CN113063939A - 一种传染性支气管炎病毒的双抗夹心elisa检测试剂盒和检测方法以及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种传染性支气管炎病毒的双抗夹心ELISA检测试剂盒和检测方法以及应用，属于生物技术领域。为了有效的提高传染性支气管炎病毒检测的灵敏度、特异性和总符合率。本发明一种传染性支气管炎病毒的双抗夹心ELISA检测试剂盒和方法，用纯化的单克隆抗体4F10株作为固相抗体结合在固相载体表面，单克隆抗体6H3株作为酶标抗体，建立一种能够快速检测传染性支气管炎病毒抗原的双抗夹心ELISA方法。该方法简便、特异、敏感、准确率高，能够在实际生产中快速诊断鸡群是否感染鸡传染性支气管炎病毒，为该病的免疫防控提供依据。

Description

一种传染性支气管炎病毒的双抗夹心ELISA检测试剂盒和检 测方法以及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种传染性支气管炎病毒的双抗夹心ELISA检测试剂盒和检测方法以及应用。

背景技术

鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起鸡的一种急性、高度接触传染性呼吸道传染病，本病呈世界性分布，是严重危害养禽业的最主要疫病之一。传染性支气管炎感染鸡后，病毒原发和主要的增殖部位为呼吸道上皮细胞，因此该病初期发病的主要特征是病鸡咳嗽、打喷嚏、气管啰音。随着病程的发展，病毒进一步呈现出更加广泛的组织嗜性，但不同病毒株往往呈现出不同的致病性。根据 IBV感染后期病毒对组织的亲嗜性、损害的主要器官，将该病分为不同的致病型，主要包括呼吸道致病型、肾脏病变型、肠病变型、生殖道病变型等，可见传染性支气管炎具有多种不同组织嗜性和致病特点，在临床上经常与其他疾病相混淆，仅依据临床和组织学变化对传染性支气管炎作出客观判断存在很大难度，这便对准确判定病原因造成巨大障碍，也便对疫病的有效防控造成困难。因此，实验室病原学检测在疫病的确诊过程中起着重要的作用。目前实验室常用的病原学检测方法包括病毒分离和鉴定、RT-PCR法鉴定、RT-qPCR 法以及核酸探针法，其中病毒分离和鉴定方法是准确鉴定鸡传染性支气管炎病毒的方法，也是病原学诊断该病的金标准，但该方法费时费力，成本较高，严重阻碍该方法在生产实践中的应用。而RT-PCR法鉴定、RT-qPCR法虽然具有敏感、快速检测病原核酸的特点，但对于操作人员的技术要求较高，容易在实验操作中造成假阳性，因此也不在临床上推广应用。核酸探针法虽然检测快速，但敏感性显著低于其他方法，这也限制了该方法在实践中的应用。

发明内容

本发明的目的是为了有效的提高传染性支气管炎病毒检测的灵敏度、特异性和总符合率，本发明提供一种传染性支气管炎病毒的双抗夹心ELISA检测试剂盒，所述双抗夹心ELISA检测试剂盒包括以下成分：固相结合单克隆抗体4F10和酶标单克隆抗体6H3。

进一步地限定，所述固相结合抗体4F10和酶标抗体6H3的浓度为5μg/ml。

进一步地限定，所述夹心ELISA检测试剂盒还包括10×PBST浓缩洗涤液、10×样品稀释液、底物显色液、终止液、封闭液、标准阳性对照、标准阴性对照和HRP标记的单克隆抗体。

进一步地限定，所述PBST浓缩洗涤液为体积分数为1％-5％Tween-20、质量体积比为8％(mg/mL)氯化钠、质量体积比为0.2％(mg/mL)氯化钾、质量体积比为3％(mg/mL) 磷酸氢二钠和质量体积比为0.2％(mg/mL)磷酸二氢钾的水溶液，pH＝7.4；所述10×样品稀释液为上述10×PBST浓缩洗涤液加入体积分数为1％Triton-X100的溶液，pH＝7.4；所述底物显色液的成分为10mg/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺磷酸缓冲溶液；所述封闭液为质量体积比为1％-5％(mg/mL)BSA。

进一步地限定，所述标准阳性对照为OD630吸光值在0.1-0.8之间的传染性支气管炎病毒抗原阳性稀释液；所述标准阴性对照为OD630吸光值在0.03-0.1之间的传染性支气管炎病毒抗原阴性稀释液。

