CN105092839A - 一种鸡传染性支气管炎间接elisa抗体检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡传染性支气管炎间接ELISA抗体检测试剂盒，属于生物技术领域。本发明利用能够稳定表达重组鸡传染性支气管炎病毒部分核蛋白的基因工程菌，诱导表达重组N160蛋白并经亲和层析纯化，用纯化出的重组N160蛋白作为包被抗原，建立一种简便、特异的间接ELISA方法。同时还为检测鸡传染性支气管炎病毒抗体提供了特异、敏感、快速、操作简便的试剂盒，能够在实际生产中快速诊断鸡群是否感染鸡传染性支气管炎病毒、监测免疫鸡血清抗体水平及雏鸡母源抗体水平，以评估鸡群感染传染性支气管炎病毒的风险程度，为传染性支气管炎免疫程序的制定提供参考。

Description

一种鸡传染性支气管炎间接ELISA抗体检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种鸡传染性支气管炎间接ELISA抗体检测试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

鸡传染性支气管炎(InfectiousBronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起鸡的一种急性、高度接触传染性呼吸道传染病，本病呈世界性分布，是严重危害养禽业的最主要疫病之一。疫苗免疫是预防和控制鸡传染性支气管炎发生的最有效途径，而免疫后抗体水平的高低反映实际的疫苗免疫效果，直接关系到免疫鸡群对鸡传染性支气管炎病毒的抵抗力。鸡传染性支气管炎疫苗免疫鸡后血清中的病毒抗体可通过酶联免疫的方法检测，酶联免疫吸附试验系统经证实在IBV抗体水平的定量检测上是有效的，有利于检测大规模群体的免疫状况。血清中的IBV抗体(主要包括IgG)水平及整个鸡群的免疫状况可用ELISA方法进行检测。该方法是将抗原包被在微孔板上，加入稀释后的血清并孵育，血清中的抗IBV抗体将与包被在微孔板上的IBV结合，形成IBV抗原-抗体复合物，洗掉未结合的物质，加入过氧化物酶或者碱性磷酸酶标记的抗鸡IgG的酶标结合物至微孔板中，酶标物将与IBV抗原-抗体复合物结合，孵育后洗掉未结合的酶标物，然后加入底物溶液，底物与碱性磷酸酶进一步发生反应并生成一种带有蓝色或黄色等颜色的产物，最后通过加入终止液终止酶活性反应，将颜色固定，颜色的深浅可用酶标仪(405-410nm或者630-650nm)测定，测定值的大小反应抗体水平的高低，还可通过一定的计算方法来界定血清中抗体的转化情况。可见，抗体间接ELISA检测方法是传染性支气管炎抗体水平定量检测的有效方法，具有重要的应用价值。

IBV的核蛋白作为一种主要结构蛋白,具有高度保守性,不同血清型间同源性高达94％～99％。并且有高度免疫原性，能诱导产生抗体。所以，核蛋白是IBV群特异性血清学检测诊断抗原的最佳选择。Ndifuna等人以及杜恩岐等人用大肠杆菌原核系统体外表达IBV的全长核蛋白，表明其具有免疫原性，郝春丽等应用原核系统体外表达IBV的全长核蛋白作为抗原建立了NP-ELISA抗体检测方法，可用于的诊断。然而，基于原核系统表达的IBV核蛋白N-末端部分抗原性更加特异，将该特异蛋白用于抗原开展抗体检测的研究和应用均未见报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种基于原核系统表达的鸡传染性支气管炎间接ELISA抗体检测试剂盒，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种鸡传染性支气管炎间接ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒含有经过纯化的鸡传染性支气管炎病毒核蛋白N-末端160个氨基酸的部分核蛋白的酶标板，其中鸡传染性支气管炎病毒核蛋白编码基因的GeneBank登录号为AY839143.1。

优选地，所述鸡传染性支气管炎病毒，为鸡传染性支气管炎病毒毒株ck/CH/LJL04I。

优选地，所述N-末端160个氨基酸的重组蛋白，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

优选地，所述N-末端160个氨基酸的重组蛋白的制备方法步骤如下：

1)通过RT-PCR从传染性支气管炎病毒ck/CH/LJL04I扩增获得核蛋白基因N-端编码160个氨基酸的N160基因；

2)将步骤1)所得基因整合到质粒载体中，获得重组质粒；

3)将步骤2)所构建的重组质粒转化到宿主菌中并诱导表达，获得菌液；

4)分离并利用亲和层析技术纯化步骤3)所得菌液，获得重组N160蛋白。

优选地，步骤1)所述扩增，所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3-SEQIDNO.4所示。

