CN101830968B - 一种具有免疫调节作用的法氏囊七肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有免疫调节作用的法氏囊七肽，及其在免疫中的应用(提高动物的免疫能力，能提高疫苗的免疫效果及影响肿瘤细胞的活性)，属于免疫学领域。本发明分离到一种七肽，分子量为722.240，氨基酸序列为EPASGMM，结构简单，无毒副作用，免疫原性极弱。即可从法氏囊中分离提取，也可化学合成，成本低，可大量生产。法氏囊七肽对抗体及其亚型的产生具有诱导作用，同时可调节细胞因子的产生，T淋巴细胞的分型和脾脏细胞的增殖，促进细胞免疫反应。是一种对功能的免疫调节因子，具有广泛的应用前景，如免疫调节、免疫治疗等方面，可应用于基础免疫研究、临床应用研究等领域。

Description

一种具有免疫调节作用的法氏囊七肽

一、技术领域

本发明涉及一种具有免疫调节作用的法氏囊七肽，及其在免疫中的应用(提高动物的免疫能力，能提高疫苗的免疫效果及影响肿瘤细胞的活性)，属于免疫学领域。 

二、背景技术

法氏囊(bursa of Fabricus，BF)最早是由Hieronymus Fabricus于1961年发现，同时并明确了腔上囊的形态和位置，由此而命名为bursa of Fabricus。法氏囊是禽类特有的体液免疫的中枢淋巴器官，位于泄殖腔背侧，其盲端呈囊状，朝向躯体前端，颈部以短柄朝向躯体后下方，开口于泄殖腔。早期的研究者观察到法氏囊随性成熟而逐渐退化，所以一直认为它是与生殖生理有关的器官。自1956年，Glick等发现摘除法氏囊会降低雏鸡对沙门氏菌“O”抗原的抗体生成以来，法氏囊被人们确认为禽类特有的中枢淋巴器官，是B细胞的最早发生场所，B细胞由它迁移到外周淋巴器官定居和繁衍，执行免疫功能。 

1960年，Glick等报道了注射6次丙酮处理9小时法氏囊粗提物的生理盐水悬液，可以提高摘除法氏囊的雏鸡对绵羊红细胞(SRBC)的抗体水平。Baba等1976年报道用鸡法氏囊提取液给切除法氏囊的雏鸡注射后，可使这些鸡获得产生IgG的能力并提高抗体水平。1976年，Brand发现法氏囊提取物能诱导雏鸡骨髓细胞表达Th-1抗原，并还存在有促进早期B细胞表达Bu-1抗原的因子，而且囊提取液浓度越低，对诱导B细胞分化的能力就越强。1981年，高舜德等进行了鸡胚法氏囊提取液对法氏囊复生的研究。1982年，Eerola等报道了由体外培养的法氏囊上皮细胞及无血清的培养上清具有促进B淋巴细胞分化的生物学特性。Audhya等在1986年首次报道了从160g鸡的法氏囊中分离到1.3mg囊素(bursin，BS)。经质谱鉴定分析，认为得到BS是一种三肽排列结构的物质，其氨基酸组成顺序为Lys-His-Gly-NH2，其中Lys∶His∶Gly∶NH2为1∶0.9∶1∶0.8，并证明它能诱导B细胞前体的分化，且能特异性地提高人Daudi B细胞中cAMP和cGMP的水平，而对T细胞较弱。当用浓度为100ug/ml的BS进行刺激时，B淋巴细胞内的cAMP和cGMP的水平可达最高值8-15pmol/ml，而对T淋巴细胞则只能使其cGMP水平升高，不能使其cAMP水平升高。这是从法氏囊得到且有关B细胞发育的第一个结构明确的活性因子。 