上述的传染性支气管炎病毒的双抗夹心ELISA检测试剂盒在制备诊断传染性支气管炎病毒试剂中的应用。

本发明还提供了一种非诊断目的检测传染性支气管炎病毒的方法，所述方法的步骤如下：

(1)将酶标单克隆抗体6H3加入到固定了单克隆抗体4F10的96孔酶联反应板中，加入酶标单克隆抗体6H3100μl/孔，置4℃下作用12小时；

(2)然后加入洗涤液，250μl/孔，洗涤3次；

(3)然后加入封闭液，200μl/孔，置37℃下封闭2小时，再加入洗涤液，250μl/孔，洗涤3次；

(4)然后用样品稀释液将IBV抗原标准品进行相应稀释，100μl/孔，置37℃温箱孵育60分钟，加入洗涤液，250μl/孔，洗涤3次；

(5)然后加入HRP标记的单克隆抗体，100μl/孔，置37℃温箱孵育60分钟，加入洗涤液，250μl/孔，洗涤3次；

(6)然后加入显色液，100μl/孔，置室温避光孵育30分钟；

(7)最后加入终止液，100μl/孔，在630nm的波长下读数，并记录结果。

有益效果：本发明利用优选的单克隆抗体4F10株和6H3株分别作为固相结合抗体和酶标抗体，建立一种简便、特异的双抗夹心ELISA方法。

本发明还为检测鸡传染性支气管炎病毒抗原提供了特异、敏感、快速、操作简便的试剂组合，能够在实际生产中快速诊断鸡群样本是否感染鸡传染性支气管炎病毒，为准确诊断鸡群是否感染传染性支气管炎病毒提供依据，为传染性支气管炎疫病的有效防控提供参考。

附图说明

图1为37℃、0.5mmol/L IPTG诱导条件下N-GST融合蛋白的表达分析；其中，M 是蛋白质标准分子量；1是未诱导阳性菌；2是诱导后菌体；3是诱导2h后菌体上清；4 是诱导3h后菌体上清；5是诱导4h后菌体上清；6是诱导5h后菌体上清；7是诱导6h 后菌体上清；

图2为N-GST融合蛋白纯化结果；其中，M是蛋白质标准分子量，1是诱导后菌体上清；2是过柱流穿液；3是过柱流穿液；4是Wash Buffer洗脱；5是Elution Buffer第一次洗脱；6是Elution Buffer第二次洗脱；

图3为4种单克隆抗体纯化后结果；其中，M是蛋白质标准分子量，1是单克隆抗体2D2株；2是单克隆抗体4F10株；3是单克隆抗体6D10株；4是单克隆抗体6H3株。

具体实施例

IBV毒株为tl/CH/LDT3/03株记载在Han,Z.,Zhang,T.,Xu,Q.,Gao,M.,Chen,Y.,Wang,Q.,Zhao,Y.,,Y.,Li,H.,Kong,X.and Liu,S.Altered pathogenicity of a tl/CH/LDT3/03 genotype infectious bronchitis coronavirus due to naturalrecombination in the 5′-17kb region of the genome.Virus Res.2016 Feb 2；213:140–148.)

克隆载体pMD18-T vector(购自TaKaRa公司)，表达载体为pET-30a和pGEX-6p-1(购自Novagen公司)。

实施例1.

一、固相结合抗体和酶标抗体的制备

1.重组N蛋白的表达、鉴定与纯化

通过对IBV tl/CH/LDT3/03毒株N蛋白基因序列的分析(Genebank ID：KT852992)，先利用Trizol方法提取IBV tl/CH/LDT3/03毒株的总RNA，利用One-step RT-PCR进行反转录，引物如下：

NF:5'-CGCGGATCCATGGCGAGCGGTAAAGCAAC-3'，序列如SEQ ID NO.1所示。

NR:5'-GCGTCGACTTATCAAAGTTCATTTTCACCAAG-3'，序列如SEQ ID NO.2所示。

将扩增出的N片段连接pMD18-T载体进行测序。测序正确后，利用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶切割，酶切产物与经BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶切割的pGEX-6p-1表达载体相连接，构建重组质粒pGEX-6p-1-N，测序正确后转化至大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3) 中，进行蛋白表达与纯化。

