CN102138072A - 皮肌炎的诊断方法和诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是鉴定与抗CADM-140抗体相应的抗原，生产重组蛋白，并建立通过ELISA等的测定系统。本发明提供了诊断皮肌炎的试剂盒，该试剂盒包含由抗CADM-140抗体识别的SEQ ID NO：4所示的MDA5蛋白或其片段。
Description
技术领域
本发明涉及诊断皮肌炎的方法和试剂盒，以及用于诊断皮肌炎的抗原蛋白的用途。
背景技术
胶原病使其被视为自身免疫性疾病的基本特征是产生抗多种细胞组分的自身抗体。已知对应这些自身抗体的许多抗原是生命过程中必不可少的酶和调节因子。预期研究自身抗体及其对应抗原(自身抗原)的分子结构以及它们的生物学功能有助于阐明结缔组织病的病理。
多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)为炎性肌病，其中主要是骨骼肌炎症所引起的近端肌无力和肌肉疼痛。特别是当观察到典型皮肤症状如向阳性皮疹和Gottron氏丘疹时，患者被诊断为DM。多发性肌炎/皮肌炎是一种自身免疫性疾病，并且已知产生了多种自身抗体。已经报道了在PM/DM患者血清中存在抗体；这些抗体包括在肌炎患者中特别检测到的抗氨酰tRNA合成酶抗体(抗ARS抗体)、抗SRP抗体、抗Mi-2抗体和类似抗体以及抗U1RNP抗体、抗SS-A抗体和与肌炎相关的类似自身抗体。已知的是，对于相同肌炎特异性自身抗体为阳性的患者表现出相似的临床特征；这对于诊断、疾病类型分类、适当治疗方法的选择和预后评估在临床上是有用的。
相比之下，自身抗体阴性被认为是PM/DM亚型临床无肌病性DM(C-ADM)的特征之一。C-ADM特异性自身抗体的存在是未知的。已知C-ADM抵抗临床治疗，并且与不良预后的急进性间质性肺疾病(RP-ILD)有关。为了挽救患有RP-ILD的C-ADM患者的生命，已报道和推荐联合利用高剂量类固醇疗法和免疫抑制药物给药的早期有效治疗的功效。因为这个原因，具有相关RP-ILD的C-ADM的早期诊断在临床上是重要的，并且期望建立用于早期诊断的新指标。
根据以上背景，本发明人根据免疫沉淀(IPP)法研究了正常健康对照、患有包括C-ADM在内的结缔组织病的患者以及患有特发性肺纤维化的患者的血清。本发明人发现C-ADM患者的血清中存在能够识别一种140-kDa蛋白的新自身抗体，并且将该新自身抗体命名为“抗CADM-140抗体”(非专利文献1(NPL 1))。
抗CADM-140抗体在患除C-ADM以外的结缔组织病患者、特发性肺纤维化患者和正常健康对照中的任一组均未检测到。临床上观察到抗CADM-140抗体阳性患者中RP-ILD显著地频繁发生，这表明抗CADM-140抗体与RP-ILD之间存在关联(非专利文件2)。
该现象被认为对于预后特别不良的具有相关RP-ILD的C-ADM的早期诊断和治疗选择是有用的，并因此希望改善其预后。
MDA5具有SNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi？locusId＝64135)。其氨基酸序列和碱基序列的NCBI登录号为NM_022168。专利文献1(PTL 1)公开了MDA5和癌症之间的关系。
本发明人发表了非专利文献3(NPL 3)，其公开了本发明所涉及的技术。
引文目录
专利文献
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非专利文献
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NPL 3：Arthritis Rheum.60(7)：2193-2200，2009
发明概述
技术问题