Pichart等(1973)曾于大鼠肝脏分离出一种增殖因子，具有与BS类似的三肽结构(Gly-His-Lys)。1989年，Viamotes等利用小鼠和兔抗BS多抗进行免疫组化染色，确定BS分布于滤泡的皮髓分界上皮(CME)和髓质的树枝网状上皮细胞(DREC)以及滤泡间表面上皮(IFSE)基底膜中。秦小强等也认为BS由上述细胞产生。1990年，Audhya等用免疫学方法检测证实BS不仅存在于鸟类的BF上皮中，还存在于哺乳动物胎儿骨髓和肝脏内胆管上皮细胞中。他们又于1991年报道，从牛骨髓和肝脏分离出的前囊素(probursin)，其氨基酸组成顺序为Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Arg-Arg，其中第9-11个氨基酸恰好是BS。经检测亦具有与BS相同的生物学特性。BS前体及其水解后的BS的活性肽段除可诱导B细胞的分化外，还可调节骨髓的其他功能。当经门脉系统进入肝脏窦状隙后，亦可调节肝细胞和枯氏细胞的功能。1995年，张红卫等从成年牛肝脏中提取到BS类生物活性物质。成年牛肝脏已不是B淋巴细胞发生的器官，却仍然含有促进淋巴细胞分化的活性分子，说明这种活性因子无种间特异性。湛南辉等(1997)用单抗免疫组化法对BS进行组织定位，发现BS分布于法氏囊的边缘上皮、树突网状上皮滤泡间上皮、连滤泡上皮、连滤泡支持以及T细胞区(TDIA)的基底膜上皮等多种细胞上。BS阳性反应不仅在BF上，而且在胸腺、脾脏、哈德氏腺、骨髓以及法氏囊；细胞区亦有特异性阳性反应。在研究过程中发现冰冻切片经PBS处理后，阳性反应消失，从而表现BS的存在方式可能为非细胞结合性的。张锦华等在随后的研究中进一步发现，能提高法氏囊指数、能促进体重与法氏囊重的正常生理发育的活性物质更集中于T区，而不是非T区。 

许多学者对BS促进高水平抗体产生的机理进行了研究。Ann Brand等证实-.提高了血清中第二信使cGMP的含量，增加了cGMP和cAMP的比值，提高了B细胞将DNA转录成mRNA的速度，促进了B细胞内蛋白质(即抗体)的合成，从而提高了血清中特异性抗体水平。Audhya等(1986)证明BS提高了淋巴细胞的转化率，促进了B细胞的分化，而B细胞则是产生抗体的细胞，因而提高了特异性抗体水平。Audhya等的研究结果表明，在BS诱导淋巴细胞分化过程中，伴有细胞内cGMP和cAMP浓度的升高，但这种作用对B淋巴细胞极明显而对T淋巴细胞较弱。郑昌学等用12.5-250ug/ml不同浓度的BS诱导C57纯系小鼠脾细胞，可使细胞内cAMP浓度明显升高。姜秀丽在体外实验中，通过细胞计数，初步断定抗体效价的升高与单纯的细胞数量增加没有直接关系，从而表明囊素提高杂交瘤细胞抗体的分泌不是通过促进细胞增殖实现的，而可能是诱发细胞的一系列复杂的生化变化过程来完成的。目前已知的B细胞信号传递途径包括：蛋白酪氨酸磷酸化途经，磷脂酰肌醇(PI)途经，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI-3-K)和磷脂酶C(PKC)途经，G蛋白偶联的信号传导途经，至于囊素的作用机理如何尚须进一步研究。Guellati等发现BS对鸡脑垂体中肾上腺素皮质激素(ACTH)中枢的生理发育起重要作用：当胚胎早期(80hr)鸡 胚的BF切除后，其ACTH中枢的发育出现各种异常改变；但若在切除BF后2-5d内给鸡胚再注射100fg-100pg BS，则可恢复ATCH的正常发育，因此，他们认为BS可能是来自B细胞免疫系统而作用于下丘脑-垂体-肾上腺皮质中枢的信号。Youbicier-Simo等报道，BS在鸡的松果体生物节律活性的正常发育中起重要作用。鸡胚胎早期切除BS，其褪黑色素水平及松果体乙酰转氨酶的生物节奏调节幅度均降低50％，但如果给这些鸡胚在切除BF后的2-5天内注射BS，则可使其恢复松果体的有关生物学功能，而且低浓度(100fg)的BS比高浓度的(100pg)更有效。张红卫等从已不是淋巴细胞发生器官的成年牛肝脏中提取到能够促进淋巴细胞增殖分化的类BS活化因子，说明这种因子可能类似于其它内分泌激素，直接释放到血液中起作用，调节肝细胞和Kupffer细胞的生长。作为机体内的一种生物活性因子，如同其它已发现的因子一样，其作用具有双向性，即适量时增强免疫效应，超量时则起抑制作用。这一点姜秀丽在研究囊素对体外培养杂交瘤细胞抗体分泌的影响时，发现适当浓度的囊素能促进抗体的分泌，而高浓度囊素(1mg/ml)能够造成杂交瘤细胞凋亡并抑制其抗体分泌。这对以后研究体内法氏囊细胞的凋亡及前B淋巴细胞的凋亡有一定的意义，但是这种诱导细胞凋亡的机制还有待于进一步研究。 