融合蛋白N-GST的诱导：挑取含阳性重组质粒pGEX-6p-1-N的Rosetta(DE3)单个菌落接种于含100μg/mlAmp的LB液体培养基中，37℃过夜培养。次日取上述过夜培养物以1％的比例接种于新鲜含100μg/mlAmp的LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h，当OD600至约0.4时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，37℃继续培养，分别诱导培养2 h、4h、6h、8h。另设对照组不加IPTG诱导，其余条件相同。诱导结束后分别取诱导组和对照组培养物1ml加入1.5ml离心管中，室温12000r/m离心1min收集菌体。弃上清，用100μl的预冷PBS(pH7.4)洗涤菌体沉淀，室温12000r/m离心1min后弃上清。向诱导组菌体中加入100μl的预冷PBS(pH7.4)悬浮后超声破碎，12000r/m离心10min，吸取上清至另一离心管中，向沉淀中加入100μl预冷PBS(pH7.4)重悬。同时对照组用100 μl预冷PBS(pH7.4)重悬。向诱导组上清、诱导组沉淀和对照组菌体悬浮液中加入1/4 体积5×SDS样品缓冲液(含DTT)，100℃煮沸5min。取15μl样品进行12％SDS-PAGE。电泳后，经考马斯亮蓝R-250染色，甲醇-冰乙酸脱色液脱色观察结果以确定目的蛋白的表达情况，分析诱导时间对N-GST融合蛋白可溶性的影响。

融合蛋白N-GST的纯化：挑取含阳性重组质粒pGEX-6p-1-N的Rosetta单菌落，接种于含100μg/mlAmp的LB液体培养基中，37℃培养过夜。次日取上述过夜培养物以1％的比例接种于1L含100μg/mlAmp的LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h，当OD600 值至约0.4时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，37℃继续培养4h。培养结束后取出培养物于4℃、12000r/min离心30min，收集菌体。弃上清，每50ml初始菌液加入1ml PBS (pH7.4)，重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，置于冰上搅动30min。在冰上高强度超声破碎，10sec为一组，每组间隔10sec。破碎后，10000g 4℃离心30min，收集上清，利用GST Bind树脂纯化重组N蛋白。上清加入到GST Bind柱中(将流速控制在每小时10倍柱体积为宜，如果流速过快，洗脱的目的蛋白中会混入较多的杂质)，用 Bind/Wash buffer(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM NaH₂PO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH7.3) 洗去杂蛋白后，再用Elutionbuffer(50mM Tris-HCl，10mM reducedglutathione，pH8.0) 洗脱，收集每步中穿过组分置于冰上待后续分析。

2.实验结果

1)结果如图1所示，构建的表达重组N蛋白的基因工程菌经IPTG诱导，在不同时间点取样检测蛋白的表达，结果显示从诱导后2～6h均能诱导重组N蛋白在大肠杆菌中表达

2)如图2所示，通过GST标签蛋白纯化树脂进行重组N蛋白的纯化，结果诱导菌液通过纯化树脂，有效地纯化出工程菌表达分泌的蛋白。

3.单克隆抗体的制备

动物免疫：将IBV病毒株tl/CH/LDT3/03进行超速离心浓缩(50-100μg/只)，用PBS稀释至200μl，用等体积的弗氏佐剂进行乳化(初次用弗氏完全佐剂免疫，之后用弗氏不完全佐剂免疫)，皮下多点免疫6-8周龄的Balb/c小鼠，每两周免疫一次。采用病毒和重组N蛋白同时免疫的方法，刺激机体的免疫系统。第三次免疫2周后采用腹腔注射加强免疫，3天后进行融合。为保证免疫的效果，可在第三次免疫后7天尾静脉采血进行效价检测。

饲养细胞的制备：取约8周龄Balb/c小鼠，脱颈椎致死后放入75％的酒精浸泡5min左右以消毒然后转入超净工作台。用剪刀将小鼠腹部皮肤剪开一个小口，然后用镊子钝性分离暴露出腹膜。取5ml注射器吸取一定体积的完全培养基注射到小鼠腹腔中，用酒精棉球对小鼠腹部按摩，使腹腔内巨噬细胞充分游离到培养基中，再将培养基吸出打到平皿里分装到96孔细胞培养板中，每孔100μl。饲养细胞的密度约为10⁵个/ml。

