CN111796105A - 一种非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫检测分析技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒及其应用，该试剂盒以ASFV P30重组蛋白为磁微粒偶联物，以化学发光标记物标记的羊抗猪IgG为检测抗体。具体由偶联有ASFV P30重组蛋白的磁微粒混悬液、试剂R、定标品、质控品、样品稀释液、洗涤液及发光液组成，所述试剂R为稀释后的化学发光标记物标记的羊抗猪IgG抗体工作液。本发明试剂盒以磁微粒化学发光法为检测技术，同时结合碱性磷酸酶标记技术，具有特异性高、灵敏性好、重复性优、稳定性强等特点，可广泛应用于基层ASFV检测。

Description

一种非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于免疫检测分析技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒及其应用。
背景技术
非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)，属于单股双链DNA病毒，其感染猪能引发猪的高热、皮肤发绀及淋巴结和内脏器官严重出血，急性型死亡率可达100％，且非洲猪瘟并不总是表现出完整的临床症状，在疫病的早期阶段或少数动物受到感染时，其症状容易与其它疫病的症状相混淆。该病于2018年8月在我国爆发后，不仅严重困扰我国动物疫病的防控，且严重危害了养猪业的发展，经济损失巨大。
ASFV直径约200nm，有囊膜衣壳，呈二十面体对称，复杂多层结构，有大约151个开放阅读框(ORF)，其编码的蛋白中有131个病毒蛋白的结构和功能已有报道，目前已有研究表明，病毒粒子的主要结构组份如p72、p30、p54、p12等分别参与病毒吸附、侵入宿主靶细胞、参与病毒复制、参与早期mRNA合成和加工等功能，这些蛋白也已经被广泛应用于各类血清学诊断方法中。
非洲猪瘟病毒基因型多，容易发生变异，感染猪机体后不能有效产生中和抗体，且非洲猪瘟免疫涉及到复杂的细胞免疫和先天非特异性免疫，从而阻碍了非洲猪瘟疫苗的研制。迄今为止，ASFV目前还没有商品化疫苗，只能通过发现疫情后进行扑杀消毒的措施来阻止病毒的传播。因此，建立快速有效的检测方法进行大规模的检测使得早发现、早诊断、早隔离具有重要的现实意义。
总结现有的诊断检测技术，胶体金技术与酶联免疫吸附技术是市面上应用较多的。胶体金检测技术操作简便，但灵敏度低，不符合高精确度检测要求；酶联免疫吸附技术主要是将抗体或抗原吸附于固相或液相载体上，以此来检测相应的抗原或抗体，吸附的过程会大大减少抗原或抗体的作用面积，从而降低灵敏度。
发明内容
为了克服上述检测技术灵敏度低以及吸附的过程中会减少抗原或抗体的作用面积的问题，本发明提供一种能扩大抗原抗体作用面积的优良载体。本发明利用磁微粒作为载体，以碱性磷酸酶为化学发光标记物，建立了一种非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒。该试剂盒具有良好的特异性、敏感性、重复性，操作简便、快速，更有利于基层推广应用的非洲猪瘟病毒血清抗体的检测技术。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明所提供的磁微粒化学发光法检测ASFV血清抗体的试剂盒，以ASFVP30重组蛋白为磁微粒偶联物，以化学发光标记物标记的羊抗猪IgG为检测抗体。具体的本发明试剂盒由偶联有ASFV P30重组蛋白的磁微粒混悬液、试剂R、定标品、质控品、样品稀释液、洗涤液及发光液组成，所述试剂R为稀释后的化学发光标记物标记的羊抗猪IgG抗体工作液。
作为本发明的优选方案，所述的ASFV P30重组蛋白磁微粒混悬液的制备包括以下步骤：将磁珠用EDC、NHS活化，按照10μg重组蛋白/mg磁珠的比例将两者混合，于37℃包被3h；磁吸附去除上清，以10％乙醇胺盐酸盐水溶液封闭3h，用清洗液清洗磁珠3次，用含有2％BSA的保存液稀释至0.5mg磁珠/mL。