1991年郑昌学、高奋标用空斑形成细胞(PFC)法为主要测活手段，研究了2-3月龄北京鸭腔上囊中免疫活性因子的本质及其在整体水平上的生物学作用。提取的粗提物分子量小于10000Da，它们可显著提高小鼠脾PFC的数目及对抗B细胞抑制剂环磷酰胺(CP)对小鼠的毒理作用，促进B细胞的发育及正常功能的发挥，还能明显增多已脱受体的猪胸腺细胞中E-玫瑰形成细胞(ERFC)的数目。80℃或蛋白水解酶处理，该提取物的促PFC活性丧失。同年，高奋标将此粗提物Sephadex G-15和Sephadex G-10两步分子筛层析后，得到了部分纯化的促PFC活性因子，该因子的分子量小于75KD。用高压液相色谱(HPLC)进一步分离活性组分，表明活性物质带有较多正电荷，极性较强。因此，可以认为该提取物是BS或其类似物。1992年，Murthy等报道，大剂量的法氏囊提取物在体外可以促进PHA诱导的淋巴细胞的转化，并确信是法氏囊提取物中囊素以外的物质在起作用。王兴金等(1994)实验表明法氏囊提取物，提高鸡的特异性抗体产生能力和对环磷酰胺造成的免疫抑制有一定的拮抗作用，这种作用与所用提取液的用量多少有关。张红卫等(1995)证实法氏囊组织提取物具有抵抗病毒、保护法氏囊正常发育的作用。1996年孙红斌和魏财文发现体外培养的法氏囊器官和细胞及其上清中的分泌物可加强鸡的免疫能力，显著提高鸡外周血中总球蛋白含量和：淋巴细胞数量，促进特异性抗体的产生，增加外周淋巴细胞的；E玫瑰花环形成率，提高鸡对布氏凝集抗原刺激而产生的抗体水平。 

Low and Kinger等研究人员已经从胸腺内提取到了具有免疫增强作用的多种激素和免疫抑制因子，它们对机体细胞免疫起到平衡和调节作用。作为另一中枢免疫器官的BF，是否也具有这种起平衡和调节作用的多种因子呢？许多学者认为BS仅 仅是作为其中一个结构明确的因子，可能还含有其它一些活性因子。但单对BS来说，在自然状态下，机体内最早出现的时间，以及它在体内的消长情况，代谢机制，与机体各个系统间的关系等基础理论，都需要进一步研究、探讨。1995年，张红卫等从成年牛肝脏中提取到BS类生物活性物质。Audhya等和Abiko等已证实BS在体外对人类的某些细胞具有增强免疫作用。这表明BS无论是从免疫学角度还是从生物进化的角度，都不存在种属差异问题，从而为禽源BS应用于哺乳动物和人类奠定了理论基础。姜秀丽实验表明高浓度的BS，能导致杂交瘤细胞凋亡。这些结果为临床治疗免疫缺陷症和提高患者机体免疫力及抗衰老药物、抗肿瘤药物的研制提供理论依据。胸腺素早已为临床应用，相信随着对BS的深入研究和严格的临床试验，不久的将来，它会同胸腺素和干扰素一样广泛应用于临床医学。因此法氏囊活性肽具有广泛的应用前景，如免疫调节、免疫治疗等方面，可应用于基础免疫研究、临床应用研究、营养保健等领域。只有广泛深入的研究，全面客观的了解，才能最大限度的开发利用，使其充分发挥作用，服务于生产，造福于人类。 