细胞融合：融合前一周将冻存的SP2/0细胞复苏，放入37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养。将脾细胞与SP2/0细胞按10：1的比例混合，800rpm离心10min，吸尽上清以免影响融合效率，轻轻弹击离心管底部使细胞尽量均匀的铺满离心管底，然后于90s内缓缓向其中加入1ml融合剂PEG1450，边加边旋转离心管。37℃静置90s后，800rpm离心 10min。弃去上清，用血清浓度为20％的HAT培养基将沉淀悬起，分装到已经加入饲养细胞的96孔细胞培养板内，每孔100μl。

杂交瘤细胞的筛选与克隆：将融合的细胞放入37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养，并用显微镜定期观察其生长状态。融合后5天更换一半的HAT培养基，8-10天换成HT 培养基。当杂交瘤细胞在板底生长面积达到板底面积的1/10时即可取其上清检测特异性抗体。

用重组N蛋白包被ELISA板进行检测上清特异性抗体，步骤如下：包被前用分光光度计测量重组蛋白的浓度，用包被液(碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释蛋白至其浓度为 0.1mg/ml，每孔包被100μl，4℃过夜；用PBST洗板3次，每次洗涤均将板倒扣于干燥滤纸上将液体拍干；加入封闭液(0.5％BSA的PBS缓冲液)，每孔200μl，37℃作用2h，用PBST洗板3次；加入待检单抗上清，每孔100μl，37℃作用1h，用PBST洗板3次；加入HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃作用1h，用PBST洗板3次；加入100μl TMB显色液，待其显色后用50μl 2M硫酸终止，在波长490nm下用酶标仪读其OD值。结果判定：样品的OD值与阴性对照的OD值之比(P/N值)，当P/N值大于2时，即判断样品为阳性。

对阳性孔细胞运用有限稀释法进行单克隆化，步骤如下：在单克隆化前一天预先做好饲养细胞，每个阳性孔一板；取阳性孔细胞在每块板的第一排对其进行倍比稀释，八个孔的稀释度依次为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256，培养细胞过夜；用显微镜观察这些孔，数出其中成对的细胞，找出最接近44对细胞的孔，将其中的细胞用培养基稀释后分装到其余88孔内；待细胞生长到板底面积的1/10时，取上清检测。经过三次克隆后，得到4株稳定分泌IBVN蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞系，分别命名为2D2(已记载在文献：“鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体制备及抗原表位鉴定，于丹， 2011年，延边大学硕士论文”中)、4F10(已记载在文献：“鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的制备及其免疫学特性分析，何小卫，2010年，中国农业科学院研究生院硕士论文”中)、6D10(已记载在文献：“鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其表位的鉴定，宋扬，2010年，中国农业科学院研究生院硕士论文”中)和6H3(已记载在文献：“鸡传染性支气管炎病毒核蛋白抗原表位鉴定与单链抗体初步研究，徐佳， 2009年，中国农业科学院研究生院博士论文”中)。

腹水制备与单克隆抗体纯化：取8-10周龄的Balb/c鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂，一周后向其腹腔内注射杂交瘤细胞(0.5-1×10⁶个/只)。待小鼠腹部膨大至影响其正常生理活动时，抽取腹水，将腹水10000rpm离心取上清，-20℃保存备用。

单克隆抗体纯化方法步骤如下，将Protein G填料装入合适的层析柱，用10倍柱体积的结合/洗涤缓冲液(20mM磷酸钠，pH7.0)平衡；取1-2ml腹水，用结合/洗涤缓冲液(20mM磷酸钠，pH7.0)稀释4-5倍，用0.22μm滤器过滤，将样品加到平衡好的层析柱中；用 10-15倍柱体积的结合/洗涤缓冲液(20mM磷酸钠，pH7.0)清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白；用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸，pH2.5-3.0)进行洗脱5-6次，每次洗脱体积1ml，收集流出液。洗脱后立即用中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH9.0)进行中和，每1ml洗脱流出液加入约50μl中和缓冲液；用分光光度计测定每次洗脱后的浓度，最终将单克隆抗体浓度调整为1mg/ml，置于-70℃保存备用。取15μl浓度为1mg/ml的单克隆抗体进行12％ SDS-PAGE电泳后，经考马斯亮蓝R-250染色，甲醇-冰乙酸脱色液脱色观察结果，结果如图3所示。