具体的，将磁珠用pH5.0的0.1M MES水溶液稀释至10mg/mL，并用等体积0.1M MES清洗2次。将EDC、NHS复温后称重，用0.1M MES溶解为10mg/mL，并立即按照1mg磁珠10μLEDC、10μL NHS的比例进行混匀，37℃反应30min。磁吸附后去除上清液，加入等体积的0.1MMES，按照确定的最佳用量加入p30重组蛋白后混匀，37℃反应3h。磁吸附后去除上清液，加入等体积的封闭液混匀，37℃反应3h。用清洗液清洗磁珠3次，用磁珠保存液将磁珠稀释至0.5mg/mL。混匀后分装，封口，存放于4℃。
作为本发明的优选方案，含有2％BSA的保存液由2％BSA，1％海藻糖，0.1％EDTA，0.9％NaCl，0.05％Tris-HCl，0.5％酪蛋白，0.05M PMSF组成。
作为本发明的优选方案，所述的化学发光标记物是碱性磷酸酶。
作为本发明的优选方案，所述的试剂R的制备包括以下步骤，将抗体稀释液、碱性磷酸酶标记的羊抗猪IgG抗体灌入盒中，塑封，放入磁珠杯，二次封口。
作为本发明的优选方案，所述抗体稀释液由1％BSA、0.9％NaCl、0.5％Tween-20、pH7.0的0.05M MOPS、1mM ZnCl2、1mM MgCl2组成。
作为本发明的优选方案，所述的定标品由定标品C1和定标品C2组成；定标品C1为ASFV抗体阴性血清，定标品C2是用保存液将ASFV抗体强阳性灭活血清稀释至工作浓度后制得。
作为本发明的优选方案，所述的质控品是用ASFV抗体阴性血清将ASFV抗体强阳性灭活血清稀释后制得。
作为本发明的优选方案，所述的样品稀释液由1％BSA，0.9％NaCl，0.5％Tween-20，pH7.0的0.05M MOPS组成。
上一种非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒应用，包括以下步骤：在反应杯中加入待测样品，再加入ASFV P30重组蛋白磁微粒混悬液，混匀，37℃反应10min，加入洗涤液洗掉上清，加入适量碱性磷酸酶标记的羊抗猪IgG抗体工作液，37℃反应10min，加入洗涤液洗掉上清，加入发光液，测定相应的发光值。
本发明具有以下有益效果：
本发明采用磁微粒化学发光技术结合碱性磷酸酶标记技术，可快速、准确、大量的进行ASFV抗体检测，为ASFV的快速诊断提供了新的技术支持。
本申请保存液(2％BSA，1％海藻糖，0.1％EDTA，0.9％NaCl，0.05％Tris-HCl，0.5％酪蛋白，0.05M PMSF)具有很好的保存效果，可以使抗原磁珠长期的保存而不影响其反应性，赋予了检测试剂盒较高的稳定性。
本申请采用ASFV P30重组蛋白制备重组蛋白磁珠，P30蛋白在ASFV感染早期产生，产生时间早，免疫原性好，且P30蛋白在ASFV的整个感染周期都持续存在于细胞质中。
附图说明
图1为ASFV血清样本发光值ROC曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。
实施例1非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒的组建
1、实验方法
1.1ASFV p30重组蛋白的制备
1.1.1P30重组蛋白生产用菌种的繁殖
取冷冻保存的原始菌种E.coli-ASFV-p30接种于含有卡那霉素(100μg/mL)LB液体培养基中，置37℃培养至OD600nmnm值为0.65，取样后加入占总体积20％的无菌甘油分装保存。
1.1.2p30重组蛋白原核表达
菌液的制备：用基因工程菌E.coli-ASFV-p30基础种子1支，取接种环钓取适量在LB琼脂平板(含100μg/mL卡那霉素)上划线，37℃培养12h，作为一级种子。将一级种子(单菌落)接种于3mL的LB培养基(含100μg/mL卡那霉素)中，37℃培养10h，作为生产用种子。取生产用菌种，按培养基总体积的1％的量接种到LB培养基(含100μg/mL卡那霉素)中，37℃，220r/min振荡培养3h左右，至OD600nm为0.5，于16℃降温1.5h，加终浓度为0.5mmol/LIPTG，16℃，220r/min诱导16h后收集菌体。
1.1.3p30重组蛋白的提取与纯化
将菌液4℃4000r/min离心5min，用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)离心洗涤两次后，收集菌体用1/10培养液体积的PBS(0.01mol/L，pH值7.2)重悬，冰上超声20min裂解菌体(超声5s，间隔10s)，4℃12000r/min离心15min，收集上清。取上清进行纯化，用BCA法测蛋白浓度，应不低于1.0mg/mL。对重组蛋白蛋白进行SDS-PAGE电泳，染色与脱色，Image J灰度分析，重组蛋白蛋白纯度应不低于90％，分装，-20℃以下保存备用。
