WO2010024089A1 - 皮膚筋炎の診断方法および診断キット - Google Patents
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Definitions
- the present inventor cloned the corresponding antigen gene of the anti-CADM-140 antibody using the HeLa cell cDNA library and examined the molecular sequence of the corresponding antigen protein.
- the corresponding antigen of the anti-CADM-140 antibody was found to be MDA5 (Melanoma Differentiation Associated Gene 5) ⁇ ⁇ ⁇ was found and the present invention was completed.
- the present invention provides the following dermatomyositis diagnostic kit and dermatomyositis diagnostic method.
- Item 1 A diagnostic kit for dermatomyositis comprising the MDA5 protein represented by SEQ ID NO: 4 or a fragment thereof recognized by an anti-CADM-140 antibody.
- Item 2. Item 2.
- Item 3. Item 2.
- anti-CADM-140 antibody In identifying anti-CADM-140 antibody, the corresponding antigen protein was purified and mass spectrometry was used to identify the antigen protein. However, a sufficient amount of antigen protein could not be purified, and identification was difficult. there were. It was speculated that this was due to the small amount of antigen in the serum or the affinity of the antigen-antibody reaction.
- the anti-CADM-140 antibody may be contained in any sample such as blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, lymph, etc. of the subject, but blood, serum or plasma, particularly a serum sample is preferably used. .
- the diagnostic kit for dermatomyositis of the present invention contains MDA5 protein or an immunogenic peptide thereof.
- This kit may contain a substance for detecting an antigen-antibody complex of MDA5 protein or an immunogenic peptide thereof and an anti-CADM-140 antibody.
- substances include peroxidases such as horseradish peroxidase (HRP), enzyme labels such as ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase, and luciferase, and any label such as fluorescent labels such as FITC (fluoresceinceisothiocyanate) and RITC (tetramethylrhodamin isothiocyanate).
- anti-human immunoglobulin antibodies labeled with, particularly anti-human IgG antibodies.
- An immunological assay is preferably used for the diagnostic kit and diagnostic method of the present invention.
- immunoassay methods include enzyme immunoassay (EIA), ELISA, fluorescence immunoassay (FIA), chemiluminescence immunoassay, immunoblotting method (Immunoblotting: IB), Western blot method, immunostaining method, etc. Is mentioned.
- the dermatomyositis diagnosis method of the present invention includes, for example, the following steps: (i) depositing a predetermined amount of the peptide composition of the present invention in a plurality of wells of a microtiter plate; (ii) diluting a blood sample (serum or plasma) from a subject with possible dermatomyositis and introducing it into the well; (iii) washing the microtiter plate after incubation, (iv) introducing an antibody against a human immunoglobulin (e.g., IgG) labeled with an enzyme label, a fluorescent label, or the like into a well of a microtiter plate; (v) The amount of bound human immunoglobulin label (substrate reacted with enzyme in the case of enzyme label) is detected relative to the control.
- a human immunoglobulin e.g., IgG
- Example 1 Early Diagnosis Method for C-ADM An antigen protein was expressed in Escherichia coli using a HeLa cell cDNA library prepared using ⁇ ZAP phage expressing Escherichia coli (XL1-Blue MRF). The expressed protein was transferred to a nitrocellulose membrane and reacted with anti-CADM-140 antibody-positive serum to isolate a positive clone.
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Abstract
Description
項1.配列番号4で示されるMDA5タンパク質または抗CADM-140抗体により認識されるその断片を含む、皮膚筋炎の診断キット。
項2.配列番号2で示されるMDA5タンパク質のC末端側の断片または抗CADM-140抗体により認識されるその断片を含む、項1に記載の皮膚筋炎の診断キット。
項3.皮膚筋炎が、急速進行性間質性肺炎を発症する可能性が高いタイプの筋炎症状の軽微なタイプの皮膚筋炎(C-ADM)である、項1に記載の診断キット。
項4.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 法により測定するための項1に記載の診断キット。
項5.
