CN111766389A

CN111766389A - 一种基于鸡传染性支气管炎病毒重组n蛋白的elisa抗体检测试剂盒

Info

Publication number: CN111766389A
Application number: CN202010736902.7A
Authority: CN
Inventors: 周景明; 王爱萍; 杨庆宝; 程凯龙; 祁艳华; 刘红亮; 陈玉梅; 刘燕凯
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2020-07-28
Filing date: 2020-07-28
Publication date: 2020-10-13

Abstract

本发明公开了一种基于鸡传染性支气管炎病毒重组N蛋白的ELISA抗体检测试剂盒，包括用于包被酶标板的IBV H120毒株重组N蛋白。该IBV H120毒株重组N蛋白通过原核表达系统E.coli Transetta（DE3）表达，首先构建原核克隆载体pMD19‑T‑N，然后再构建原核表达载体pGEX‑6P‑1‑N及诱导表达和纯化：设计引物RT‑PCR扩增IBV H120 N基因，然后将N基因与pMD‑19‑T进行连接，构建得到原核克隆载体pMD19‑T‑N；以pMD19‑T‑N为模板，PCR扩增N基因，将N基因与pGEX‑6p‑1连接，构建得到原核表达载体pGEX‑6P‑1‑N。本试剂盒具有成本低廉、使用简单方便、敏感性高且特异性强的优点，可以批量检测，为IBV抗体水平监测提供了一种可靠的检测手段。

Description

一种基于鸡传染性支气管炎病毒重组N蛋白的ELISA抗体检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种基于鸡传染性支气管炎病毒重组N蛋白的ELISA抗体检测试剂盒。

背景技术

传染性支气管炎（Infectious bronchitis，IB）是传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV)引起的禽类的一种急性、高度接触性传染病，是严重危害养禽业的重大传染病之一。IBV是一种变异性很强的冠状病毒，传播迅速、血清型众多，不同的血清型之间缺乏交叉保护。IBV在世界范围内呈广泛流行趋势,对全球家禽业造成了严重损失。

IBV基因组能够编码四种结构蛋白，具有重要的的生物学功能。其结构蛋白分别为：纤突糖蛋白(Spike protein, S)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein, N)、膜蛋白(Membrane protein, M)以及小囊膜蛋白(Envelope proteinn, E)。N蛋白是诱导机体免疫应答的重要蛋白，具有高度的保守性。N蛋白是IBV中唯一一个完全位于膜内部的结构蛋白，由409个氨基酸构成。N蛋白的功能主要是包裹病毒核酸从而构成病毒核衣壳，还可以进入宿主细胞核内部或抑制细胞因子，有助于IBV复制。

IBV的变异株以及新的血清型不断出现，使IB的诊断以及防治变得十分困难。目前IB的实验室诊断方法主要包括病毒分离培养、血清学诊断以及分子生物学诊断。国内目前IBV防控主要以接种灭活和弱毒疫苗为主，弱毒疫苗免疫效果优于灭活疫苗。但IBV易突变，弱毒疫苗可能会造成毒力反转，存在散毒风险。

酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)具有很高的灵敏性，其操作简单、快速。N蛋白具有很好的免疫原性，可诱导宿主体内产生高水平的抗体并介导细胞毒性T细胞效应，激活细胞毒性T淋巴细胞应答，而且还可以激活体内的辅助性T淋巴细胞。重组IBV毒株N蛋白作为检测抗原在抗体水平检测方面具有巨大优势。

发明内容

本发明的目的在于利用ELISA方法的检测优势，提供一种基于鸡传染性支气管炎病毒重组N蛋白的ELISA抗体检测试剂盒，用于IBV抗体检测，是一种可靠检测IBV抗体水平的工具。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的基于鸡传染性支气管炎病毒重组N蛋白的ELISA抗体检测试剂盒，包括用于包被酶标板的IBV H120毒株重组N蛋白。