优选地，步骤2)所述质粒载体，是质粒pGEX-6P-1。

优选地，所述酶标板的制备方法如下：

1)向酶标板的每孔中分别加入含量为5μg纯化的鸡传染性支气管炎病毒部分核蛋白N₁₆₀的抗原溶液，4℃包被过夜；

2)利用洗涤液洗涤3-5遍；

3)再用250μL1-5％牛血清白蛋白溶液封闭，洗涤。

优选地，所述试剂盒还包括：

(1)10×PBST浓缩洗涤液：pH7.4，体积200mL；

(2)10×血清稀释液：pH7.4，体积200mL；

(3)酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡或羊抗鸡抗体，25mL；

(4)底物显色液：60mL；

(5)终止液：60mL；

(6)标准阳性对照：5mL；

(7)标准阴性对照：0.5mL。

优选地，所述PBST浓缩洗涤液为1-5％Tween-20、8％氯化钠、0.2％氯化钾、3％磷酸氢二钠和0.2％磷酸二氢钾的水溶液；所述10×血清稀释液为上述10×PBST浓缩洗涤液加入1-5％牛血清白蛋白的溶液；所述底物显色液为TMB单组份底物显色液，其主要成分为10mg/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺磷酸缓冲溶液，而磷酸缓冲液为：0.1mol/L磷酸二氢钠水溶液87.7mL和0.1mol/L磷酸氢二钠水溶液12.3mL混合而成的液体。

优选地，所述标准阳性对照，为利用所述酶标板标定为OD₆₃₀或OD₆₅₀吸光值在0.1-0.8之间的传染性支气管炎抗体阳性血清稀释液；所述标准阴性对照，为利用所述酶标板标定为OD₆₃₀或OD₆₅₀吸光值在0.03-0.1之间的传染性支气管炎抗体阴性血清稀释液。

本发明构建的传染性支气管炎抗体检测试剂盒应用于检测传染性支气管炎疫苗免疫鸡或者鸡感染传染性支气管炎后诱导产生的传染性支气管炎病毒特异性抗体。

发明人对不同长度N-端蛋白的蛋白敏感度、特异性及符合率等进行了测定，发现并不是任意长度的N-端蛋白均能取得良好效果，其中N140，N160和N180的效果较佳。经过大量研究发现，重组N160蛋白的综合效果要优于N140蛋白和N180蛋白。

本发明获得有益效果如下：

本发明利用能够稳定表达重组鸡传染性支气管炎病毒部分核蛋白(N-末端160个氨基酸，简称N160)的基因工程菌，在合适的条件下诱导表达重组N160蛋白并经亲和层析纯化。用纯化出的重组N160蛋白作为包被抗原，建立一种简便、特异的间接ELISA方法。

本发明还为检测鸡传染性支气管炎病毒抗体提供了特异、敏感、快速、操作简便的试剂盒，能够在实际生产中快速诊断鸡群是否感染鸡传染性支气管炎病毒、监测免疫鸡血清抗体水平及雏鸡母源抗体水平，以评估鸡群感染传染性支气管炎病毒的风险程度，为传染性支气管炎免疫程序的制定提供参考。

附图说明

图1为37℃、0.5mmol/LIPTG诱导条件下N1-GST融合蛋白的表达分析；

(M：蛋白质标准分子量；1：未诱导阳性菌；2：诱导2h后菌体上清；3：诱导2h后菌体沉淀；4；诱导4h后菌体上清；5：诱导4h后菌体沉淀；6：诱导6h后菌体上清；7：诱导6h后菌体沉淀)。

图2为37℃、0.5mmol/LIPTG诱导条件下N2-GST融合蛋白的表达分析；

(M：蛋白质标准分子量；1：未诱导阳性菌；2：诱导2h后菌体上清；3：诱导2h后菌体沉淀；4：诱导4h后菌体上清；5：诱导4h后菌体沉淀；6：诱导6h后菌体上清；7：诱导6h后菌体沉淀；8：诱导8h后菌体上清；9：诱导8h后菌体沉淀)。