1.2ASFV P30重组蛋白磁微粒混悬液的制备
1.2.1ASFV P30重组蛋白最佳包被浓度的确定
将磁珠用EDC、NHS活化，按照5、10、20μg重组蛋白/mg磁珠的比例将ASFV p30重组蛋白与磁珠混合，37℃包被3h；磁吸附去除上清，加入封闭液，37℃封闭3h；用清洗液清洗磁珠3次，用含有2％BSA的保存液稀释至0.5mg磁珠/mL。
分别检测ASFV阴、阳性血清。每孔加入重组蛋白磁珠25μL、碱性磷酸酶标记的羊抗猪IgG抗体100μL，再加入阴/阳性血清10μL，37℃反应10min；清洗3次，加发光液，检测发光值，根据发光值、检测范围确定最佳包被浓度。
1.2.2ASFV p30重组蛋白包被温度的确定
将磁珠用EDC、NHS活化，按照10μg重组蛋白/mg磁珠的比例将两者混合，分别于室温、37℃包被3h；磁吸附去除上清，加入封闭液，分别于室温、37℃封闭3h；用清洗液清洗磁珠3次，用含有2％BSA的保存液稀释至0.5mg磁珠/mL。
按照1.2.1的试验方法评估，根据发光值确定最佳包被温度。
1.2.3ASFV p30重组蛋白包被时间的确定
将磁珠用EDC、NHS活化，按照10μg重组蛋白/mg磁珠的比例将两者混合，分别于37℃下包被1、2、3h；磁吸附去除上清，加入封闭液，分别于37℃封闭3h；用清洗液清洗磁珠3次，用含有2％BSA的保存液稀释至0.5mg磁珠/mL。
按照1.2.1的试验方法评估，根据发光值确定最佳包被时间。
1.2.4ASFV p30重组蛋白封闭液的选择
选择以下二种封闭液：①10％BSA水溶液；②10％乙醇胺盐酸盐水溶液。包被重组蛋白磁珠并以这二种封闭液封闭磁珠。
按照1.2.1的试验方法评估，根据发光值确定封闭液。
1.2.5ASFV p30重组蛋白封闭时间的确定
将磁珠用EDC、NHS活化，按照10μg重组蛋白/mg磁珠的比例将两者混合，分别于37℃包被3h；磁吸附去除上清，加入封闭液，分别于37℃封闭1、2、3h；用清洗液清洗磁珠3次，用含有2％BSA的保存液稀释至0.5mg磁珠/mL。
按照1.2.1的试验方法评估，根据发光值确定封闭时间。
1.2.6磁珠保存液的选择
以10μg重组蛋白/mg磁珠的比例包被磁珠，分别用以下保存液保存磁珠：①1％BSA，PBST；②2％BSA，1％海藻糖，0.1％EDTA，0.9％NaCl，0.05％Tris-HCl，0.5％酪蛋白，0.05M PMSF；③1％BSA，0.9％NaCl，0.5％Tween-20，1％海藻糖，0.05M MOPS(pH7.0)。将磁珠分装，分别在4℃和37℃放置3天、7天，取出，搭配碱性磷酸酶标记的羊抗猪IgG抗体检测标准血清，计算37℃与4℃存放磁珠的发光值比值。选择比值较大的保存液。
1.3碱性磷酸酶标记羊抗猪IgG抗体工作液的制备
1.3.1碱性磷酸酶标记羊抗猪IgG抗体最佳稀释度的确定
以10μg重组蛋白磁珠/mg磁珠的比例包被磁珠。将碱性磷酸酶标记的羊抗猪IgG抗体用酶稀释液分别稀释至1:5000、1:10000、1:20000，搭配重组蛋白磁珠磁珠，检测稀释的灭活阳性血清和阴性血清，根据阳性与阴性的发光值比值，确定最佳的稀释度。
1.3.2碱性磷酸酶标记羊抗猪IgG抗体稀释液的确定
将碱性磷酸酶标记的羊抗猪IgG抗体分别用以下稀释液稀释至工作浓度：①1％BSA，PBST；②1％BSA，0.9％NaCl，0.5％Tween-20，0.05M MOPS(pH7.0)；③1％BSA，0.9％NaCl，0.5％Tween-20，0.05M MOPS(pH7.0)，1mM ZnCl2，1mM MgCl2。各分为2份，分别于4℃和37℃放置3天、7天，取出，搭配重组蛋白磁珠检测稀释的灭活阳性血清和阴性血清，计算37℃与4℃的发光值比值。选择比值较大的抗体稀释液。
1.4样品稀释液的确定
将ASFV抗体强阳性灭活血清分别用以下稀释液梯度稀释：①1％BSA，PBST；②1％BSA，0.9％NaCl，0.5％Tween-20，0.05M MOPS(pH7.0)；③1％BSA，0.9％NaCl，0.5％Tween-20，1％海藻糖，0.05M MOPS(pH7.0)。各分为2份，分别于4℃和37℃放置3天、7天，取出检测，计算37℃与4℃的发光值比值。选择比值较大的稀释液。