所述IBV H120毒株重组N蛋白是由Genebank中已发表的IBV H120（accessionnumber：FJ888351）的N基因序列设计引物扩增并构建表达菌株进行诱导表达。

所述IBV H120毒株重组N蛋白通过原核表达系统E.coli Transetta（DE3）表达，首先构建原核克隆载体pMD19-T-N，然后再构建原核表达载体pGEX-6P-1-N及诱导表达和纯化：设计引物RT-PCR扩增IBV H120 N基因，然后将N基因与pMD-19-T进行连接，构建得到原核克隆载体pMD19-T-N；以pMD19-T-N为模板，PCR扩增N基因，将N基因与pGEX-6p-1连接，构建得到原核表达载体pGEX-6P-1-N。

具体的，IBV H120毒株重组N蛋白的制备方法为：

使用Primer 5.0设计IBV H120 (accession number:FJ888351) 基因的上下游引物

HP1：5’-CCGGAATTCATGGCGAGCGGTAAGAC-3’ ，

HP2：5’-CCGCTCGAGTTACAACTCATTCTCTCCAAG-3’，

以IBV H120毒株总RNA为模板，以Random Hexamer Primer 为引物，RT-PCR合成cDNA；再以cDNA为模板，上下游引物HPI和HP2 PCR扩增N基因；将N基因与pMD-19-T连接构建克隆载体pMD19-T-N；将N基因与pGEX-6p-1连接构建原核表达载体pGEX-6P-1-N；将重组质粒pGEX-6p-1-N转化 E.coli Transetta（DE3）感受态细胞，用LB培养基培养，加入诱导剂IPTG进行诱导表达；将重组N蛋白用GST柱纯化，再用PreScission Protease切除GST标签并纯化。

本发明试剂盒还包括酶标试剂，封闭液，洗涤液，稀释液，阳性对照样品，阴性对照样品，显色液和终止液；

优选的，酶标试剂为HRP标记的羊抗鸡IgG；封闭液为含5％脱脂奶的PBST；洗涤液为含0.05％Tween-20的PBST；稀释液为PBS；阳性对照样品为IBV 阳性鸡血清；阴性对照样品为阴性SPF鸡血清；显色液为酶底物TMB反应液（A液＋B液）；终止液为2M H₂SO₄。

本发明试剂盒的使用方法为：

包被酶标板：用pH9.6的0.05 M的CBS将IBV H120毒株重组N蛋白稀释至浓度为0.62 µg/mL，然后向96孔酶标板中每孔加入100 µL，进行抗原包被，4 ℃条件下过夜，第二天取出酶标板用PBST冲洗3次并拍干；

封闭：向96孔酶标板中每孔加200 µL5%脱脂奶（现配现用），37℃孵育2 h，拍干；

待检血清孵育：用PBS对待检血清分别进行梯稀释，稀释倍数为1:16000，并设置阴性和阳性对照（阳性对照为IBV阳性鸡血清；阴性对照样品阴性SPF鸡血清），向96孔酶标板中每孔加100 µL，在37 ℃条件下孵育1 h，然后用PBST冲洗3次酶标板并拍干；

羊抗鸡IgG-HRP孵育：用5%脱脂奶对羊抗鸡IgG-HRP进行稀释，稀释倍数1:5000，然后向96孔酶标板中每孔加100 µL，在37 ℃条件下孵育1h，然后用PBST冲洗3次板并拍干；

显色和终止反应：向96孔酶标板中每孔加100 µL的酶底物TMB反应液（A液与B液等体积混匀，现配现用），作为酶的底物被催化发生反应，室温反应8 min，然后每孔加100 μL2 MH₂SO₄终止液终止反应；

结果判定：用酶标仪检测各孔的OD450nm值，记录数据并分析。

结果判定标准：当待检样品的OD450nm≧0.1435时，样品可判定是阳性，否则为阴性。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本产品构建原核表达载体pGEX-6P-1-N转化 E.coli Transetta（DE3）感受态细胞诱导表达可溶性IBV H120 N蛋白，相对于全病毒来说易于获得和纯化。