HRP标记单克隆抗体：HRP标记试剂盒为Abcam公司商品化试剂盒(货号：ab102890)，实验步骤如下：取1mg/ml的单克隆抗体，加100μl的修饰剂(Modifierreagent)，轻轻混匀；打开HRP Conjugation Mix管，加入混合过修饰剂的单克隆抗体，用移液器轻轻重悬混匀，盖上盖子后，置于室温(20-25℃)避光作用3小时；孵育3小时后，加入100μl的淬灭剂(Quencher reagent)，轻轻混匀，避光作用30分钟后，将标记好的单克隆抗体稀释至相应倍数，保存备用。

二、鸡传染性支气管炎病毒抗原的双抗夹心ELISA检测方法的建立

通过对影响ELISA方法的各种因素的筛选优化，确定了鸡传染性支气管炎病毒抗原双抗夹心ELISA检测方法的最适反应条件，结果见表1-5。

表1最佳单克隆抗体包被浓度与待检抗原最佳稀释度的确定(P/N值)

表2最佳封闭液与封闭时间的确定(P/N值)

表3待检抗原最佳孵育时间的确定(P/N值)

表4酶标抗体最佳孵育时间的确定(P/N值)

表5底物溶液最佳反应时间的确定(P/N值)

分别将4个单克隆抗体，2D2、4F10、6D10和6H3作为固相结合抗体，4个单克隆抗体作为酶标抗体，按照ELISA最适反应条件来优选这些组合方法的检测效果。步骤如下：用包被液(碳酸盐缓冲液，pH9.6)将纯化的单克隆抗体稀释至5μg/ml，加入到96 孔酶联反应板中，100μl/孔，置4℃下作用12小时，甩去孔内液体，加入洗涤液(PBST)， 250μl/孔，洗涤3次，甩去孔内液体，拍干；加入封闭液(1-5％BSA)，200μl/孔，置37℃下封闭2小时，甩去孔内液体，加入洗涤液(PBST)，250μl/孔，洗涤3次，甩去孔内液体，拍干；用样品稀释液将IBV抗原标准品进行相应稀释，100μl/孔，置37℃温箱孵育 60分钟，甩去孔内液体，加入洗涤液(PBST)，250μl/孔，洗涤3次，甩去孔内液体，拍干；HRP标记的单克隆抗体(1:5000倍稀释)，100μl/孔，置37℃温箱孵育60分钟, 甩去孔内液体，加入洗涤液(PBST)，250μl/孔，洗涤3次，甩去孔内液体，拍干；加入底物溶液KPL Blue TMB显色液，100μl/孔，置室温(15～25℃)避光孵育30分钟；加入终止液TMB BlueSTOP Solution 100μl/孔，轻微震荡混合均匀后，在630nm的波长下读数(应在加入终止液后15分钟内完成读数)，并记录结果。

结果如表6所示，以单克隆抗体4F10作为固相结合抗体，单克隆抗体6H3作为酶标抗体的鸡传染性支气管炎病毒抗原双抗夹心ELISA方法，阳性样品的反应值显著高于其他组，同时阴性样品的反应值显著低于其他组，可见检测特异性和反应性显著优于其它单克隆抗体组合的鸡传染性支气管炎病毒抗原双抗夹心ELISA方法。

表6鸡传染性支气管炎病毒抗原的双抗夹心ELISA检测方法的优选

利用以下实验验证实验效果：将实施例1的双抗夹心ELISA检测方法与鸡传染性支气管炎病毒分离方法同时检测500份组织样品，分析该方法的敏感性、特异性和符合率。

相对敏感性(％)＝{阳性数/(阳性数+假阴性数)}×100％

相对特异性(％)＝{阴性数/(阴性数+假阳性数)}×100％

总符合率(％)＝{(阳性数+阴性数)/检测总数}×100％

实验结果显示，用建立的双抗夹心ELISA方法检测500份不同组织样品，检测结果为阳性381份，阴性119份；鸡传染性支气管炎病毒分离方法检测结果为阳性389份，阴性111份，具体数据见表7，由此可知建立的双抗夹心ELISA方法的相对敏感性、相对特异性和总符合率分别是97.1％、97.3％和97.2％。因此，本发明中4F10单克隆抗体作为固相结合抗体，6H3单克隆抗体作为酶标抗体组合而成的双抗夹心ELISA检测方法与病毒分离方法相比，其敏感性显著高于其他组合、特异性同样显著好于其他组合，因此将该组合作为本发明的优选方案。