根据IPP方法，利用S35标记的白血病来源的K562细胞提取物或HeLa细胞对抗CADM-140抗体进行了一般测量。虽然这是具有高灵敏度和高特异性的可靠测量方法，但是该方法使用同位素并需要复杂的程序。因此，该测量方法仅在数量有限的实验室中使用。
为了将抗CADM-140抗体的测量应用到实际临床诊断中，亟需建立能够容易地测量大量样品的测量系统。鉴定与抗CADM-140抗体相应的抗原、制备重组蛋白及建立通过ELISA的测量系统等对于建立该系统是重要的。
问题的解决方案
本发明人利用HeLa细胞cDNA文库克隆与抗CADM-140抗体相应的抗原基因，并且研究了该相应抗原蛋白的分子序列。结果，本发明人发现MDA5(黑色素瘤分化相关基因5)为与抗CADM-140抗体相应的抗原，并在这一发现的基础上完成本发明。
本发明提供了用于皮肌炎诊断的试剂盒和方法，如下逐项所述。
项1.用于诊断皮肌炎的试剂盒，其包含由抗CADM-140抗体识别的SEQ ID NO：4所示的MDA5蛋白或其片段。
项2.根据项1的用于诊断皮肌炎的试剂盒，其包含由抗CADM-140抗体识别的SEQ ID NO：2所示的MDA5蛋白C-末端片段或其片段。
项3.根据项1的试剂盒，其中所述皮肌炎为与发生急进性间质性肺疾病的高风险有关的临床无肌病性皮肌炎(C-ADM)。
项4.根据项1的试剂盒，其用于通过酶联免疫吸附测定(ELISA)的测量。
项5.根据项1的试剂盒，其包含：
(i)抗原，其包含MDA5蛋白或其免疫原性肽；
(ii)介质，其适用于个体的样品与所述抗原(i)之间的反应；
(iii)试剂，其用于检测所述抗原(i)与抗CADM-140抗体的复合物；以及任选的
(iv)参照样品，其不含抗CADM-140抗体。
项6.用于诊断皮肌炎的方法，其包括使个体的样品与由抗CADM-140抗体识别的MDA5蛋白或其片段反应；以及当在所述样品中检测到抗CADM-140抗体时诊断该个体患有皮肌炎。
项7.根据项5的方法，其中所述样品为血液、血清或血浆样品。
项8.根据项6的方法，其中所述样品中的抗CADM-140抗体通过ELISA来检测。
项9.根据项6的方法，其包括以下步骤：
(i)将特定量的本发明的肽组合物沉积在微量滴定板的多个孔上；
(ii)将疑似患有皮肌炎的个体的样品稀释，并将稀释后的样品添加至所述孔；
(iii)孵育后洗涤所述微量滴定板；
(iv)将标记的抗人免疫球蛋白抗体引入所述微量滴定板的孔；并且
(v)通过与对照比较来检测与抗体结合的标记的量。
项10.由抗CADM-140抗体识别的MDA5蛋白或其片段用于诊断皮肌炎的用途。
发明的有益效果
根据本发明可以高准确性地检测预后特别不良的临床无肌病性皮肌炎，其与发生预后特别不良的急进性间质性肺疾病的高风险有关。
本发明能够快速测量许多样品中的抗CADM-140抗体。这对于具有相关RP-ILD的C-ADM的早期诊断和治疗选择是有益的，并且期望改善该疾病的预后，该疾病的治疗方法尚未建立并且被认为是预后特别不良的疾病。此外，抗CADM-140抗体阳性样品的累积使得能够分析外源性抗原，诸如为特异性自身抗体靶标的病毒，并且有助于阐明具有相关RP-ILD的C-ADM的发病机理。
附图简述
图1示出了根据免疫沉淀法研究作为抗原的克隆#8(MDA5)蛋白与C-ADM患者血清之间反应的结果，该研究在纯化克隆#8(MDA5)蛋白并利用体外转录/翻译系统证实该蛋白表达后进行。克隆#8(MDA5)与所有抗CADM-140抗体阳性血清样品反应，但它不与正常健康对照血清反应。
图2示出了根据免疫沉淀法研究作为抗原的克隆#8(MDA5)重组蛋白与抗CADM-140抗体阳性C-ADM患者、患有其他结缔组织病的患者以及正常健康对照的血清之间反应的结果，该研究在纯化克隆#8(MDA5)蛋白并利用体外转录/翻译系统证实该蛋白表达后进行。该重组蛋白不与正常健康对照的血清或除抗CADM-140抗体阳性的C-ADM患者以外患者的血清反应。