2、N基因具有高度的保守性，N蛋白抗原性好，且相对于全病毒来说更加安全。

3、本试剂盒具有成本低廉、使用简单方便、敏感性高且特异性强的优点，可以批量检测，为IBV抗体水平监测提供了一种可靠的检测手段。

附图说明

图1 PCR扩增IBV H120 N基因。

图2 pMD19-T-N重组载体的PCR鉴定。

图3 pGEX-6p-1-N重组载体的PCR鉴定。

图4 重组N蛋白可溶性表达的SDS-PAGE鉴定。

图5 重组N蛋白IPTG诱导浓度优化的SDS-PAGE鉴定。

图6 重组N蛋白诱导时间优化的SDS-PAGE鉴定。

图7 重组N蛋白纯化的SDS-PAGE鉴定。

图8 N蛋白的Western-bolt鉴定。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。

在以下实施例中，所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1 制备IBV H120毒株重组N蛋白

1、构建原核克隆载体pMD19-T-N和原核表达载体pGEX-6P-1-N

以提取IBV H120的总RNA为模板，Random Hexamer Primer 为引物，RT-PCR合成cDNA，具体步骤如下：

（1）在无酶管中加以下体系（反应体系A）

低速离心，将反应体系A放置于65 ℃恒温水浴锅中5 min，冰上放置1 min。

（2）再加入以下体系（反应体系B）

（3）低速离心，在PCR仪上进行反转录，程序为：25℃ 5min，42℃ 1h，70℃ 5min。将PCR产物cDNA 保存于-80℃备用。

PCR扩增N基因：

在微量离心管中加入以下体系

登陆NCBI，根据Genebank中已发表的IBV H120（accession number:FJ888351）的N基因序列，使用Primer 5.0设计关于N基因的上下游引物

(HP1: 5’-CCGGAATTCATGGCGAGCGGTAAGAC-3’

HP2: 5’-CCGCTCGAGTTACAACTCATTCTCTCCAAG-3’)，以cDNA为模板，PCR循环程序：95 ℃5 min，94 ℃45 s， 53 ℃ 45 s，72 ℃1 min20 s，35个循环以后；72 ℃5 min，4 ℃保存备用。PCR扩增IBV H120 N基因结果如图1所示。

将N基因与pMD-19T连接构建克隆载体pMD19-T-N；将N基因与pGEX-6p-1连接构建原核表达载体pGEX-6P-1-N。重组载体的PCR鉴定结果如图2、图3所示。

2、重组N蛋白pGEX-6p-1-N-Transetta（DE3）的表达与纯化

将连接后的重组质粒pGEX-6p-1-N，转化入100 μL E.coli Transetta(DE3)感受态细胞。挑取单克隆，接种于含有Amp与Crm的5 mL LB液体培养基内，37 ℃条件下220 rpm培养约14 h。将上述菌液以1:100的比例加入含有Amp与Crm的1000 mL液体LB培养基，37 ℃ 220rpm二次活化约3 h，至OD600nm为0.6~0.8。然后加入IPTG，使其终浓度为1 mmol/L，20 ℃条件下，220 rpm继续诱导。重组N蛋白诱导表达的SDS-PAGE鉴定如图4、图5、图6和图7所示。

重组N蛋白的纯化

（1）将诱导表达的1000 mL的pGEX-6p-1-N-Transetta(DE3)的菌液，4 ℃，5000 rpm离心15 min；

（2）将沉淀用预冷的1×PBS重新悬浮，3500 g 离心10 min，去上清；

（3）在沉淀里加一定量的裂解液（量取500 mL的1×PBS缓冲液，加入500 μL Triton混匀，0.45 μm滤器过滤）充分重悬。超声约20 min使菌体破碎，菌液透亮且均匀；