1.5定标品的制备
选择一份ASFV抗体阴性血清作为定标品C1；用稀释液将ASFV抗体强阳性灭活血清按照确定的比例稀释至工作浓度，作为定标品C2。各分装为1.0mL/支。
1.6质控品的制备
用ASFV抗体阴性血清将ASFV抗体强阳性灭活血清按照确定的比例稀释。分装为1.0mL。
1.7试剂R的灌装
将抗体稀释液、碱性磷酸酶标记的羊抗猪IgG抗体按照最佳用量灌入盒中，塑封，放入磁珠杯，用硅胶膜二次封口。
2、结果
2.1ASFV p30重组蛋白最佳包被浓度
取包被好的3个浓度的ASFV p30重组蛋白磁珠，检测稀释的阳性血清P1、阴性血清N1～N4，计算各血清发光值(S)与阴性血清发光值均值(N)的比值(S/N)，发现10μg p30重组蛋白/mg磁珠为p30重组蛋白的最佳包被浓度。结果见表1。
表1 ASFV p30重组蛋白最佳包被浓度的确定
Figure BDA0002609788770000061
Figure BDA0002609788770000071
2.2ASFV p30重组蛋白包被温度的确定
取不同温度下包被的p30重组蛋白磁珠，检测稀释的阳性血清P1、阴性血清N1～N4，计算各血清发光值(S)与阴性血清发光值均值(N)的比值(S/N)，显示37℃为最佳包被温度，结果见表2。
表2 ASFV p30重组蛋白包被温度的确定
Figure BDA0002609788770000072
2.3ASFV p30蛋白最佳包被时间的确定
取不同包被时间的p30重组蛋白磁珠，检测稀释的阳性血清P1、阴性血清N1～N4，计算各血清发光值(S)与阴性血清发光值均值(N)的比值(S/N)，显示3h为p30重组蛋白的最佳包被时间，结果见表3。
表3 ASFV p30重组蛋白包被时间的确定
Figure BDA0002609788770000073
Figure BDA0002609788770000081
2.4ASFV p30重组蛋白最佳封闭液的选择
取不同封闭液封闭的p30重组蛋白磁珠，检测稀释的阳性血清P1、阴性血清N1～N4，计算各血清发光值(S)与阴性血清发光值均值(N)的比值(S/N)，显示10％乙醇胺盐酸盐水溶液为最佳封闭液，结果见表4。
表4 ASFV p30重组蛋白封闭液的选择
Figure BDA0002609788770000082
2.5ASFV p30重组蛋白最佳封闭时间的确定
取不同封闭时间下封闭的p30重组蛋白磁珠，检测稀释的阳性血清P1、阴性血清N1～N4，计算各血清发光值(S)与阴性血清发光值均值(N)的比值(S/N)，显示3h为最佳封闭时间，结果见表5。
表5 ASFV p30重组蛋白封闭时间的选择
Figure BDA0002609788770000083
Figure BDA0002609788770000091
2.6最佳磁珠保存液的选择
取不同保存液下保存的p30重组蛋白磁珠，检测稀释的阳性血清P1、阴性血清N1～N4，计算37℃与4℃存放磁珠的发光值比值。显示②2％BSA，1％海藻糖，0.1％EDTA，0.9％NaCl，0.05％Tris-HCl，0.5％酪蛋白，0.05M PMSF为最佳保存液，结果见表6。
表6磁珠保存液的选择
Figure BDA0002609788770000092
Figure BDA0002609788770000101
2.7碱性磷酸酶标记羊抗猪IgG抗体最佳稀释度的确定
取不同稀释度碱性磷酸酶标记的羊抗猪IgG抗体，搭配p30重组蛋白磁珠，检测稀释的阳性血清P1、阴性血清N1～N4，计算各阳性血清发光值(S)与阴性血清发光值均值(N)的比值(S/N)，显示1:20000为最佳稀释度，结果见表7。
表7碱性磷酸酶标记的羊抗猪IgG抗体最佳稀释度的确定
Figure BDA0002609788770000102
2.8碱性磷酸酶标记的羊抗猪IgG抗体稀释液的确定
取不同稀释液稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗猪IgG抗体，搭配p30重组蛋白磁珠，检测稀释的阳性血清P1、阴性血清N1～N4，计算37℃与4℃的发光值比值，显示稀释液③1％BSA，0.9％NaCl，0.5％Tween-20，0.05M MOPS(pH7.0)，1mM ZnCl2，1mM MgCl2为最佳抗体稀释液，结果见表8。