(i)MDA5タンパク質またはその免疫原性ペプチドからなる抗原
(ii)被験体のサンプルと(i)の抗原との反応に適した媒体、
(iii)抗CADM-140抗体と(i)の抗原との複合体を検出するための試薬
(iv)必要に応じて、抗CADM-140抗体を含まない基準となるサンプル
を含む、項1に記載の診断キット。
項6.被験者のサンプルをMDA5タンパク質または抗CADM-140抗体により認識されるその断片と反応させる工程、サンプル中の抗CADM-140抗体が検出された場合に皮膚筋炎と診断することを特徴とする、皮膚筋炎の診断方法。
項7.前記サンプルが、血液、血清または血漿サンプルである項5に記載の診断方法。
項8.サンプル中の抗CADM-140抗体をELISA法により検出する、項6に記載の診断方法。
項9.以下の工程を含む、項6に記載の診断方法:
(i)所定量の本発明ペプチド組成物をマイクロタイタープレートの複数のウェルに沈着させる工程、
(ii)皮膚筋炎の可能性がある被験体由来のサンプルを希釈してウェルに導入する工程、
(iii)マイクロタイタープレートをインキュベーション後に洗浄する工程、
(iv)標識されたヒト免疫グロブリンに対する抗体をマイクロタイタープレートのウェルに導入する工程、および
(v)結合したヒト免疫グロブリンの標識量を対照と比較して検出する工程。
項10.MDA5タンパク質または抗CADM-140抗体により認識されるその断片の皮膚筋炎の診断のための使用。
(i)所定量の本発明ペプチド組成物をマイクロタイタープレートの複数のウェルに沈着させ、
(ii)皮膚筋炎の可能性がある被験体由来の血液サンプル(血清ないし血漿)を希釈してウェルに導入し、
(iii)マイクロタイタープレートをインキュベーション後に洗浄し、
(iv)酵素標識、蛍光標識などにより標識されたヒト免疫グロブリン(例えばIgG)に対する抗体をマイクロタイタープレートのウェルに導入し、
(v) 結合したヒト免疫グロブリンの標識(酵素標識の場合には酵素によって反応された基質)の量を対照と比較して検出する。
(i)MDA5タンパク質またはその免疫原性ペプチドからなる抗原(マイクロタイタープレートのウェルなどに付着されていてもよく、また、bovine serum albumin (BSA)、HSAなどのアルブミン、スキムミルクなどのブロッキング剤でさらにブロッキングされていてもよい)
(ii)被験体のサンプルと(i)の抗原との反応に適した媒体(例えば、PBSなどのバッファー(buffer))、
(iii)抗CADM-140抗体と(i)の抗原との複合体を検出するための試薬(例えば抗CADM-140抗体と結合する標識された抗ヒト免疫グロブリン抗体)
(iv)必要に応じて、抗CADM-140抗体を含まない基準となるサンプル
などが含まれ得る。
実施例1:C-ADMの早期診断法
大腸菌(XL1-Blue MRF)発現λZAPファージを用いて作製したHeLa細胞cDNAライブラリーを使用し、大腸菌に抗原蛋白質を発現させた。発現蛋白をニトロセルロース膜に転写し、抗CADM-140抗体陽性血清と反応させ、陽性クローンを単離した。次に、得られた陽性クローンにそれぞれと抗CADM-140抗体陽性C-ADM患者10血清と抗CADM-140抗体陰性14血清(C-ADM 2例、PM 2例、全身性エリテマトーデス、強皮症、間質性肺炎各1例、健常人7例)との反応性を検討した。得られた9つのクローンのうち、クローン#8は、抗CADM-140抗体陽性血清10例中9例と、抗CADM-140抗体陽性血清と高頻度に反応した。そこで、In vitro transcription/ translation assayを用いて、蛋白を精製し、発現を確認した後、その蛋白を抗原として、免疫沈降法でC-ADM患者血清と反応を検討した。クローン#8は、抗CADM-140抗体陽性血清全例で反応したが、健常人血清とは反応しなかった(図1)。さらに、クローン#8は、抗CADM-140抗体陽性C-ADM血清以外の膠原病とも反応しなかった(図2)。さらに、クローン#8の塩基配列を決定するために、同クローンの得られたファージDNAからプラスミドDNAの切り出しを行い、プラスミドDNAを精製して塩基配列を決定した。最後に得られた塩基配列について、ホモロジーサーチを行ったところ、MDA5のC末端部分の配列と完全に一致した。