（4）4 ℃12000 rpm离心20 min。上清用0.45 µm的滤器过滤，冰上放置备用；

（5）装下垫片，吸取4 mL填料，待填料自然沉降，排净柱内以及侧壁上的气泡，装上垫片；

（6）依次用20%乙醇水溶液、约10倍柱体积的PBS、约10倍柱体积的2号裂解液平衡柱子；

（7）上样，控制流速为0.5 mL/min，然后依次用约30倍柱体积的2号裂解液冲洗和约30倍柱体积的PBS平衡柱子；

（8）15倍柱体积洗脱液洗脱，控制流速为0.5 mL/min；

（9）20%乙醇水溶液平衡柱子，4 ℃保存。

用GST柱纯化重组N蛋白，加入PreScission Protease切除GST标签，Western-blot检测N蛋白的抗原性，结果显示N蛋白有较好的抗原性。N蛋白的Western-bolt鉴定如图8所示。

实施例2 IBV H120N蛋白间接ELISA方法的步骤和优化

以实施例1制备的N蛋白（切去GST标签并纯化）作为试剂盒酶标板的包被抗原，优化并确定间接ELISA方法的最优工作条件，检测鸡血清中的抗体水平：

（1）用CBS将N蛋白（0.198 mg/ml）梯度倍比稀释至工作浓度，然后向96孔酶标板中每孔加入100 µL对酶标板进行包被，放在4 ℃条件下过夜，第二天取出用PBST冲洗3次并拍干；

（2）向96孔板中每孔加入200 µL5%脱脂奶（现配现用），37 ℃孵育2 h，拍干（可置于4℃短时间保存）；

（3）用PBS对阴性血清和阳性血清分别进行稀释，并设置PBS为空白对照，然后向96孔酶标板中每孔加入100µL，在37 ℃条件下孵育1 h后用PBST冲洗3次酶标板并拍干；

（4）用5%脱脂奶以1:5000的比例对羊抗鸡IgG-HRP进行稀释，然后在96孔酶标板中每孔加入100µL酶标二抗，在37 ℃条件下放置1 h后用PBST冲洗3次酶标板并拍干；

（5）最后向96孔酶标板中每孔加入100 µL的酶底物TMB反应液（A液与B液等体积混匀，现配现用）室温反应8 min，然后每孔加入100 μL2 M H₂SO₄终止液终止反应；

（6）迅速用酶标仪测定各孔的OD450nm值，记录数据，分析结果。

实施例3 试剂盒抗原最佳包被浓度和阴阳性血清最佳稀释倍数的确定

用pH9.6的CBS将N蛋白（0.198 mg/mL）梯度倍比稀释至浓度为4.95、2.48、1.24、0.62、0.31、0.15、0.08、0.04µg/mL包被酶标板；用PBS对阴性血清和阳性血清分别进行梯度倍比稀释，稀释倍数为4000、8000、16000、32000、64000，并用PBS作空白对照，通过棋盘法测定阴阳性血清最佳稀释度，确定抗原最佳包被浓度和阴阳性血清最佳稀释倍数。选择阳性血清OD450nm值约为1.0且阴性血清OD450nm值较低的结果对应的包被抗原的稀释度即为抗原包被的最佳浓度，对应的阴性和阳性血清稀释度为阴性和阳性血清的最佳稀释倍数。

表1间接ELISA法探索最佳抗原包被浓度和阴阳性血清最佳稀释度OD_450nm值

从表1中可以看出，试剂盒抗原最佳包被浓度为0.62μg/mL，阴阳性血清最佳稀释倍数为1:16000。

实施例4 试剂盒ELISA方法阴阳性临界值的确定

根据上述实验中优化确定的最佳工作条件，使用间接ELISA试验检测21份SPF鸡血清（每份SPF血清做4个重复）作为一抗孵育，进行间接ELISA实验（步骤同上），并设置阳性对照和阴性对照，PBS做空白对照。对获得的测试数据进行统计分析，计算所得数据OD450nm的平均值及标准偏差，并计算得出判断标准即阴阳性临界值（SPF样本OD450nm平均值+3×标准偏差)。