表8碱性磷酸酶标记的羊抗猪IgG抗体稀释液的确定
Figure BDA0002609788770000103
Figure BDA0002609788770000111
2.9样品稀释液的确定
取不同稀释液稀释的ASFV抗体强阳性灭活血清，搭配搭配p30重组蛋白磁珠和碱性磷酸酶标记的羊抗猪IgG抗体工作液进行检测，计算37℃与4℃的发光值比值。显示稀释液②1％BSA，0.9％NaCl，0.5％Tween-20，0.05M MOPS(pH7.0)为最佳样品稀释液，结果见表9。
表9样品稀释液的确定
Figure BDA0002609788770000112
Figure BDA0002609788770000121
实施例2非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒的检测与判定
1、试验方法
1.1最佳反应时间选择
将每一步的反应时间都做5min、10min、15min 3个梯度。用全自动化学发光免疫分析仪检测。根据发光值确定最佳反应时间。
1.2最佳加样量的确定
1.2.1血清最佳加样量的确定
检测标准血清，分别设血清加样量10μL、20μL，用全自动化学发光免疫分析仪检测。根据发光值、检测范围确定最佳血清加样量。
1.2.2样品稀释液最佳用量的确定
检测标准血清，分别设样品稀释液用量为100μL、180μL，用全自动化学发光免疫分析仪检测。根据发光值、检测范围确定最佳用量。
1.2.3碱性磷酸酶标记羊抗猪IgG抗体工作液最佳用量的确定
检测标准血清，分别设酶标抗体工作液用量为100μL、200μL，用全自动化学发光免疫分析仪检测。根据发光值、检测范围确定最佳用量。
1.3判定标准的确定
1.3.1临界值的确定
选取178份血清样品，用以确定该方法的临界值，测得的发光值应用SPSS18.0软件绘制ROC(Receiver operating characteristic)曲线，计算指数Youden指数(Youden指数：敏感性特异性)，并选择Youden指数最大的切点为临界值。
1.3.2临界值计算方法的确定
取20份ASFV抗体阳性血清、20份ASFV抗体阴性血清。检测以上40份血清，分别计算发光值均值。根据阴性血清、阳性血清的发光值均值，选择合适的系数，使二者之和等于临界值。
1.3.3判定标准的确定
以检测样品发光值(S)与临界值(CO)的比值(S/CO)来判定。S/CO≥1.0判定为阳性，S/CO<1.0判定为阴性。
根据此判定标准，检测131份样品，根据敏感性、特异性判定临界值是否有效。
1.4质控品质控范围的确定
1.4.1检测质控品
分别用3批试剂盒检测质控品Q1、Q2，连续10天，每天各进行2次试验，每次试验对每个质控品各进行4次检测。每个质控品各得到240个检测结果，计算S/CO的平均值和标准偏差。
1.4.2确定质控范围
以质控品平均值±3倍标准偏差，作为其质控范围。
2、结果
2.1最佳反应时间的选择
将反应时间分别设5min、10min、15min，用全自动化学发光免疫分析仪检测稀释的灭活阳性血清(P1)和阴性血清(N1～N4)，计算发光值比值。显示10min为最适反应时间，结果见表10：
表10最佳反应时间选择
Figure BDA0002609788770000131
2.2最佳加样量的确定
检测稀释的灭活阳性血清(P1)和阴性血清(N1～N4)，分别设置不同的血清加样量、样品稀释液加样量、碱性磷酸酶标记的羊抗猪IgG抗体工作液用量，用全自动化学发光免疫分析仪检测，显示血清、样品稀释液、酶标抗体工作液的最佳加样量分别为10μL、100μL、100μL，结果见表11：
表11最佳加样量的确定
Figure BDA0002609788770000141
Figure BDA0002609788770000151
2.3判定标准的确定
2.3.1临界值的确定
将测得的178份血清样品的发光值绘制ROC(Receiver operatingcharacteristic)曲线，结果显示曲线下面积(AUC)为0.998，表示检测结果合格。根据SPSS结果中各个切点的敏感性及特异性结果，计算Youden指数为0.974，所对应的切点为104315，所以确定发光值104315为临界值，结果如图1所示。
2.3.2临界值计算方法的确定