具体的には、リコンビナント MDA5を0.05μg/wellの割合で、96穴ELISAプレートに固相化し、3 % BSAでブロッキングを行った。測定する血清(250倍希釈)100μlずつをプレートに分注し、室温2時間で反応させ、2次抗体として、5.000倍希釈のPeroxidase conjugated goat anti-human-IgGを用いた。Tetramethylbenzidine (1mg/ml) を発色剤として添加し、H2SO4 で反応を停止し、プレートリーダーで吸光度 (450 nm: OD450) を測定した。この測定系を用いて、C-ADM含有膠原病、間質性肺炎 (ILD)および健常人の血清を用いて測定を行った。抗CADM-140抗体陽性PM/DM患者血清は、抗CADM-140抗体陰性PM/DM患者、強皮症(SSc)患者、全身性エリテマトーデス(SLE)患者、 ILD患者および健常人と比較して、より大きな反応性を示した(図5)。健常人血清の平均値+標準偏差の10倍までを正常のカットオフ値とすると、このELISA測定系による分析感度(analytical sensitivity)は85%、分析特異度(analytical specificity)は100%となり、感度・特異度ともにきわめて優れた抗CADM-140抗体の検出法であることが明らかになった。
Claims (10)
- 配列番号4で示されるMDA5タンパク質または抗CADM-140抗体により認識されるその断片を含む、皮膚筋炎の診断キット。
- 配列番号2で示されるMDA5タンパク質のC末端側の断片または抗CADM-140抗体により認識されるその断片を含む、請求項1に記載の皮膚筋炎の診断キット。
- 皮膚筋炎が、急速進行性間質性肺炎を発症する可能性が高い筋炎症状の軽微なタイプの皮膚筋炎(C-ADM)である、請求項1に記載の診断キット。
- Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 法により測定するための請求項1に記載の診断キット。
- (i)MDA5タンパク質またはその免疫原性ペプチドからなる抗原
(ii)被験体のサンプルと(i)の抗原との反応に適した媒体、
(iii)抗CADM-140抗体と(i)の抗原との複合体を検出するための試薬
(iv)必要に応じて、抗CADM-140抗体を含まない基準となるサンプル
を含む、請求項1に記載の診断キット。 - 被験者のサンプルをMDA5タンパク質または抗CADM-140抗体により認識されるその断片と反応させる工程、サンプル中の抗CADM-140抗体が検出された場合に皮膚筋炎と診断することを特徴とする、皮膚筋炎の診断方法。
- 前記サンプルが、血液、血清または血漿サンプルである請求項5に記載の診断方法。
- サンプル中の抗CADM-140抗体をELISA法により検出する、請求項6に記載の診断方法。
- 以下の工程を含む、請求項6に記載の診断方法:
(i)所定量の本発明ペプチド組成物をマイクロタイタープレートの複数のウェルに沈着させる工程、
(ii)皮膚筋炎の可能性がある被験体由来のサンプルを希釈してウェルに導入する工程、
(iii)マイクロタイタープレートをインキュベーション後に洗浄する工程、
(iv)標識されたヒト免疫グロブリンに対する抗体をマイクロタイタープレートのウェルに導入する工程、および
(v)結合したヒト免疫グロブリンの標識量を対照と比較して検出する工程。 - MDA5タンパク質または抗CADM-140抗体により認識されるその断片の皮膚筋炎の診断のための使用。
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