表2间接ELISA法检测鸡血清的OD450nm值（n=4）

经计算得SPF鸡血清OD450nm平均值为0.096，标准偏差为0.015845，阴阳性临界值=0.096+3×0.015845=0.1435,当待检鸡血清样品的OD450nm≧0.1435时，可断定为阳性，即感染了IBV，否则为阴性即未感染IBV。

实施例5 间接ELISA方法进行特异性实验-交叉反应实验

采取实施例5中确定的最佳工作条件，将禽传染性囊病病毒（IBDV）、新城疫病毒（NDV)、禽流感病毒（AIV）血清和IBV阴阳性血清通过ELISA方法测定OD450nm值，每组做6个重复，计算平均值并与临界值比对。IBDV、NDV以及AIV阳性血清OD450nm值均小于阴阳性临界值0.1435，均为阴性，表明IBDV、NDV、AIV血清和IBV纯化N蛋白无交叉反应。

表3 IB抗体检测ELISA对不同病毒血清抗体检测结果

实施例6 试剂盒保存期试验

将N蛋白包被的酶标板分别置于4 ℃和室温条件下保存，分别在第1个月、第2、第3、第4、第5个月后，使用试剂盒对现有IBV阳性样品和SPF阴性样品进行检测，方法步骤同上，测试试剂盒的保存期。

经过对试剂盒进行检测，4℃条件下存放，阳性率稳定，阳性样品以及阴性样品的结果与先前保持一致，而室温条件下阳性率显著下降。这说明本发明制备的基于鸡传染性支气管炎病毒重组N蛋白的ELISA抗体检测试剂盒在4℃条件下可以稳定保存，在室温条件下保存超过一个月其有效性显著降低。

表4 试剂盒保存期试验结果

通过上述实施例可以证明，本发明提供的一种基于鸡传染性支气管炎病毒重组N蛋白的ELISA抗体检测试剂盒，具有使用简单方便、敏感性高且特异性强的优点，可以进行批量检测IBV抗体，是IBV抗体水平检测的可靠工具。

Organization Applicant

----------------------

Street :

City :

State :

Country :

PostalCode :

PhoneNumber :

FaxNumber :

EmailAddress :

<110> OrganizationName : 郑州大学

Application Project

-------------------

<120> Title : 一种鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白N ELISA抗体检测试剂盒

<130> AppFileReference : 2020

<140> CurrentAppNumber :

<141> CurrentFilingDate : ____-__-__

Sequence

--------

<213> OrganismName : 人工序列

<400> PreSequenceString :