图3示出了IPP-IB的结果。当抗CADM-140抗体与表达MDA5的非洲绿猴肾细胞来源的COS7细胞提取物反应时，产生的140-kDa免疫沉淀物与山羊抗MDA5抗体反应。
图4示出了抗CADM-140抗体阳性患者和正常健康对照的血清的免疫印迹结果，该结果是通过利用重组RIG-I、重组MDA5和重组LGP-2作为抗原得到的。抗CADM-140抗体阳性患者的血清仅与重组MDA5反应，而正常健康对照(NHC)的血清完全不反应。
图5示出了抗CADM-140抗体阳性的C-ADM患者、抗CADM-140抗体阴性的C-ADM患者、PM/DM患者、硬皮病(SSc)患者、系统性红斑性狼疮(SLE)患者、ILD患者和正常健康对照的血清ELISA结果，该结果是通过利用MDA5作为抗原底物得到的。截断值通过水平线来显示。该ELISA系统的分析灵敏度和分析特异性分别为85％和100％。
实施方案描述
本发明的特征是由抗CADM-140抗体特异性识别的抗原(MDA5)，这被本发明人发现。MDA5是RIG-I家族蛋白的一种类型。RIG-I家族蛋白参与包括生成I型干扰素的特异性免疫应答。RIG-I家族蛋白高度同源并含有DexD/H盒解旋酶结构域。除MDA5之外，已知RIG-I和LPG-2也为RIG-I家族蛋白。这些蛋白的序列和结构非常相似，并因此可能交叉反应。因此还研究了抗CADM-140抗体与RIG-I家族蛋白之间的反应性。抗CADM-140抗体与MDA5的结合依赖于抗原的构象，并且抗CADM-140抗体优先地与天然结构部分修饰的MDA5反应。这些因素使得难以确定抗CADM-140抗体是MDA5的抗体。
为了鉴定抗CADM-140抗体，本发明人纯化了与其相应的抗原蛋白并试图通过质谱分析法来鉴定抗原蛋白。然而，不可能纯化足量的抗原蛋白，并且鉴定是困难的。这被认为是由于血清中抗原量少或由于抗原-抗体反应的亲和力。
此外，在C-ADM早期，难以区分该疾病与其他类型皮肌炎，因为C-ADM难以诊断并且需要继续小心地确定是否存在肌肉症状。
然而，本发明人鉴定了抗CADM-140抗体特异性识别的MDA5。结果，很显然皮肌炎(C-ADM)的ELISA测定的临床灵敏度和临床特异性分别为69％和99.6％。虽然抗CADM-140抗体阴性的C-ADM患者以前难以诊断或诊断通常花很多时间，但是本发明使其能够快速诊断。
在本说明书中，“皮肌炎”包括被称为DM以及DM的亚型-临床无肌病性皮肌炎(C-ADM)，但不包括多发性肌炎PM。因此，本发明提供了用于诊断个体是否患有DM或C-ADM或其他疾病的试剂盒和方法。DM为炎性肌病，其中主要为特征性皮肤症状如向阳性皮疹和Gottron氏丘疹、以及由骨骼肌炎症引起的近端肌无力和/或肌肉疼痛。DM通常是根据Bohan & Peter的诊断标准(Bohan A，Peter JB.Polymyositis and dermatomyositis.N Engl J Med 1975；292：344)来诊断的。然而，C-ADM不满足Bohan & Peter的标准，并且是不可诊断的，所述C-ADM指其中表现出DM的皮肤损害特征但未表现出肌无力的情况。在2002年，Sontheimer提出新分类标准，其中将无肌无力的典型皮肤损害的情况称为“C-ADM”(临床无肌病性皮肌炎)，并且将“C-ADM”归类为DM的亚型[Sontheimer RD：Would a new name hasten the acceptance of amyopathic dermatomyositis(dermatomyositis sine myositis)as a distinctive subset within the idiopathic inflammatory dermatomyopathies spectrum of clinical illness？J Am Acad Dermatol 2002；46：626-36]。根据本发明诊断的靶标DM包括满足Bohan & Peter诊断标准的或满足Sontheimer分类标准的那些。
