|---|---|---|
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| GB0014288D0 (en) | 2000-06-10 | 2000-08-02 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| GB0120150D0 (en) * | 2001-08-17 | 2001-10-10 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel compounds |
| EP1620461A2 (en) * | 2003-04-25 | 2006-02-01 | Novozymes A/S | Group 1 mite polypeptide variants |
| WO2005103082A2 (en) * | 2004-04-23 | 2005-11-03 | Novozymes A/S | Group 1 mite polypeptide variants |
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| CA2629923C (en) | 2005-11-24 | 2014-10-14 | Alk-Abello A/S | A method of measuring enzymatic activity of adsorbed allergenic enzyme |
| CN107118265A (zh) | 2008-03-25 | 2017-09-01 | 拜尔工业制药有限公司 | 用于治疗变态反应的低变应原性杂合蛋白 |
| EP2976107B1 (en) * | 2013-03-19 | 2019-02-20 | ASIT BioTech s.a. | Allergen preparation |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| IL61904A (en) | 1981-01-13 | 1985-07-31 | Yeda Res & Dev | Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same |
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| GB8913737D0 (en) | 1989-06-15 | 1989-08-02 | Univ Birmingham | A novel anti-allergy treatment |
| US5433948A (en) * | 1990-02-13 | 1995-07-18 | Thomas; Wayne R. | Cloning and sequencing of allergens of dermatophagoides (house dust mite) |
| SG49909A1 (en) | 1992-06-25 | 1998-06-15 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine composition containing adjuvants |
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Cited By (3)
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