图3为37℃、0.5mmol/LIPTG诱导条件下N-GST融合蛋白的表达分析；

(M：蛋白质标准分子量；1：未诱导阳性菌；2：诱导2h后菌体上清；3：诱导2h后菌体沉淀；4：诱导4h后菌体上清；5：诱导4h后菌体沉淀；6：诱导6h后菌体上清；7：诱导6h后菌体沉淀)。

图4为N1-GST融合蛋白纯化结果；

(M：蛋白质标准分子量1：诱导后菌体上清；2：过柱流穿液；3：过柱流穿液；4：WashBuffer洗脱；5：ElutionBuffer第一次洗脱；6：ElutionBuffer第二次洗脱；7：ElutionBuffer第三次洗脱)。

图5为N2-GST融合蛋白纯化结果；

(M：蛋白质标准分子量；1：诱导后菌体上清；2：过柱流穿液；3：WashBuffer洗脱；4：ElutionBuffer第一次洗脱；5：ElutionBuffer第二次洗脱；6：ElutionBuffer第三次洗脱)。图6为N-GST融合蛋白纯化结果；

(M：蛋白质标准分子量；1：诱导后菌体上清；2：过柱流穿液；3：ElutionBuffer第一次洗脱；4：ElutionBuffer第二次洗脱；5：ElutionBuffer第三次洗脱；6：ElutionBuffer第四次洗脱；7：ElutionBuffer第五次洗脱；8：ElutionBuffer第六次洗脱)。

图7为N1-GST、N2-GST和N-GST蛋白作为抗原与传染性支气管炎阳性血清反应的western-blot检测结果；

(M：蛋白质标准分子量；1：N1-GST；2：N-GST；3：N2-GST)。

图8为N140、N160、N180重组蛋白与传染性支气管炎阳性血清反应的western-blot检测结果；

(M：蛋白质标准分子量；1：N140；2：N160；3：N180)

图9为IDEXX商品化试剂盒与本发明试剂盒测定4/91型、Mass型(H120)、QX型(LDL091022)血清符合率结果；

(a为商品化试剂盒测定结果；b为本发明试剂盒对应检测显色结果)。

图10为IDEXX商品化试剂盒与本发明试剂盒测定4/91型和LDT3型血清的符合率结果；

(a为IDEXX商品化试剂盒测定结果，b为本发明试剂盒对应检测显色结果)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

实施例1ELISA板包被抗原蛋白的制备

本实施例所用IBV毒株为ck/CH/LJL/04I株；克隆载体pMD18-Tvector(购自TaKaRa公司)，表达载体为pGEX-6p-1。

1.1通过对IBVCK/CH/LJL04I毒株N蛋白抗原表位的分析，选取N基因的1-480bp片段作为N1，433-1230bp作为N2，1-1230bp为N，设计引物，表达N1、N2及N这三种蛋白，首先利用Trizol方法提取IBVck/CH/LJL04I毒株的总RNA，利用One-stepPCR进行反转录，N1、N2、N引物分别如下：

N1F:5'CGCGGATCCATGGCGAGCGGTAAAGCAAC3'

N1R:5'GCGTCGACTTACAGAGGAATAAAATCCCAACGG3'

N2F:5'CGCGGATCCATGTCAGATGGAGGACCTGACGG3'

N2R:5'GCGTCGACTTATCAAAGTTCATTTTCACCAAG3'

NF:5'CGCGGATCCATGGCGAGCGGTAAAGCAAC3'

NR:5'GCGTCGACTTATCAAAGTTCATTTTCACCAAG3'

将扩增出的N1、N2、N片段连接pMd18-T载体进行测序。测序正确后，利用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶切割，酶切产物与经BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶切割的pGEX-6p-1表达载体相连接，构建重组质粒pGEX-6p-1-N1、pGEX-6p-1-N2、pGEX-6p-1-N，测序正确后转化至大肠杆菌E.coliRosetta(DE3)中，进行蛋白表达与纯化。