本发明的诊断试剂盒和诊断方法利用由抗CADM-140抗体识别的MDA5蛋白或其片段来检测抗CADM-140抗体(以下“由抗CADM-140抗体识别的片段”有时简称为“免疫原性肽”)。因为SEQ ID NO：4所示的MDA5蛋白的C-末端523氨基酸序列片段(SEQ ID NO：2)与抗CADM-140抗体结合，所以抗CADM-140抗体识别的表位存在于MDA5蛋白的C-末端区域。只要维持该表位，MDA5蛋白或其免疫原性肽可以为在其非表位区域中具有一个或多个氨基酸缺失、替代、添加或插入的修饰的MDA5蛋白或其免疫原性肽。该表位通常由约5至约10个氨基酸组成，并且特别是约5至约8个氨基酸。例如，MDA5的表位可以通过以下方法来确定：合成特定数量的肽(例如一次10个肽)，同时从SEQ ID NO：2所示的MDA5C-末端片段的N-末端位移固定数量的氨基酸(例如5个氨基酸)(例如，制备由第一个至第十个氨基酸组成的肽，由第六个至第十五个氨基酸组成的肽，由第十一至第二十个氨基酸组成的肽，由第十六个至第二十五个氨基酸组成的肽，...)，然后研究各个肽片段与抗CADM-140抗体的反应性。当表位确定或表位的位置缩小后，由抗CADM-140抗体识别的MDA5蛋白(免疫原性肽)片段可以缩短。较短的免疫原性肽从易于生产的角度来看是优选的。由40个或更少氨基酸、30个或更少氨基酸、或者20个或更少氨基酸、特别是约5至约10个氨基酸组成的肽是优选的。RNA解旋酶是由MDA5编码的。
已知MDA5有SNP。本发明所使用的MDA5蛋白或免疫原性肽可以具有任何类型的SNP。SEQ ID NO：3表示MDA5的碱基序列。SEQID NO：1表示编码SEQ ID NO：2所示的MDA5片段的C-末端片段的碱基序列。然而，具有与SNP相关的其他氨基酸序列/碱基序列的MDA5或MDA5的等位基因也包括在本说明书的“MDA5”范围内。
可以将本发明的MDA5或免疫原性肽表达为重组蛋白，并通过基因工程来生产，或者可以通过化学合成来生产。特别地，当免疫原性肽具有短序列，其由优选的50个或更少氨基酸、更优选的30个或更少、甚至更优选的20个或更少以及尤其为5至10个氨基酸组成时，优选地利用化学合成(固相或液相合成)生产该肽。MDA5或其免疫原性肽可以单体形式使用，也可以通过诸如戊二醛的多官能团交联剂交联，或者能够通过利用其中免疫原性肽串联连接的编码肽的DNA的基因工程来生产。
抗CADM-140抗体可以从任何样品中获得，所述样品例如个体的血液、血清、血浆、脑脊液和淋巴。血液、血清和血浆是优选的，并且作为样品的血清是特别优选的。
本发明用于诊断皮肌炎的试剂盒包含MDA5蛋白或其免疫原性肽。该试剂盒可以包含用于检测MDA5蛋白或其免疫原性肽与抗CADM-140抗体的抗原-抗体复合物的物质。此类物质的实例包括用下述标记的抗人免疫球蛋白抗体，并且特别是用下述标记的抗人IgG抗体：诸如辣根过氧化物酶(HRP)的过氧化物酶，诸如β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和荧光素酶的酶标记，诸如FITC(异硫氰酸荧光素)和RITC(异硫氰酸四甲基罗丹明)的荧光标记，或任何其他合适的标记。
免疫测定优选地用于本发明的诊断试剂盒和诊断方法。免疫测定的实例包括酶免疫测定(EIA)、ELISA、荧光免疫测定(FIA)、化学发光免疫测定、免疫印迹(IB)、蛋白印迹、免疫染色以及类似方法。