atggcgagcg gtaagacaac tgggaagaca gacgccccag cgccagtcat caaactagga 60

gggtcaaaac cacctaaagt tggttcttct ggaaatgcat cttggtttca agcactaaaa 120

gccaagaagt taaattcacc tcctcctaag tttgaaggta gcggcgttcc tgataatgaa 180

aatcttaaat taagccagca acatgggtac tggagacgtc aagccaggta caagccaggt 240

aaaggcggaa gaaaatcagt cccagatgct tggtacttct attacactgg aacaggacca 300

gccgctgacc tgaattgggg tgatagccaa gatggtatag tgtgggtttc tgcaaagggt 360

gctgatacta aatctagatc taaccagggt acaagggatc ctgataagtt tgaccaatac 420

ccgctacgat tctcagatgg aggacctgat ggtaatttcc gttgggactt cattccaata 480

aatcgtggta ggagtggaag atcaacagcg gcttcatcag cagcatctag tagagcaccg 540

tcgcgtgatg gctcgcgtgg acgtagaagc ggagctgaag atgatcttat agctcgtgca 600

gcaaagatca ttcaggatca gcagaagaag ggttctcgca ttactaaagc taaggccgat 660

gaaatggctc atcgccggta ttgtaagcgt actatcccac ctggttataa ggttgatcaa 720

gtatttggtc cccgtactaa atgtaaggag ggaaattttg gtgatgacaa gatgaatgag 780

gagggtatta aggatgggcg cgttacagca atgctcaacc tagtccctag cagccatgct 840

tgtctttttg gaagtagagt gacgcccaaa cttcaaccag atgggctgca cttgagattt 900

gaatttacta ctgtggtttc acgtgatgat ccgcagtttg ataattatgt gaaaatttgt 960

gatcagtgtg tcgatggtgt agggacgcgt ccaaaagacg atgaaccgag accaaagtca 1020

cgcccaaatt caagacctgc tacaagaaca agttctccag cgccaagaca acagcgtcaa 1080

aagaaggaga agaagtcaaa gaagcaggat gatgaagtag ataaggcatt gacctcagat 1140

gaggagagga acaatgcaca gctggaattt gatgatgaac ccaaggtgat taactggggg 1200

gagtcagcac ttggagagaa tgagttgtaa 1230

<212> Type : DNA

<211> Length : 1230

SequenceName : 1330

SequenceDescription :

Sequence

--------

<213> OrganismName : 人工序列

<400> PreSequenceString :

masgkttgkt dapapviklg gskppkvgss gnaswfqalk akklnspppk fegsgvpdne 60

nlklsqqhgy wrrqarykpg kggrksvpda wyfyytgtgp aadlnwgdsq dgivwvsakg 120

adtksrsnqg trdpdkfdqy plrfsdggpd gnfrwdfipi nrgrsgrsta assaassrap 180

srdgsrgrrs gaeddliara akiiqdqqkk gsritkakad emahrryckr tippgykvdq 240

vfgprtkcke gnfgddkmne egikdgrvta mlnlvpssha clfgsrvtpk lqpdglhlrf 300

efttvvsrdd pqfdnyvkic dqcvdgvgtr pkddeprpks rpnsrpatrt sspaprqqrq 360

kkekkskkqd devdkaltsd eernnaqlef ddepkvinwg esalgenel 409

<212> Type : DNA

<211> Length : 409

SequenceName : 409

SequenceDescription :

Claims

1.一种基于鸡传染性支气管炎病毒重组N蛋白的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：包括用于包被酶标板的IBV H120毒株重组N蛋白。

2.根据权利要求1所述的基于鸡传染性支气管炎病毒重组N蛋白的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述IBV H120毒株重组N蛋白是由IBV H120的N基因序列设计引物扩增并构建表达菌株进行诱导表达。

3.根据权利要求2所述的基于鸡传染性支气管炎病毒重组N蛋白的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述IBV H120毒株重组N蛋白通过原核表达系统E.coli Transetta表达，首先构建原核克隆载体pMD19-T-N，然后再构建原核表达载体pGEX-6P-1-N及诱导表达和纯化。

4.根据权利要求3所述的基于鸡传染性支气管炎病毒重组N蛋白的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：构建所述原核克隆载体pMD19-T-N时，首先设计引物RT-PCR扩增IBV H120N基因，然后将N基因与pMD-19-T进行连接。

5.根据权利要求3所述的基于鸡传染性支气管炎病毒重组N蛋白的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：构建所述原核表达载体pGEX-6P-1-N时，以pMD19-T-N为模板，PCR扩增N基因，将N基因与pGEX-6p-1连接。

6.根据权利要求1所述的基于鸡传染性支气管炎病毒重组N蛋白的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括酶标试剂，封闭液，洗涤液，稀释液，阳性对照样品，阴性对照样品，显色液和终止液。

7.根据权利要求1所述的基于鸡传染性支气管炎病毒重组N蛋白的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述酶标试剂为HRP标记的羊抗鸡IgG；所述封闭液为含5％脱脂奶的PBST；所述洗涤液为含0.05％Tween-20的PBST；所述稀释液为PBS；所述阳性对照样品为IBV 阳性鸡血清；所述阴性对照样品为阴性SPF鸡血清；所述显色液为酶底物TMB反应液；所述终止液为2M H₂SO₄。