表7双抗夹心ELISA方法和IBV病毒分离方法检测组织样品结果

对比例1.多克隆抗体的双抗体夹心ELISA检测传染性支气管炎病毒方法

制备多克隆抗体，取纯化后的IBVN蛋白500μg/只的剂量与弗氏完全佐剂混合乳化，经颈背部皮下多点注射首次免疫兔，2星期后进行第二次免疫，方法与第一次相同。测定兔免疫血清的效价达到1:10000后进行心脏采血(测定效价按以下方法进行：用重组N 蛋白包被ELISA板进行检测上清特异性抗体，步骤如下：包被前用分光光度计测量重组蛋白的浓度，用包被液(碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释蛋白至其浓度为0.1mg/ml，每孔包被100μul，4℃过夜；用PBST洗板3次，每次洗涤均将板倒扣于干燥滤纸上将液体拍干；加入封闭液(0.5％BSA的PBS缓冲液)，每孔200μl，37℃作用2h，用PBST洗板3次；加入1:10000稀释后的待检多克隆抗血清，每孔100μl，37℃作用1h，用PBST洗板3次；加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗，37℃作用1h，用PBST洗板3次；加入100μl TMB显色液，待其显色后用50μul 2M硫酸终止，在波长490nm下用酶标仪读其OD值。当P/N 值大于2时，即判断样品效价达到1:10000)，37℃水浴析出血清，1000rpm离心30min 后收集血清，即为多克隆抗体血清。之后利用Protein G亲和层析树脂进行纯化，方法同上单克隆抗体纯化方法，得到多克隆抗体。

以上述得到的多克隆抗体作为固相结合抗体，分别以单克隆抗体2D2株、单克隆抗体4F10株、单克隆抗体6D10株以及单克隆抗体6H3株作为酶标抗体，依照实施例1检测方法对已知IBV阳性样品1、IBV阳性样品2(IBV阴性样品1和IBV阴性样品2分别进行检测，结果表明，以多克隆抗体作为固相结合抗体，单克隆抗体2D2株、4F10株、 6D10株以及6H3株作为酶标抗体组合而成的鸡传染性支气管炎病毒抗原双抗夹心ELISA 方法，无论阳性样品还是阴性样品的反应值显著高于其他组，可见其特异性较优选的单克隆抗体组合的鸡传染性支气管炎病毒抗原双抗夹心ELISA方法差。同时对500份不同组织样品进行检测，具体数据见表8-13，由此可知以多克隆抗体作为固相结合抗体，以2D2 作为酶标抗体建立的双抗夹心ELISA方法的相对敏感性、相对特异性和总符合率分别是 93.8％、83.8％和91.6％；以多克隆抗体作为固相结合抗体，以4F10作为酶标抗体建立的双抗夹心ELISA方法的相对敏感性、相对特异性和总符合率分别是94.1％、85.6％和 92.2％；以多克隆抗体作为固相结合抗体，以6D10作为酶标抗体建立的双抗夹心ELISA 方法的相对敏感性、相对特异性和总符合率分别是92.5％、81.1％和90％；以多克隆抗体作为固相结合抗体，以6H3作为酶标抗体建立的双抗夹心ELISA方法的相对敏感性、相对特异性和总符合率分别是93.1％、89.2％和92.2％。结果表明，以多克隆抗体作为固相结合抗体的特异性差，阴性样品背景值较高，符合率低，假阳性多。因此，本发明中涉及的双抗夹心ELISA检测方法与其他方法相比更优。