本发明使用的MDA5蛋白或免疫原性肽优选地结合于固相。此类固相的实例包括琼脂糖、微量滴定板的孔、乳胶颗粒等。ELISA法的具体实例包括竞争性免疫测定、夹心免疫测定等。
根据本发明的诊断皮肌炎的方法，使获得自个体的样品与MDA5蛋白或其免疫原性肽接触以通过物理或化学方法来检测MDA5或其免疫原性肽与抗CADM-140抗体的抗原-抗体复合物存在或不存在。
例如，本发明的诊断皮肌炎的方法包括以下步骤：
(i)将特定量的本发明的肽组合物沉积在微量滴定板的多个孔上；
(ii)将疑似患有皮肌炎的个体的血液样品(血清或血浆)稀释，然后将稀释的样品添加至所述孔；
(iii)孵育后洗涤微量滴定板；
(iv)将用酶标记、荧光标记等标记的人免疫球蛋白(例如IgG)添加至所述微量滴定板的孔；然后
(v)与对照比较，检测与人免疫球蛋白结合的标记的量(在人免疫球蛋白用酶标记标记的情况下，与酶作用的底物的量)。
在优选的实施方案中，本发明的诊断试剂盒可以含有：
(i)抗原，其包含MDA5蛋白或其免疫原性肽(抗原可以附着在微量滴定板等的孔中，并且还可以用封闭剂来封闭，所述封闭剂如脱脂乳，或者诸如牛血清白蛋白(BSA)或I的白蛋白)。
(ii)介质，其适合用于个体样品与抗原(i)之间的反应(例如，诸如PBS的缓冲液)；
(iii)试剂，其用于检测抗原(i)与抗CADM-140抗体的复合物(例如，与抗CADM-140抗体结合的标记的抗人免疫球蛋白抗体)；以及任选的
(iv)参照样品，其不含抗CADM-140抗体。
“不含抗CADM-140抗体的参照样品”包括例如正常健康对照的血液、血清和血浆样品。
当抗人免疫球蛋白抗体用过氧化物酶标记时，抗CADM-140抗体可以通过以下方法来检测，该方法包括加入诸如四甲基联苯胺的显色底物；用H2SO4终止反应；以及用酶标仪测量吸光度(450nm：OD450)。
通过用本发明的诊断试剂盒测试大量样品并将获得的结果与其他临床观测结果进行比较，能够建立基于测量的抗CADM-140抗体量的用于确定个体是否患有DM的更准确的标准。
实施例
下文对本发明进行了更详细地描述。
实施例1：C-ADM早期诊断方法
通过使用表达利用HeLa细胞cDNA文库制备的λZAP噬菌体的大肠杆菌(XL1-Blue MRF)来在大肠杆菌中表达抗原蛋白。将表达的蛋白转移至硝酸纤维素膜，并与抗CADM-140抗体阳性血清反应以分离阳性克隆。然后，研究了获得的阳性克隆与抗CADM-140抗体阳性C-ADM患者的10个血清样品、抗CADM-140抗体阴性个体的14个血清样品(2个C-ADM样品，2个PM样品，系统性红斑性狼疮、硬皮病和间质性肺疾病各1个样品，以及7个正常健康对照样品)的反应性。在获得的9个克隆中，克隆#8以高频数与抗CADM-140抗体阳性血清样品反应，即10个抗CADM-140抗体阳性C-ADM血清样品中的9个。在蛋白纯化并且利用体外转录/翻译测定确认表达以后，通过免疫沉淀研究了C-ADM患者的血清与作为抗原的蛋白的反应性。克隆#8与所有抗CADM-140抗体阳性血清样品反应，但不与正常健康对照的血清反应(图1)。此外，克隆#8不与结缔组织病患者的血清反应，抗CADM-140抗体阳性C-ADM除外(图2)。此外，为了确定克隆#8的碱基序列，从获得克隆的噬菌体DNA切下质粒DNA。将质粒DNA纯化以确定碱基序列。最后，对所得碱基序列进行同源性检索，并且该序列与MDA5C-末端序列完全匹配。
通过IPP-IB方法，将抗CADM-140抗体阳性血清与表达MDA5的非洲绿猴肾细胞来源的COS7细胞提取物反应。研究了140kDa的获得的免疫沉淀物与山羊抗MDA5抗体的反应性。当表达MDA5时，该免疫沉淀物与山羊抗MDA5抗体反应(图3)。此外，研究了抗CADM-140抗体阳性血清及正常健康对照血清与作为抗原的RIG-I家族RIG-I、MD5和LGP-2重组纯化蛋白之间的反应性。抗CADM-140抗体阳性患者的血清仅与重组MDA5反应，而正常健康对照的血清不与重组MDA5反应(图4)。由以上结果清楚看到，与抗CADM-140抗体相应的抗原为MDA5。