三、发明内容

技术问题 

本研究的目的是，通过超滤分子截流、反相高压液相色谱(HPLC)柱层析、质谱和氨基酸分析等技术从法氏囊组织液中分离到一个全新的七肽并鉴定，弄清了其氨基酸的结构组成。对法氏囊七肽的在动物体内的免疫调节机制进行深入系统研究，从而为法氏囊活性肽的临床应用提供理论依据，并有望推进禽类免疫学理论的发展。 

技术方案 

本发明的一个方面涉及到法氏囊素活性小肽的分离、纯化及质谱分析。因此，本发明还涉及包含一种氨基酸序列的基本上纯化的肽(见实施例1)。本发明充分利用现代科技技术，首先利用超滤浓缩技术，回收分子量1000Da以下的有效成分(即粗提物)。超滤浓缩技术的主要原理是通过微孔滤膜(排阻率为1000Da)在外来压力作用下，使小于1000Da的分子物质滤过，而大的物质则阻挡在滤膜上。该技术是新近发展起来的一种分离、纯化技术，已广泛应用于医学制品、生物制品等下游工程方面。粗提物经真空干燥，再次浓缩。然后溶解后，用反向高效液相色谱(RP-HPLC)分离、纯化多种法氏囊中的活性成分。收获的各种组分经MODIL-TOF质谱分析，测定该法氏囊活性肽的分子量为722.240(m/z)，并获得完整的氨基酸序列，即EPASGMM。 

有益效果 

获得法氏囊七肽有多种途径，上述方法仅为其中一种。目前，固相多肽合成技 术十分成熟。众所周知，化学合成多肽的方法也常见于免疫学、生物化学、蛋白质化学、食品学、药物学等多种领域。化学合成肽现在可以在程序控制的自动化多肽合成仪上进行，即在一个反应容器中进行所有的反应，便于自动化操作，加入过量的反应物可以获得高效率的产物，同时产物很容易分离、纯化。本发明中，法氏囊七肽采用该方法由生物公司合成，纯度达97％以上。 

此外，基因工程技术也日益成熟、完善，是最近二三十发展起来的最重要的新兴技术之一。目前已有多种基因工程新型药物(如干扰素等)及疫苗(如亚单位疫苗等)等投放市场，产生了巨大的社会效益和经济效益，同时该技术也是大量、批量生产多肽的主要技术之一。通过目的基因重组到表达载体中，并在宿主菌种充分表达，在通过后处理将表达的活性肽分离、纯化。 

本发明的另一方面涉及到诱导调节动物体液免疫力(见实施例2)。利用上述的法氏囊七肽，可验证该分子对抗体反应的免疫调节作用。按动物(小型动物)每只使用活性肽1～25ug。活性肽与AIV疫苗疫苗混匀后，按正常免疫剂量，腹腔注射免疫动物。其特征在于：活性肽在25ug/只时，按疫苗常规剂量用于动物，活性肽效果会更好，如抗体水平变化显著，同时调节作用明显。 

本发明的另一方面涉及到增强动物细胞免疫力的调节作用(见实施例3)。利用本发明中的法氏囊七肽与疫苗联合作用，即可证明该肽具有调节细胞介导的免疫反应的作用。按动物(小型动物)每只使用活性肽1～25ug。活性肽与AIV疫苗混匀后，按正常免疫剂量，腹腔注射免疫动物。其特征在于：活性肽在5ug/只时，按疫苗常规剂量用于动物，活性肽效果会更好，如细胞因子产生增加，提高T淋巴细胞的分型，促进脾脏细胞生长活性等等。 

本发明的另一方面涉及到调节肿瘤细胞增殖活性作用(见实施例4)。其应用比较广泛，可延伸到抗感染及抑制肿瘤的生长。本发明一个可实施的方案是将法氏囊七肽或和其他药剂联合作用于不同的肿瘤细胞，在这种情况下验证其效果，即属于本发明的范畴。将靶细胞分装到96孔细胞板中，用法氏囊七肽刺激，然后检测细胞生长情况。其特征在于该活性肽对不同靶细胞具有不同的调节作用，同时不向浓度的活性肽对同一靶细胞，具有明显的浓度依赖性。 