检测ASFV抗体标准阴性血清、稀释的标准阳性血清各20次，分别计算发光值均值。如表12所示。设定标准阳性发光值系数为0.2，标准阴性血清发光值系数为0.785，此时两者之和为104301，与临界值104315一致。为方便计算，确定标准阳性血清发光值的系数为0.2，标准阴性血清发光值的系数为0.8。
表12临界值计算方法的确定
Figure BDA0002609788770000152
Figure BDA0002609788770000161
2.3.3判定标准的确定
依据1.3.3中所述判定标准，用本试剂盒检测131份血清样品(96份非洲猪瘟阴性血清和35份非洲猪瘟阳性血清)，检测结果显示，96阴性样本中有94份为阴性，2份为阳性，特异性为97.9％；35份阳性样本中检测出35份阳性，敏感性达100％。因此，综上所述，本试剂盒的判定标准定为：
当被检血清S/CO≥1.0时，为非洲猪瘟病毒抗体阳性；
当被检血清S/CO<1.0时，为非洲猪瘟病毒抗体阴性。
2.4质控品质控范围的确定
对质控品Q1、Q2检测分别所得的240个结果进行S/CO的平均值和标准偏差计算。以均值±3SD确定质控范围，质控品Q1的质控范围为2.01±0.56，质控品Q2的质控范围为5.04±1.28，可见两个质控品测值偏差都在均值±30％范围以内。因此将质控品Q1的质控范围定为2.0±0.6，即1.4～2.6；质控品Q2的质控范围定为5.0±1.5，即3.5～6.5。结果见表13。
表13质控品质控范围的确定
Figure BDA0002609788770000162
Figure BDA0002609788770000171
Figure BDA0002609788770000181
Figure BDA0002609788770000191
实施例3非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒的性能指标
1、试验方法
1.1特异性实验
用制备的3批ASFV抗体磁微粒化学发光试剂盒对ASFV抗体阳性血清(20份)；ASFV抗体阴性血清(10份)；塞内卡病毒阳性血清5份；猪瘟病毒阳性血清5份；猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清5份；口蹄疫病毒O型阳性血清5份；口蹄疫病毒A型阳性血清5份；共计55份血清进行检测，根据测得的发光值计算S/CO，判定阴阳性。
1.2敏感性试验
将阳性标准血清用样品稀释液分别按1:2、1:8、1:32比例进行稀释，分别命名为CP1、CP2、CP3，作为敏感性质控血清，用制备的3批ASFV Ab磁微粒化学发光试剂盒检测。要求CP1的S/CO大于5.0，CP2的S/CO介于1～2之间，CP3的S/CO介于0.2～0.8之间。同时用西班牙非洲猪瘟抗体检测试剂盒进行复核(批号：171218)
1.3重复性试验
用制备的3批磁微粒化学发光试剂盒分别对1份强阳性、1份弱阳性血清各进行20次重复检测，计算发光值均值和标准差，计算变异系数CV％；并计算同一份血清3批试剂盒共计60次测试的CV％。
1.4准确性试验
取3份ASFV抗体标准阳性血清，分别用3批化学发光试剂盒检测。计算血清的实测发光值与其理论阻断率的偏差。
1.5稳定性试验
将试剂盒存放于37℃3、7、10天，取出定标品，并与4℃存放试剂盒做对比，计算定标品发光值的比值。两种温度存放试剂盒分别检测阴阳性血清，计算测得血清S/CO的差异。
2、结果
2.1特异性实验
对1.1所述55份血清进行检测，根据测得的S/CO判定阴阳性。结果显示，3批试剂盒检测20份非洲猪瘟病毒阳性血清均为阳性；检测非洲猪瘟病毒阴性血清(10份)、塞内卡(5份)、猪瘟(5份)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(5份)、口蹄疫O型(5份)、口蹄疫A型(5份)阳性血清，结果均呈阴性。由此可见，“非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒”不与塞内卡、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、口蹄疫O型、口蹄疫A型病毒阳性血清发生交叉反应。结果见表14。
表14特异性试验
Figure BDA0002609788770000201
注：“+”表示阳性；“－”表示阴性
2.2敏感性实验