此外，本发明人用纯化的重组MDA5作为抗原来包被96孔板以建立用于抗CADM-140抗体测定的ELISA。研究了抗CADM-140抗体测定方法的诊断灵敏度和诊断特异性。
更具体地，将重组MDA5以0.05μg/孔的量固定在96孔ELISA板上，并且用3％BSA封闭。将血清样品(各作250倍稀释)以100μl每孔的量分配到板上，并使其在室温下反应2小时。作为二抗，使用5000倍稀释的过氧化物酶偶联的山羊抗人IgG。加入四甲基联苯胺(1mg/ml)作为显色底物，并且用H2SO4终止反应。用酶标仪(450nm：OD450)测量吸光度。利用该测定系统，测量了包含C-ADM的胶原疾病患者的血清样品、间质性肺疾病(ILD)患者的血清样品和正常健康对照的血清样品。结果显示抗CADM-140抗体阳性PM/DM患者血清的反应性高于抗CADM-140抗体阴性PM/DM患者、硬皮病(SSc)患者、系统性红斑性狼疮(SLE)患者、ILD患者及正常健康对照的血清(图5)。当将正常健康对照的平均值+高达标准偏差的10倍定义为正常截断范围时，该ELISA测定系统测量的分析灵敏度和分析特异性分别为85％和100％。因此，这些结果清楚地表明该测定是具有优异的灵敏度和特异性的抗CADM-140抗体检测方法。
Claims (10)
1.用于诊断皮肌炎的试剂盒，其包含由抗CADM-140抗体识别的SEQ ID NO：4所示的MDA5蛋白或其片段。
2.如权利要求1所述的用于诊断皮肌炎的试剂盒，其包含由抗CADM-140抗体识别的SEQ ID NO：2所示的MDA5蛋白C-末端片段或其片段。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述皮肌炎为与发生急进性间质性肺疾病的高风险有关的临床无肌病性皮肌炎(C-ADM)。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其用于通过酶联免疫吸附测定(ELISA)的测量。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其包含：
(i)抗原，所述抗原包含MDA5蛋白或其免疫原性肽；
(ii)介质，所述介质适用于个体的样品与所述抗原(i)之间的反应；
(iii)试剂，所述试剂用于检测所述抗原(i)与抗CADM-140抗体的复合物；以及任选的
(iv)参照样品，所述参照样品不含抗CADM-140抗体。
6.用于诊断皮肌炎的方法，其包括使个体的样品与由抗CADM-140抗体识别的MDA5蛋白或其片段反应；以及当在所述样品中检测到抗CADM-140抗体时诊断所述个体患有皮肌炎。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述样品为血液、血清或血浆样品。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述样品中的抗CADM-140抗体通过ELISA来检测。
9.如权利要求6所述的方法，包括以下步骤：
(i)将特定量的本发明的肽组合物沉积在微量滴定板的多个孔上；
(ii)将疑似患有皮肌炎的个体的样品稀释，并将稀释的样品添加至所述孔；
(iii)孵育后洗涤所述微量滴定板；
(iv)将标记的抗人免疫球蛋白抗体引入所述微量滴定板的孔；并且
(v)通过与对照比较来检测与所述抗体结合的标记的量。
10.由抗CADM-140抗体识别的MDA5蛋白或其片段用于诊断皮肌炎的用途。
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