本发明的另一方面可能涉及到利用法氏囊七肽治疗肿瘤疾病，特别是与机体免疫状态密切相关的肿瘤疾病，为肿瘤疾病的防控提高新的有效分子及创新的方法。 

本发明的另一方面可能涉及到法氏囊七肽的实施量可根据使用目的、使用方法等适当选择，组合物的有效肽的用量可以在较大范围内变化。此外，肽的使用量取决于组合物的使用方法和所用的特别配制剂型。 

与现有技术相比，本发明具有的优点及意义如下： 

1、从法氏囊中发现一种新的七肽，分子量为722.240(m/z)，氨基酸序列为EPASGMM，该七肽是第一次从禽类的中枢体液免疫器官中分离出来，从而说明法 氏囊中存在多种活性分子，分子量不同，且可能发挥的免疫功能也不相同。 

2、在实验动物体内具有明显的免疫调节作用，法氏囊七肽不仅对体液免疫具有诱导效应(如调节抗体的产生和分型)，这与以往报道的法氏囊提取物作用类似，而且对细胞介导的免疫反应具有强烈的调节作用，这在以往的报道中很少提到，从而说明，法氏囊是一个有机组合器官，其中的各种组分相辅相成，谐调发挥法氏囊的作用，既有正向调节作用的物质，也有负向影响的活性分子。本发明补充了这方面的缺陷，丰富了这方面的内容。 

3、在体外，法氏囊七肽能影响肿瘤细胞的生长情况。肿瘤细胞的增殖是肿瘤疾病发展、恶化的重要因素，法氏囊七肽具有调节肿瘤细胞生长活性的作用，从而为肿瘤疾病的治疗和防控提供了新的药剂和方法，有望在临床应用中发挥重要作用。 

本发明从法氏囊提取物中，分离法氏囊七肽结构简单，无毒副作用，免疫原性极弱。即可从法氏囊中分离提取，也可化学合成，成本低，可大量生产。对抗体及其亚型的产生具有诱导作用，同时可调节细胞因子的产生，T淋巴细胞的分型和脾脏细胞的增殖，促进细胞免疫反应。此外，还以剂量依赖性方式调节肿瘤细胞的生长，是一种多功能的免疫调节因子，具有广泛的应用前景，如免疫调节、免疫治疗等方面，可应用于基础免疫研究、临床应用研究、营养保健等领域。 

四、附图说明

图1：法氏囊七肽的分离和纯化。反向高效液相色谱图中，箭头所指，BSP的洗脱峰23.89min。 

图2：MALDI-TOF-MS分析。 

图3：HI抗体的测定。与AIV免疫组比较，差异显著P＜0.05；差异极显著P＜0.01。 

图4～6：AIV抗体亚型测定。与AIV免疫组比较，差异显著P＜0.05；差异极显著P＜0.01。其中图4为抗体IgG亚型分析图；图5为抗体IgG1亚型分析图；图6为抗体IgG2α亚型分析图。 

图7～9：细胞免疫反应测定。与AIV免疫组比较，差异显著P＜0.05；差异极显著P＜0.01。其中图7为细胞因子分析图；图8为T淋巴细胞亚型分析图；图9为脾脏淋巴细胞增殖分析图。 

图10：法氏囊七肽影响肿瘤细胞增殖活性测定。与空白对照组比较，差异显著P＜0.05；差异极显著P＜0.01。 

五、具体实施方式

实施1、法氏囊素七肽的分离与鉴定： 

一种法氏囊七肽的提取方法，包括以下操作步骤：取健康4～6周龄鸡的法氏囊(AA肉鸡，上海农业科学院附属养殖场)2000克，用3000ml生理盐水碾碎、混匀， 反复冻融三次。于4℃，14000g离心60分钟，上清转入另一个管中，再次离心一次。然后经1000Da超滤膜，超滤，并冻干滤液。冻干样品用B液(2％乙腈，0.065％三氟乙酸)稀释，12000g离心10分钟，然后用0.22um滤膜过滤。取滤液经反向高效液相纯化分析，收获滞留时间为23.98分钟的活性峰(见图1)。收获的洗脱液经MALDI-TOF-MS分析，分子量为722.240，氨基酸序列EPAGSMM(见图2)，这是第一次从法氏囊中分离发现。 