1.2融合蛋白N1-GST、N2-GST、N-GST的诱导：挑取含阳性重组质粒pGEX-6p-1-N1、pGEX-6p-1-N2、pGEX-6p-1-N的Rosetta(DE3)单个菌落接种于含100μg/mlAmp的LB液体培养基中，37℃过夜培养。次日取上述过夜培养物以1％的比例接种于新鲜含100μg/mlAmp的LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h，当OD₆₀₀至约0.4时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，37℃继续培养，分别诱导培养2h、4h、6h、8h。另设对照组不加IPTG诱导，其余条件相同。诱导结束后分别取诱导组和对照组培养物1ml加入1.5ml离心管中，室温12000r/m离心1min收集菌体。弃上清，用100μl的预冷PBS(pH7.4)洗涤菌体沉淀，室温12000r/m离心1min后弃上清。向诱导组菌体中加入100μl的预冷PBS(pH7.4)悬浮后超声破碎，12000r/m离心10min，吸取上清至另一离心管中，向沉淀中加入100μl预冷PBS(pH7.4)重悬。同时对照组用100μl预冷PBS(pH7.4)重悬。向诱导组上清、诱导组沉淀和对照组菌体悬浮液中加入1/4体积5×SDS样品缓冲液(含DTT)，100℃煮沸5min。取15μl样品进行12％SDS-PAGE。电泳后，经考马斯亮蓝R-250染色，甲醇-冰乙酸脱色液脱色观察结果以确定目的蛋白的表达情况，分析诱导时间对N1-GST、N2-GST、N-GST融合蛋白可溶性的影响。

1.3融合蛋白N1-GST、N2-GST、N-GST的纯化：挑取含阳性重组质粒pGEX-6p-1-N1、pGEX-6p-1-N2、pGEX-6p-1-N的Rosetta单菌落，接种于含100μg/mlAmp的LB液体培养基中，37℃培养过夜。次日取上述过夜培养物以1％的比例接种于1L含100μg/mlAmp的LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h，当OD600值至约0.4时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，37℃继续培养4h。培养结束后取出培养物于4℃、12000r/min离心30min，收集菌体。弃上清，每50ml初始菌液加入1mlPBS(pH7.4)，重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，置于冰上搅动30min。在冰上高强度超声破碎，10sec为一组，每组间隔10sec。破碎后，10000g4℃离心30min，收集上清，利用GSTBind树脂纯化含有GST标签的N1、N2和N融合蛋白。上清加入到GSTBind柱中(将流速控制在每小时10倍柱体积为宜，如果流速过快，洗脱的目的蛋白中会混入较多的杂质)，用Bind/Washbuffer(140mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNaH2PO4，1.8MmKH2PO4，pH7.3)洗去杂蛋白后，再用Elutionbuffer(50mMTris-HCl，10mMreducedglutathione，pH8.0)洗脱，收集每步中穿过组分置于冰上待后续分析。

1.4实验结果

1)构建的表达N1-GST融合蛋白的基因工程菌经IPTG诱导，在不同时间点取样检测蛋白的表达，结果显示从诱导后2～6h均能诱导N1-GST融合在大肠杆菌中表达，结果如图1所示。N2-GST融合蛋白的诱导表达和N-GST融合蛋白的诱导表达结果如图2和图3所示。

2)通过GST标签蛋白纯化树脂进行融合蛋白N1-GST、N2-GST和N-GST的纯化，结果诱导菌液通过纯化树脂，有效地纯化出工程菌表达分泌的这3种融合蛋白，如图4～6所示。实施例2ELISA板包被抗原蛋白与血清抗体反应型的测定。

将纯化的融合蛋白N1-GST、N2-GST和N-GST分别与传染性支气管炎病毒阳性血清进行反应，按照western-blot方法经验证各融合蛋白与阳性血清反应的特异性；同时，参照常用ELISA抗原包被浓度分别将N1-GST、N2-GST和N-GST蛋白按照5μg/ml的浓度进行ELISA板的包被，按照间接ELISA方法检测已知传染性支气管炎阳性血清。首先将包被24h的ELISA板用250μlPBST洗涤3次，分别加入100μl经稀释的已知阳性血清和阴性血清，标准品到各自的微孔中，再加入100μl适当浓度的酶标二抗，在微型振荡器上充分混匀，室温避光孵育1h，倒出孔内液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体，用250μlPBST洗涤3次。加入100μlTMB底物显色液溶液到微孔中，充分混合，室温孵育15min，再加入100μlKPL公司的终止液到微孔中，测650nm波长的吸收值。