对1.2中所述CP1、CP2、CP3三份血清进行敏感性检测，结果显示均为阳性；同时应用西班牙非洲猪瘟抗体检测试剂盒进行检测，CP1和CP2为阳性，CP3为阴性，结果如表15所示。
表15敏感性试验
Figure BDA0002609788770000202
Figure BDA0002609788770000211
2.3重复性实验
如1.3所述方法进行非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒重复性实验检测。结果显示，2份血清批内CV小于5％，批间CV小于8％，重复性良好，见表16。
表16重复性试验
Figure BDA0002609788770000212
2.4稳定性实验
将试剂盒于37℃分别存放3、7、10天，取出定标品，分别检测阴阳性血清，计算测得血清37℃与4℃的S/CO值，以及定标品37℃与4℃发光值的比值。结果显示试剂盒存放于37℃条件下10天，阳性血清S/CO值偏差都低于10％，阴性血清S/CO偏差都低于20％。说明试剂盒稳定性良好。见表17。
表17稳定性试验
Figure BDA0002609788770000221
以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒，其特征在于，由偶联有ASFVP30重组蛋白的磁微粒混悬液、试剂R、定标品、质控品、样品稀释液、洗涤液及发光液组成，所述试剂R由抗体稀释液、碱性磷酸酶标记的羊抗猪IgG抗体组成。
2.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的ASFV P30重组蛋白磁微粒混悬液的制备包括以下步骤：将磁珠用EDC、NHS活化，按照10μg重组蛋白/mg磁珠的比例将两者混合，于37℃包被3h；磁吸附去除上清，以10%乙醇胺盐酸盐水溶液封闭3h，用清洗液清洗磁珠3次，用含有2%BSA的保存液稀释至0.5mg磁珠/mL。
3.根据权利要求2所述的一种非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒，其特征在于，含有2%BSA的保存液由2%BSA，1%海藻糖，0.1%EDTA，0.9%NaCl，0.05%Tris-HCl，0.5%酪蛋白，0.05M PMSF组成。
4.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光标记物是碱性磷酸酶。
5.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂R的制备包括以下步骤，将抗体稀释液、碱性磷酸酶标记的羊抗猪IgG抗体灌入盒中，塑封，放入磁珠杯，二次封口。
6.根据权利要求5所述的一种非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒，其特征在于，所述抗体稀释液由1%BSA、0.9%NaCl、0.5%Tween-20、pH7.0的0.05M MOPS、1mM ZnCl2、1mM MgCl2组成。
7.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的定标品由定标品C1和定标品C2组成；定标品C1为ASFV抗体阴性血清，定标品C2是用保存液将ASFV抗体强阳性灭活血清稀释至工作浓度后制得。
8.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的质控品是用ASFV抗体阴性血清将ASFV抗体强阳性灭活血清稀释后制得。
9.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的样品稀释液由1%BSA，0.9%NaCl，0.5%Tween-20，pH7.0的0.05M MOPS组成。
10.权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测试剂盒应用，其特征在于，包括以下步骤：在反应杯中加入待测样品，再加入ASFV P30重组蛋白磁微粒混悬液，混匀，37℃反应10min，加入洗涤液洗掉上清，加入适量碱性磷酸酶标记的羊抗猪IgG抗体工作液，37℃反应10min，加入洗涤液洗掉上清，加入发光液，测定相应的发光值。
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