采用固相化学合成方法，合成氨基酸结构相同的七肽，纯度在97％以上。 

2、动物免疫及体液免疫反应： 

天然的法氏囊提取物能促进B细胞的增殖、分化，从而导致抗体的产生。在此基础上，发明人以4-6周龄BALB/c小鼠(购自扬州大学试验动物中心)为动物模型，以禽流感灭活疫苗(H9N2亚型F株，购自南京梅里亚动物保健有限公司)与不同浓度的法氏囊七肽联合免疫三次，分别在三次免疫后14天，采血，分离血清，检测HI抗体水平和抗体亚型IgG1和IgG2α的变化情况，分析法氏囊七肽对体液免疫的调节功能(见表1)。通过该实验可以发现法氏囊七肽能明显调节体液免疫功能，且与剂量密切相关，并且具有平衡Th1和Th2型免疫反应的功能。 

1)HI抗体水平，采用血凝抑制试验方法检测，具体操作方法为： 

确定4倍抗原： 

于V微量血凝反应板的每孔中滴加PBS25ul，共滴四排。吸取病毒抗原(H9N2亚型F株，购自中国兽医药品检查所菌种保藏室)滴加于第一列孔，每孔25ul，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11列孔各吸取25ul弃之。然后于每孔中再加入PBS25ul。在于每孔中加入1％鸡红细胞悬液25ul。置微型振荡器上振荡混匀，室温(约20℃)静置40分钟，或4℃60分钟，应在对照孔的RBC显著呈钮扣状时判定结果。 

表1免疫程序 

以红细胞完全凝集(++++)的抗原最大稀释度为该抗原的血凝效价，表示一个HA单位(HAU)。每次四排重复，以几何均值表示结果。 

计算出含4个血凝单位的抗原浓度，按如下公式进行计算： 

抗原应稀释倍数＝血凝滴度/4 

HI梯度的测定： 

于微量血凝反应板1～11孔中加入25ulPBS，第12孔加入50ulPBS。吸被检血清25ul于第1孔中，混匀后吸于第2孔，依次倍比稀释至第10孔，最后弃去25ul。1-11孔均加入含4个HAU的病毒抗原液，室温下静置不少于30分钟，4℃不少于60分钟。然后滴加25ul1％红细胞悬液与各孔中，振荡混合后，室温下静置40min，或4℃60分钟，应在对照孔的RBC显著呈钮扣状时判定结果。 

结果判定：完全抑制4HAU抗原的最高血清稀释倍数为HI效价。阴性对照血清效价不高于2log2，和阳性对照血清效价应在已知效价的一个稀释度以内，结果有效。HI效价小于或等于log2³判定HI试验阴性；HI效价等于log2⁴为阳性。 

结果表明法氏囊七肽(BSP)具有调节血清抗体水平的能力，且调节能力与浓度有关(见附图3)。 

2)抗体亚型检测，采用间接ELISA方法，具体操作方法为：分别于免疫后14天、28天和42天，采血分离血清检测特异的亚型抗体。将10^2.5EID₅₀/ml灭活AIV抗原包被板条，100ul/孔，4℃作用过夜，或37℃作用2小时，洗涤三次，然后1％BSA封闭37℃作用2个小时，或4℃作用过夜。然后加入血清，分别按1∶10-1∶10⁵四个梯度，37℃作用2个小时，然后分别加入1∶1000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG和1∶2000稀释的羊抗鼠IgG1 and IgG2α，37℃作用2个小时，充分洗涤后，加入TMB底物显色液，37℃作用10～15min，然后加入2M H₂SO₄终止，450nm读值，分析结果。 

结果表明法氏囊七肽(BSP)能明显调节抗体亚型的水平(见附图4，5，6)。在抗体分型中，可以发现，BSP诱导的抗体亚型以IgG1为主，同时也诱导IgG2α亚型。因为IgG1和IgG2α是IgG的主要亚型，它们是由不同类型的免疫反应产生的。IgG1抗体由Th2型免疫反应产生，IgG2α抗体由Th1型免疫反应产生。因此，BSP能明显诱导Th1/Th2型免疫反应。 