结果表明，western-blot验证表明N1-GST、N2-GST和N-GST融合蛋白均能够与传染性支气管炎病毒阳性血清反应，但是N-GST和N2-GST融合蛋白与阳性血清反应出现非特异性条带，而N1-GST融合蛋白与阳性血清反应出现特异性的单一条带，说明N1-GST融合蛋白能够作为传染性支气管炎病毒抗体的特异性抗原，可以作为抗体检测的候选抗原，结果如图7所示；用N1-GST、N2-GST和N-GST蛋白作为包被抗原用ELISA方法测定阳性血清和阴性血清，结果表明N1-GST作为抗原反应性较N2-GST的吸光值高，说明N1-GST与传染性支气管炎病毒抗体反应性更好，而N-GST蛋白和N2-GST作为包被抗原与阳性血清反应，测定的吸光值较N1-GST均高，同时与传染性支气管炎病毒阴性血清也有部分反应性，其吸光值较N1-GST均高，可见通过ELISA方法也表明N-GST和N2-GST蛋白作为抗原并不特异，如表1所示。因此N1-GST融合蛋白可与传染性支气管炎抗体具备很好的反应特异性，具备作为传染性支气管炎病毒抗体检测的候选抗原蛋白。

表1N1-GST、N2-GST和N-GST蛋白作为包被抗原测定抑制血清结果

实施例3抗原蛋白的优化

实施例2中已初步确定N1-GST(N160)作为传染性支气管炎病毒检测的候选抗原蛋白，为确定所选择的蛋白为最佳重组蛋白，构建N140、N180重组蛋白与N160重组蛋白进行比较。将纯化的重组蛋白N140、N160和N180分别与传染性支气管炎病毒阳性血清进行反应，按照western-blot方法经验证各融合蛋白与阳性血清反应的特异性。结果如图8显示，western-blot验证表明N140、N160和N180融合蛋白均能够与传染性支气管炎病毒阳性血清反应，但是N180重组蛋白与阳性血清反应出现非特异性条带，N140重组蛋白与阳性血清反应性较弱，而N160重组蛋白与阳性血清反应出现特异性的单一条带，说明N160重组蛋白分别相比于N140、N180敏感性更强，特异性更好。

用N140、N160、N180作为包被抗原的ELISA板检测抗体效价的血清大样品，同时与IDEXX公司IBVELISA抗体检测试剂盒的检测结果相对比，分析N140、N160、N180三种蛋白包被的敏感性、特异性和符合率。

相对敏感性(％)＝{阳性数/(阳性数+假阴性数)}×100％

相对特异性(％)＝{阴性数/(阴性数+假阳性数)}×100％

总符合率(％)＝{(阳性数+阴性数)/检测总数}×100％

结果如表2所示，N160的相对敏感性、相对特异性和总符合率分别是96.76％、88.57％和95.35％。敏感性强于N140，特异性好于N180，总体的符合率N160最高。因此，本发明中选择IBV-N1(N160)重组蛋白作为传染性支气管炎病毒抗体检测的抗原蛋白。

表2N140、N160、N180敏感性、特异性、符合率对比

实施例4N1-GST抗原蛋白特异性试验

用N1-GST作为包被抗原的ELISA板分别检测3份已知的IBV、禽白血病病毒(ALV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)和禽网状内皮组织增生病毒(REV)等病原的阳性血清，并以IDEXXIBV试剂盒作为对照，分析试剂盒的特异性。结果显示，除IBV血清检测为阳性以外，其他病原的阳性血清检测均为阴性，说明该试剂盒的特异性良好，与其它阳性血清无交叉反应。

表3不同病原阳性血清的检测结果

实施例5试剂盒阳性临界值的确定

用建立的间接ELSIA方法检测30份来自于未免疫IBV疫苗，并经IDEXX公司IBV抗体检测试剂盒检测的已知鸡血清样品，计算出阴性血清样品OD630nm值的平均值(x)和标准差(SD)。根据统计学原理，确定判定血清样品为阳性或阴性的临界值。

表430份鸡阴性血清的ELISA检测结果

运用本方法检测共计30份经IDEXX公司IBV抗体检测试剂盒检测为阴性的鸡血清，30份阴性血清求得其平均值(X)为0.074；标准偏差(SD)为0.019；根据统计学原理，确定阴阳性临界值为Cp＝X+3SD＝0.131，即待测样品的检测值≥0.131为阳性，小于0.131为阴性。