表8鸡传染性支气管炎病毒抗原的双抗夹心ELISA检测方法的优选

表9对比例双抗(以多克隆抗体作为固相结合抗体，单克隆抗体2D2株作为酶标抗体组合)夹心ELISA 方法和IBV病毒分离方法检测组织样品结果

表10对比例双抗(以多克隆抗体作为固相结合抗体，单克隆抗体4F10株作为酶标抗体组合)夹心 ELISA方法和IBV病毒分离方法检测组织样品结果

表11对比例双抗(以多克隆抗体作为固相结合抗体，单克隆抗体6D10株作为酶标抗体组合)夹心 ELISA方法和IBV病毒分离方法检测组织样品结果

表12对比例双抗(以多克隆抗体作为固相结合抗体，单克隆抗体6H3株作为酶标抗体组合)夹心ELISA 方法和IBV病毒分离方法检测组织样品结果

表13鸡传染性支气管炎病毒抗原的双抗夹心ELISA检测方法符合率的比较

对比例2.其他单抗组合双抗夹心ELISA方法符合率

将实施例1的双抗夹心ELISA检测方法与鸡传染性支气管炎病毒分离方法同时检测 500份组织样品，分析该方法的敏感性、特异性和符合率。

相对敏感性(％)＝{阳性数/(阳性数+假阴性数)}×100％

相对特异性(％)＝{阴性数/(阴性数+假阳性数)}×100％

总符合率(％)＝{(阳性数+阴性数)/检测总数}×100％

实验结果如表14所示，除优选组合以外的双抗夹心ELISA方法其敏感性、特异性和符合率均低于优选的双抗夹心ELISA方法，因此，本发明中涉及的双抗夹心ELISA方法敏感性高、特异性好。

表14不同组合的双抗夹心ELISA方法和IBV病毒分离方法检测组织样品的相对敏感性、相对特异性和总符合率结果

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈

尔滨分中心)

<120> 一种传染性支气管炎病毒的双抗夹心ELISA检测试剂盒和检测方法以及应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> NF

<400> 1

cgcggatcca tggcgagcgg taaagcaac 29

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> NR

<400> 2

gcgtcgactt atcaaagttc attttcacca ag 32

Claims (7)

1.一种传染性支气管炎病毒的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述双抗夹心ELISA检测试剂盒包括以下成分：固相结合单克隆抗体4F10和酶标单克隆抗体6H3。

2.根据权利要求1所述的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述固相结合抗体4F10和酶标抗体6H3的浓度为5μg/ml。

3.根据权利要求1所述的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述夹心ELISA检测试剂盒还包括10×PBST浓缩洗涤液、10×样品稀释液、底物显色液、终止液、封闭液、标准阳性对照、标准阴性对照和HRP标记的单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述PBST浓缩洗涤液为体积分数为1％-5％Tween-20、质量体积比为8％(mg/mL)氯化钠、质量体积比为0.2％(mg/mL)氯化钾、质量体积比为3％(mg/mL)磷酸氢二钠和质量体积比为0.2％(mg/mL)磷酸二氢钾的水溶液，pH＝7.4；所述10×样品稀释液为上述10×PBST浓缩洗涤液加入体积分数为1％Triton-X100的溶液，pH＝7.4；所述底物显色液的成分为10mg/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺磷酸缓冲溶液；所述封闭液为质量体积比为1％-5％(mg/mL)BSA。

5.根据权利要求3所述的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述标准阳性对照为OD630吸光值在0.1-0.8之间的传染性支气管炎病毒抗原阳性稀释液；所述标准阴性对照为OD630吸光值在0.03-0.1之间的传染性支气管炎病毒抗原阴性稀释液。

6.权利要求1-5任意一项所述的双抗夹心ELISA检测试剂盒在制备诊断传染性支气管炎病毒试剂中的应用。

7.一种非诊断目的检测传染性支气管炎病毒的方法，其特征在于，所述方法的步骤如下：

(1)将酶标单克隆抗体6H3加入到固定了单克隆抗体4F10的96孔酶联反应板中，加入酶标单克隆抗体6H3100μl/孔，置4℃下作用12小时；

(2)然后加入洗涤液，250μl/孔，洗涤3次；

(3)然后加入封闭液，200μl/孔，置37℃下封闭2小时，再加入洗涤液，250μl/孔，洗涤3次；

(4)然后用样品稀释液将IBV抗原标准品进行相应稀释，100μl/孔，置37℃温箱孵育60分钟，加入洗涤液，250μl/孔，洗涤3次；

(5)然后加入HRP标记的单克隆抗体，100μl/孔，置37℃温箱孵育60分钟，加入洗涤液，250μl/孔，洗涤3次；

(6)然后加入显色液，100μl/孔，置室温避光孵育30分钟；

(7)最后加入终止液，100μl/孔，在630nm的波长下读数，并记录结果。

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