3、细胞免疫试验 

1)细胞免疫反应检测： 

细胞免疫的表现形式有多种，其中细胞因子在免疫反应中起重要作用，可以调节多种反应。脾细胞增殖和T细胞亚型等也是细胞免疫反应的常用指标。 

2)细胞因子检测： 

我们采用ELISA方法，用试剂盒(RD，USA)检测血清中IL-4和IFN-γ的含量。在第三次免疫后1周，采血分离血清。按说明书操作。结果表明，BSP能促进细胞 的分泌，特别是0.05mg/只时，IL-4和IFN-γ量均明显高于疫苗对照组。如附图7，法氏囊七肽不仅能提高代表Th1类型免疫反应得细胞因子IFN-γ的水平，同时能显著提高代表Th2类型的细胞因子IL-4的水平。 

3)T细胞分型检测： 

采用三色法检测T细胞亚型。在第三次免疫后1周，处死小鼠，无菌分离脾脏淋巴细胞，分装到96孔细胞板上(105cells/well)。用三个剂量的BSP刺激48～72小时后，收获细胞。加入PE、FITC和PE-Cy5标记的CD3、CD4和CD8单抗(eBioscience，USA)室温作用30m分钟，洗涤一次，然后用1％新生牛血清(杭州四季青，中国)的PBS悬浮细胞，在流氏分析仪(BD，LSR)上分析细胞亚型。结果表明，BSP能明显刺激T细胞的分化，且在0.05mg/只时，效果最为明显，见附图8。 

4)脾细胞增殖试验： 

在2^nd boost免疫后1周，处死小鼠，无菌分离小鼠脾脏淋巴细胞，分装到96孔细胞板上(10⁵个细胞/孔)。用三个剂量的BSP刺激48～72小时后，加入100μg/孔MTT(Sigma，USA)，作用4小时，弃去上清，加入DMSO(Sigma，USA)100ul/孔，OD570nm读值，分析结果。结果，BSP能增加脾脏淋巴细胞的活性，在0.05mg/只时，达到最高值，见附图9。 

4、肿瘤细胞活性的影响： 

将长成单层的Hela细胞(购自中国科学院细胞库，编号TCHu187)，用胰酶消化，同时将长成单层的SP2/0细胞(购自中国科学院细胞库，编号TCM18)从瓶壁反复吹打下来，分别分装到96孔细胞板上。用10％血清的生长液培养。2小时后，以四个剂量0.2μg/ml、1μg/ml、5μg/ml和25μg/ml BSP加入到细胞中，作用48～72小时。然后加入100μM/well的MTT于各孔中，37℃作用4个小时。弃去上清，加入DMSO 100ul/孔，于570nm读值，分析结果。结果表明，BSP对Hela和SP2/0细胞的活性具有调节作用，且在高剂量时，细胞活性受到抑制；见附图10，从而说明法氏囊七肽能调节肿瘤细胞的生长，且不同的肿瘤细胞，且调节能力与剂量的关系不同。总的趋势是，在低剂量时，BSP能促进肿瘤细胞的生长。然而随着剂量的增殖，肿瘤细胞的活性逐渐降低，即BSP抑制了肿瘤细胞的增殖。据此，结果表明，BSP虽然来源于禽法氏囊组织中，但可能也是肿瘤细胞的一种效应因子，在不同的情况下，可能发挥不同的作用。 

Claims (2)

1.一种法氏囊七肽，由七个氨基酸组成，其序列为EPASGMM，分子量为722.240，在体内外均具有免疫调节作用。

2.权利要求1中所述法氏囊七肽的制备工艺，其特征在于，取健康青年鸡的法氏囊组织，于质量比0.85％的生理盐水中碾碎，反复冻融三次，并在0-10℃下14000g离心60分钟，采用截流分子量为1000Da的超滤膜过滤，真空冷冻干燥，得法氏囊活性肽粉剂，冻干粉溶解，经0.22μm滤膜过滤，进行高效反向液相，在220nm波长，收集23.89min峰值的洗脱液，然后进行MODLID-TOF质谱分析，即得法氏囊七肽。

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