为了降低人为因素(如操作人员技术误差)、环境因素(环境温度)及每批试剂尤其是每批抗原的差异对检测结果的影响，引入S/P值{S/P值＝(样品测定空OD630nm值-阴性对照孔平均OD630nm值)/(阳性对照孔平均OD630nm值-阴性对照孔平均OD630nm值)}对该方法的判定标准进行修正，通过设定阴性和阳性对照血清的OD630nm值，用S/P值作为判定标准，当S/P值≥0.25为阳性，S/P值小于0.25为阴性。此时，设定的阴性和阳性对照血清OD630nm值的具体计算方法如下：将实际测得的阴阳性临界0.131以样品测定孔OD630nm值代入S/P＝0.25，从而计算得出阳性对照孔平均OD630nm值和阴性对照孔平均OD630nm值为0.302和0.074。

因此，判定标准确定为：检测样品S/P值≥0.25时，判定为阳性样品；检测样品S/P值＜0.25时，判定为阴性样品。

实施例5符合率测定

用建立的IBV-N1作为包被抗原的ELISA板检测409份不同抗体效价的血清大样品，同时与IDEXX公司IBVELISA抗体检测试剂盒的检测结果相对比，分析该方法的敏感性、特异性和符合率。

相对敏感性(％)＝{阳性数/(阳性数+假阴性数)}×100％

相对特异性(％)＝{阴性数/(阴性数+假阳性数)}×100％

总符合率(％)＝{(阳性数+阴性数)/检测总数}×100％

实验结果显示，用建立的IBV-N1蛋白包被的ELISA板和检测方法检测409份不同抗体效价的血清样品，检测结果为阳性336份，阴性73份，IDEXX公司IBVELISA检测试剂盒的检测结果为阳性339份，阴性70份，具体数据见表5，由此可知建立的ELISA方法的相对敏感性、相对特异性和总符合率分别是96.76％、88.57％和95.35％。因此，本发明中涉及的以IBV-N1蛋白包被的ELISA板为主的抗体检测试剂盒敏感性、特异性较高，与已有的商品化试剂盒具有较高的符合率。

表5N1-IBVELISA和IDEXXIBVELISA检测鸡血清样品结果

为了验证本发明针对不同型传染性支气管炎病毒抗体检测的有效性和与商品化试剂盒检测的符合率，将已知的4/91型、Mass型(H120)、QX型(LDL091022)及LDT3型的阳性血清进行检测，分析本发明设计试剂盒与已有检测抗体水平的商品化试剂盒的符合性，结果表明本发明涉及的试剂盒检测结果具有较好的符合率，不同类型的传染性支气管炎病毒血清检测符合率达到95.65％-100％，尤其对于4/91型、Mass型(H120)、QX型的符合率均达到100％，结果如图9和图10以及表6和表7所示。

表6本发明试剂盒与IDEXX试剂盒检测4/91型、Mass型(H120)、QX型血清测定结果

表7本发明试剂盒与IDEXX试剂盒检测4/91型、Mass型(H120)、QX型血清测定结果

为了更清晰的展示本发明涉及试剂盒在应用中的效果，以下通过应用实施例的研究内容进一步证实本发明的特点。

应用实施例1传染性支气管炎免疫水平检测

用传染性支气管炎活疫苗H120免疫10只SPF鸡，在免疫后第4d、8d、12d、16d、20d、24d、28d、32d、36d、40d、44d、48d、52d分别采血分离血清，同时用本发明涉及的试剂盒和商品化IDEXXELISA试剂盒(以传染性支气管炎病毒作为抗原包被ELISA板)进行检测，以IDEXX检测结果为标准，计算二者符合率。实验结果表明，传染性支气管炎活疫苗免疫后4天本发明涉及的试剂盒检测结果和IDEXXELISA试剂盒检测血清阳性数都为0，从免疫第8天后，本发明涉及的试剂盒和IDEXX公司的试剂盒同时检测出阳性，符合率均为100％，结果见表8。可见本发明涉及的试剂盒检测结果与目前国际上大量应用的试剂盒检测结果基本一致，可应用于传染性支气管炎抗体水平的检测。

表8IBV-N1和IDEXXELISA检测IBV感染后的SPF鸡血清

应用实施例2保存期实验

本发明涉及的抗体检测试剂盒作为临床应用的产品，在商业应用中其保存条件和保存期尤为重要，本实施例通过实验研究数据进一步展示本发明在应用中具有可操作性的特点。

1、N1包被ELISA板制备：将纯化的重组IBVN1蛋白作为抗原，包被ELISA酶标板，具体操作如下：

(1)用pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释至最佳包被浓度5μg/ml，100μl/孔，4℃过夜包被

(2)用含0.05％Tween-20的PBS洗涤，每孔250μl，洗涤3次，每次5min，拍干液体。

(3)加入封闭液和酶标板保护剂200μl/孔，置于37℃下2h。

(4)拍干，常温无菌干燥1h，真空压膜包装并加入干燥剂，4℃保存备用。

2、保存期测定：将制备的阴性对照血清、阳性对照血清以及已知背景血清样品24份按已确定的最佳稀释度进行稀释，无菌过滤后分装，于-70℃冷藏保存。将分别在室温和4℃放置的第0、1、2、3、4、5、6个月的用IBVN1蛋白包被ELISA酶标板进行检测，根据S/P值，判定保存期。结果显示，本发明试剂盒在室温不能长期保存，保存1个月其有效性降低。而在4℃保存12个月，包括包被抗原的ELISA板在内的各组分仍然保持较好的反应性，能够有效检测已知的血清抗体水平。检测结果表8所示。

表8室温和4℃保存期结果

以上实施例和实验例表明，以本发明涉及的传染性支气管炎病毒抗体检测试剂盒作为检测IBV疫苗免疫鸡或IBV病毒感染鸡所产生抗体水平的有效手段，其具备特异性、重复性和有效性，且具备长时间保存的特点，说明本发明具有良好的应用价值。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种鸡传染性支气管炎间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，含有经过纯化的鸡传染性支气管炎病毒核蛋白N-末端160个氨基酸的重组蛋白的酶标板，其中鸡传染性支气管炎病毒核蛋白编码基因的GeneBank登录号为AY839143.1。

2.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述鸡传染性支气管炎病毒，为鸡传染性支气管炎病毒毒株ck/CH/LJL04I。

3.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述N-末端160个氨基酸的重组蛋白，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

4.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述N-末端160个氨基酸的重组蛋白的制备方法步骤如下：

1)通过RT-PCR从传染性支气管炎病毒ck/CH/LJL04I扩增获得核蛋白基因N-端编码160个氨基酸的N160基因；

2)将步骤1)所得基因整合到质粒载体中，获得重组质粒；

3)将步骤2)所构建的重组质粒转化到宿主菌中并诱导表达，获得菌液；

4)分离并利用亲和层析技术纯化步骤3)所得菌液，获得重组N160蛋白。

5.权利要求4所述试剂盒，其特征在于，步骤1)所述扩增，所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3-SEQIDNO.4所示。

6.权利要求4所述试剂盒，其特征在于，步骤2)所述质粒载体，是质粒pGEX-6P-1。

7.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述酶标板的制备方法如下：

1)向酶标板的每孔中分别加入含量为5μg纯化的鸡传染性支气管炎病毒部分核蛋白N160的抗原溶液，4℃包被过夜；

2)利用洗涤液洗涤3-5遍；

3)再用250μL1-5％牛血清白蛋白溶液封闭，洗涤。

8.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，还包括：

(1)10×PBST浓缩洗涤液：pH7.4，体积200mL；

(2)10×血清稀释液：pH7.4，体积200mL；

(3)酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡或羊抗鸡抗体，25mL；

(4)底物显色液：60mL；

(6)终止液：60mL；

(7)标准阳性对照：5mL；

(8)标准阴性对照：0.5mL。

9.权利要求8所述试剂盒，其特征在于，所述PBST浓缩洗涤液为1-5％Tween-20、8％氯化钠、0.2％氯化钾、3％磷酸氢二钠和0.2％磷酸二氢钾的水溶液；所述10×血清稀释液为上述10×PBST浓缩洗涤液加入1-5％牛血清白蛋白的溶液；所述底物显色液为TMB单组份底物显色液，主要成分是10mg/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺磷酸缓冲溶液，而磷酸缓冲液为：0.1mol/L磷酸二氢钠水溶液87.7mL和0.1mol/L磷酸氢二钠水溶液12.3mL混合而成的液体；所述标准阳性对照，为利用权利要求1所述酶标板标定为OD₆₃₀或OD₆₅₀吸光值在0.1-0.8之间的传染性支气管炎抗体阳性血清稀释液；所述标准阴性对照，为利用权利要求1所述酶标板标定为OD₆₃₀或OD₆₅₀吸光值在0.03-0.1之间的传染性支气管炎抗体阴性血清稀释液。

10.权利要求1-9所述任一试剂盒，其特征在于，应用于检测传染性支气管炎疫苗免疫鸡或者鸡感染传染性支气管炎后诱导产生的传染性支气管炎病毒特异性抗体。